CN118667915A - 一种重组特立帕肽生物学活性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测重组特立帕肽生物学活性的方法。具体地，选用大鼠骨肉瘤(UMR‑106)细胞作为检测细胞，通过测定所述细胞在重组特立帕肽作用下的cAMP水平来反映其生物学活性。本发明建立的方法曲线拟合度高，准确度好，重复性高，耐用性强，能够很好的适用于重组特立帕肽生物学活性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物药物的生物学检测技术领域，具体而言，涉及一种重组特立帕肽生物学活性的测定方法。
背景技术
重组特立帕肽[化学名称为重组人甲状旁腺素1-34，rhPTH(1-34)]是由重组人甲状旁腺素N末端1-34氨基酸残基组成的多肽，通过基因重组技术将带有其编码基因的重组质粒转化到大肠杆菌，经过细胞培养、分离和纯化后获得。重组特立帕肽是一款促骨形成类抗骨松药物，可有效改善骨微结构、增加骨强度，同时能促进骨愈合，降低椎体和非椎体骨折风险，适用于有骨折高发风险的绝经后妇女骨质疏松症的治疗。
多肽类药物生物学活性的测定是药物有效性评价的重要指标，其在产品研发、生产工艺控制及质量控制方面必不可少。目前已报道的重组特立帕肽生物学活性的测定方法主要有放免法、化学发光法、细胞增殖法。以上几种检测方法操作较为繁琐，且需使用大型仪器进行检测，细胞增殖法还需严格控制细胞密度。本发明公开的方法为基于UMR-106细胞的生物学活性测定方法，该方法准确、稳定可靠，精密度高，对细胞代次的改变均具有很好的耐用性，能够更好的满足于重组特立帕肽药物的工艺控制、放行检验等检验需求。
发明内容
本发明的目的是针对目前现有重组特立帕肽生物学活性检测方法技术的不足之处进行优化研究，并进行方法学验证，提供一种准确度高、精密度好、耐用性强的重组特立帕肽生物学活性检测方法，不仅能够检测重组特立帕肽纯品，还能够适用于配方复杂的重组特立帕肽制剂，可以更好的应用于重组特立帕肽生物学活性检测。
为实现本发明的目的，提供一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，其包括以下步骤：
(1)取对数生长期生长状态良好的UMR-106细胞，用培养基制备成1.0×
105～3.0×105cells/ml的细胞悬液，100μl/孔铺至细胞培养板，培养16～24h；
(2)倍比稀释重组特立帕肽参考品和供试品，所述重组特立帕肽参考品和供试品的起始浓度为0.5～0.7μg/ml，稀释倍数为3.5～5，共8～9个浓度梯度；
(3)将步骤(2)各浓度梯度的参考品和供试品分别以100μl/孔加入所述细胞培养板，与所述细胞孵育15～30min；
(4)孵育完成后，弃上清，用预冷的PBS清洗细胞；
(5)裂解细胞，检测cAMP含量，计算生物学活性。
在一些实施方案中，所述细胞悬液为2.0×105～3.0×105cells/ml，优选2.0×105cells/ml。在一些实施方案中，所述培养时间为20h。在一些优选实施方案中，所述细胞悬液为1.0×105～3.0×105cells/ml，所述培养时间为20h；或所述细胞悬液为2.0×105cells/ml，所述培养时间为16～24h。
在一些实施方案中，所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为3.5，共9个浓度梯度；或所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为4，共8个浓度梯度；或所述起始浓度为0.7μg/ml，稀释倍数为5，共8个浓度梯度；所述起始浓度优选为0.5μg/ml，稀释倍数优选为3.5，优选共9个浓度梯度。
在一些实施方案中，所述裂解细胞包括以150μl/孔加入细胞裂解液，冻融一次。在一些实施方案中，所述细胞裂解液包含5mM Tris，1％ SDS，所述Tris的pH为7.5。
在一些实施方案中，所述细胞的汇合度控制在80％～90％之间，优选约85％；所述培养基为完全培养基，包含DEME培养基和10％胎牛血清。在一些实施方案中，所述细胞悬液的细胞活率≥90％。
在一些实施方案中，用样品稀释液倍比稀释所述重组特立帕肽参考品和供试品，所述样品稀释液包含磷酸盐缓冲液(PBS)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，所述IBMX浓度为1mmol/L。IBMX是cAMP和cGMP磷酸二酯酶(PDE)的一种非选择抑制剂，能够增强细胞内cAMP水平。选择PBS替代常规培养基作为稀释液，在维持检测效果的前提下能够进一步降低成本。
在一些实施方案中，所述孵育优选15min。所述培养或孵育条件包括37℃，5％CO2。
在一些实施方案中，所述检测cAMP含量包括通过竞争ELISA法检测cAMP含量。所述竞争ELISA法检测cAMP含量包括在酶标板上包被cAMP抗体，加入细胞裂解物，再加入带辣根过氧化物酶HRP标记的cAMP，显色然后终止，测定450nm处的OD值。
