CN106383226A - 猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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CN106383226A CN201610690963.8A CN201610690963A CN106383226A CN 106383226 A CN106383226 A CN 106383226A CN 201610690963 A CN201610690963 A CN 201610690963A CN 106383226 A CN106383226 A CN 106383226A
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Abstract

本发明公开了一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒。该方法是通过用已知量的猪瘟病毒与不同稀释度的待检猪血清进行中和，中和后接种ST细胞，培养2‑5天，通过间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价(中和结果)，从而间接获得猪血清中和抗体的效价。本发明检测时间短、操作简单、成本低廉、结果准确特异，能真实反映免疫猪群的中和抗体水平，可用于疫苗免疫程序的制定、鉴别疫苗的质量、监测猪群的免疫状态等，应用广泛。

Description

猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别是涉及一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CFS)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起的一种急性、热性高度接触性传染病，主要临床症状有：稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点。猪瘟病毒主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和病死率高，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。猪瘟是严重危害全球养猪业的重要传染病,是世界动物卫生组织(OIE)疫病目录所列的必须通报的疫病之一。近年来,我国猪瘟时有发生,主要表现为隐性带毒和慢性感染,成为影响养猪业发展的一大隐患。
对猪瘟的成功控制主要依赖于疫苗免疫。因此，疫苗免疫效果的优劣对猪瘟的防控起到了决定性作用。猪瘟抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，另外，猪瘟抗体水平检测对于猪瘟疫苗免疫程序的制定也具有重要意义。
目前，猪瘟抗体水平的检测方法主要有间接血凝试验、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)、病毒中和试验等。间接血凝试验主观性强，检测效率低，不适合大批量检测。液相阻断ELISA检测方法操作简便、方法敏感、检测样本量大，但由于自身的弊端，容易出现非特异性反应，且检测成本高。病毒中和试验以测定病毒感染力为基础，以病毒与血清中和后的感染力为依据，从而判断血清中抗体消长情况及抗体对病毒的中和能力。病毒中和实验结果准确特异，能真实反映猪群的免疫抗体水平。
国内常规使用中和兔体试验，但实验中一些不可控制的动物因素，如动物间个体差异等可能造成结果的变化，且操作时所需人力物力成本较高，且对操作人员的专业技能要求较高，在实际应用中不易操作。而国际上采用的中和免疫荧光试验，由于采用了猪瘟病毒强毒株作为试验毒株，由于其容易散毒且不易获得等因素，使其推广应用也受到了限制。因此，迫切需要一种猪血清中猪瘟中和抗体的定量检测方法及检测试剂盒。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法。
本发明所提供的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，是以猪瘟兔化弱毒细胞毒为中和毒株，先将已知滴度的猪瘟兔化弱毒细胞毒和不同稀释度的灭活猪血清混合进行中和反应，再将中和后毒液感染已知细胞浓度的ST细胞悬液，最后，以猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2Monoclional Antibody为一抗，以过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价。
在上述猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法中，所述用于作中和毒的猪瘟兔化弱毒细胞毒稀释至200TCID50，同时以100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒为回归对照；所述灭活猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；所述猪瘟兔化弱毒细胞毒与灭活猪血清的混合比例为1:1；所述ST细胞悬液的细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL，中和液与ST细胞悬液的混合比例为1:1。
所述用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价的方法包括以下步骤：
a.洗板；
b.用冷丙酮固定细胞，洗板；
c.用过氧化氢溶液去除细胞源性的过氧化酶，洗板；
d.加入猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2Monoclional Antibody(一抗)，孵育，使ST细胞质内猪瘟病毒与一抗特异结合，洗板；
e.加入用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，孵育，使二抗与一抗特异结合，洗板；
f.加入显色液显色，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：被感染细胞胞质呈现红色，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性；
g.根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价：根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，说明中和毒稀释准确，判定结果有效，否则结果无效。
具体来讲，本发明所提供的猪血清中猪瘟中和抗体的定量检测方法，可包括以下步骤：
1)待检猪血清灭活：将无菌采集的待检猪血清置55-57℃水浴灭活30-40min；
2)猪血清稀释：在细胞培养板各孔中加入50μL MEM培养液，随后在第一孔中加入待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL，再加入第三孔中，以此类推，直至最后一孔(将混合液弃去50μL)，猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，以此类推，每个不同稀释度待检猪血清设2-4个平行孔；
