CN115873839B - 一种检测mog抗体滴度的检测材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测MOG抗体滴度的检测材料及其制备方法，属于生物、医药工程中的检测分析及材料技术领域，本发明将过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞和空载MOG蛋白的CHO细胞混合接种于载片的细胞培养孔内，培养后去除培养基，于2～6℃的温度下加入试剂A浸没细胞处理5min，然后去除试剂A，加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，即得所述检测材料。本发明针对过表达MOG蛋白的细胞，在不使用甲醛或多聚甲醛的情况下，即可实现高保真MOG蛋白抗原结构域下的细胞固定，提供了一种便捷、准确检测MOG抗体滴度的检料，临床检验时，能够实现批量检测的稳定性，灵敏性和准确性，能够满足常规冷链运输及长时间的保存。

Description

一种检测MOG抗体滴度的检测材料及其制备方法

技术领域

本发明是一种检测MOG抗体滴度的检测材料及其制备方法，具体涉及一种用于抗人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白IgG抗体相关疾病临床诊断的人血清和脑脊液中MOG抗体滴度的检测材料及其制备方法，属于生物、医药工程中的检测分析及材料技术领域。

背景技术

抗人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白IgG抗体（anti- Myelin OligodendrocyteGlycoprotein-IgG）相关疾病（MOG-IgG associated disorders，MOGAD）是一种可能由MOG-IgG导致的自身免疫性疾病，主要症状包括视神经炎、脊髓炎等，及时、准确、快速的对其进行诊断有利于良好的预后和降低致残率。

人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，简称MOG蛋白）由218个氨基酸组成，是免疫球蛋白超家族中的一员，在中枢神经系统特异性表达，仅存于少突胶质细胞和中枢神经系统髓鞘表面，是一个重要的少突胶质细胞成熟的表面标志物，参与髓鞘的完整性、黏附、细胞表面交互作用等。在临床诊断中，以完整、具有正确空间构象的MOG蛋白作为抗原测定血清中MOG抗体阳性的存在是鉴别MOG抗体病可作为诊断脱髓鞘、视神经脊髓炎等自身免疫性疾病的主要标准依据之一，但由于当前检测方法的局限性，不可避免出现假阳性或假阴性。细胞免疫荧光法（cell-based assay，CBA）作为检测人血清及脑脊液中MOG抗体的首选方法，可以对非常见临床表型病人使用不同的CBA方法进行重复检测以降低假阳性或假阴性率。MOGAD患者经过免疫抑制或血浆置换治疗后其MOG滴度下降，可以通过检测人血清及脑脊液中MOG抗体滴度以便于指导临床治疗方案调整。

目前固定化CBA试剂盒为方便细胞片的保存和运输，广泛采用经过一定浓度的甲醛固定检测MOG抗体的细胞，但甲醛固定后，会使细胞的表面部分MOG蛋白抗原表位缺失，导致部分检测样本出现假阴性以及检测灵敏度的降低，不能准确检测出抗体滴度或直接报告假阴性结果。文献（A multicenter comparison of MOG-IgG cellbased assays，Neurology. 2019；International multicenter examination of MOG antibody assays，Neurol Neuroimmunol Neuroinflflamm 2020）表明，活细胞免疫荧光法比固定细胞免疫荧光法对MOG抗体的检出特异性和灵敏度更高。但是，由于运输、仓储和临床检验操作的局限性，活细胞CBA法无法开发为方便使用的试剂盒，且耗时长、操作复杂和成本较高，难以实现大规模推广应用。目前MOG抗体CBA检测的现有方法主要是固定或活HEK293细胞法，所用细胞为人胚肾细胞HEK293，在HEK293上构建的过表达MOG蛋白，再进行免疫反应时，容易与人血清中的其它抗体成分发生非相关免疫反应，降低检测准确性、出现假阳性。（Detectionof MOG-IgG in Clinical Samples by Live Cell-Based Assays：Performance ofImmunoflfluorescence Microscopy and Flow Cytometry，Frontiers in Immunology，2021；Cell-based assays for the detection of MOG antibodies：a comparativestudy. Journal of Neurology，2020。）

