RU2810503C1 - Тест-система и способы определения биологической активности агонистов рецептора тромбопоэтина человека - Google Patents
Тест-система и способы определения биологической активности агонистов рецептора тромбопоэтина человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810503C1 RU2810503C1 RU2023103087A RU2023103087A RU2810503C1 RU 2810503 C1 RU2810503 C1 RU 2810503C1 RU 2023103087 A RU2023103087 A RU 2023103087A RU 2023103087 A RU2023103087 A RU 2023103087A RU 2810503 C1 RU2810503 C1 RU 2810503C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thrombopoietin receptor
- human thrombopoietin
- artificial
- romiplostim
- test system
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 11
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 title description 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 title description 3
- 101000799466 Homo sapiens Thrombopoietin receptor Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000054764 human MPL Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 229940127323 Thrombopoietin Receptor Agonists Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 108010017584 romiplostim Proteins 0.000 claims description 45
- 229960004262 romiplostim Drugs 0.000 claims description 42
- WUWDLXZGHZSWQZ-WQLSENKSSA-N semaxanib Chemical group N1C(C)=CC(C)=C1\C=C/1C2=CC=CC=C2NC\1=O WUWDLXZGHZSWQZ-WQLSENKSSA-N 0.000 claims description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 229940126460 thrombopoietin receptor agonist Drugs 0.000 claims description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 7
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 1
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 14
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 102100034196 Thrombopoietin receptor Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000028622 Immune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 3
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 3
- 101710148535 Thrombopoietin receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 3
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 201000003067 thrombocytopenia due to platelet alloimmunization Diseases 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 102000005763 Thrombopoietin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010070774 Thrombopoietin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003734 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Methods 0.000 description 1
- 206010014080 Ecchymosis Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018276 Gingival bleeding Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000617830 Homo sapiens Sterol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010027514 Metrorrhagia Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101150115192 OLIG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000697584 Streptomyces lavendulae Streptothricin acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000032851 Subarachnoid Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000012827 T-B+ severe combined immunodeficiency due to gamma chain deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000023940 X-Linked Combined Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 229960001069 eltrombopag Drugs 0.000 description 1
- XDXWLKQMMKQXPV-QYQHSDTDSA-N eltrombopag Chemical compound CC1=NN(C=2C=C(C)C(C)=CC=2)C(=O)\C1=N/NC(C=1O)=CC=CC=1C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 XDXWLKQMMKQXPV-QYQHSDTDSA-N 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000007106 menorrhagia Diseases 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000011309 nasal bleeding Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 206010034754 petechiae Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000035921 thrombopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека, включающая клетки линии 32D clone 3 трансформированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий рецептор тромбопоэтина. Технический результат заключается в возможности использования данной тест-системы для определения биологической активности и иммуногенности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека при разработке новых лекарственных препаратов. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к тест-системе для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), или первичная иммунная тромбоцитопения - это заболевание, представляющее собой изолированную иммуноопосредованную тромбоцитопению с количеством тромбоцитов в периферической крови менее 100×109 /л, возникающую и/или сохраняющуюся без каких-либо явных причин, с геморрагическим синдромом различной степени выраженности или без него (STASI R. et al., Idiopathic thrombocytopenic purpura: current concepts in pathophysiology and management, Thrombosis and haemostasis, 2008, V. 99, N. 01, p.4-13).
Наиболее частыми клиническими проявлениями заболевания являются спонтанный или посттравматический кожный геморрагический синдром, петехии и экхимозы на слизистых, носовые и десневые кровотечения, мено- и метроррагии, реже кровотечения из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и гематурия. Частота жизнеугрожающих событий, таких как субарахноидальные кровоизлияния, как правило, не превышает 0,5% (КОВАЛЕВА Л. Г. и др., Клинико-статистические данные и оценка различных методов терапии идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, Терапевтический архив, 2011, V. 83, N. 4, с.60-65). Как и другие нарушения свертываемости крови, ИТП характеризуется значительной потерей трудоспособности, ухудшением качества жизни, повышенным риском смертности, а также частыми госпитализациями, что образует экономическое бремя для пациентов, систем здравоохранения и общества.
Основная цель терапии ИТП - купирование геморрагического синдрома путем нормализации или повышения тромбоцитов до безопасного уровня, обеспечивающего нормальное существование пациента без спонтанной кровоточивости и без снижения качества жизни; таким уровнем считается количество тромбоцитов от 50,0×109 /л и выше (STASI R. et al., 2008).