3)中和毒稀释：将猪瘟兔化弱毒细胞毒用MEM培养液稀释至200TCID50/100μL，再将稀释后的猪瘟兔化弱毒细胞毒进行2倍、20倍、200倍、2000倍稀释，得到100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒；
4)血清中和：按每孔50μL将200TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到步骤2)含不同稀释度猪血清的孔中，将猪血清与猪瘟兔化弱毒细胞毒37℃中和1h；同时设病毒回归对照，按每孔100μL将100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒加入空白孔中，每个稀释度设4-8个平行孔；
5)制备ST细胞悬液及培养ST细胞：将长满单层的猪睾丸(Swine Testis，ST)细胞用EDTA-胰蛋白酶消化分散，得到细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL的ST细胞悬液，将ST细胞悬液按每孔100μL加入步骤4)中的细胞培养板中，将细胞培养板放入恒温二氧化碳培养箱中在37℃、5％CO2条件下培养48h-120h；
6)用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价，具体过程如下：
6.1将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养孔内的液体，用PBS洗涤；
6.2每孔加入100μL 80％、-20℃冷丙酮4℃固定10-30min，弃去丙酮溶液，用PBS洗涤；
6.3每孔加入100μL 0.1％过氧化氢溶液，室温作用20-30min；
6.4加入用PBS稀释100-800倍(浓度为1.25-10μg/mL)的猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody(一抗)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去一抗，用PBS洗涤；
6.5加入用PBS稀释300-1000倍(浓度为1-3/μg/mL)的用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去二抗，用PBS洗涤；
6.6加入显色液室温显色10-20min，弃去显色液，PBS洗涤，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：被感染细胞胞质呈现红色，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性。
6.7根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价：根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，说明中和毒稀释准确，判定结果有效，否则结果无效。
在上述猪血清中猪瘟中和抗体的定量检测方法中，所述步骤1)中将无菌采集的待检猪血清置56℃水浴灭活30min，灭活的目的是灭活血清中的补体，消除非特异性的结合。
所述步骤5)中ST细胞悬液的细胞密度优选为0.2×106个ST细胞/mL，所述细胞培养时间优选为96h。
所述步骤6.2中的冷丙酮固定时间优选为30min，目的是将细胞固定在96孔细胞培养板上，防止细胞脱落。
所述步骤6.3中的过氧化氢溶液作用时间优选为20min，目的是去除细胞源性的过氧化酶。
所述步骤6.4中猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody(一抗)的稀释度优选为100倍，该稀释度着色效果清晰。
所述步骤6.5中用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)稀释度优选为500倍，该稀释度着色效果清晰，基本无背景着色。
所述步骤6.6中的显色时间优选为15min。
本发明的第二个目的是提供一种猪血清中猪瘟中和抗体的间接免疫过氧化物酶方法定量检测试剂盒。
本发明所提供的猪血清中猪瘟中和抗体的间接免疫过氧化物酶定量检测试剂盒，包括猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2Monocl ional Antibody(一抗)和用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)。
为方便检测，本发明的试剂盒还包括0.01mol pH7.4的PBS、过氧化酶底物显色液、80％丙酮固定液等。
本发明提供了一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，是通过用已知量的猪瘟病毒与不同稀释度的待检猪血清进行中和，中和后接种ST细胞，培养2-5天，通过间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价(中和结果)，从而间接获得猪血清中和抗体的效价。
本发明具有以下优点：
1)以猪瘟兔化弱毒细胞毒为中和毒株，该毒株易于获得，毒力弱，不易散毒；
2)采用猪瘟高敏感性ST细胞克隆株，该细胞感染猪瘟后产毒量高且稳定，试验结果稳定准确度高；
3)使用猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody为一抗，该抗体为商品化的抗体，容易获得，特异性强，与BVDV无交叉反应；使用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，抗体稀释度500倍以上着色效果清晰，大大节约了抗体使用量；使用过氧化物酶底物显色，显色后不会淬灭，显色结果可长期保存；另外，用普通显微镜即可观察显色结果，不需要使用昂贵的荧光显微镜；
4)检测时间短、操作简单、成本低廉、结果准确特异，能真实反映免疫猪群的中和抗体水平，可用于疫苗免疫程序的制定、鉴别疫苗的质量、监测猪群的免疫状态等，具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明用间接免疫过氧化物酶方法检测猪血清中和抗体的阳性结果(被感染细胞)。
具体实施方式
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例1、制备猪瘟兔化弱毒细胞毒(中和毒)及其TCID50测定
1、病毒的培养及收获
将猪瘟兔化弱毒脾淋毒(购自中监所)按照0.3％(质量体积比，W/V)接种于单层猪睾丸(Swine Testis，ST)细胞(来源于ATCC)，维持液使用MEM培养液(购自宜兴市赛尔生物科技有限公司)，新生牛血清(购自内蒙古金源康有限公司)含量1％-3％(V/V)，37℃培养4天后收获细胞培养物，记为1收，将1收培养物冻融3次后按照10％(V/V)接种于ST单层细胞，37℃培养4天，收获细胞培养物，记为2收，将2收培养物冻融3次后按照10％(V/V)接种于ST单层细胞，37℃培养4天，收获细胞培养物，记为3收。
2、测定病毒的TCID50