因此，现有的采用固定或活HEK293细胞法检测人血清及脑脊液中MOG抗体滴度时存在以下技术问题：

（1）现有的固定CBA法为方便细胞片的保存和运输，广泛采用经过一定浓度的甲醛或多聚甲醛固定检测MOG抗体的细胞，但当前含有醛类成分进行固定后的MOG蛋白，会发生免疫反应后的镜下观察中阳性反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性，这是由于当前甲醛或多聚甲醛固定细胞会影响细胞的表面部分MOG蛋白抗原表位缺失，存在多批次检测不稳定的技术问题。

针对甲醛或多聚甲醛对MOG抗体细胞的影响，公开号为CN110687085A的发明专利公开了一种固定细胞的方法，该方法利用90%冷甲醇和1%多聚甲醛作为固定液对细胞进行固定，在一定程度上减少了多聚甲醛的用量，能够维持细胞正常结构以及尽量使抗原保持与抗体结合的状态，还能提高免疫荧光检测时的荧光效应，但仍然不可避免会使用到多聚甲醛，且该专利仅选择性的使用人诱导多能干细胞（hiPSCs）对上述效果进行了验证，因此，在应用于检测MOG抗体的其他细胞时是否存在上述效果还难以预料，且高浓度醇的使用还可能影响细胞形态和其上面过表达的膜蛋白结构和分布，影响读片观察。

（2）活细胞CBA法检测MOG抗体灵敏度虽较上述固定CBA法高，且目前用于MOG抗体的固定CBA法也达不到活细胞CBA宽检测限水平，但是由于活细胞无法长期保存，需要一直进行细胞的传代培养，现用现取，检测需要的实验室和人员条件较高，也存在多批次检测不稳定的技术不足，且活细胞片无法长距离运输、保存，难以开发为便于开展临床工作的试剂盒，进行推广应用。

（3）现有技术普遍采用HEK293细胞作为MOG抗体检测用细胞系（MOG cell-basedassay detects non-MS patients with inflammatory neurologic disease.AmericanAcademy of Neurology，2015）。HEK293为人源细胞，表达外源蛋白表达量高，常用于重组蛋白表达和细胞免疫荧光技术。但由于人血清中成分非常复杂，各种非目标抗体和HEK293细胞系有较多结合，导致免疫反应后整体背景较高，容易发生假阴性、影响临床检验人员对结果的判定。而且HEK293细胞是半贴壁细胞，在实验过程中容易脱落掉片，影响结果观察。

例如：公开号为CN107299111A的发明专利公开的一种检测MOG-IgG的CBA试剂盒的细胞爬片组件的制备方法，即采用HEK293构建过表达MOG蛋白并制作细胞爬片组件；以及公开号为CN113481166A的发明专利公开的一种能够用于即时检测人体血清中 MOG-IgG水平的GFP-MOG-HEK293细胞模型，虽然在一定程度上提升了MOG-IgG抗体检测的灵敏性和特异性，但该技术所构建的细胞在检测时，同样需要加入甲醛或多聚甲醛进行固定。

综上所述，现有技术在细胞固定过程中，不可避免的会使用到多聚甲醛，多聚甲醛虽然能够提供更好的固定效果，但多聚甲醛的使用难免会影响MOG蛋白的结构而造成检测结果的不确定性，特别是针对采用HEK293细胞进行的MOG抗体检测，细胞固定的稳定性对检测的灵敏度和准确性十分关键，因此，迫切需要研究和开发一种高效、准确、快速、稳定的检测血清中MOG-IgG滴度的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测MOG抗体滴度的检测材料的制备方法，该方法是针对MOG蛋白表达的细胞，在不使用甲醛或多聚甲醛的情况下，即可实现细胞的固定，同时，本发明还提供了检测MOG抗体滴度的检测材料，在临床MOGAD的诊断过程中，能够实现批量检测的稳定性，具有灵敏性和准确性，且能够满足常规冷链运输及长时间的保存。

