CN103616505A - 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，它包括6个步骤：细胞的铺板及培养、病毒的梯度稀释、病毒沉降剂的添加、病毒的接种及培养、免疫荧光检测和统计特异荧光孔的数目，并计算猪瘟病毒滴度。本发明为一种可精确评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力，且易于推广应用的IFA检测方法，能够对生产、运输各环节中的疫苗及半成品进行快速、精确检测，从而保证了疫苗的质量。与传统的兔体定型热反应法相比，具有省时，省力，直观，准确等优点。

Description

一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的检测方法。 
背景技术
猪瘟（Classical Swine Fever，CSFV）俗称“烂肠瘟”，在美国称为猪霍乱，欧洲一些地区称为古典猪瘟。本病是由猪瘟病毒引起的一种急性热性全身性败血性传染病，各种年龄猪只均可发病，有最急性、急性、亚急性、慢性等多种病程，一年四季流行，传染性极强，具有高发病率和死亡率。该病一旦发生，具有毁灭性，严重地威胁养猪业的发展，影响人民的生活。在猪病中，猪瘟是危害最大、最受重视的一种病，此病被国际兽医卫生组织法定为必检的A类16种传染病之一，在我国被列为一类传染病。 
我国研制的猪瘟病毒兔化弱毒株（C株）是国际上公认的最佳疫苗毒株，已被欧洲很多国家采用，有效的控制了猪瘟的流行。近年来，猪瘟免疫失败时有报道，其原因虽然很多，但疫苗的质量是首要考虑的因素。由于猪瘟病毒半衰期比较短，建立可准确检测疫苗半成品及成品效力检验方法尤为重要。 
目前，猪瘟兔化弱毒活疫苗（猪瘟活疫苗）效力检测的标准方法为兔体定型热反应法。由于我国纯系大耳白家兔供应不足、兔体状态差异等原因，该方法的检测结果往往不稳定，不准确，而且在实际生产过程中往往只按照国家标准（例如：政府采购专用猪瘟活疫苗（细胞源）的标准为7500RID/头份）或企业内控标准（例如：2×104RID/头份）进行一个稀释度的检测，以评价疫苗或半成品是否合格，而不进行其他稀释度的检测，即只作定性的判定，而不作准确定量的检测。因此疫苗及其半成品的效力不能被准确反映，造成病毒接种、疫苗制备等环节都存在不确定因素，严重影响了疫苗成品的质量。 
据相关报道介绍，猪瘟活疫苗检测也可采用新型的检测方法，如酶联免疫吸附检测法（ELISA）、免疫荧光检测法（IFA）、聚合酶链式反应（PCR）检测法和实时荧光定量PCR检测法（Real-time PCR）。 
酶联免疫吸附检测法（ELISA）只能评价病毒粒子（包括失活病毒）的总量，实际病毒存活量往往与检测结果大相径庭，在实际应用中这种方法只能作为参考。 
现有的实时荧光定量PCR检测方法和普通的PCR检测方法设计的引物并不能有效区分失活的病毒粒子和活病毒粒子，通常检测的是总RNA（包括失活病毒RNA及RNA片段），假阳性检测结果偏多，只在检测新鲜毒液时才具有一定的参考意义，因此并没有受到广泛的认可。 
猪瘟病毒兔化弱毒株（C株）对目前常用已知的适应性原代细胞和传代细胞系不具有致病变作用，无法应用细胞病变孔数对病毒进行滴度（半数组织培养感染剂量，TCID50）检测。免疫荧光法（IFA）通过荧光标记抗体检测受病毒感染的细胞，是检测猪瘟病毒滴度较为适宜的方法。目前，由于受到以下多种因素的制约，如猪瘟病毒兔化弱毒株（C株）对普通适应性细胞感染率低、半衰期短、增殖速度慢、病毒滴度低、敏感细胞系的垄断和抗体特异性差，现有的免疫荧光技术很难对疫苗质量进行评价，仅有极少数对猪瘟兔化弱毒高敏感优势细胞克隆株作为检测细胞对病毒滴度进行检测的报道，目前IFA方法在国内并没有广泛应用到猪瘟疫苗效力检测中，各疫苗生产企业仍然延用费时费力的兔体定型热反应法对疫苗质量进行评价。因此如何建立一种可精确评价猪瘟活疫苗效力、且易于推广应用的IFA检测方法，成为亟待解决的问题。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有免疫荧光检测法（IFA）的缺陷，提供一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，它能够基于普通猪睾丸细胞（ST）或猪肾细胞（PK15），高效、精确评价猪瘟活疫苗效力。 