将猪瘟兔化弱毒脾淋毒3收毒液冻融3次后，用MEM培养液进行10倍系列稀释，即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个稀释度取100μL接种于96孔细胞培养板中的ST单层细胞，每个稀释度8个重复孔，并设立不接毒细胞孔为阴性对照，加入100μL无血清MEM。置37℃、5％CO2培养箱中培养72h。用间接免疫过氧化物酶方法检测病毒感染结果，记录各稀释度的显色孔数。显色结果如表1(“+”表示显色结果阳性)所示，根据karber方法计算毒液TCID50(细胞半数致死剂量)，根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)(其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔比例总和)，logTCID50＝-1-1(4.5-0.5)＝-5.0,故100μL该猪瘟兔化弱毒细胞毒的TCID50＝105.0。
表1 不同稀释度猪瘟兔化弱毒细胞毒感染ST单层细胞的间接免疫过氧化物酶方法检测结果
猪瘟毒液稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
显色结果 8/8(+) 8/8(+) 8/8(+) 8/8(+) 4/8(+) 0/8(+)
实施例2、猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测
本发明猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，包括以下步骤：
1)待检猪血清灭活：将无菌采集的待检猪血清置56℃水浴灭活30min(55-57℃水浴灭活30-40min均可)；
2)猪血清稀释：在细胞培养板各孔中加入50μL MEM培养液，随后在第一孔中加入待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL，再加入第三孔中，以此类推，直至最后一孔(将混合液弃去50μL)，猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每个不同稀释度待检猪血清设2个(2-4个均可)平行孔；
3)中和毒稀释：将实施例1获得的猪瘟兔化弱毒细胞毒(TCID50：105.0/100μL)用MEM培养液稀释至200TCID50/100μL，再将稀释后的猪瘟兔化弱毒细胞毒进行2倍、20倍、200倍、2000倍稀释，得到100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒，每个稀释度设4个(4-8个均可)平行(孔)；
4)血清中和：按每孔50μL将200TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到步骤2)含不同稀释度猪血清的孔中，将猪血清与猪瘟兔化弱毒37℃中和1h；同时设置病毒回归对照：按每孔100μL将100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到空白细胞孔中，每个稀释度设4个平行孔；
5)制备ST细胞悬液及培养ST细胞：将长满单层的猪睾丸(Swine Testis，ST)细胞用EDTA-胰蛋白酶(购自gibco)消化分散，得到细胞密度为0.2×106个ST细胞/mL(0.15-0.3×106个ST细胞/mL均可)的ST细胞悬液，，将ST细胞悬液按每孔100μL加入步骤4)中的细胞培养板中，将细胞培养板放入恒温二氧化碳培养箱中在37℃、5％CO2条件下培养96h(48h-120h均可)；
6)用间接免疫过氧化物酶方法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体滴度，具体过程如下：
6.1将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养孔内的液体，用PBS洗涤；
6.2每孔加入100μL 80％、-20℃冷丙酮4℃固定30min(10-30min均可)，弃去丙酮溶液，用PBS洗涤；
6.3每孔加入100μL 0.1％过氧化氢溶液，室温作用20min(20-30min均可)；
6.4加入用PBS稀释100倍(浓度为10μg/mL)(100-800倍均可，浓度为1.25-10μg/mL)的猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody(一抗，购自韩国金诺)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去一抗，用PBS洗涤；
6.5加入用PBS稀释500倍(浓度为2μg/mL)(300-1000倍均可，浓度为1-3μg/mL)的用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗，购自abcam)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去二抗，用PBS洗涤；
6.6加入显色液(购自美国Vector公司)室温显色15min(10-20min均可)，弃去显色液，PBS洗涤，用显微镜观察显色结果，被感染细胞胞质呈现红色，核质分明，且呈斑块状，记为阳性(见图1)；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性。
6.7根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体滴度，Karber计算公式为：logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；
间接免疫过氧化物酶方法检测猪血清中和抗体结果如表2(“+”表示显色结果阳性，“-”表示显色结果阴性)所示。病毒回归对照(是指验证病毒按照该TCID50稀释是否准确,稀释后病毒量是否在合适范围内，过浓、过稀会使抗体滴度结果偏低或偏高)结果如表3所示，0.1TCID50均为阴性，1TCID50 4个孔中有3个孔阳性，10TCID50、100TCID50 4个孔均为阳性，说明中和毒稀释符合标准(100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，判定结果有效，说明中和毒稀释准确，否则结果无效)，表明中和毒稀释准确。用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价，6份猪血清中猪瘟中和抗体效价如表4所示，可以看出7#、14#、15#、16#、20#、33#血清的抗体效价依次为：1:32、1:8、1:45、1:256、1:23、1:181。
表2 间接免疫过氧化物酶方法检测猪血清中和抗体结果
表3 病毒回归结果
病毒稀释度 结果
100TCID50 4/4(+)
10TCID50 4/4(+)
1TCID50 3/4(+)
0.1TCID50 0/4(+)
表4 6份猪血清中猪瘟中和抗体滴度检测结果
血清号 血清中猪瘟中和抗体滴度
7 1:32
14 1:8
15 1:45
16 1:256
20 1:23
33 1:181
实施例3、猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测试剂盒