本发明通过下述技术方案实现：

一种检测MOG抗体滴度的检测材料的制备方法，将过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞和空载MOG蛋白的CHO细胞混合接种于载片的细胞培养孔内，培养后去除培养基，于2～6℃的温度下加入试剂A浸没细胞处理5min，然后去除试剂A，加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，即得所述检测材料，

所述试剂A是在含有醇类物质和pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液的混合液中添加L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物而制得；

所述试剂B是在含有醇类物质和pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液的混合液中添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物而制得。

所述试剂A和试剂B中pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液均为磷酸盐水溶液。

按体积百分比计，所述试剂A的混合液中，醇类物质为15～30%，磷酸盐缓冲液为70～85%。

所述试剂A中，按质量体积浓度计，L-脯氨酰甘氨酸为2～10g/L，N-烟酰甘氨酸为2～10g/L。

按体积百分比计，所述试剂B的混合液中，醇类物质为2～5%，磷酸盐缓冲液为95～98%。

所述试剂B中，按质量体积浓度计，氯化锌为0.1～0.2g/L ，L-脯氨酰甘氨酸为2～10g/L，N-烟酰甘氨酸为2～10g/L。

所述试剂B中还包含有氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清、鱼胶原蛋白、甘油以及杀菌剂中的至少一种。

所述试剂A和试剂B中的醇类物质包括甲醇或乙醇。

所述载片至少包括一个放置变色硅胶指示剂颗粒的指示剂孔，去除试剂A后，在细胞培养孔和指示剂孔内同时加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，待指示剂孔变色后取出变色硅胶指示剂颗粒，即得所述检测材料。

本发明的技术方案还包括：采用上述制备方法制得的检测材料。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明构建了一种过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞（CHO-MOG-eGFP），能够在宽灵敏度范围检测人血清及脑脊液中MOG抗体滴度，与HEK293细胞系比较具有贴壁更牢，免疫荧光反应背景低的技术效果，特异性达到100%。

（2）本发明采用一种特殊的无甲醛或多聚甲醛的固定技术对上述过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞进行固定，经试验证明，可达到采用与活细胞法相当的特异性和准确性。

（3）本发明提供的固定技术是在制备过程中，采用特定配方组成的试剂A和试剂B，利用试剂A作为固定剂具有保护细胞抗原结构域成分的功能，试剂B不仅具有保护抗原结构的作用，还具有抗氧化和杀菌作用，能够满足细胞抗原保护及细胞保存的特定条件。特别是配方（试剂A或试剂B）中采用的L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合，它们的组合能够实现与醇类物质（如甲醇）的协同作用，以进行固定脱水和保持细胞固定时的正常形态。

（4）本发明通过上述固定技术，还可以在不使用甲醛或多聚甲醛的条件下，实现批量检测的稳定性，可为临床检测提供技术支持。

（5）本发明采用一种无甲醛或多聚甲醛的固定技术对上述过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞进行固定后，可以实现在常规冷链运输（干冰冷链）或冷冻（-18℃）保存2个月，并未降低其灵敏性和准确性的效果。

（6）本发明可同时对多个不同稀释倍数（1/3.2/10/32/100/320）的样本进行检验，实现对样本中MOG抗体的滴度值进行宽灵敏度范围检测。

（7）本发明的制备方法简单，可在常温条件下进行制备，同时在载片上使用指示剂孔作为对照，使得制备方式更加便捷。

综上所述，本发明是在无甲醛或多聚甲醛的使用条件下，采用L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸组合的特定试剂，专门针对CHO-MOG-eGFP细胞而设计的一种新型细胞固定方法，由其制备得到的检测材料不仅具有活细胞法相当的特异性、准确性以及宽灵敏度的检测范围，还可实现批量检测的稳定性，并满足常规冷链运输及2个月的冷冻保存。