本发明所述技术问题是通过下述技术方案实现的： 
一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，包括如下步骤：
（1）细胞的铺板及培养
以0.25%的EDTA-胰酶将生长良好的检测用细胞进行消化分散，然后以细胞生长液重悬为细胞浓度2~4×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h，检测用细胞长满单层； 
（2）病毒的梯度稀释
在10℃~15℃，用0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）将猪瘟兔化弱毒活疫苗复溶，PBS加入量0.1ml/头份，并用0.01M的PBS进行梯度稀释；
（3）病毒沉降剂的添加
将无菌的病毒沉降剂聚乙二醇溶液按体积比1:1添加于各检测梯度病毒液中，混匀；
（4）病毒的接种及培养
将步骤（3）所述的添加了病毒沉降剂的各检测梯度病毒液接种于步骤（1）中的细胞培养板中，加入量100μl/孔，同时设置不接病毒液的细胞对照孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育2~3h；孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱继续培养72h； 
（5）免疫荧光检测
培养结束后，对细胞依次进行固定、封闭、孵育猪瘟病毒抗体（一抗）、孵育荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），而后在显微镜下进行荧光细胞观察。
（6）统计特异荧光细胞孔的数目，并计算猪瘟病毒滴度 
特异荧光细胞孔（阳性孔）的判定标准为，培养孔中有特异荧光细胞即可；特异荧光细胞判定标准为，自然光下观察应为健康细胞，荧光下观察具有细胞形态。
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，所述细胞生长液为含有8%~10%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，pH为7.2~7.4；细胞维持液为含2%~3%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，PH为7.2~7.4。 
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，步骤（1）中所述的检测用细胞为猪睾丸细胞（ST）或猪肾细胞（PK15）。 
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，步骤（2）中的梯度稀释采用两步法，先将猪瘟病毒进行10倍梯度稀释至10-3或10-4，再将10-3或10-4稀释度进行2倍梯度稀释，稀释6～8个梯度至10-4.8～10-6.4；病毒接种细胞的梯度范围为2倍梯度稀释部分。 
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，步骤（3）中所述的病毒沉降剂为将聚乙二醇按照质量体积浓度为15%~20%溶于0.01M的磷酸盐缓冲液，过滤除菌制成；所用聚乙二醇的规格为PEG4000~PEG20000之一。 
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，步骤（5）中免疫荧光检测包括如下步骤： 
1）培养结束后，弃尽板孔内细胞维持液，加入固定液，加入量100μl/孔，-20℃固定5~10min； 
2）弃尽固定液，将细胞板风干；
3）向细胞板孔中加入质量体积浓度1%的牛血清白蛋白溶液进行封闭处理，加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min；
4）以0.01M的PBS冲洗，将稀释后的猪瘟病毒抗体（一抗）添加于细胞培养板，加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min；
5）弃尽一抗，以0.01M的PBS冲洗，添加稀释后的荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min；
6）弃尽二抗，以0.01M 的PBS冲洗，荧光显微镜下观察。