本发明的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测试剂盒，包括猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody(一抗)和用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)。
为方便检测，本发明的试剂盒还包括0.01mol pH7.4的PBS、过氧化酶底物显色液、80％丙酮固定液等。
本发明试剂盒的使用方法参考实施例2。

Claims (10)

1.猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，是以猪瘟兔化弱毒细胞毒为中和毒株，先将已知滴度的猪瘟兔化弱毒细胞毒和不同稀释度的灭活猪血清混合进行中和反应，中和后病毒液与已知细胞浓度的ST细胞悬液混合，未被中和的猪瘟病毒会感染ST细胞并且繁殖，最后，以猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2Monoclional Antibody为一抗，以过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价。
2.根据权利要求1所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述用作中和毒的猪瘟兔化弱毒细胞毒稀释至200TCID50/100μL，同时以100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒为回归对照；所述灭活猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；所述猪瘟兔化弱毒细胞毒与灭活猪血清的混合比例为1:1；所述ST细胞悬液的细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL，中和液与ST细胞悬液的混合比例为1:1。
3.根据权利要求1或2所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价的方法，包括以下步骤：
a.洗板；
b.用冷丙酮固定细胞，洗板；
c.用过氧化氢溶液去除细胞源性的过氧化酶，洗板，；
d.加入猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2Monoclional Antibody(一抗)，孵育，使ST细胞质中的猪瘟病毒与一抗特异结合，洗板；
e.加入用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，孵育，使二抗与一抗特异结合，洗板；
f.加入显色液显色，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：细胞胞质呈现红色(被染色)，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性；
g.根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价的具体方法为：根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，说明中和毒稀释准确，判定结果有效，否则结果无效。
4.根据权利要求3所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：具体的检测方法，包括以下步骤：
1)待检猪血清灭活：将无菌采集的待检猪血清置55-57℃水浴灭活30-40min；
2)猪血清稀释：在细胞培养板各孔中加入50μL MEM培养液，随后在第一孔中加入待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL，再加入第三孔中，以此类推，直至最后一孔(将混合液弃去50μL)，猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每个不同稀释度待检猪血清设2-4个平行孔；
3)中和毒稀释：将猪瘟兔化弱毒细胞毒用MEM培养液稀释至200TCID50/100μL，再将稀释后的猪瘟兔化弱毒细胞毒进行2倍、20倍、200倍、2000倍稀释，得到100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒，每个稀释度设4-8个平行孔；
4)血清中和：按每孔50μL将200TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到步骤2)含不同稀释度猪血清的孔中，将猪血清与猪瘟兔化弱毒37℃中和1h；同时设置病毒回归对照，按照每孔100μL将100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到空白细胞孔中，每个稀释度设4-8个平行孔；
5)制备ST细胞悬液及培养ST细胞：将长满单层的猪睾丸(Swine Testis，ST)细胞用EDTA-胰蛋白酶消化分散，得到细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL的ST细胞悬液，将ST细胞悬液按每孔100μL加入步骤4)中的细胞培养板中，将细胞培养板放入恒温二氧化碳培养箱中在37℃、5％CO2条件下培养48h-120h；
6)用间接免疫过氧化物酶方法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价，具体过程如下：
6.1将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养孔内的液体，用PBS洗涤；
6.2每孔加入100μL 80％、-20℃冷丙酮4℃固定10-30min，弃去丙酮溶液，用PBS洗涤；
6.3每孔加入100μL 0.1％过氧化氢溶液，室温作用20-30min；
6.4加入用PBS稀释100-800倍(浓度为1.25-10μg/mL)的猪瘟单克隆抗体Anti-CSFVE2Monoclional Antibody(一抗)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去一抗，用PBS洗涤；
6.5加入用PBS稀释300-1000倍(浓度为1-3μg/μL)的用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去二抗，用PBS洗涤；
6.6加入显色液室温显色10-20min，弃去显色液，用PBS洗涤，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：细胞胞质呈现红色(被染色)，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性；
6.7根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价：根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，说明中和毒稀释准确，判定结果有效，否则结果无效。
5.根据权利要求4所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述步骤1)中将无菌采集的待检猪血清置56℃水浴灭活30min。