附图说明

图1为本发明制备方法的流程框图。

图2和图3为不同材料测试样品特异性和准确性的免疫荧光结果对照表。

图4和图5为不同材料测试样品梯度稀释下灵敏性的免疫荧光结果对照表。

图6为采用不同批次测试样品的免疫荧光结果对照表。

图7为CHO细胞过表达MOG材料对阴性血样进行的免疫荧光图。

图8为HEK293细胞过表达MOG材料对阴性血样进行的免疫荧光图。

图9为CHO细胞过表达MOG材料对阳性血样进行的免疫荧光图。

图10为HEK293细胞过表达MOG材料对阳性血样进行的免疫荧光图。

图11为采用实施例1的检测材料对阳性血样进行的免疫荧光图。

图12为采用对比例4的检测材料对阳性血样进行的免疫荧光图。

图13为采用对比例5的检测材料对阳性血样进行的免疫荧光图。

其中，图7和图8所示为同一阴性血样的免疫荧光图，图9和图10所示为同一阳性血样的免疫荧光图，图11、图12和图13所示为同一阳性血样的免疫荧光图。

实施方式

下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明旨在解决现有固定化CBA法采用甲醛或多聚甲醛对表面MOG抗原造成的影响，以及MOG抗体检测时采用HEK293细胞构建细胞模型对检测准确度的影响，由此而提供的一种检测MOG抗体滴度的检测材料及其制备方法。

参见图1所示，其制备流程可具体概况如下：

首先，准备如图1所示的载片，载片具有一个指示剂孔（G）以及六个细胞培养孔（A-F），载片可采用聚碳酸酯（PC）材质制得，并在孔位内进行多聚赖氨酸涂布处理。

于指示剂孔内放入变色硅胶指示剂颗粒（如蓝色变色硅胶，可以检测含水量的变化），再将慢病毒转染构建的MOG蛋白表达细胞（即过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞）和空载MOG蛋白的CHO细胞混合后，接种于载片的细胞培养孔内，培养后去除培养基，2～6℃的温度下加入试剂A浸没细胞处理5min，然后去除试剂A，在指示剂孔和细胞培养孔内分别加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，待指示剂孔变色后取出变色硅胶指示剂颗粒，在底面放置脱氧剂，真空包装后即得所述检测材料。

在本发明中，将过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞和空载MOG蛋白的CHO细胞按1∶1～3的比例混合均匀后，按总密度1×10⁵～3×10⁵/mL接种到对应的细胞培养孔内，采用F12K+10%FBS+NEAA作为培养基，生长24～72小时左右，汇合度为50～100%时停止培养，再去除残余培养基。其中，F12K具体是指：F12K培养基，FBS具体是指：胎牛血清，NEAA具体是指：非必需氨基酸。在具体实施过程中，上述比例、接种密度、生长时间等数据，可根据需要参照上述范围值进行适当调整。

在一个具体的实施例中，采用慢病毒转染法，制备表达MOG-eGFP融合蛋白的慢病毒载体，通过转染293T细胞，获得病毒，将获得的病毒感染CHO细胞，获得转染细胞。转染细胞通过有限稀释法进行筛选，获得表达MOG-eGFP融合蛋白的单克隆细胞：取长满了转染MOG-eGFP细胞的培养皿，用trypsin-EDTA溶液消化成单细胞悬液，用细胞计数板计算出细胞密度，然后用完全培养基稀释细胞，采用有限稀释法将细胞稀释成4个/100uL，2个/100uL，1个/100uL，分别按100uL/孔接种到96孔板中，筛选出单细胞群的单孔，反复筛选其中绿色荧光强的单孔进行冻存并采用MOG蛋白一抗进行免疫荧光检测，筛选出MOG蛋白表达量较高的单克隆细胞，即得过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞。

需要说明的是，本发明所述空载MOG蛋白的CHO细胞是指：具有与MOG慢病毒转染细胞相同的慢病毒载体框架，但没有插入MOG基因，用该空载慢病毒载体转染CHO细胞，即为空载MOG蛋白的CHO细胞。