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，步骤（5）中猪瘟病毒抗体（一抗）的稀释倍数为500~700倍；荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗）的稀释倍数为800~1000倍。 
上述猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，步骤（6）中病毒滴度（TCID50/0.1ml）的计算公式为： 
LogTCID50=高于50%阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之差
稀释度对数之差=低于50%阳性孔率最低稀释度的对数-高于50%阳性孔率最高稀释度的对数
距离比例=（高于50%阳性孔率的百分数-50）/（高于50%阳性孔率的百分数-低于50%阳性孔率的百分数）。
本发明克服现有免疫荧光检测法（IFA）的缺陷，建立一种可精确评价猪瘟活疫苗效力，且易于推广应用的IFA检测方法。该方法能够对生产、运输各环节中的疫苗及半成品进行快速、精确检测，从而保证了疫苗的质量。与传统的兔体定型热反应法相比，具有省时，省力，直观，准确等优点。 
本发明所述的病毒沉降剂—聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有无毒，无刺激，不挥发，生理惰性，亲水性，温和性等特性。PGE有两个羟基，具有良好的亲水性，容易与猪瘟病毒粒子结合。本发明利用其亲水性和高分子量的特点，将PEG添加于猪瘟病毒液中，使猪瘟病毒粒子在短时间内沉降到细胞表面，快速、高效地感染普通适应性细胞，最大程度地避免了猪瘟病毒在较高温度（37℃）条件下快速衰亡，同时提高了猪瘟兔化弱毒对宿主细胞猪睾丸细胞（ST）和猪肾细胞（PK15）的感染效率，进而提高了IFA法对猪瘟病毒效力检测的精确度和灵敏度；本发明所述方法不必采用对猪瘟弱毒高度敏感的克隆化细胞，普通ST或PK细胞系即可满足检测需求，避免了复杂的细胞克隆工作，打破该领域的技术垄断，有利于IFA检测方法的推广使用。 
猪瘟病毒的梯度稀释步骤中，先10倍稀释再2倍稀释，用2倍稀释的检测梯度对病毒滴度进行检测，比仅仅使用10倍稀释法具有更高的精确度和准确度，检测结果可以涵盖和有效区分目前猪瘟疫苗生产质量要求的各水平质量控制点（如：150RID/头份、750RID/头份、7500RID/头份、1万RID/ml、2万RID/ml、10万RID/ml、20万RID/ml、50万RID/ml），且与兔体定型热法的检测结果形成了良好的对应关系。 
荧光检测步骤中对特异荧光细胞的判定标准为具有细胞形态的特异荧光细胞。由于具有细胞形态的特异荧光更容易判定，能有效区分非特异荧光，避免传统方法中采用胞浆内随机形态荧光的不确定性，从而最大限度的消除了人为判定差异。 
附图说明
图1是本发明实施例1添加PEG组的荧光图； 
图2是本发明实施例1不添加PEG组的荧光图；
图3是本发明实施例1细胞对照组荧光图；
图4是本发明实施例2中-20℃保存组荧光图；
图5是本发明实施例2中55℃作用1h组荧光图；
图6是本发明实施例2中55℃作用2h组荧光图；
图7是本发明实施例2细胞对照组荧光图；
图8是本发明实施例4的LogTCID50与LogRID的关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。 
本发明所用试剂如下： 
1、猪瘟病毒抗体（一抗）即猪瘟病毒阳性血清，购自中国兽医药品监察所。
2、荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），购自Sigma公司。 
3、固定液为甲醇与丙酮按体积比（V/V）1:1配制的混合液。丙酮、甲醇为分析纯。 
本发明包括如下步骤： 
（1）细胞的铺板及培养
以0.25%的EDTA-胰酶将生长良好的检测用细胞进行消化分散，然后以细胞生长液重悬为细胞浓度为2~4×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2，细胞培养箱中培养24h，检测用细胞长满单层。
