CN112230000B - 一种检验pcv2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法 - Google Patents

一种检验pcv2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物用生物制品检验技术领域，具体涉及一种基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法。本发明所述基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法，使用表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组杆状病毒（DBN01株），感染Sf9细胞后制备抗原及灭活参考疫苗，通过将待检疫苗与参考疫苗进行双抗夹心ELISA抗原检测即体外相对效力ELISA检测。本发明所述检测方法，操作简单、耗时短，具有良好的灵敏性和特异性，检测结果稳定性、特异性和重复性好，是一种方便、快捷、特异、灵敏符合发展趋势的效力测定方法。

Description

一种检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法
技术领域
本发明属于动物用生物制品检验技术领域，具体涉及一种基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法。
背景技术
猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2，PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。其中，猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征等相关疾病的首要致病因子，给养猪业造成巨大的经济损失。
目前，市场上有多家国内外疫苗公司均在生产和销售猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗。目前，传统的检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗体外相对效力的方法为攻毒保护试验，即猪只免疫疫苗后通过强毒攻击，通过与对照组相比，以确定疫苗的保护效力。此方法虽然可以直观的评价疫苗的保护体外效力，但是却存在动物试验历时时间长，而且试验进行期间需要进行攻毒，存在生物安全风险，并且会因动物的种属、窝别、年龄、体重、性别、健康状况、饲养环境及饲料营养等诸多因素，直接影响到检测结果的准确性及可靠性，不可避免地影响到检测的重复性；以及试验成本较高，效力检验使用动物、操作人员、攻毒菌液制备、饲养环境等条件导致攻毒保护试验批间差异较大的缺陷。更重要的是，此方法检测及出结果周期长达3个月之久，不仅延长了新疫苗的研发周期也间接缩短了疫苗的有效期，增加了疫苗库存压力，导致严重影响了疫苗的生产及销售。因此，开发新的对猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗效力检测的方法，使之满足快速、灵敏、重复性好的要求，将有利于提高检测结果的可靠性，进一步保证产品质量，具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法，该检测方法操作简单，特异性好，敏感性高，耗时短。以取代传统的猪体内效力动物试验，解决受试动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达3个月的不利因素，同时也可以减少生产线疫苗库存量多，延长疫苗的有效期，保证疫苗的品质，降低检定成本及劳动强度，提高检测效率，两天完成疫苗的体外相对效力全部试验及数据整理和判定结果，可实现高通量疫苗效力检测；
本发明所要解决的第二个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的参考疫苗制备方法及长期稳定保存的条件；
本发明所要解决的第三个问题在于提供建立以上所述的检测方法的检测一抗（抗猪圆环病毒2型多克隆抗体）、阳性对照和阴性对照的制备方法；
本发明所要解决的第四个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的待检疫苗和参考疫苗稀释方法；
本发明所要解决的第五个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的全程孵育时间的确定方法；
本发明所要解决的第六个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的全程稀释液的确定方法；