进一步的，上述制备方法所使用的试剂A是在含有醇类物质和pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液的混合液中添加L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸而制得，醇类物质包括但不限于甲醇或乙醇，按体积百分比计，在试剂A的混合液中，醇类物质为15～30%，磷酸盐缓冲液为70～85%；试剂A中，按质量体积浓度计，L-脯氨酰甘氨酸为2～10g/L，N-烟酰甘氨酸为2～10g/L。

例如在一个具体的实施例中，在15%甲醇（V/V）和85% pH为7.0～7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物来制备试剂A，并控制每升试剂A中L-脯氨酰甘氨酸的含量为5g，N-烟酰甘氨酸的含量为5g。

以及所使用的试剂B是在含有醇类物质和pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液的混合液中添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸而制得，还可以添加其他常规物质如：氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清、鱼胶原蛋白、甘油、杀菌剂等等，以及它们的任意组合。醇类物质包括但不限于甲醇或乙醇，按体积百分比计，在试剂B的混合液中，醇类物质为2～5%，磷酸盐缓冲液为95～98%；试剂B中，按质量体积浓度计，氯化锌为0.1～0.2g/L，L-脯氨酰甘氨酸为2～10g/L，N-烟酰甘氨酸为2～10g/L。进一步的，还可以含有0.1～0.2g/L的氯化钠、0.1～0.2g/L的氯化钾、0.1～0.2g/L的谷胱甘肽，1～5g/L的小牛血清（BSA）、1～5g/L的鱼胶原蛋白，1~2g/L的甘油以及适量的杀菌剂。具体的，杀菌剂可列举的如叠氮化钠、水合肼、亚硝酸钠或其它杀菌剂。

例如在一个具体的实施例中，在2%甲醇（V/V）和98%的pH为7.0～7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物，以及其他可能的常规物质来制备试剂B，并控制每升试剂B中氯化锌的含量为0.1g、L-脯氨酰甘氨酸的含量为5g，N-烟酰甘氨酸的含量为5g，而其他可能的常规物质的添加量则可以根据需要进行确定。

在上述制备过程中，在进行常温真空干燥脱水处理时，是在10～30℃下，将载片放入真空干燥机托盘，开启真空泵开始减压干燥至指示剂变色显示脱水处理完成，然后解除真空，取出载片，在载片底面放置1g脱氧剂（常规的脱氧剂），真空包装后即得所述检测材料。

下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

材料来源：

过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞：按本发明所述慢病毒转染法制备得到；

L-脯氨酰甘氨酸：CAS编号 2578-57-6；

N-烟酰甘氨酸：CAS编号583-08-4；

其余试剂均为常规试剂，可通过市场渠道购买得到。

实施例1：

采用图1所示载片，将变色硅胶指示剂颗粒放入载片的指示剂孔内；将过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞和空载MOG蛋白的CHO细胞按1∶2的比例混合均匀后，按总密度2×10⁵/mL接种到载片的细胞培养孔内，采用F12K+10%FBS+NEAA作为培养基，生长48小时左右，汇合度为80%时停止培养，再去除残余培养基。

在冰上（约4℃）加入试剂A浸没细胞处理5min，然后去除试剂A，在细胞培养孔和指示剂孔内同时加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，待指示剂孔变色后取出变色硅胶指示剂颗粒，在底面放置脱氧剂，真空包装后即得所述检测材料。

试剂A是在15%甲醇（V/V）和85% pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物而制得，每升试剂A中L-脯氨酰甘氨酸的含量为5g，N-烟酰甘氨酸的含量为5g。

试剂B是在2%甲醇（V/V）和98%的pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物，以及氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清（BSA）、鱼胶原蛋白，甘油以及适量的杀菌剂而制得，每升试剂B中氯化锌的含量为0.1g、L-脯氨酰甘氨酸的含量为5g、N-烟酰甘氨酸的含量为5g、氯化钠的含量为0.1g、氯化钾的含量为0.2g、谷胱甘肽的含量为0.15g、小牛血清的含量为2.5g、鱼胶原蛋白的含量为5g，甘油的含量为2g，叠氮化钠的含量为0.1g。