检测用细胞为对猪瘟病毒适应的猪睾丸细胞（ST）或猪肾细胞（PK15）。细胞生长液为含有8%~10%新生牛血清（CBS）的MEM或DMEM溶液，其pH为7.2~7.4。其中新生牛血清（CBS）中不含牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体及抗原。 
（2）病毒的梯度稀释 
猪瘟病毒的稀释应在低于15℃的环境下进行，优选10℃~15℃。按照猪瘟活疫苗说明书标明的剂量，用摩尔浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）将猪瘟兔化弱毒活疫苗进行复溶，加入量0.1ml/头份（即每头份疫苗以0.1ml PBS复溶）。取复溶液0.1ml，首先以0.01M PBS进行10倍梯度稀释（基础梯度）至10-3或10-4；然后进行2倍梯度稀释，稀释6～8个梯度（检测梯度）至10-4.8～10-6.4，检测梯度的范围应充分包含被检疫苗病毒滴度的可能值。
（3）病毒沉降剂的添加 
将无菌的病毒沉降剂—聚乙二醇溶液按体积比（V:V）1:1添加于各检测梯度病毒液中，轻轻混匀。病毒沉降剂为将聚乙二醇按照质量体积浓度为15%~20%溶于0.01M的磷酸盐缓冲液，过滤除菌制成；聚乙二醇为PEG4000~PEG20000之一。
（4）病毒的接种及培养 
将步骤（3）中添加了病毒沉降剂的各检测梯度病毒液接种于步骤（1）所述长满单层的检测用细胞的细胞培养板中，加入量100μl/孔，每个稀释度接种8孔，同时设置不接病毒液的细胞对照孔。将细胞培养板置于37℃，5%CO2，细胞培养箱中孵育2~3h。孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续培养72h。细胞维持液为含2%~3%新生牛血清（CBS）的MEM或DMEM溶液，其PH为7.2~7.4。新生牛血清（CBS）中不含牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体及抗原。
（5）免疫荧光检测 
1）培养结束后，弃尽板孔内细胞维持液，加入固定液，加入量100μl/孔，-20℃固定5~10min。
2）弃尽固定液，将细胞板风干； 
3）向细胞板孔中加入质量体积浓度（m/V）1%牛血清白蛋白（BSA）溶液进行封闭处理，加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min。
4）以0.01M PBS冲洗3遍，每遍加入量200μl/孔。将500~700倍稀释的猪瘟病毒抗体（一抗）添加于细胞培养板，加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min。 
5）弃尽一抗，以0.01M PBS冲洗5遍，每遍加入量200μl/孔。添加800~1000倍稀释的荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min。 
6）弃尽二抗，以0.01M PBS冲洗5遍，每遍加入量200μl/孔，荧光显微镜下观察。 
（6）统计并计算病毒滴度 
统计出现特异荧光孔的数目，以Reed-Muench法对猪瘟病毒滴度（TCID50/0.1ml）进行计算。
特异荧光细胞孔（阳性孔）的判定标准为，培养孔中有特异荧光细胞即可；特异荧光细胞判定标准为，自然光下观察应为健康细胞，荧光下观察具有细胞形态。 
疫苗效价（病毒滴度，TCID50/0.1ml）的计算公式为： 
LogTCID50=高于50%阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之差
稀释度对数之差=低于50%阳性孔率最低稀释度的对数-高于50%阳性孔率最高稀释度的对数
距离比例=（高于50%阳性孔率的百分数-50）/（高于50%阳性孔率的百分数-低于50%阳性孔率的百分数）。
实施例1 
目的：比较本发明的病毒接种方法（添加沉降剂）与普通病毒接种方法（不加沉降剂）的差异。
方法：将一份猪瘟活疫苗病毒液稀释103倍，分为两份，分别以本发明的病毒接种方法和普通病毒接种方法接种于两组检测用猪睾丸细胞（ST细胞），培养结束后，以IFA法进行检测，分析比较荧光细胞密度的差异，从而比较出两种病毒接种方法的优劣。 
猪瘟活疫苗（细胞源）：瑞普（保定）生物药业有限公司，20头份/瓶，批号为120202，兔体感染量为7500RID/头份。 
本实施例包括以下步骤： 
（1）细胞的铺板及培养