本发明所要解决的第七个问题在于提供用于建立以上所述检测方法的检测结果的计算和分析方法；
本发明所要解决的第八个问题在于提供用于建立以上所述检测方法在制备猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗中的用途。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，包括如下步骤：
（1）分别制备待测的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）和经验证的参考疫苗，备用；
（2）将抗猪圆环病毒2型单克隆抗体用包被液进行稀释，加至酶标板中进行包被处理，结束后洗板，并加入封闭液进行恒温培养箱孵育，洗板后备用；
（3）将参考疫苗、待检疫苗以及经倍比稀释的参考疫苗和待检疫苗分别加入上述处理后的酶标板不同的孔中，并在另外的空白孔中分别加入标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，置恒温培养箱孵育，洗板后备用；
（4）继续向上述酶标板各孔中加入检测一抗，置恒温培养箱孵育，洗板后继续加入用HRP标记的酶标检测二抗，置恒温培养箱孵育；洗板后加入显色液，恒温避光孵育后，加入终止液以终止反应；
（5）将各孔反应液于450nm条件下测定其OD值，并将经过计算后的OD450nm值输入RelPot4.0软件计算RP值，计算抗原含量之间的数值关系值以及数值关系图，以判断疫苗的体外相对效力是否合格。
具体的，所述步骤（1）中，所述参考疫苗为经检验合格的攻毒试验最小保护量抗原的疫苗。
具体的，所述步骤（2）中，控制所述抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的稀释浓度为5±2μg/ml，控制加液量为100ul/孔，控制所述包被处理步骤的温度为4℃包被16-18小时；
控制所述封闭液的加液量为100μL/孔，于37±2℃恒温培养1-2小时。
具体的，所述步骤（3）中，所述待检疫苗和所述参考疫苗的加液量为300μl/孔。
具体的，所述步骤（3）中，所述待检疫苗和所述参考疫苗的倍比稀释梯度为1：50、1：100、1：200、1：400、1:800、1：1600、1：3200、1：6400的2倍系列倍比稀释所得。
具体的，所述步骤（4）中：
所述检测一抗为PBST稀释的抗猪圆环病毒2型多克隆抗体，加液量为100ul/孔；
所述检测二抗为含5%牛血清白蛋白的PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗，加液量为100ul/孔。
具体的，所述步骤（4）中：
所述显色液包括TMB底物，加液量为100ul/孔；
所述终止液包括0.05mol/L的浓硫酸，加液量为100ul/孔。
具体的，所述步骤（5）中，试验有效性判定包括：标准阴性对照OD450nm值<0.3，标准阳性对照OD450nm值为0.8-2.0，空白对照≤0.1，如果上述标准中有一条不符合，试验无效。
具体的，所述步骤（5）中，所述疫苗合格的判定标准为：
A：符合试验有效标准；
B：设定参考疫苗RP值为1.0，待检疫苗RP值应≥1.0，待检疫苗相对效力合格；
C：如待检疫苗RP值＜1.0，应重检1次；重检结果的RP值≥1.0，判待检疫苗相对效力合格；否则判待检疫苗相对效力不合格。
本发明还公开了所述方法在检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力领域的应用。
本发明所述基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法，使用表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组杆状病毒（DBN01株），感染Sf9细胞后制备抗原及灭活参考疫苗，通过将待检疫苗与参考疫苗进行双抗夹心ELISA抗原检测即体外相对效力ELISA检测。本发明所述检测方法，操作简单、耗时短，具有良好的灵敏性和特异性，检测结果稳定性、特异性和重复性好，是一种方便、快捷、特异、灵敏符合发展趋势的效力测定方法。
本发明所述基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法，具有良好的灵敏性和特异性，可以检测抗原含量区间为2ug/ml～2000ug/ml，并实现高通量检测，完全可以满足疫苗生产的体外效力检测技术需要，且与常见的几种猪病毒PCV1、PPV、PRV、TGEV、PEDV、CSFV和PRRSV均无交叉反应。本发明所述检测方法，只需约7小时即可完成疫苗相对效力检测，有效减少了疫苗库存量且延长了疫苗的有效期，降低了疫苗生产的成本和动物试验劳动强度，尤其在疫苗紧张时可增加生产疫苗量，可创造更多的产值。本发明所述方法可以对疫苗相对效力进行全程监测，克服因使用试验动物所带来的影响因素多、重复性差、检定周期长达3个月的不利因素，以及试验中途动物意外死亡等各种影响因素的影响，可彻底取代传统的猪只体内疫苗相对效力检测方法，对于进一步保证疫苗质量有重要意义。