В настоящее время на территории Российской Федерации зарегистрировано всего 2 препарата, относящихся к этой группе - Энплейт (Nplate, AMGEN EUROPE, B.V.) и Револейд (Revolade, NOVARTIS PHARMA, AG). Действующее вещество препарата Энплейт - ромиплостим - было многократно проверено на эффективность и показало свою терапевтическую активность при лечении идиопатической тромбоцитопенической пурпуры. Это позволило пациентам получать современную терапию, улучшающую качество жизни (KUTER D. J. et al., Romiplostim in adult patients with newly diagnosed or persistent immune thrombocytopenia (ITP) for up to 1 year and in those with chronic ITP for more than 1 year: a subgroup analysis of integrated data from completed romiplostim studies, British journal of haematology, 2019, V. 185, N. 3, p.503-513).
Ромиплостим представляет собой белковую конструкцию, содержащую четыре связывающих TPO-R (тромбопоэтиновый рецептор, MPL) домена TPO с высокой аффинностью к TPO-R и один Fc-домен IgG1 (BUSSEL J. B. et al., A review of romiplostim mechanism of action and clinical applicability, Drug Design, Development and Therapy, 2021, p.2243-2268). Ромиплостим связывается и активирует TPO-R на предшественниках мегакариоцитов в костном мозге. Он связывается так же, как эндогенный ТРО, и может вытеснять ТРО из связи с рецептором. Ромиплостим, аналогично TPO, активирует многие из тех же путей, что приводит к устойчивому повышению количества тромбоцитов (BUSSEL J. B. et al., 2021).
Однако этот препарат производится за пределами РФ, что повышает его стоимость для потребителя, а при создании биоаналога используются более новые технологии, что в конечном счёте влияет на стоимость их производства (WOLFF-HOLZ E. et al., Evolution of the EU biosimilar framework: past and future, BioDrugs, 2019, V. 33, N. 6, p.621-634). Поскольку при ИТП приём стимуляторов тромбопоэза требуется постоянно (СУНЦОВА Е. В. и др., Применение ромиплостима при впервые выявленной иммунной тромбоцитопении у детей, Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2020, V. 19, N. 1, с.18-26), их наличие и экономическая доступность являются жизненно важными для пациентов. Создание биоаналога ромиплостима позволит повысить доступность лечения на территории РФ.
При этом, при создании биоаналогов или улучшении известных терапевтических средств важным элементом являются способы определения их биологической активности in vitro, позволяющие отбирать наиболее эффективные варианты на ранних этапах разработки.
Следовательно, разработка новых методов определения биологической активности in vitro потенциальных терапевтических средств поможет оптимизировать процесс разработки биоаналогов ромиплостима, и ускорить обеспечение пациентов с ИТП современной терапией.
Важное условие создания современных клеточных тест-систем - выбор клеток, которые способны синтезировать молекулы, специфичные для клинических проявлений заболевания.
Одним из подходов для определения биологической активности in vitro ромиплостима или его биоаналогов может быть использование клеток млекопитающих, экспрессирующих экзогенный hTPOR.
На сегодняшний день наиболее часто используемыми системами для доставки ДНК в клетки являются методы на основе вирусов. Аденовирусные и лентивирусные векторные системы, вероятно, являются наиболее эффективными переносчиками генов, которые могут обеспечить высокую эффективность трансдукции, интеграцию в геном клетки-хозяина и высокий уровень экспрессии генов (BLESCH A., Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, Methods, 2004, V. 33, N. 2, p.164-172).
Однако использование вирусных векторных систем осложняется различными негативными эффектами, в том числе внутриклеточным переносом, потенциальными мутациями и генетическими изменениями из-за интеграции (HACEIN-BEY-ABINA S. et al., A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency, New England journal of medicine, 2003, V. 348, N. 3, p. 255-256; LI Z. et al., Murine leukemia induced by retroviral gene marking, Science, 2002, V. 296, N. 5567, p.497-497), что может препятствовать использованию модифицированных клеток в тест-системах для разработки терапевтических средств.