实施例2至实施例8：

采用与实施例1相同的制备方法，区别仅在于个别试剂的选择和添加量的不同，具体参见下表1和表2所示。

表1 实施例2至实施例8的区别数据表——试剂A

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表2 实施例2至实施例8的区别数据表——试剂B

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对比例1：

本对比例采用与实施例1相同的制备方法，但在试剂A中未添加L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物，在试剂B中未添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物，其余组分含量略有调整，如下所示：

试剂A：采用15%甲醇（V/V）和85% pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）组成的混合物。

试剂B：在2%甲醇（V/V）和98%的pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清、鱼胶原蛋白，甘油以及适量的杀菌剂而制得，每升试剂B中氯化钠的含量为0.2g、氯化钾的含量为0.2g、谷胱甘肽的含量为0.1g、小牛血清的含量为5g、鱼胶原蛋白的含量为4.5g，甘油的含量为2g，叠氮化钠的含量为0.1g。

对比例2：

本对比例采用与实施例1相同的制备方法，但在试剂A中仅添加单一物质：L-脯氨酰甘氨酸，在试剂B中仅添加氯化锌和L-脯氨酰甘氨酸的组合物，其余组分含量略有调整，如下所示：

试剂A：在15%甲醇（V/V）和85% pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加L-脯氨酰甘氨酸而制得，每升试剂A中L-脯氨酰甘氨酸的含量为10g。

试剂B：在2%甲醇（V/V）和98%的pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸、氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清、鱼胶原蛋白，甘油以及适量的杀菌剂而制得，每升试剂B中氯化锌的含量为0.2g，L-脯氨酰甘氨酸的含量为10g，氯化钠的含量为0.1g，氯化钾的含量为0.1g、谷胱甘肽的含量为0.2g、小牛血清的含量为5g、鱼胶原蛋白的含量为5g，甘油的含量为1g，叠氮化钠的含量为0.1g。

对比例3：

本对比例采用与实施例1相同的制备方法，但在试剂A中仅添加单一物质：N-烟酰甘氨酸，在试剂B中添加氯化锌和N-烟酰甘氨酸的组合物，其余组分含量略有调整，如下所示：

试剂A：在15%甲醇（V/V）和85% pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加N-烟酰甘氨酸而制得，每升试剂A中N-烟酰甘氨酸的含量为10g。

试剂B：在2%甲醇（V/V）和98%的pH为7.4磷酸盐缓冲液（V/V）的混合物中添加氯化锌、N-烟酰甘氨酸、氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清、鱼胶原蛋白，甘油以及适量的杀菌剂而制得，每升试剂B中氯化锌的含量为0.2g，N-烟酰甘氨酸的含量为10g ，氯化钠的含量为0.2g，氯化钾的含量为0.1g、谷胱甘肽的含量为0.1g、小牛血清的含量为2g、鱼胶原蛋白的含量为3g，甘油的含量为1.5g，叠氮化钠的含量为0.1g。

对比例4：活细胞法

细胞培养：取消化的CHO-MOG-eGFP单克隆细胞和对照空载细胞，按单克隆细胞：对照细胞=1∶2的比例混合均匀，按总密度2×10⁵/mL接种到96孔板，用F12K+10%FBS+NEAA培养，生长48小时左右，期间取3孔细胞，消化计数，至细胞密度1×10⁶/mL，停止培养。

细胞爬片的处理：吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液洗去残余的培养基。（细胞不固定处理，直接进行下一步免疫荧光）

对比例5：多聚甲醛固定细胞法

细胞培养：取消化的CHO-MOG-eGFP单克隆细胞和对照空载细胞，按单克隆细胞：对照细胞=1∶2的比例混合均匀，按总密度2×10⁵/mL接种到96孔板，用F12K+10%FBS+NEAA培养，生长48小时左右，期间取3孔细胞，消化计数，至细胞密度1×10⁶/mL，停止培养。