本发明所述基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法，采用双平行线生物检定原理，做出的双抗夹心ELISA方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力，待检疫苗稀释度（1：50、1：100、1：200、1：400、1:800、1：1600、1：3200、1：6400）与相对应OD450nm值的对数之间表现出良好的线性回归R2在0.99以上，经软件计算后RP值均在1.0以上且斜率（slopescore）均在0.97以上，检测结果表现出较好的特异性性及重复性，因此，是一种方便操作、快捷完成、结果可靠的检测方法，可以成为猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）生产中动物试验检测疫苗相对效力的替代方法，具有积极的推广价值。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为包被单克隆抗体与检测一抗方阵滴定，P/N值较高且R2大于0.99的结果图；
图2为检测一抗与检测二抗方阵滴定，P/N值较高且R2大于0.99的结果图；
图3为最佳封闭时间优化，P/N值较高结果图；
图4为最佳待检疫苗孵育时间优化，P/N值较高结果图；
图5为最佳检测一抗孵育时间优化，P/N值较高结果图；
图6为最佳检测二抗孵育时间优化，P/N值较高结果图；
图7为最佳显色时间优化，P/N值较高结果图；
图8为待检疫苗YH-018001体外对效力RP值图；
图9为待检疫苗YH-018001体外对效力斜率（slope score）图；
图10为待检疫苗YH-018002体外对效力RP值图；
图11为待检疫苗YH-018002体外对效力斜率（slope score）图。
具体实施方式
本发明下述实施例中，使用的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体购自INGENASA公司；涉及的PBS（磷酸盐缓冲液）、PBST（含千分之五吐温80的磷酸盐缓冲液）、封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS）、包被液、检测二抗稀释液（含5%牛血清白蛋白的PBS）、显色液、终止液均为现有技术的常规用液。
实施例1
本实施例用于制备猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）及参考疫苗（批号：CK001）。
所用猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）参考疫苗（批号：CK001）为申请人严格按现行《中国兽药典》标准生产，待检的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗DBN01株（批号：YH-018001、YH-018002）也为申请人严格按现行《中国兽药典》标准生产。
参考疫苗CK001及待检的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗DBN01株（批号：YH-018001、YH-018002）用猪圆环病毒2型ORF2基因的重组杆状病毒DBN01株，接种Sf9细胞，收获细胞培养物，经二乙烯亚胺（BEI）灭活，澄清、浓缩纯化后制备抗原，配制多个抗原浓度梯度，分别加入适宜佐剂乳化成疫苗。
参考疫苗质控
性状：淡黄色或浅白色液体，久置后下层有沉淀，振摇后呈均匀混悬液；
装量检查：按现行《中国兽药典》进行检验，应符合规定；
无菌检验：按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长；
按上述现行《中国兽药典》进行性状（淡黄色）、装量检查（符合规定）、无菌验（无菌生长）检验均符合规定。
参考疫苗的安全检验和效力检验
安全检验：用3-4周龄健康易感猪5头，各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，连续观察14日。没出现因注射疫苗引起的全身和局部不良反应，注射后2日内试验猪体温均未不超过基础体温的1.5℃；
效力检验：用3-4周龄健康易感猪15头，分为3组，每组5头。第1组为免疫组，每头颈部肌肉注射疫苗2.0ml，第2组为攻毒对照组（非免疫），第3组为空白对照组（非免疫、非攻毒），各组猪隔离饲养。免疫后28日对所有猪称重，第1、2组分别用猪圆环病毒2型DBN-SX07株病毒液（含106.0TCID50/ml）攻毒，每头滴鼻4.0ml，肌肉注射4.0ml，隔离饲养。攻毒后连续观察28日，免疫后28日称重、采血、分离血清，PCR检测法检测血清中猪圆环病毒2型病毒血症、腹股沟淋巴结免疫组化检测法，检测猪圆环病毒2型抗原。经判定，免疫猪应至少4头保护，攻毒对照猪应至少4头发病的最低抗原含量的疫苗即可作为参考疫苗。
贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为四年。
实施例2
本实施例之后，所述阳性对照的制备方法包括如下步骤：猪圆环病毒2型ORF2基因的重组杆状病毒DBN01株，接种Sf9细胞，收获细胞培养物，浓缩纯化后制备PCV2 Cap蛋白，Tris-NaCl为蛋白缓冲液，调整浓度为30ug/ml，批量冻干。
阳性对照冻干品质控标准
性状：应为白色海绵状疏松团块；
无菌检验：应无菌生长；
浓度测定：30μg/ml；
特异性：采用Western Blot检测，应出现28kD的特异性条带；
纯度测定：灰度分析，纯度不低于95%；
剩余水分测定：剩余水分含量应≤4.0%；
真空度测定：应5/5呈紫色或者白色辉光。
贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为四年。
本实施例中，所述阴性对照的制备方法包括如下步骤：所述阴性对照为上述阳性对照PCV2 Cap蛋白缓冲液Tris-NaCl，分装EP管，无需冻干。
所述阴性对照贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为四年。
本实施例中，所述检测一抗的制备方法包括如下步骤：用猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01）株免疫健康猪，当免疫后猪血清1：2000稀释后，用猪圆环病毒2型（PCV-2）抗体检测试剂盒检测ELISA抗体效价为阳性时，无菌采血、分离血清、过滤除菌、灭活纯化后经冷冻真空干燥制成。用于猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力检测--双抗夹心ELISA试验用检测一抗。
检测一抗冻干品质控标准
性状：淡黄色海绵状疏松团块，加稀释液后迅速溶解；
无菌检验：按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长；
效价测定：采用商品化的猪圆环病毒2型 ELISA抗体检测试剂盒进行检测，应不低于1：2000；
特异性：采用IFA进行检验，中和组应无可见绿色荧光物质着染，病毒对照组应有大量绿色荧光物质着染。
贮藏与有效期：-70℃以下保存，有效期为四年。
实施例3
本实施例所述基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法的建立机优化，具体包括如下步骤：
（1）将抗猪圆环病毒2型单克隆抗体以包被液（碳酸盐缓冲液CBS浓度0.05mol/L，pH值9.6）稀释为5ug/ml，加至96孔酶标板中，控制加液量100ul/孔，4℃包被16-18小时；待恢复室温后，用PBST洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；随后加入封闭液含5%脱脂奶粉的PBS，加液量100μL/孔，37℃恒温培养箱孵育，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；
（2）将制备的参考疫苗、待检疫苗先用PBST稀释50倍，再分别加入至低吸附的稀释板，于A3、A4、A5三孔加入稀释50倍后的参考疫苗（CK001）300ul/孔，于A6、A7、A8三孔加入稀释50倍后的待检疫苗（批号：YH-018001）300ul/孔，于A9、A10、A11三孔加入稀释50倍后的待检疫苗（批号：YH-018002）300ul/孔；
按照2倍的系列倍比稀释（150ul倍比150ul）至第8孔H行，加入100ul/孔到对应的酶标板中，第A1-H1、A2-H2和A9-H9列分别加入标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，37℃恒温培养箱孵育，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；
（4）在各孔之后加入用PBST稀释的检测一抗100ul/孔，于37℃恒温培养箱孵育，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；然后，加入先用含5%牛血清白蛋白的PBS稀释100倍，再用含5%牛血清白蛋白的PBS稀释的HRP标记的酶标检测二抗100ul/孔，37℃恒温培养箱孵育，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；取TMB显色液恢复至室温，按100ul/孔加入量加入酶标板中，于37℃恒温培养箱避光孵育；随后加入100μL/孔终止液终止反应。