Для предотвращения проявления подобных нежелательных эффектов были разработаны невирусные методы трансфекции. Обычно используемые невирусные системы трансфекции, включая реагенты для липофекции/полифекции, микроинъекцию, генную пушку и электропорацию, гораздо менее эффективны по сравнению с вирусной трансдукцией и часто вызывают высокую смертность клеток из-за токсичности. Нуклеофекция - метод невирусной трансфекции, специально разработанный для первичных клеток и клеточных линий, трудно поддающихся трансфекции. Нуклеофекция объединяет электрические параметры и решения клеточного типа для доставки плазмидной ДНК, олигонуклеотидов, а также миРНК непосредственно в ядро клетки. Следовательно, такая трансфекция клеток не зависит от клеточного деления, и высокая эффективность трансфекции может быть достигнута в свежих или иммортализованных первичных клетках (GRESCH O. et al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, Methods, 2004, V. 33, N. 2, p.151-163).
Эта технология была успешно применена для трансфекции NK- и моноцитарных клеточных линий, первичным миобластам, а также к эмбриональным и нейральным стволовым клеткам (QUENNEVILLE S. P. et al., Nucleofection of muscle-derived stem cells and myoblasts with ϕC31 integrase: stable expression of a full-length-dystrophin fusion gene by human myoblasts, Molecular Therapy, 2004, V. 10, N. 4, p.679-687; BALASUBRAMANIYAN V. et al., Transient expression of Olig1 initiates the differentiation of neural stem cells into oligodendrocyte progenitor cells, Stem Cells, 2004, V. 22, N. 6, p.878-882; LAKSHMIPATHY U. et al., Efficient transfection of embryonic and adult stem cells, Stem cells, 2004, V. 22, N. 4, p.531-543).
Таким образом, клетки, трансфецированные плазмидной ДНК, обеспечивающей экспрессию рецептора тромбопоэтина человека, посредством нуклеофекции, могут быть использованы в тест-системе для определения биологической активности новых искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека и при проведении исследований их иммуногенности.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все термины и сокращения, используемые в настоящей заявке, употребляются в том же значении, как это принято в данной области техники, и понятны специалистам.
Настоящее изобретение относится к тест-системе для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека.
Термины «белок», «пептид» и «полипептид» использованы взаимозаменяемо.
Для целей настоящего изобретения, термин «искусственный агонист» подразумевает молекулу небелковой или белковой природы, в том числе, но не ограничиваясь, химическое соединение, сконструированный пептид, полипептид, белок, антитело или его фрагмент, конъюгат, белковую конструкцию, а также природный агонист рецептора, полученный рекомбинантным путем или методами химического синтеза, в том числе методами твердофазного синтеза, и др.
Термин «биологическая активность искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека» в настоящем описании означает биологические свойства, характерные для агонистов рецептора тромбопоэтина человека, а именно специфичное связывание с рецепторами тромбопоэтина человека, что приводит к активации JAK/STAT-сигнального пути и устойчивому повышению количества тромбоцитов (см., например, BUSSEL J. B. et al., 2021).
Применение термина «содержат», «содержащие», «содержит», «включает», «включающий» или «включают» на протяжении всего текста и формулы изобретения данной заявки подразумевает включение приведенного числа или стадии или группы чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого числа или стадии или стадии или группы чисел или стадий.
Термин «вектор», использованный в данном описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью репродуцировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Термин включает в себя вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, в том числе «клонирующий вектор», а также вектор, встроенный в геном клетки хозяина, в которую он введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном описании «экспрессирующими векторами».
Термины «клетка-хозяин», «линия клеток хозяина» и «культура клеток хозяина» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки хозяина включают «трансформанты» и «трансфицированные клетки», которые включают первичную трансфицированную клетку и ее потомство безотносительно числа пересевов. Потомство может быть не полностью идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может содержать мутации. Мутантное потомство, которое обладает той же функцией или биологической активностью, по которой проводят скрининг или отбирают первоначально трансфицированную клетку, включено в данное изобретение.
Термин «приведение в контакт», используемый в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, означает приведение клеток и соответствующих антител в физическую близость с обеспечением физического и/или химического взаимодействия. Подходящие условия, обеспечивающие специфическое взаимодействие, хорошо известны специалистам в данной области техники. Очевидно, указанные условия будут зависеть от антител и клеток, применяемых в способе согласно настоящему изобретению, и могут быть модифицированы обычным способом специалистом в данной области техники. Более того, время, достаточное для обеспечения взаимодействия, также может быть сразу определено квалифицированным специалистом.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к тест-системе для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека.
В одном из воплощений настоящего изобретения, тест-система включает в себя клетку, экспрессирующую рекомбинантный человеческий рецептор тромбопоэтина с SEQ ID NO:1 (hTPOR).
В одном из воплощений настоящего изобретения hTPOR-экспрессирующие клетки представляют собой клетки мыши (Mus musculus).