以0.25%的EDTA-胰酶将生长良好的检测用猪睾丸细胞（ST）进行消化分散，然后以细胞生长液重悬为细胞浓度为4×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2，细胞培养箱中培养24h。细胞生长液为含有8%新生牛血清（CBS）的MEM溶液，PH7.2。
（2）病毒的梯度稀释 
在10℃，以2ml 0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）将1瓶猪瘟活疫苗进行复溶，取0.1ml复溶液用0.01M PBS进行10倍梯度稀释至10-3，取样两份，取样量1ml/份，分别标记为A、B组。
（3）病毒沉降剂的添加 
将1ml病毒沉降剂溶液添加于A组，轻轻混匀；将1ml PBS（0.01M）添加于B组，轻轻混匀。病毒沉降剂为无菌的质量体积浓度为20%的聚乙二醇8000（PEG8000）溶液。
（4）病毒的接种及培养 
将添加了病毒沉降剂的A组和未添加病毒沉降剂的B组病毒液分别接种于步骤（1）所述长满单层的ST细胞，加入量100μl/孔，每个稀释度接种8孔，同时设置不接病毒液的细胞对照（记为C组），置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育3h；孵育结束后，弃掉病毒液，接入细胞维持液，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续培养72h。细胞维持液为含有3%新生牛血清（CBS）的MEM溶液，PH7.4。
（5）免疫荧光IFA检测 
1）培养结束后，弃尽板孔内细胞维持液，加入固定液，加入量100μl/孔，-20℃固定10min。
2）弃尽固定液，将细胞板风干； 
3）以浓度（m/V）1%的牛血清白蛋白（BSA）溶液进行封闭处理，100μl/孔，37℃孵育60min。
4）以0.01M PBS冲洗3遍，200μl/孔。将500倍稀释的猪瘟病毒抗体（一抗）添加于细胞培养板，加入量100μl/孔，37℃，孵育60min。 
5）弃尽一抗，以0.01M PBS冲洗5遍，每遍加入量200μl/孔。添加800倍稀释的荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），加入量100μl/孔，37℃孵育60min。 
6）弃尽二抗，以0.01M PBS冲洗5遍，每遍加入量200μl/孔，荧光显微镜下观察。 
（6）结果 
A组：特异荧光广泛，病毒感染率较高，如图1所示；
B组：特异荧光较少，病毒感染率较低，如图2所示；
C组：无特异荧光，如图3所示。
试验结果显示，本发明的接种方法，将病毒沉降剂添加于猪瘟病毒液，而后接种于ST细胞，显著提高了特异荧光细胞数目。说明在猪瘟弱毒液中添加沉降剂，大大提高了特异荧光细胞密度，显著提高了IFA法对猪瘟兔化弱毒的检测灵敏度，为检测方法的建立提供了支持。 
实施例2  
目的：证实按照本发明的病毒接种方法，IFA法所检测到的特异荧光细胞数与活病毒粒子数的正相关。
方法：将同一份猪瘟病毒液分为三份，其中两份进行不同时长的加热处理灭活猪瘟弱毒，而后用本发明的病毒接种方法将两份病毒分别接种于三组ST细胞，培养结束后，以IFA法对三组细胞进行检测，分析比较荧光数的差异，证实荧光数是否随存活病毒数的减少而减少。 
猪瘟活疫苗（细胞源）：瑞普（保定）生物药业有限公司，20头份/瓶，批号为120806，兔体感染量为20000RID/头份。 
本实施例包括以下步骤： 
（1）细胞的铺板及培养
同实施例1的步骤（1）。
（2）病毒的梯度稀释 
在温度12℃，以2ml 0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）将1瓶猪瘟活疫苗进行复溶，而后以0.01M PBS进行103倍稀释，取样三份，0.5ml/份，分别标记为D，E，F组。
（3）病毒的热处理 
将D组病毒液保存于-20℃，E，F组病毒液分别在55℃水浴处理1h，2h。
（4）病毒沉淀剂的添加 
分别将0.5ml病毒沉降剂溶液添加于D、E、F三组病毒液，轻轻混匀。病毒沉降剂为无菌的质量体积浓度为18%的聚乙二醇10000（PEG10000）的PBS溶液。
（5）病毒的接种及培养 