细胞爬片的固定处理：吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液洗去残余的培养基，加入4%多聚甲醛，室温固定20分钟，吸弃多聚甲醛，用磷酸盐缓冲液洗去残余的多聚甲醛，室温晾干30分钟。

任意选取上述实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5制得的检测材料进行免疫荧光检测：

（一）特异性和准确性

方法及步骤：

选择30个临床诊断为MOG抗体病患者的样本和10个临床诊断为非MOG抗体病患者（血清和脑脊液分开统计），分别采用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5检测免疫荧光。

免疫荧光：

（1）准备血清和脑脊液原液作为样品，按1∶10的比例，用样品稀释液对样本进行稀释，样品稀释液中含有如下成分：磷酸缓冲液（pH7.2）和BSA（2%）。在37℃湿盒中对样品进行孵育，孵育1小时后，用磷酸缓冲液冲洗细胞片3次，每次5分钟。

（2）按1∶500的比例，用样品稀释液稀释二抗，二抗为Delight 594标记的羊抗人IgG（Fc）。在步骤（1）处理后的样品中加入稀释的二抗，室温孵育40分钟，吸弃二抗，用磷酸缓冲液洗细胞片3次，每次5分钟。

（3）按1∶2000的比例，用样品稀释液稀释DAPI溶液，在步骤（2）处理后的样品中加入稀释的DAPI溶液，孵育5分钟，吸弃DAPI溶液，用磷酸缓冲液洗细胞片3次，每次5分钟。

（4）加少许磷酸缓冲液完全浸泡细胞片，在荧光显微镜下观察，荧光结果如图2和图3所示。

由图2和图3可知，固定细胞法因采用多聚甲醛进行固定，在与活细胞法免疫荧光比较时，阳性反应不强，容易出现假阴性，检测结果的准确性较差，具体参见对比例4和对比例5；本发明因采用特定的组合物（氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸）并使用醇类对细胞进行固定化处理时对细胞和抗原结构提供特异性保护，具有保护细胞抗原结构域成分的功能，因此，在与其他对比例（未采用上述特定组合物）及活细胞法的免疫荧光进行比较时，假阴性的情况得到极大的改善，检测结果具有特异性和准确性，具体参见实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4。

（二）灵敏性

方法及步骤：在进行上述（一）的免疫荧光检测时，同时进行灵敏度的测试，即采用1∶1、1∶3.2、1∶10、1∶32、1∶100、1∶320的稀释倍数对样品进行梯度稀释后，进行免疫荧光检查，荧光结果如图4和图5所示。

由图4和图5可知，在与活细胞法免疫荧光比较时，本发明在不同稀释倍数下均具有较好的特异性及准确性，灵敏度高，具体参见实施例1和对比例4；而在其他对比例（未采用上述特定组合物）以及固定细胞法的荧光免疫中，灵敏度较差，具体参见对比例1、对比例2、对比例3和对比例4。

（三）批量检测的稳定性

按照实施例1的方法，分三批次处理检测材料，选择10个临床诊断为MOG抗体病患者的样本和10个临床诊断为非MOG抗体病患者（血清和脑脊液分开统计），同时用三批次处理的检测材料检测免疫荧光，具体方法及步骤与上述（二）的操作方法相同，荧光结果如图6所示。

由图6可知，样品在每批次的免疫荧光检测中，结果一致，证明本发明的检测材料可以实现批量检测的稳定性。

（四）样品的保存

将本发明固定的样品（血清和脑脊液原液）分别保存2个月后，进行免疫荧光检测，仍然具有上述特异性和准确性的特点，灵敏度高，同时，具备批量检测的稳定性。如下表3所示。

表3 样品保存后的检测效果对照表

。

对比例6：

采用与本发明记载的相同构建方法，使用相同慢病毒载体及筛选方式构建的过表达MOG蛋白HEK293细胞（即HEK293-MOG-EGFP转染细胞）替代CHO-MOG-eGFP，按实施例1的方法制备对应的检测材料。