В одном из воплощений настоящего изобретения hTPOR-экспрессирующие клетки представляют собой клетки линии 32D clone 3.
В одном из воплощений настоящего изобретения, экспрессия hTPOR в клетках тест-системы достигается путем нуклеофекции клеток-хозяев вектором, обеспечивающим экспрессию hTPOR.
Специалистам в данной области известно множество методик осуществления нуклеофекици клеток млекопитающих (см., например, CHICAYBAM L. et al., An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells, Frontiers in bioengineering and biotechnology, 2017, V. 4, p.99). Для целей настоящего изобретения могут быть использованы такие системы для нуклеофекции как Amaxa или иные.
Настоящее изобретение также относится к способу определения биологической активности in vitro искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека
Биологическая активность, в соответствии с настоящим описанием, может быть исследована различными, хорошо известными способами, включая, например, эксперименты по конкурентному связыванию с hTPOR или вестерн-блоттинг.
В одном из воплощений настоящего изобретения специфическое связывание с hTPOR может быть обнаружено на основании пролиферации hTPOR-экспрессирующих клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу определения антител к искусственным агонистам рецептора тромбопоэтина человека в плазме крови человека.
В одном из воплощений настоящего изобретения специфическое связывание с hTPOR может быть обнаружено по отсутствию пролиферации hTPOR-экспрессирующих клеток в присутствии антител к искусственным агонистам рецептора тромбопоэтина человека.
Специалисту в данной области также хорошо известны множество методик анализа жизнеспособности и пролиферации клеток, в том числе посредством люменисцентного теста - путем измерения уровня люминесценции клеток при добавлении люменисцентного сигнала, каждая из которых может быть использована в предложенном изобретении. Для целей настоящего изобретения могут быть использованы такие системы определения жизнеспособности клеток как CellTiter-Glo или иные (см., например, АФАНАСЬЕВА А. Н. и др., Выбор оптимального метода детекции жизнеспособности клеточных культур для тестов на пролиферативную активность и цитотоксичность, Лабораторные животные для научных исследований, 2021, N. 2, с.16-24).
В предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретения относится к тест-системе для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека, включающей клетки линии 32D clone 3 трансфецированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий рецептор тромбопоэтина (SEQ ID NO:1) посредством нуклеофекции.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления, настоящее изобретения относится к способу определения биологической активности in vitro искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека, включающему:
a) Приведение вышеуказанной тест-системы в контакт с искусственным агонистом рецептора тромбопоэтина человека;
b) анализ пролиферации клеток посредством люменисцентного теста.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления, настоящее изобретения относится к способу определения антител к искусственным агонистам рецептора тромбопоэтина человека в плазме крови человека, включающему:
a) приведение тест-системы по п.1 в контакт с искусственным агонистом рецептора тромбопоэтина человека;
b) анализ пролиферации клеток посредством люменисцентного теста.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой белок.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой ромиплостим.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Зависимость уровня пролиферации hTPOR-экспрессирующих клеток линии 32D clone 3 от концентрации ромиплостима, данные представлены в виде Mean RLU ± SD.
Фигура 2. Специфичность ответа hTPOR-экспрессирующих клеток линии 32D clone 3. На графике представлена зависимость уровня пролиферации hTPOR-экспрессирующих клеток от концентрации исследуемого объекта, данные представлены в виде Mean ± SD.
Фигура 3. График зависимости RLU от концентрации rNABs с константной концентрацией ромиплостима 1 нг/мл.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. Получение hTPOR-экспрессирующих клеток.
Для получения hTPOR-экспрессирующих клеток были использованы клетки линии лимфобластов мыши (Mus musculus) 32D clone3 (ATCC; кат. CRL-11346), которые были трансфецированны вектором, содержащим мРНК, кодирующую полную последовательность человеческого рецептора тромбопоэтина (SEQ ID NO:1) и клонированную в сайты KpnI и XbaI вектора pCMV3 (Sino Biological; кат. HG10443-UT). Доставка вектора в ядро была произведена методом нуклеофекции на приборе Nucleofector 2b Device с помощью набора реагентов Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V (Lonza VCA-1003). Каждая тестовая пробирка для нуклеофекции содержала 1×106 клеток, 2 мкг вектора экспрессии hTPO-R и 100 мкл раствора Cell Line Nucleofector Solution V.