在一些实施方案中，所述计算生物学活性包括以参考品或供试品的稀释倍数为X轴，以对应的cAMP含量为Y轴，拟合四参数方程曲线，计算半数稀释倍数(EC50)值，所述供试品的相对生物学活性＝供试品EC50/标准品EC50×100％。在一些实施方案中，所述cAMP含量以OD450值表示。所述四参数方程曲线如下：
y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/X0)^p)
x：供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数；
y：OD值；
A1：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最小值；
A2：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最大值；
p：四参数曲线的斜率；
X0(EC50)：半效稀释倍数。
在一些实施方案中，所述供试品包括重组特立帕肽注射液，所述注射液包含重组特立帕肽原液、冰醋酸、无水醋酸钠、甘露醇、间甲酚、盐酸、氢氧化钠、注射用水。
在一些优选实施方案中，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取对数生长期生长状态良好的UMR-106细胞，用培养基制备成2.0×
105cells/ml的细胞悬液，100μl/孔铺至细胞培养板，培养20h；所述细胞的汇合度控制在约85％，所述细胞悬液的细胞活率≥90％；
(2)用样品稀释液倍比稀释重组特立帕肽参考品和供试品，所述重组特立帕肽参考品和供试品的起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为3.5，共9个浓度梯度，所述样品稀释液包含PBS和1mmol/L的IBMX；
(3)将步骤(2)各浓度梯度的参考品和供试品分别以100μl/孔加入所述细胞培养板，与所述细胞孵育15min；
(4)孵育完成后，弃上清，用预冷的PBS清洗细胞；
(5)以150μl/孔加入细胞裂解液，先后放置于≤-70℃以及37℃冻融一次，所述细胞裂解液包含5mM Tris，1％ SDS，所述Tris的pH为7.5，检测cAMP含量，以参考品或供试品的稀释倍数为X轴，以对应的cAMP含量为Y轴，拟合四参数方程曲线，计算半数稀释倍数(EC50)值，所述供试品的相对生物学活性＝供试品EC50/标准品EC50×100％；所述四参数方程曲线如下：
y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/X0)^p)
x：供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数；
y：OD值；
A1：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最小值；
A2：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最大值；
p：四参数曲线的斜率；
X0(EC50)：半效稀释倍数。
在另一方面，本发明提供了所述重组特立帕肽生物学活性的检测方法在重组特立帕肽药物生产工艺的质量控制中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
1、本发明提供了一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，通过优化细胞密度、裂解方式和样品稀释方式，提高了检测结果的准确度，具有良好的精密度和耐用性，各组样品相对偏倚(RB)、几何变异系数(GCV)均小于5％，活性理论值与测定值之间具有良好的线性关系，R2＝0.999，对细胞代次的容忍度高、培养时间灵活，在实际应用中更具便利性。
2、本发明提供了一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，能够实现复杂的重组特立帕肽制剂，尤其是重组特立帕肽注射液的准确检测，所述方法抗干扰能力强，在实际应用中具有更宽的适用范围。
附图说明
图1为实施例1中不同细胞铺板密度研究实验的四参数曲线拟合图。
图2为实施例2中以细胞裂解液1-2以及裂解方式一进行研究的四参数曲线拟合图。
图3～图8依次为实施例3中实验分组1-6的四参数曲线拟合图。
图9为实施例4中相对准确度评估的生物学活性理论值与测定值的对数值的直线回归方程。
注：所有四参数拟合曲线中，起始浓度均作为稀释倍数1开始作图。
具体实施方式
为详细说明本发明的目的、技术方法和优点，下面结合具体实施例和附图，对本发明进行详细、清晰的阐述。
实验材料：UMR-106细胞(中国科学院)；胎牛血清(FBS)(GIBCO，货号10099141C)、DMEM培养基(GIBCO，货号11965-092)、胰酶(GIBCO，货号25200-056)；cAMP ELISA检测试剂盒(金斯瑞，产品编号L00460)；重组特立帕肽国家标准品(中检院，410019-201801)；重组特立帕肽国际标准品(WHO，15/304)；重组特立帕肽供试品共2批：重组特立帕肽原液、特立帕肽注射液(信立泰(苏州)药业)；完全培养基为含10％FBS的DMEM培养基；样品稀释液：PBS(含1mmol/L IBMX)。