6.根据权利要求1所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述步骤5)中ST细胞悬液的细胞密度为0.2×106个ST细胞/mL，所述细胞培养时间为96h。
7.根据权利要求1所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述步骤6.2中的冷丙酮固定时间为30min；所述步骤6.3中的过氧化氢溶液作用时间为20min。
8.根据权利要求1所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述步骤6.4中猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody(一抗)的稀释度为100倍；所述步骤6.5中用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)稀释度为500倍。
9.根据权利要求1所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述步骤6.6中的显色时间为15min。
10.一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的间接免疫过氧化物酶定量检测试剂盒，包括猪瘟单克隆抗体Anti-CSFV E2 Monoclional Antibody(一抗)和用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112611867A (zh) * 2020-12-11 2021-04-06 新乡学院 一种csfv的ifa抗体检测方法
CN112611866A (zh) * 2020-12-11 2021-04-06 新乡学院 一种csfv的ipma中和抗体检测方法
CN112630445A (zh) * 2020-12-11 2021-04-09 新乡学院 一种csfv的ipma抗体检测方法
CN113552336A (zh) * 2021-07-22 2021-10-26 金宇保灵生物药品有限公司 一种基于ifa的brv血清中和抗体效价水平的检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240264A (zh) * 2008-03-21 2008-08-13 南京农业大学 猪圆环病毒2型灭活疫苗
CN101915837A (zh) * 2010-07-28 2010-12-15 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
CN103751774A (zh) * 2013-07-17 2014-04-30 哈尔滨维科生物技术开发公司 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用
CN103777009A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 辽宁成大动物药业有限公司 一种使用辣根过氧化物酶标抗体检测猪瘟弱毒病毒滴度的方法
CN105242044A (zh) * 2015-11-23 2016-01-13 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 猪瘟病毒e2蛋白定量的检测方法
CN105527442A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法
CN105675861A (zh) * 2016-01-11 2016-06-15 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的gcrv病毒ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法
CN105829892A (zh) * 2013-12-19 2016-08-03 英特维特国际股份有限公司 Csfv抗体的改进的诊断测试

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240264A (zh) * 2008-03-21 2008-08-13 南京农业大学 猪圆环病毒2型灭活疫苗
CN101915837A (zh) * 2010-07-28 2010-12-15 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
CN103777009A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 辽宁成大动物药业有限公司 一种使用辣根过氧化物酶标抗体检测猪瘟弱毒病毒滴度的方法
CN103751774A (zh) * 2013-07-17 2014-04-30 哈尔滨维科生物技术开发公司 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用
CN105829892A (zh) * 2013-12-19 2016-08-03 英特维特国际股份有限公司 Csfv抗体的改进的诊断测试
CN105527442A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法
CN105242044A (zh) * 2015-11-23 2016-01-13 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 猪瘟病毒e2蛋白定量的检测方法
CN105675861A (zh) * 2016-01-11 2016-06-15 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的gcrv病毒ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王海光: "猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗效检替代方法和猪瘟病毒鉴别检测方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
郑天然: "混合血清中和抗体测定法用于猪瘟免疫监测", 《中国兽医科技》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112611867A (zh) * 2020-12-11 2021-04-06 新乡学院 一种csfv的ifa抗体检测方法
CN112611866A (zh) * 2020-12-11 2021-04-06 新乡学院 一种csfv的ipma中和抗体检测方法
CN112630445A (zh) * 2020-12-11 2021-04-09 新乡学院 一种csfv的ipma抗体检测方法
CN113552336A (zh) * 2021-07-22 2021-10-26 金宇保灵生物药品有限公司 一种基于ifa的brv血清中和抗体效价水平的检测方法

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