После нуклеофекции клетки инкубировались в СО2-инкубаторе при температуре 37°C, в атмосфере 5% CO2. После 48 часов к клеткам был добавлен селективный антибиотик гигромицин B. Селекция проводилась на шестой день в присутствии 0,6 мг/мл гигромицина, селективную среду заменяли каждые 48 часов.
Пример 2. Определение биологической активности ромиплостима.
Для подтверждения возможности использования предложенной тест-системы для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека в качестве агониста hTPOR использовался ромиплостим, биологическая активность и терапевтическая эффективность которого широко известна из уровня техники.
Культивирование hTPOR-экспрессирующих клеток осуществляли в среде RPMI 1640 + 2 мM L-глутамин с содержанием 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ ХЕПЕС и 1 мМ пирувата натрия (далее RPMI Basal) с добавлением 10% FBS, 5 нг/мл IL-3 и 0,3 мг/мл Гигромицин B.
Для целей определения биологической активности ромиплостима брали клетки, прошедшие логарифмическую фазу роста, но не вышедшие на плато, а также использовали среду без IL-3 и Гигромицин B, т.к. эти растворы влияют на пролиферативную активность.
Изначально готовили 10-ти кратные разбавления объекта испытания (далее ОИ) в среде RPMI Basal + 10% FBS. Для этого производили 2 независимых предразбавления до концентрации 5000 нг/мл для стандартного образца (далее СО) и внутреннего контрольного образца (далее ВКО). В качестве СО и ВКО выступала одна серия препарата Энплейт. В качестве ОИ выступала серия плацебо, содержащее раствор вспомогательных веществ препарата ромиплостим.
Затем из каждого разбавления СО, ВКО и ОИ с концентрацией 5000 нг/мл в микроцентрифужной пробирке готовили разбавления с концентрацией 100 нг/мл (данная концентрация 10-ти кратная и вносилась в лунки) по схеме 20 мкл образца + 980 мкл RPMI Basal +10% FBS с осторожным вортексированием.
Из растворов СО, ВКО и ОИ с концентрацией 100 нг/мл готовили серийные разведения в RPMI Basal+ 10% FBS до концентраций: 33; 11; 4; 2; 0,93; 0,46; 0,23; 0,08; 0,03; 0,01 нг/мл. Приготовленные 10х растворы образцов вносили в лунки планшета по 10 мкл. Затем готовили клеточную суспензию hTPOR-экспрессирующих клеток линии 32D clone3 с концентрацией 55 555 клеток/мл и вносили в лунки по 90 мкл.
На следующий день после рассева клеток добавляли реагент CellTiter-Glo в объеме, равном объему среды для культивирования клеток, присутствующему в каждой лунке. Содержимое лунок смешивали на орбитальном планшетном шейкере в течение 2 минут, чтобы вызвать лизис клеток. Инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы стабилизировать люминесцентный сигнал. Затем записывали свечение, используя gain 3000; программу Ultra Glo; время регулирования 0.1; интервал измерений 0.40; время для нормализации результатов 5.00. Непосредственно перед снятием свечения устанавливали в мультимодальном микропланшетном ридере CLARIOstar опцию шейкирования на 500 rpm в течение 30 сек. Результаты представлены на Фиг.1.
Оценивали уровень пролиферативной активности hTPOR-экспрессирующих клеток в исследуемых концентрационных точках. Для плацебо использовали разведения, идентичные разведениям ромиплостима каждой концентрации. Результаты нормализовали по шкале от 0 до 100 %, где за 0% принимался уровень пролиферации клетками без внесения исследуемых объектов, а за 100 % - максимальный уровень пролиферации в ответ на стимуляцию ромиплостимом. Графическое представление полученных данных представлено на Фигуре 2, численные значения приведены в таблице 1.
Раствор Концентрация, нг/мл |
Концентрация, нг/мл | ||||||||||
0,001 | 0,003 | 0,01 | 0,02 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 1,1 | 3,3 | 10 | |
Пролиферативная активность, % (Mean, n=8) | |||||||||||
Ромиплостим | -0,2 | 0,1 | 2,3 | 7,6 | 13,4 | 26,9 | 44,1 | 70,6 | 91,9 | 101,5 | 102,1 |
Плацебо | -0,62 | -1,16 | -0,43 | -0,42 | 0,02 | 0,27 | 0,02 | -0,18 | -0,11 | -0,26 | -0,58 |
Таблица 1. Пролиферативная активность hTPOR-экспрессирующих клетками линии 32D clone3 в зависимости от концентрации ромиплостима. |
Из приведенных выше данных видно, что в максимальной концентрации значение пролиферативной активности для раствора Плацебо Ромиплостим составляет -0,26% от максимального значения, а для Энплейт это 101,5%. Таким образом значения для Плацебо в 309 раз отличаются от таковых для растворов, имеющих в составе лекарственное вещество (ромиплостим).