所述特立帕肽注射液成份为重组特立帕肽原液、冰醋酸、醋酸钠(无水)、甘露醇、间甲酚、盐酸、氢氧化钠、注射用水。
实验仪器：多功能酶标仪、二氧化碳培养箱(Thermo Fisher)。
实施例1：细胞密度筛选研究实验
细胞培养：复苏UMR-106细胞，用完全培养基于37.0℃、5.0％ CO2培养箱中传代培养，所述传代培养的细胞汇合度控制在85％左右。
细胞处理：取生长状态良好的UMR-106细胞，弃去培养上清，吸取3.0～5.0ml PBS清洗残余的培养基，弃上清，加入1.0～3.0ml 0.25％胰酶，室温消化，显微镜下观察至约80％细胞变圆，立即加入4～10ml完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶壁上的细胞制成细胞悬液，收集细胞悬液置于无菌离心管中，800～1000rpm离心3～5min，弃上清，用完全培养基重悬、计数，确认细胞活率≥90％，然后用完全培养基分别稀释至0.5×105、1.0×105、2.0×105、3.0×105cells/ml，每孔100μl，铺至96孔细胞培养板，置于37.0℃、5％CO2培养箱中培养20h。
样品处理：用样品稀释液逐级稀释重组特立帕肽国际标准品，以0.6μg/ml作为起始浓度，5倍梯度稀释，共制备9个浓度点的样品，将各浓度点的样品以100μl/孔加入96孔细胞培养板中与所述细胞共同孵育，每个浓度点样品设置双复孔，置于37.0℃、5.0％ CO2培养箱中培养15min后取出细胞培养板，吸弃上清，用2～8℃预冷的PBS，300μl/孔清洗一次。
细胞裂解：弃去上清液后，再以150μl/孔加入细胞裂解液，先后放于≤-70℃冰箱以及37℃CO2培养箱冻融一次。
cAMP检测：根据试剂盒说明书操作。
数据分析：以样品浓度对应的稀释倍数为X轴，以其对应的OD值为Y轴，用ORIGIN软件拟合四参数方程曲线，计算半效稀释倍数；所述四参数方程曲线如下：
y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/X0)^p)
x：样品浓度对应的稀释倍数；
y：OD值；
A1：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最小值；
A2：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最大值；
p：四参数曲线的斜率；
X0(EC50)：半效稀释倍数。
实验结果如图1所示，可以看出低密度点0.5×105cells/ml时下平台信号值偏高，且下平台点数较少，其余三个浓度点曲线分布情况整体上优于0.5×105cells/ml，其曲线拟合度较高且较为接近，因此选择细胞铺板密度范围为1.0×105～3.0×105cells/ml。考虑到培养时间对细胞密度大小存在影响，为了进一步提高方法在操作上的灵活性，考察了细胞铺板密度范围为1.0×105～3.0×105cells/ml时将培养时间控制在16h～24h对检测的影响，结果发现2.0×105cells/ml可以作为优选铺板密度，在该铺板密度下均可以将培养16h～24h后的细胞密度控制在合理的范围内，保证细胞在培养板中保持最佳生长状态。
实施例2：裂解液以及裂解方式筛选研究实验
细胞培养和处理：参照实施例1的方法，其中细胞铺板密度为2.0×105cells/ml。
样品处理：用样品稀释液逐级稀释重组特立帕肽国家标准品，并以0.5μg/ml作为起始浓度，4倍梯度稀释，共制备8个浓度点的样品用于检测生物学活性，将各浓度点的样品以100μl/孔加入96孔细胞培养板中与所述细胞共同孵育，每个浓度点样品设置双复孔，置于37.0℃，5.0％ CO2培养箱中培养15min后取出细胞培养板，吸弃上清液，用2～8℃预冷的PBS，300μl/孔清洗一次。
细胞裂解：弃去上清液后，再以150μl/孔分别加入细胞裂解液A至I以及商品化裂解液2(碧云天，货号P0013G)、裂解液3(碧云天，货号P0013J)，其中细胞裂解液A至I的组分见表1。放于37℃二氧化碳培养箱裂解30min。
cAMP检测和数据分析：采用与实施例1相同的方法。
表1裂解液组分
以第3个浓度点样品处理后的细胞的cAMP含量检测结果为例进行说明，如表2所示，可以看出经同一浓度样品处理后的细胞，不同的裂解液释放的cAMP量差异显著，裂解液H释放的cAMP量最多，能够更真实地反映重组特立帕肽对细胞的刺激效果，因此优选裂解液H(5mM Tris(pH7.5)，1％ SDS)进行细胞裂解。
表2cAMP含量检测结果
| 裂解液 | cAMP浓度(pmol/ml) |
| A | 60.92 |
| B | 30.26 |
| C | 5.27 |
| D | 77.79 |
| E | 71.71 |
| F | 7.12 |
| G | 103.63 |
| H | 124.05 |
| I | 19.15 |
| 裂解液2 | 103.25 |
| 裂解液3 | 88.57 |
