CN103773892B - 一种流感病毒滴度的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种流感病毒感染滴度的检测方法，其特点是利用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染性滴度，于35℃培养箱，流感病毒吸附Vero细胞90min后，加入终浓度为1％Agarose覆盖物，3天后加入第二层覆盖物，完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。选择出斑数在10～100个进行数斑，计算出空斑形成单位，并分别与鸡胚法检测病毒滴度进行比较，利用空斑法检测流感病毒感染滴度。具有灵敏度高，重复性好的特点，精密度在1.5％～5.3％之间，适合用来检测流感病毒感染滴度。

Description

一种流感病毒滴度的检测方法
技术领域
本发明涉及一种流感病毒感染滴度的检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
传统的流感病毒病毒滴度的检测方法是利用鸡胚法。选择9～11日龄的鸡胚，将流感病毒按10倍系列稀释，至少取3个稀释度尿囊腔注射，每只注射0.2ml.每个稀释度注射4只鸡胚。37℃孵箱培养3天，取尿囊液做血凝滴度检测。计算出病毒滴度。利用空斑法检测病毒滴度的方法早在50年代就开始研究使用了。1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)。
蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
1.病毒生物学纯化(Virus biological purification)在进行血清中和试验时，常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性，这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂，或者已有许多变异病毒粒子存在其中，甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时，有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化，应用病毒蚀斑技术，挑选出各个不同的纯化病毒，亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖，测定其滴度，选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化，必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度，一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。
2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test)蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作，接种预先准备好的单层细胞，再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养，数天后分别统计蚀斑数，用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种利用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的检测方法。
本发明给出的技术方案是：这种流感病毒滴度的检测方法，其特征在于：采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度，其步骤有：
(1)将流感病毒10倍系列稀释，取各稀释度病毒液加入Vero细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔。35℃吸附90min后倒掉病毒液。
(2)加入保持37℃～42℃的第一层覆盖物，每孔3ml。完全凝固后35℃倒置培养72小时。
(3)加入保持37℃～42℃的第二层覆盖物，每孔2ml。完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。选择出斑数在10～100个进行数斑。
(4)采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度。
(5)将流感病毒稀释至每0.5ml含1～5个病毒(即每孔1～5个空斑)，分别用鸡胚法和空斑法检测流感病毒感染滴度。检测阳性检出率，比较两种方法的灵敏度。
(6)分别采用终浓度为1％和0.5％的Agarose覆盖物，进行试验操作。比较不同的终浓度对出斑的影响。
(7)35℃培养箱流感病毒分别吸附60min和90min后加入第一层覆盖物。比较不同吸附时间对出斑的影响。
(8)流感病毒在33℃和35℃培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖。本次试验在33℃和35℃条件下进行了比较。
(9)按上述方法，五个不同操作者同时用空斑法检测同一个流感病毒感染滴度，分别重复5次以上，对结果进行分析。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的病毒稀释液为含6ug/ml胰酶的无血清培养基。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第一层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基43.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3 3ml、HEPES 1.5ml、3％谷氨酰胺1ml、0.25％胰酶0.3ml、双抗1ml。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第二层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基38.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3 3ml、HEPES 1.5ml、3％谷氨酰胺1ml、0.25％胰酶0.3ml、双抗1ml、中性红5ml。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持37℃～42℃的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培养72小时。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持37℃～42℃的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时选择出斑数在30～70个进行数斑。
为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种利用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染性滴度的方法，通过鸡胚法和Vero细胞空斑法检测流感病毒的感染性滴度的比较。建立以Vero细胞为培养基质，应用空斑法检测流感病毒感染滴度的方法。此方法于35℃培养箱，流感病毒吸附Vero细胞90min后，加入终浓度为1％Agarose覆盖物，3天后加入第二层覆盖物，完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。选择出斑数在10～100个进行数斑。计算出空斑形成单位(PFU/ml)。并分别与鸡胚法检测病毒滴度(EID50/ml)进行比较。利用空斑法检测流感病毒感染滴度具有灵敏度高，重复性好。精密度(CV％)在1.5％～5.3％之间。空斑法适合用来检测流感病毒感染滴度。
附图说明
图1A和图1B为不同浓度琼脂糖出斑比较，图中：图1A：Agarose终浓度1％，图1B：Agarose终浓度0.5％；
图2A和图2B为流感病毒在Vero细胞吸附时间的比较，图中：图2A：吸附90min，图2B：吸附60min；
图3A和图3B为不同温度培养流感病毒对空斑大小的影响，图中：图3A：35℃培养，图3B：33℃培养。
具体实施方式：
实施例1
Vero细胞空斑法与鸡胚法检测流感病毒感染滴度的比较。鸡胚法：选择9～11日龄的鸡胚，将流感病毒按10倍系列稀释，至少取3个稀释度尿囊腔注射，每只注射0.2ml.每个稀释度注射4只鸡胚。37℃孵箱培养3天，取尿囊液做血凝滴度检测。计算出病毒滴度。空斑法：将病毒10倍系列稀释，取各稀释病毒液加入Vero细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔。35℃吸附90min后倒掉病毒液。加入保持37℃～42℃的第一层覆盖物，每孔3ml。完全凝固后35℃倒置培养72小时。加入保持37℃～42℃的第二层覆盖物，每孔2ml。完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。结果判定：选择出斑数在10～100个进行数斑。
空斑法和鸡胚法检测结果表明CV分别为2.9％和10.21％，空斑法检测流感病毒感染滴度重复性明显好于鸡胚法。见下表：
表1流感病毒滴度检测方法比较
实施例2
将流感病毒稀释至每0.5ml含1～5个病毒(即每孔1～5个空斑)，分别用鸡胚法和空斑法检测流感病毒感染滴度。检测阳性检出率，比较两种方法的灵敏度。阳性捡出率，空斑法和鸡胚法分别为100％对67％和67％对50％。空斑法灵敏度高于鸡胚法。见下表：
表2灵敏度的比较
备注：“+”表示阳性、“-”表示阴性
实施例3
见图1A和图1B，分别采用终浓度为1％和0.5％的Agarose覆盖物，进行试验操作。比较不同的终浓度对出斑的影响。当Agarose浓度由1％降至0.5％，病毒形成的空斑随之变大，病毒空斑边缘模糊不清，病毒与病毒之间融合的较多。所以，我们选用的Agarose浓度为1％。
实施例4
见图2A和图2B，35℃培养箱流感病毒分别吸附60min和90min后加入第一层覆盖物。比较不同吸附时间对出斑的影响。采用吸附感染能缩短病毒在液体中游离的时间，使病毒吸附宿主细胞相对同步，出斑时间相对一致，有利结果判定。一般病毒吸附时间常在60min和90min之间，本次试验选用这两个时间点。吸附90min比60min出斑数要多，肉眼更容易分辨。
实施例5
见图3A和图3B，流感病毒在33℃和35℃培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖。本次试验在33℃和35℃条件下进行了比较。流感病毒在33℃和35℃培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖。本次试验在33℃和35℃条件下进行了比较。出斑情况35℃好于33℃。
实施例6
按上述方法，五个不同操作者同时用空斑法检测同一个流感病毒感染滴度，分别重复5次以上，对结果进行分析。五名操作者CV在1.5％～5.3％之间，小于30％。
表3病毒滴度检测方法的精密度分析(1gPFU/ml)