Таким образом, ответ тест-системы hTPOR-экспрессирующих клеток линии 32D clone3 специфичен по отношению к ромиплостиму, что подтверждает возможность её использования для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека.
Пример 3. Определение антител к ромиплостиму
Ромиплостим проявляет свою активность за счет связывания с тромбопоэтиновым рецептором, которое ведет к активации MAPK каскада и активной пролиферации клеток с накоплением АТФ. Как было показано выше, интенсивность люминесцентного сигнала при анализе пропорциональна функциональной активности ромиплостима в исследуемом образце. В присутствии нейтрализующих антител к ромиплостиму (rNABs) количество свободного ромиплостима снижается, приводя к снижению пролиферации и концентрации АТФ. Таким образом, интенсивность люминесценции обратно пропорциональна количеству нейтрализующих антител в исследуемом образце.
Рассев клеток, внесение ромиплостима и rNABs проводили в один день. Готовили раствор препарата ромиплостим с концентрацией 1 нг/мл в среде RPMI Basal + 10% FBS, раствор вносили в лунки 96- луночного планшета в объеме 10 мкл. Затем из стокового раствора rNABs с концентрацией 2 160 мкг/мл готовили серийные разведения в RPMI Basal + 10% FBS или пулированной плазме крови человека до концентраций: 50 000, 25 000, 12 500, 5 000, 2 500, 1 000, 500, 250, 100, 10 нг/мл - данные концентрации 10-кратные вносилась в лунки в объеме 10 мкл для получения калибровочной кривой. Тестовые образцы плазмы предварительно разводили в 4 раза средой RPMI Basal.
Планшеты с раствором ромиплостим + rNABs инкубировали в течение 1 часа на шейкере при 37°С, 200 об/мин.
По завершении инкубации, вносили в лунки по 80 мкл с уже добавленным раствором ромиплостима и нейтрализующих антител к ромиплостиму в раститровке концентраций и снимали хемилюминесценцию с помощью набора CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, G7571).
Результаты приведены в Таблице 2 (CV - коэффициент вариации, Mean - среднее арифметическое, RLU - относительная единица люминесценции).
Концентрация
rNABs, нг/мл |
RLU | Mean, ОП | CV% | ||
1 | 162225 | 169187 | 162600 | 164671 | 2% |
10 | 155937 | 159737 | 165950 | 160541 | 3% |
25 | 155737 | 154575 | 153800 | 154704 | 1% |
50 | 122250 | 138112 | 132737 | 131033 | 6% |
100 | 72150 | 81537 | 81087 | 78258 | 7% |
250 | 33987 | 36200 | 40662 | 36950 | 9% |
500 | 23812 | 24662 | 26837 | 25104 | 6% |
1250 | 22462 | 21687 | 23962 | 22704 | 5% |
2500 | 22137 | 21712 | 23312 | 22387 | 4% |
5000 | 20850 | 22762 | 22450 | 22021 | 5% |
Таблица 2. Пролиферативная активность hTPOR-экспрессирующих клетками линии 32D clone3 в зависимости от концентрации нейтрализующих антител к ромиплостиму. |
Для метода определения концентрации нейтрализующих антител к ромиплостиму в плазме крови человека определена нелинейная зависимость на всем диапазоне концентраций rNABs от 1 до 5000 нг/мл. Полученные данные моделируются функцией, являющейся нелинейной комбинацией параметров модели и зависящей от одной и более независимых переменных. Линейный диапазон методики от 25 до 1250 нг/мл.
С помощью метода наименьших квадратов была выбрана 4-х параметрическая кривая как функция, наиболее близко описывающая зависимость результатов теста от концентрации антител. На Фигуре 3 представлены результаты в виде графика зависимости RLU от концентрации rNABs с константной концентрацией ромиплостима 1 нг/мл, приведен коэффициент детерминации.