将步骤（4）中添加了病毒沉降剂的D、E、F三组病毒液分别接种于步骤（1）所述长满单层的检测用细胞，加入量100μl/孔，每个稀释度接种8孔，同时设置不接病毒液的细胞对照组（G组），置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育3h；孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱继续培养72h。
（6）免疫荧光检测 
如实施例1步骤（5）所述。
（7）结果 
D组（图4）荧光细胞数显著多于E组（图5），F组（图6）和G组几乎无特异荧光细胞。
结果显示，随着加热时间的延长，活病毒粒子数减少，IFA法检测到的特异荧光细胞逐渐减少；当病毒完全灭活后，IFA法检测不到特异荧光细胞。本实施例说明，按照本发明的病毒接种方法（添加沉降剂）将猪瘟弱毒接种于ST细胞后，产生的特异荧光细胞数目与体现活疫苗效力的活病毒粒子数仍呈正相关关系。 
实施例3 
目的：本发明的IFA检测方法与普通IFA检测方法检测敏感度的对比试验。
方法：将同一份猪瘟活疫苗样品，分为两份，分别以本发明IFA检测方法与普通IFA检测方法进行病毒滴度检测，分析两种检测方法结果的差异。 
猪瘟活疫苗（细胞源）：瑞普（保定）生物药业有限公司，20头份/瓶，批号为121008，兔体感染量为7500RID/头份； 
本实施例包括以下步骤：
（1）细胞的铺板及培养
如实施例1步骤（1）所述。
（2）疫苗复溶 
在10℃，以2ml 0.01M PBS将1瓶猪瘟活疫苗进行复溶。
（3）病毒沉降剂的添加、病毒的接种及培养 
分别以如下所述两种方式进行处理
本发明方法：取0.1ml（1头份）猪瘟活疫苗复溶样品以0.01M PBS进行10倍梯度稀释得到10-1、10-2、10-3、10-4，4个基础稀释梯度，而后将10-4进行2倍梯度稀释得到1×10-4、0.5×10-4、0.25×10-4、0.125×10-4、0.625×10-5，0.3125×10-5，6个检测稀释梯度，将病毒沉降剂PEG8000溶液按体积比1:1加入1×10-4~0.3125×10-5 这6个检测稀释梯度，轻轻混匀，使相应的稀释度变为0.5×10-4、0.25×10-4、0.125×10-4、0.625×10-5、0.3125×10-5，0.15625×10-5，稀释后的病毒液接种于步骤（1）所述长满单层的检测用细胞，100μl/孔，每个稀释度接种8孔，同时设置不接病毒液的细胞对照，37℃，5%CO2，细胞培养箱中孵育3h；孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，100μl/孔，37℃，5%CO2，细胞培养箱中培养72h。
普通IFA检测方法：取0.1ml（1头份）猪瘟活疫苗复溶样品以0.01M PBS溶液进行10倍梯度稀释，10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6 共6个稀释梯度。将稀释后的病毒液10-1~10-6共6个梯度接种于步骤（1）所述长满单层的检测用细胞，100μl/孔，每个稀释度接种8孔，同时设置不接病毒液的细胞对照，37℃，5%CO2，细胞培养箱中孵育3h；孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，100μl/孔，37℃，5%CO2，细胞培养箱中培养72h。 
（4）免疫荧光检测 
如实施例1步骤（5）所述。
（5）统计并计算病毒滴度。 
统计出现特异荧光孔的数目，以Reed-Muench法对猪瘟病毒的滴度（TCID50/0.1ml）进行计算。 
（6）结果 
两种检测方法的特异荧光细胞孔数统计如下表1、2所示。
表1  本发明检测方法的猪瘟活疫苗效力检测结果 
Figure DEST_PATH_998252DEST_PATH_IMAGE001
距离比例=（高于50%阳性孔率的百分数-50）/（高于50%阳性孔率的百分数-低于50%阳性孔率的百分数=（91.67-50）/（91.67-44.44）=0.88
稀释度的对数之差= log10-5.2-log10-4.9=-0.30
logTCID50=高于50%阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度的对数之差=-4.90+0.88×(-0.30)=-5.16