将上述各孔的反应液于450nm条件下测定OD450nm值，并进行计算。
为了确定出最佳反应条件，本实施例在不同反应条件下，对包被抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体与检测一抗以及检测一抗与检测二抗分别系列稀释后做方阵滴定，以P/N值较高且R2达到0.99以上为评价指标，确定它们的最佳使用浓度，测定结果分别见附图1和2所示。
然后基于上述确定的最佳检测一抗和检测二抗的使用浓度分别检测封闭液、待测样品、检测一抗和检测二抗不同孵育时间（30min、60min、90min和120min）对检测效果的影响，选取P/N值较高者作为最佳的孵育时间；最后测定不同显色时间（10min、15min和20min）对双抗夹心ELISA检测效果的影响，同样选取P/N值较高者作为最佳的显色时间。经测定，各步骤的最佳反应时间结果分别见附图3-7所示。
经试验，确定抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的包被最佳浓度为5ug/ml；检测一抗最佳稀释倍数为1：1600；检测二抗最佳稀释倍数为1：25000；封闭、待测样品、检测一抗、检测二抗及显色液的最佳作用时间分别为1.5h、1h、1h和15min。根据上述最佳作用条件，确定参考疫苗和待检疫苗的最佳稀释方式为，先将疫苗稀释50倍，然后在进行浓度梯度稀释1：50、1：100、1：200、1：400、1:800、1：1600、1：3200、1：6400，2倍系列倍比稀释所得。
实施例4
本实施例所述基于双抗夹心ELISA检测方法检验猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）体外相对效力的方法的具体实施。
将抗猪圆环病毒2型单克隆抗体以包被液（碳酸盐缓冲液CBS浓度0.05mol/L，pH值9.6）稀释为5ug/ml，加至96孔酶标板中，控制加液量100ul/孔，4℃包被16-18小时；待恢复室温后，用PBST洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；随后加入封闭液含5%脱脂奶粉的PBS，加液量100μL/孔，37℃恒温培养箱孵育1.5小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干。
将制备的参考疫苗、待检疫苗先用PBST稀释50倍，再分别加入至低吸附的稀释板，于A3、A4、A5三孔加入稀释50倍后的参考疫苗（CK001）300ul/孔，于A6、A7、A8三孔加入稀释50倍后的待检疫苗（批号：YH-018001）300ul/孔，于A9、A10、A11三孔加入稀释50倍后的待检疫苗（批号：YH-018002）300ul/孔。
按照2倍的系列倍比稀释（150ul倍比150ul）至第8孔H行，加入100ul/孔到对应的酶标板中，第A1-H1、A2-H2和A9-H9列分别加入标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，37℃恒温培养箱孵育1小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干。各孔加样示意图见下表1所示。
表1待检疫苗YH-018001、待检疫苗YH-018002测定的OD450nm值加样示意图
Figure 15931DEST_PATH_IMAGE001
在各孔之后加入用PBST稀释1：1600的检测一抗100ul/孔，于37℃恒温培养箱孵育1小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；然后，加入先用含5%牛血清白蛋白的PBS稀释100倍，再用含5%牛血清白蛋白的PBS稀释1：250的HRP标记的酶标检测二抗100ul/孔，37℃恒温培养箱孵育1小时，洗板3次，每次间隔3分钟，最后一次在吸水纸上拍干；取TMB显色液恢复至室温，按100ul/孔加入量加入酶标板中，于37℃恒温培养箱避光孵育15分钟；随后加入100μL/孔终止液终止反应。
将上述各孔的反应液于450nm条件下测定OD450nm值，测定结果见表2所示。
表2待检疫苗YH-018001、待检疫苗YH-018002的OD450nm值
Figure 8158DEST_PATH_IMAGE002
根据上表值计算，对照OD450nm平均值1.503，阴性对照OD450nm的平均值0.091，空白对照OD450nm的平均值0.088，对照成立，证明本次试验有效。
将参考疫苗、待检疫苗的OD450nm值减去空白对照OD450nm平均值，输入Relpot 4.0软件进行相体外对效力RP值及斜率（slope score）计算，结果如下表3及图8、9、10和11所示，其中图8中RP：1.4，图10中RP：1.36。