Таким образом, предложенная методика является линейной, специфичной, высокопрецизионной, правильной и селективной методикой определения нейтрализующих антител к ромиплостиму в плазме крови человека, что подтверждает возможность её использования для определения нейтрализующих антител к искусственным агонистам рецептора тромбопоэтина человека в образцах плазмы крови человека при проведении клинических исследований иммуногенности.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Тест-система и
способы определения биологической активности агонистов рецептора
тромбопоэтина человека.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-01-19">
<ApplicantFileReference>0000001</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">ООО
"ГЕРОФАРМ"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>OOO "GEROPHARM"</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система и способы определения
биологической активности агонистов рецептора тромбопоэтина
человека</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1908</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1908</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgccctcctgggccctcttcatggtcacctcctgcctcctcctggccc
ctcaaaacctggcccaagtcagcagccaagatgtctccttgctggcatcagactcagagcccctgaagtg
tttctcccgaacatttgaggacctcacttgcttctgggatgaggaagaggcagcgcccagtgggacatac
cagctgctgtatgcctacccgcgggagaagccccgtgcttgccccctgagttcccagagcatgccccact
ttggaacccgatacgtgtgccagtttccagaccaggaggaagtgcgtctcttctttccgctgcacctctg
ggtgaagaatgtgttcctaaaccagactcggactcagcgagtcctctttgtggacagtgtaggcctgccg
gctccccccagtatcatcaaggccatgggtgggagccagccaggggaacttcagatcagctgggaggagc
cagctccagaaatcagtgatttcctgaggtacgaactccgctatggccccagagatcccaagaactccac
tggtcccacggtcatacagctgattgccacagaaacctgctgccctgctctgcagaggcctcactcagcc
tctgctctggaccagtctccatgtgctcagcccacaatgccctggcaagatggaccaaagcagacctccc
caagtagagaagcttcagctctgacagcagagggtggaagctgcctcatctcaggactccagcctggcaa
ctcctactggctgcagctgcgcagcgaacctgatgggatctccctcggtggctcctggggatcctggtcc
ctccctgtgactgtggacctgcctggagatgcagtggcacttggactgcaatgctttaccttggacctga
agaatgttacctgtcaatggcagcaacaggaccatgctagctcccaaggcttcttctaccacagcagggc
acggtgctgccccagagacaggtaccccatctgggagaactgcgaagaggaagagaaaacaaatccagga
ctacagaccccacagttctctcgctgccacttcaagtcacgaaatgacagcattattcacatccttgtgg
aggtgaccacagccccgggtactgttcacagctacctgggctcccctttctggatccaccaggctgtgcg
cctccccaccccaaacttgcactggagggagatctccagtgggcatctggaattggagtggcagcaccca
tcgtcctgggcagcccaagagacctgttatcaactccgatacacaggagaaggccatcaggactggaagg
tgctggagccgcctctcggggcccgaggagggaccctggagctgcgcccgcgatctcgctaccgtttaca
gctgcgcgccaggctcaacggccccacctaccaaggtccctggagctcgtggtcggacccaactagggtg
gagaccgccaccgagaccgcctggatctccttggtgaccgctctgcatctagtgctgggcctcagcgccg
tcctgggcctgctgctgctgaggtggcagtttcctgcacactacaggagactgaggcatgccctgtggcc
ctcacttccagacctgcaccgggtcctaggccagtaccttagggacactgcagccctgagcccgcccaag
gccacagtctcagatacctgtgaagaagtggaacccagcctccttgaaatcctccccaagtcctcagaga
ggactcctttgcccctgtgttcctcccaggcccagatggactaccgaagattgcagccttcttgcctggg
gaccatgcccctgtctgtgtgcccacccatggctgagtcagggtcctgctgtaccacccacattgccaac
cattcctacctaccactaagctattggcagcagccttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (13)
1. Тест-система для определения биологической активности искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека, включающая клетки линии 32D clone 3 трансфецированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий рецептор тромбопоэтина с SEQ ID NO:1.
2. Тест-система по п.1, где искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой белок.
3. Тест-система по п.1, где искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой ромиплостим.
4. Способ определения биологической активности in vitro искусственных агонистов рецептора тромбопоэтина человека, включающий:
a) приведение тест-системы по п.1 в контакт с искусственным агонистом рецептора тромбопоэтина человека;
b) анализ пролиферации клеток посредством люменисцентного теста.
5. Способ по п.4, где искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой белок.
6. Способ по п.4, где искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой ромиплостим.
7. Способ определения антител к искусственным агонистам рецептора тромбопоэтина человека в плазме крови человека, включающий:
a) приведение тест-системы по п.1 в контакт с искусственным агонистом рецептора тромбопоэтина человека и образцом плазмы;
b) анализ пролиферации клеток посредством люменисцентного теста.