另外，还测试了裂解液1(即裂解液H)与裂解液2分别采用不同裂解方式对检测的影响，其中，裂解方式一：先后放于≤-70℃冰箱以及37℃CO2培养箱冻融一次；裂解方式二：37℃裂解30min。经同一浓度样品处理后的细胞的cAMP含量见下表3，显示使用裂解液1时，裂解方式一比裂解方式二产生的cAMP量更多，而冻融对裂解液2的效果无明显影响。采用裂解液1与裂解液2在方式一处理下进行的生物学活性检测结果如图2所示，裂解液1各浓度点的上下平台吸光值均明显低于裂解液2，也说明了裂解液1释放出了更多的cAMP，对细胞裂解更充分，此外，裂解液1对应的曲线拟合度也优于裂解液2(裂解液1和裂解液2的R2分别为0.999、0.998)。因此优选裂解液1冻融一次的方式进行检测。
表3cAMP含量检测结果
实施例3：样品起始浓度、稀释方案研究实验
细胞培养和处理：采用与实施例2相同的方法。
样品处理：参照实施例2的方法，其中用样品稀释液按照表4实验分组逐级稀释重组特立帕肽国家标准品。
细胞裂解：弃去上清液后，再以150μl/孔加入细胞裂解液1(5mM Tris(pH7.5)，1％SDS)，先后放于≤-70℃冰箱以及37℃CO2培养箱冻融一次。
cAMP检测和数据分析：采用与实施例1相同的方法。
以四参数曲线上平台点数≥2个，下平台点数≥1个，线性区域点数≥3个为标准确定样品起始浓度和稀释倍数。实验结果如图3～图8所示，可以看出实验分组1和实验分组2上平台点数较少，实验分组6下平台点数过少，上述实验分组的拟合曲线浓度点分布不均匀，而实验分组3-5样品起始浓度适中、浓度点设置合理，都呈现比较好的“S”型响应曲线，并且以实验分组5(样品起始浓度0.5μg/ml，3.5倍梯度稀释9个点)进行样品处理时，上下平台的浓度点分布最均衡，曲线对称性及稳定性最好。
表4样品起始浓度和稀释方案
实施例4：方法的相对准确度和精密度评估
本实施例评估所建立的方法的相对准确度和精密度，同时设置对比例1和对比例2，对比例1按照专利文献CN 116410334 A实施例17所记载的生物学活性检测进行，对比例2按照专利文献CN108318677A实施例4所记载的rhPTH药物活性的检测方法进行，相对生物学活性按照本发明的公式进行计算。
相对准确度系指在规定的范围内，测得的相对活性与真实值或参考值接近的程度，一般用相对偏倚(RB，％)表示。实验设计如下：两名实验人员(A和B)共制备5个样品，所述样品的起始浓度分别为0.25μg/ml、0.375μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1.0μg/ml样品，理论活性分别为50％、75％、100％、150％、200％，以起始浓度0.5μg/ml的重组特立帕肽国家标准品作为参考品，参照实施例1的方法和表5所列优选参数进行生物学活性检测。
精密度系指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，相对活性测定方法的精密度一般用几何标准偏差(GSD)或几何变异系数(GCV，％)表示。实验设计如下：两名实验人员(A和B)在不同日期各进行一次实验，分别制备起始浓度为0.5μg/ml的样品，所述样品平行制备3份，参照实施例1的方法和表5所列优选参数进行生物学活性检测。
表5方法的优选参数
| 铺板密度(cells/ml) | 2.0×105 |
| 稀释倍数 | 3.5 |
| 参与拟合曲线点数(个) | 9 |
| 裂解液 | 5mM Tris(pH7.5)，1％SDS |
相对准确度实验结果如下表6所示，本发明的方法对不同样品进行检测的相对偏倚均在±5％范围内，相对偏倚较小。以活性理论值的对数(横坐标)对其相应的活性测定值对数(纵坐标)作直线回归，所述对数为ln值，如图9所示，拟合曲线的R2＝0.999，表明本发明的方法具有很高的准确度。
精密度实验结果如下表7所示，几何变异系数(GCV)在5％以内，说明发明的方法具有很高的精密度。
表6相对准确度评估实验结果
表7精密度实验结果
实施例5：方法的耐用性评估
本实施例评估所建立的方法的耐用性，同时设置对比例1和对比例2，对比例1按照专利文献CN 116410334 A实施例17所记载的生物学活性检测进行，对比例2按照专利文献CN108318677A实施例4所记载的rhPTH药物活性的检测方法进行，相对生物学活性按照本发明的公式进行计算。
本发明所建立的方法按照如下步骤评估耐用性：
1、细胞处理
取三个不同代次的细胞(P12、P19、P27)进行铺板，用完全培养基稀释至2.0×105cells/ml，每孔100μl铺至96孔细胞培养板，培养18-20h。
2、样品处理
以重组特立帕肽国家标准品作为参考品，重组特立帕肽原液及注射液(各1批)作为供试品，以实施例3表2的实验分组3、4、5三种处理方式分别进行稀释。100μl/孔加入细胞培养板中，双复孔，培养15min后取出细胞培养板，吸弃上清液，加入用2～8℃预冷的PBS，300μl/孔，洗一次。弃去上清液后，再以150μl/孔加入细胞裂解液1(5mM Tris(pH7.5)，1％SDS)，先后放于≤-70℃冰箱以及37℃CO2培养箱冻融一次。