表3待检疫苗体外对效力RP值及斜率（slope score）
Figure 31477DEST_PATH_IMAGE003
根据上述结果判定：待检疫苗YH-018001的RP值 1.40，斜率1.00；待检疫苗YH-018002的RP值1.36，斜率0.99。以CK001为参考疫苗，检测待检疫苗YH-018001和YH-018002体外相对效力试验合格。
实施例5
本实施例对待检疫苗抗原含量与反应OD450nm值的线性关系进行评价。
用本发明上述方法对待检猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）进行三次平行检测，以待检疫苗稀释度（1：50、1：100、1：200、1：400、1:800、1：1600、1：3200、1：6400）为纵坐标、相对应的OD450nm值及OD450nm值的对数为横坐标进行直线回归分析，三次平行检测的两批待检疫苗样品均表现出良好的线性回归，R2均在0.99以上，RP值均大于1.0，斜率均在0.97 以上，可以用于建立生物检定方法。R2值、RP值及斜率如下表4所示。
表4待检疫苗抗原含量与对应OD450nm值线性回归分析比较
Figure 741944DEST_PATH_IMAGE004
注：8个稀释点为1：50、1：100、1：200、1：400、1:800、1：1600、1：3200、1：6400。
可见，三次平行检测的待检疫苗样品均表现出良好的线性回归，可以用于建立生物检定方法。
实施例6
本实施例对双平行线检测方法的可靠性检验。
根据上述实施例6中线性回归分析结果，取线性最好的6点进行分析，建立双平行线检定方法。按统计分析的基本要求，双平行线（6，6）检定方法应为直线回归非常显著（p＜0.01），偏离平行、二次曲线及反向二次曲线三个参数检验均应为不显著（p＞0.05）。本发明建立的6.6复孔检测法F（1，8）0.01＝10.25，F（1，8）0.05＝4.89，即当F＞10.25 时，p＜0.01，非常显著；F＜4.89时，p＞0.05，不显著。满足以上条件时验证通过。
对本发明建立的效力试验待检疫苗样品（批号YH-018001和YH-018002）灭活疫苗进行两批待检样品三人次（A、B、C）检测，对本发明体外相对效力试验方法RP值及斜率值检测结果统计如表5，对本发明体外相对效力试验方法进行验证如表6，对同批次效力试RP值及斜率值分析如表7。
表5疫苗体外相对效力试验方法RP值及斜率值检测结果
Figure 361276DEST_PATH_IMAGE005
表6疫苗体外相对效力试验方法进行验证
Figure 473588DEST_PATH_IMAGE006
表7同批次疫苗体外相对效力试验RP值及斜率值分析
Figure 402230DEST_PATH_IMAGE007
本发明体外相对效力试验进行了2 批3人次检测均通过验证，其RP值及斜率值在6次检测结果中，同批次待检疫苗YH-018001 RP值和斜率的变异系数（CV％）分别为1.70%和1.00%；待检疫苗YH-018002 RP值和斜率的变异系数（CV％）分别为1.52%和1.00%。变异系数（CV％）均小于10%，表明检测结果稳定重复性好。所有批次的RP值和斜率值最大分别为1.32和1.00，最小分别为1.20和0.97，平均值分别为1.27和0.980，标准差分别为4.3%和1.2%。
实施例7应用效果评价
用现有的方法检测批号为YH-201801、YH-201802、YH-201803、YH-201804、YH-201805的5批待检猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（DBN01株）产品，同时与本发明动物体内相对效力试验结果进行应用比较（见表8）。
表8体外相对效力试验与动物体内疫苗相对效力相关性试验统计分析
Figure 865572DEST_PATH_IMAGE008
从表8可以看出，5批待检疫苗产品的体外疫苗相对效力试验RP值及斜率值的标准差SD及变异系数CV 值均明显低于动物体内疫苗相对效力试验，动物体内疫苗相对效力试验变异系数（CV%）为12.45%，不仅高于体外疫苗相对效力变异系数（CV%），且大于10%，表明本发明体外相对效力试验更稳定、重复性更好。
实施例8
将上述实验室制备的5批待检疫苗产品（YH-201801、YH-201802、YH-201803、YH-201804、YH-201805）置2～8℃保存初始、3、6、9、12、18和21个月，分别取样进行体外相对效力试验和动物体内疫苗相对效力试验，进行统计学分析及比较，结果如表9所示。
表9夹心ELISA疫苗体外相对效力试验与动物体内疫苗相对效力试验结果比对分析
Figure 787130DEST_PATH_IMAGE009