8. Способ по п.7, где искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой белок.
9. Способ по п.7, где искусственный агонист рецептора тромбопоэтина человека представляет собой ромиплостим.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2810503C1 true RU2810503C1 (ru) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1134539C (zh) * | 1994-01-03 | 2004-01-14 | 基因技术股份有限公司 | 血小板生成素 |
WO2010099019A1 (en) * | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies containing therapeutic tpo/epo mimetic peptides |
RU2703458C1 (ru) * | 2018-07-13 | 2019-10-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) | Способ лечения иммунной тромбоцитопении |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1134539C (zh) * | 1994-01-03 | 2004-01-14 | 基因技术股份有限公司 | 血小板生成素 |
WO2010099019A1 (en) * | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies containing therapeutic tpo/epo mimetic peptides |
RU2703458C1 (ru) * | 2018-07-13 | 2019-10-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) | Способ лечения иммунной тромбоцитопении |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Зотова И.И., Грицаев С.В., Шилова Е.Р., Потихонова Е.А., Адбулкадыров К.М., Чечеткин А.В. Агонисты рецептора тромбопоэтина в лечении первичной иммунной тромбоцитопении: эффективность и безопасность в повседневной клинической практике одного медицинского центра // Вестник гематологии. 2015. N. 4. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Seabright et al. | AMPK activation induces mitophagy and promotes mitochondrial fission while activating TBK1 in a PINK1‐Parkin independent manner | |
O'Hayre et al. | Inactivating mutations in GNA13 and RHOA in Burkitt’s lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma: a tumor suppressor function for the Gα13/RhoA axis in B cells | |
Li et al. | Follistatin-like 1 suppresses sensory afferent transmission by activating Na+, K+-ATPase | |
Zani et al. | Interferon-induced transmembrane proteins inhibit cell fusion mediated by trophoblast syncytins | |
Miao et al. | Suppressor of cytokine signaling-3 suppresses the ability of activated signal transducer and activator of transcription-3 to stimulate neurite growth in rat primary sensory neurons | |
Teglund et al. | Stat5a and Stat5b proteins have essential and nonessential, or redundant, roles in cytokine responses | |
Stove et al. | Human immunodeficiency virus Nef induces rapid internalization of the T-cell coreceptor CD8αβ | |
Pan et al. | Cyclophilin A is required for CXCR4-mediated nuclear export of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2, activation and nuclear translocation of ERK1/2, and chemotactic cell migration | |
Toney et al. | BCL-6 regulates chemokine gene transcription in macrophages | |
Haeckel et al. | The actin-binding protein Abp1 controls dendritic spine morphology and is important for spine head and synapse formation | |
Carneiro et al. | The multiple LIM domain-containing adaptor protein Hic-5 synaptically colocalizes and interacts with the dopamine transporter | |
Richter et al. | The EphA4 receptor regulates neuronal morphology through SPAR-mediated inactivation of Rap GTPases | |
Chen et al. | Progranulin associates with hexosaminidase A and ameliorates GM2 ganglioside accumulation and lysosomal storage in Tay-Sachs disease | |
Gaffen et al. | Distinct tyrosine residues within the interleukin-2 receptor β chain drive signal transduction specificity, redundancy, and diversity | |
Nguyen et al. | SIDT1 localizes to endolysosomes and mediates double-stranded RNA transport into the cytoplasm | |
Kadri et al. | Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt induced by erythropoietin renders the erythroid differentiation factor GATA-1 competent for TIMP-1 gene transactivation | |
Kannan et al. | The Abl pathway bifurcates to balance Enabled and Rac signaling in axon patterning in Drosophila | |
Kikuchi et al. | Map7/7D1 and Dvl form a feedback loop that facilitates microtubule remodeling and Wnt5a signaling | |
CN101773668A (zh) | 一种抗病毒相关蛋白及其用途 | |
US7691582B2 (en) | Methods of secretory vimentin detection and modulation | |
JP2005501548A5 (ru) | ||
RU2810503C1 (ru) | Тест-система и способы определения биологической активности агонистов рецептора тромбопоэтина человека | |
TW200539864A (en) | Oxydecahydronaphthalene modulators of HM74 | |
Chang et al. | Ephexin1 is required for Eph-mediated limb trajectory of spinal motor axons | |
Hao et al. | The LIM/homeodomain protein Islet1 recruits Janus tyrosine kinases and signal transducer and activator of transcription 3 and stimulates their activities |