取实施例1和对比例6制备的检测材料，对同一个阴性血样（健康人）进行荧光免疫检测（包括DAPT、GFP和二抗红光），其检测结果参见图7和图8。

由图7和图8比较可知，在采用实施例1的CHO细胞过表达MOG材料对阴性血样进行免疫荧光检测时，如图7所示，阴性血样背景更干净，检测结果更加准确；在采用对比例6的HEK293细胞过表达MOG材料对同一阴性血样进行免疫荧光检测时，如图8所示，阴性血样也会产生一些二抗红光背景，影响检测结果的判定。

取实施例1和对比例6制备的检测材料，对同一个阳性血样进行荧光免疫检测（包括DAPT、GFP和二抗红光），其检测结果参见图9和图10。

由图9和图10比较可知，采用实施例1的CHO细胞过表达MOG材料对阳性血样进行免疫荧光检测时，如图9所示，对照细胞背景更加干净，检测结构更加准确；在采用对比例6的HEK293细胞过表达MOG材料对同一阳性血样进行免疫荧光检测时，如图10所示，对照细胞出现红色背景，对二抗红光检测的结果判定不准确。

取实施例1、对比例4和对比例5的检测材料，对同一阳性血样进行荧光免疫检测（包括GFP、二抗红光以及两种检测结果的重合比对），其检测结果参见图11、图12和图13。

由图12所示，采用对比例4（活细胞法）的检测材料进行免疫荧光检测时，免疫荧光二抗结果可以显示出明确的阳性；由图11所示，采用实施例1的检测材料进行免疫荧光检测时，免疫荧光二抗结果可以显示出明确的阳性，背景略高于对比例4的活细胞法（参见图12）；由图13所示，采用对比例5（固定细胞法）的检测材料进行免疫荧光检测时，免疫荧光二抗阳性结果不明显，检测血样MOG抗体滴度明显低于实施例1和对比例4的结果（参见图11和图12）。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测MOG抗体滴度的检测材料的制备方法，其特征在于：将过表达重组人MOG全长蛋白的CHO细胞和空载MOG蛋白的CHO细胞混合接种于载片的细胞培养孔内，培养后去除培养基，于2～6℃的温度下加入试剂A浸没细胞处理5min，然后去除试剂A，加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，即得所述检测材料，

所述试剂A是在含有醇类物质和pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液的混合液中添加L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物而制得；

所述试剂B是在含有醇类物质和pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液的混合液中添加氯化锌、L-脯氨酰甘氨酸和N-烟酰甘氨酸的组合物而制得，

所述试剂A和试剂B中的醇类物质为甲醇或乙醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：按体积百分比计，所述试剂A的混合液中，醇类物质为15～30%，磷酸盐缓冲液为70～85%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述试剂A中，按质量体积浓度计，L-脯氨酰甘氨酸为2～10g/L，N-烟酰甘氨酸为2～10g/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：按体积百分比计，所述试剂B的混合液中，醇类物质为2～5%，磷酸盐缓冲液为95～98%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述试剂B中，按质量体积浓度计，氯化锌为0.1～0.2g/L ，L-脯氨酰甘氨酸为2～10g/L，N-烟酰甘氨酸为2～10g/L。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述试剂B中还包含有氯化钠、氯化钾、谷胱甘肽、小牛血清、鱼胶原蛋白、甘油以及杀菌剂中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述载片至少包括一个放置变色硅胶指示剂颗粒的指示剂孔，去除试剂A后，在细胞培养孔和指示剂孔内同时加入试剂B，于常温下真空干燥脱水处理，待指示剂孔变色后取出变色硅胶指示剂颗粒，即得所述检测材料。

8.采用权利要求1～7任一项所述制备方法制得的检测材料。

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