Figure 753949DEST_PATH_IMAGE010
Figure 260016DEST_PATH_IMAGE011
如表9所示，以RP值≥1.0及斜率≥0.97为判定标准，将上述5批待检疫苗的6次取样夹心ELISA体外疫苗相对效力试验与动物体内疫苗相对效力试验同步进行检验，结果如下表9所示，体外疫苗相对效力试验RP值及斜率值的标准差SD及变异系数CV 值均明显低于动物体内疫苗相对效力试验，且两种试验结果一致，5批待检疫苗的7次取样2种试验方法检验全部为合格品。动物体内疫苗相对效力试验每一个疫苗取样开始到检验结束需要3个月时间，夹心ELISA体外疫苗相对效力试验方法只需7小时左右全部完成，具有高效且省事省力的优势。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别制备待测的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗和经验证的参考疫苗，备用；
（2）将抗猪圆环病毒2型单克隆抗体用包被液进行稀释，加至酶标板中进行包被处理，结束后洗板，并加入封闭液进行恒温培养箱孵育，洗板后备用；
（3）将参考疫苗、待检疫苗以及经倍比稀释的参考疫苗和待检疫苗分别加入上述处理后的酶标板不同的孔中，并在另外的空白孔中分别加入标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，置恒温培养箱孵育，洗板后备用；
（4）继续向上述酶标板各孔中加入检测一抗，置恒温培养箱孵育，洗板后继续加入用HRP标记的酶标检测二抗，置恒温培养箱孵育；洗板后加入显色液，恒温避光孵育后，加入终止液以终止反应；
（5）将各孔反应液于450nm条件下测定其OD值，并将经过计算后的OD450nm值输入RelPot4.0软件计算RP值，计算抗原含量之间的数值关系值以及数值关系图，以判断疫苗的体外相对效力是否合格；
所述疫苗合格的判定标准为：
A：符合试验有效标准；
B：设定参考疫苗RP值为1.0，待检疫苗RP值应≥1.0，待检疫苗相对效力合格；
C：如待检疫苗RP值＜1.0，应重检1次；重检结果的RP值≥1.0，判待检疫苗相对效力合格；否则判待检疫苗相对效力不合格。
2.根据权利要求1所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述参考疫苗为经检验合格的攻毒试验最小保护量抗原的疫苗。
3.根据权利要求2所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，控制所述抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的稀释浓度为5±2μg/ml，控制加液量为100ul/孔，控制所述包被处理步骤的温度为4℃包被16-18小时；
控制所述封闭液的加液量为100μL/孔，于37±2℃恒温培养1-2小时。
4.根据权利要求3所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述待检疫苗和所述参考疫苗的加液量为300μl/孔。
5.根据权利要求4所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述待检疫苗和所述参考疫苗的倍比稀释梯度为1：50、1：100、1：200、1：400、1:800、1：1600、1：3200、1：6400的2倍系列倍比稀释所得。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（4）中：
所述检测一抗为PBST稀释的抗猪圆环病毒2型多克隆抗体，加液量为100ul/孔；
所述检测二抗为含5%牛血清白蛋白的PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗，加液量为100ul/孔。
7.根据权利要求6所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（4）中：
所述显色液包括TMB底物，加液量为100ul/孔；
所述终止液包括0.05mol/L的浓硫酸，加液量为100ul/孔。
8.根据权利要求7所述的检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，试验有效性判定包括：标准阴性对照OD450nm值<0.3，标准阳性对照OD450nm值为0.8-2.0，空白对照≤0.1，如果上述标准中有一条不符合，试验无效。
9.权利要求1-8任一项所述方法在检验PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗体外效力领域的应用。
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