3、cAMP检测：根据试剂盒说明书操作。
对比例1和对比例2中也分别使用三个不同代次的细胞(P12、P19、P27)进行检测。
实验结果如下表8所示，采用本发明的方法，三个不同代次细胞对各供试品进行生物学活性检测的结果均比较接近，特别是实验分组5处理下的检测结果更为稳定，说明本发明的方法不受细胞代次的影响，耐用性好。对比例1和对比例2在不同细胞代次中的检测结果波动性大，受细胞传代导致的细胞状态不稳定的影响更明显，其检测结果不可靠。
表8不同细胞代次检测结果
Claims (10)
1.一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，其包括以下步骤：
(1)取对数生长期生长状态良好的UMR-106细胞，用培养基制备成1.0×105～3.0×105cells/ml的细胞悬液，100μl/孔铺至细胞培养板，培养16～24h；
(2)倍比稀释重组特立帕肽参考品和供试品，所述重组特立帕肽参考品和供试品的起始浓度为0.5～0.7μg/ml，稀释倍数为3.5～5，共8～9个浓度梯度；
(3)将步骤(2)各浓度梯度的参考品和供试品分别以100μl/孔加入所述细胞培养板，与所述细胞孵育15～30min；
(4)孵育完成后，弃上清，用预冷的PBS清洗细胞；
(5)裂解细胞，检测cAMP含量，计算生物学活性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述细胞悬液为2.0×105～3.0×105cells/ml，优选2.0×105cells/ml。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为3.5，共9个浓度梯度；或所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为4，共8个浓度梯度；或所述起始浓度为0.7μg/ml，稀释倍数为5，共8个浓度梯度。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述裂解细胞包括以150μl/孔加入细胞裂解液，冻融一次；优选地，所述细胞裂解液包含5mM Tris，1％SDS，所述Tris的pH为7.5。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述细胞的汇合度控制在80％～90％之间，所述细胞悬液的细胞活率≥90％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，用样品稀释液倍比稀释所述重组特立帕肽参考品和供试品，所述样品稀释液包含磷酸盐缓冲液(PBS)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，所述IBMX浓度为1mmol/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述孵育为15min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测cAMP含量包括通过竞争ELISA法检测cAMP含量；优选地，所述竞争ELISA法检测cAMP含量包括在酶标板上包被cAMP抗体，加入细胞裂解物，再加入带辣根过氧化物酶HRP标记的cAMP，显色然后终止，测定450nm处的OD值。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述计算生物学活性包括以供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数为X轴，以其对应的OD值为Y轴，拟合四参数方程曲线，计算半效稀释倍数(X0/EC50)；
所述四参数方程曲线如下：
y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/X0)^p)
x：供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数；
y：OD值；
A1：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最小值；
A2：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最大值；
p：四参数曲线的斜率；
X0(EC50)：半效稀释倍数；
供试品的相对生物学活性＝供试品EC50/标准品EC50×100％。
10.权利要求1-9任一项所述重组特立帕肽生物学活性的检测方法在重组特立帕肽药物生产工艺的质量控制中的应用。
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| CN202311844442.XA CN118667915A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 一种重组特立帕肽生物学活性测定方法 |
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