TCID50=10-5.16/0.1ml，即10-5.16/头份，表示将该病毒稀释105.16（约14.45万）倍后，接种0.1ml于检测细胞，可使50%的细胞孔出现特异荧光。
表2  普通IFA检测方法的猪瘟活疫苗效力检测结果 
Figure DEST_PATH_820715DEST_PATH_IMAGE002
距离比例=（高于50%阳性孔率的百分数-50）/（高于50%阳性孔率的百分数-低于50%阳性孔率的百分数=（80.00-50）/（80.00-20.00）=0.50
稀释度的对数之差= log10-3-log10-2=-1.00
logTCID50=高于50%阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度的对数之差=-2.00+0.50×(-1.00)=-2.50
TCID50=10-2.50/0.1ml，即10-2.50/头份，表示将该病毒稀释102.50（约316）倍后，接种0.1ml于检测细胞，可使50%的细胞孔出现特异荧光。
本实施例证实：本发明的检测结果与兔体定型热反应法的检测结果关系为7500RID/头份≈105.16TCID50/头份；本发明检测方法的敏感度比普通IFA检测方法高大约500倍，荧光细胞孔具有良好的统计学规律，能够更有效评价猪瘟活疫苗效力。 
实施例4 
目的：本发明检测结果与兔体定型热法检测结果的对应关系。
方法：根据疫苗说明书标定的规格（20头份/瓶），对多批次、多滴度的猪瘟活疫苗以本发明所述方法（同实施例3）对每头份病毒含量（病毒滴度，TCID50/0.1ml，即TCID50/头份）进行测定，而后与兔体定型热法（见猪瘟活疫苗制造及检验规程）测得的每头份病毒含量（兔体感染量，RID/ml，即RID/头份）进行统计对比，分析出TCID50与RID的对应关系。两种方法检测结果对应关系见表3。 
表3  病毒滴度（TCID50/头份）与兔体反应热（RID/头份）的对应关系 
RID/头份 1.0×105 5.0×104 2.0×104 1.0×104 5.0×103
LogRID 5.00 4.70 4.30 4.00 3.70
TCID50/头份 2.0×106 1.0×106. 4.0×105 2.0×105 1.0×105
LogTCID50 6.30 6.00 5.60 5.30 5.00
对两种检测方法的结果进行对比分析，建立了病毒滴度（TCID50/头份）与兔体反应热（RID/头份）的线性关系图，见图8。
病毒滴度（TCID50/头份）与兔体感染量（RID/头份）两者的大体对应关系为：20TCID50/头份≈1 RID/头份，即20个TCID50相当于1RID。 
本发明能够与传统的兔体定型热法建立起良好的数量关系，说明该方法与标准的兔体定型热检测方法的在检测结果上的一致性，而其检测敏感度、精确度远高于传统的兔体定型热法。 
实施例5 
可以用猪肾细胞（PK15）代替实施例3中猪睾丸细胞（ST），其它操作与上述实施例基本相同。
实施例6 
可以用猪瘟活疫苗（兔源）代替实施例3中猪瘟活疫苗（细胞源），其它操作与上述实施例基本相同。

Claims (8)

1.一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，它包括如下步骤：
（1）细胞的铺板及培养
以0.25%的EDTA-胰酶将生长良好的检测用细胞进行消化分散，然后以细胞生长液重悬为细胞浓度2~4×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h，检测用细胞长满单层； 
（2）病毒的梯度稀释
在10℃~15℃，用0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）将猪瘟兔化弱毒活疫苗复溶，PBS加入量0.1ml/头份，并用0.01M的PBS进行梯度稀释；
（3）病毒沉降剂的添加
将无菌的病毒沉降剂聚乙二醇溶液按体积比1:1添加于各检测梯度病毒液中，混匀；
（4）病毒的接种及培养
将步骤（3）所述的添加了病毒沉降剂的各检测梯度病毒液接种于步骤（1）中的细胞培养板中，加入量100μl/孔，同时设置不接病毒液的细胞对照孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育2~3h；孵育结束后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，加入量100μl/孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱继续培养72h； 