Claims (4)

1.一种流感病毒滴度的检测方法，其特征在于：采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度，其步骤有：
（1）将流感病毒按10倍系列稀释，取各稀释度病毒液加入Vero细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔， 35℃吸附90min后倒掉病毒液；
（2）加入保持37℃～42℃的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培养72小时；
（3）加入保持37℃～42℃的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后，35℃倒置培养24～48小时判定结果，选择出斑数在10～100个进行数斑；
（4）根据Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度；
（5）将流感病毒稀释至每0.5ml含1～5个病毒（即每孔1～5个空斑），分别用鸡胚法和空斑法检测流感病毒感染滴度，检测阳性检出率，比较两种方法的灵敏度；
（6）分别采用终浓度为1％和0.5％的Agarose覆盖物，进行试验操作，比较不同的终浓度对出斑的影响；
（7）35℃培养箱流感病毒分别吸附60min和90min后加入第一层覆盖物，比较不同吸附时间对出斑的影响；
（8）流感病毒在33℃和35℃培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖；
（9）按上述方法，五个不同操作者同时用空斑法检测同一个流感病毒感染滴度，分别重复5次以上，对结果进行分析；
其中采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的病毒稀释液为含6μg/ml胰酶的无血清培养基；
采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第一层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基43.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3 3ml、HEPES 1.5ml、3％谷氨酰胺 1ml、0.25％胰酶0.3ml、双抗1ml；
采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第二层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基38.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3 3ml、HEPES 1.5ml、3％谷氨酰胺 1ml、0.25％胰酶0.3ml、双抗1ml、 中性红5ml。
2.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持40℃的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培养72小时。
3.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持40℃的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。
4.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时选择出斑数在30～70个进行数斑。
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