（5）免疫荧光检测
培养结束后，对细胞依次进行固定、封闭、孵育猪瘟病毒抗体（一抗）、孵育荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），而后在显微镜下进行荧光细胞观察；
（6）统计特异荧光细胞孔的数目，并计算猪瘟病毒滴度
特异荧光细胞孔（阳性孔）的判定标准为，培养孔中有特异荧光细胞即可；特异荧光细胞判定标准为，自然光下观察应为健康细胞，荧光下观察具有细胞形态。
2.根据权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，所述细胞生长液为含有8%~10%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，pH为7.2~7.4；细胞维持液为含2%~3%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，PH为7.2~7.4。
3.根据权利要求2所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的检测用细胞为猪睾丸细胞（ST）或猪肾细胞（PK15）。
4.根据权利要求3所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，步骤（2）中的梯度稀释采用两步法，先将猪瘟病毒进行10倍梯度稀释至10-3或10-4，再将10-3或10-4稀释度进行2倍梯度稀释，稀释6～8个梯度至10-4.8～10-6.4；病毒接种细胞的梯度范围为2倍梯度稀释部分。
5.根据权利要求4所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的病毒沉降剂为将聚乙二醇按照质量体积浓度为15%~20%溶于0.01M的磷酸盐缓冲液，过滤除菌制成；所用聚乙二醇的规格为PEG4000~PEG20000之一。
6.根据权利要求5所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，步骤（5）中免疫荧光检测包括如下步骤：
1）培养结束后，弃尽板孔内细胞维持液，加入固定液，加入量100μl/孔，-20℃固定5~10min； 
2）弃尽固定液，将细胞板风干；
3）向细胞板孔中加入质量体积浓度1%的牛血清白蛋白溶液进行封闭处理，加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min；
4）以0.01M的PBS冲洗，将稀释后的猪瘟病毒抗体（一抗）添加于细胞培养板，加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min；
5）弃尽一抗，以0.01M的PBS冲洗，添加稀释后的荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗），加入量100μl/孔，37℃孵育30~60min；
6）弃尽二抗，以0.01M 的PBS冲洗，荧光显微镜下观察。
7.根据权利要求6所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，步骤（5）中猪瘟病毒抗体（一抗）的稀释倍数为500~700倍；荧光色素（FITC）标记的兔抗猪IgG抗体（二抗）的稀释倍数为800~1000倍。
8.根据权利要求7所述的猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法，其特征在于，步骤（6）中病毒滴度（TCID50/0.1ml）的计算公式为：
LogTCID50=高于50%阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之差
稀释度对数之差=低于50%阳性孔率最低稀释度的对数-高于50%阳性孔率最高稀释度的对数
距离比例=（高于50%阳性孔率的百分数-50）/（高于50%阳性孔率的百分数-低于50%阳性孔率的百分数）。
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