CN101915837A - 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪瘟兔化弱毒活疫苗的效力检验方法。本发明包括以下技术步骤：(1)建立猪瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效价测定方法；(2)通过实验证实病毒效价与兔体试验或与猪体试验之间的数量关系；(3)应用数量关系，对疫苗进行体外效力检验和结果判定。本发明避免了猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验常规方法采用的兔体试验或猪体试验，具有避免动物品种和个体差异的影响，提高效力检验结果的准确性，缩短检验时间，减少劳动强度和检验成本等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报性疫病，我国将其划为一类动物传染病。
长期以来，猪瘟兔化弱毒活疫苗免疫一直是世界上广为采用的最有效、经济的猪瘟控制方法。我国研制和使用猪瘟兔化弱毒活疫苗已有近50年历史，并为世界上许多国家猪瘟的控制和消灭做出了重要贡献。目前，我国实行强制免疫猪瘟弱毒活疫苗作为控制猪瘟的主要手段。疫苗质量无疑是保证猪瘟防控效果的最关键因素，而保证疫苗质量的最重要环节是效力检验，因此效力检验则是重中之重。根据已有的方法，猪瘟兔化弱毒活疫苗的效力检验可以采用家兔或猪进行。用家兔效检，每批疫苗约需7天，实验结果易受家兔品种和个体差异影响，且劳动强度大；用猪效检，每批疫苗需猪7头，并且预先需用兔体中和试验对实验猪进行抗体检测，耗时约需3周。由此可见，两种效检方法均存在很大不足，亟需进一步改进提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法。本发明是通过以下技术路线来实现的：
1.建立猪瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效价测定方法是：(1)选择细胞系用于测定疫苗的病毒效价；(2)细胞的传代与培养：将上述细胞消化并用培养液制成细胞悬液，接种24孔组织培养板，在CO2培养箱中培养成单层细胞；(3)将疫苗10倍系列稀释后接种至细胞培养板，同时设立阴性、阳性对照；(4)病毒吸附后加入维持液在CO2培养箱中静置培养3天；(5)培养结束时，用固定液固定细胞；(6)用标记的猪瘟特异性抗体进行免疫染色；(7)观察结果，计算病毒效价(TCID50/0.1ml)。
2.通过实验证实病毒效价与兔体试验或与猪体试验之间的数量关系；
3.实现对疫苗进行体外效力检验，最终根据数量关系计算和判定结果。
本发明的详细描述：
一、试剂、材料
1 猪瘟病毒参考毒株
猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)、猪瘟病毒石门强毒株，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和提供。
2 细胞系
本发明所用的细胞系为猪肾细胞(PK-15或SK-6)、猪睾丸细胞(ST)、牛肾细胞(MDBK)、牛睾丸细胞(BT)、兔肾细胞(RK-13)和/或其他猪瘟病毒兔化弱毒株适应的细胞系中的一种细胞(均来自中国兽医药品监察所)，需要按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程.二○○○年版.化学工业出版社，2001，本发明以下简称《规程》)和/或《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2005，本发明以下简称《中国兽药典》)要求检测不含外源病毒。
3 细胞培养液
90％～95％MEM(或DMEM)+5～10％的胎牛血清(新生牛血清)，pH调至7.0～7.4。
4 细胞维持液
98％MEM(或DMEM)+2％的胎牛血清(新生牛血清)+双抗(青霉素和链霉素，终浓度各100IU/ml，以下同)，pH调至7.2～7.4。
5 稀释液
99％MEM(或DMEM)+双抗(终浓度各100IU/ml)。
6 固定液
50％丙酮-甲醇溶液(50％丙酮+50％甲醇)或80％丙酮水溶液(80％丙酮+20％水)。
7 抗体
本发明所涉及的猪瘟特异性抗体为荧光或酶标记的猪瘟单克隆抗体、荧光或酶标记的猪瘟多克隆抗体，荧光或酶标记的第二抗体(二抗)与猪瘟单克隆抗体或多克隆抗体联用。以上猪瘟多克隆抗体为猪源或兔源。
8 DAB显色液
(1)0.05M TB：0.2M Tris-HCl 133ml加NaCl 6.20g，加去离子水至400ml，调至pH 7.6；
(2)DAB显色液：DAB 500mg加入100ml 0.05M的TB中(先以少量TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀)过滤后备用；
(3)显色前加入30％的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01％。
9 实验动物
1.5～3kg的健康家兔；40～80kg的健康猪，按照《规程》和/或《中国兽药典》要求检测不含猪瘟中和抗体。
二、猪瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效价测定
1 细胞培养
将生长良好的细胞消化后加入适量培养液制成细胞悬液，接种至24孔组织培养板，每孔400μl，置35～38℃的CO2培养箱中培养成单层细胞。
2 接毒
(1)根据说明书标明的含量，用MEM或DMEM将待测疫苗复溶并稀释至1ml/头份；
(2)将稀释好的疫苗悬液10倍系列稀释至10-5；
(3)吸去细胞培养板中的生长培养基；
(4)每个稀释度的待测疫苗悬液以100μl/孔加入细胞培养板中，每个稀释度重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
(5)稀释的参考病毒对照以100μl/孔加入细胞培养板中，重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
(6)在细胞培养板上留3孔仅加入维持液作为细胞空白对照；
(7)将接种过的培养板在CO2培养箱中吸附60min，每10min轻轻转动培养板1次使细胞避免干燥；
(8)吸附完毕后，细胞培养板每个孔中加入300μl维持液，在35～38℃的CO2培养箱中静置培养3天。
3 固定
(1)培养结束时，倒掉维持液，迅速用PBS轻轻洗涤细胞，再用去离子水洗涤，风干；
(2)在培养板中加满细胞固定液，室温静置10～20min，弃去固定液，风干。
4 免疫染色下列方法任选其一。
(1)直接免疫荧光染色
1)在所有培养孔中加入100μl猪瘟荧光抗体，室温孵育45～60min；
2)在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
3)重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
4)用荧光显微镜检测每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈苹果绿荧光染色，则认为该孔为阳性。
(2)间接免疫荧光染色
1)在所有培养孔中加入100μl猪瘟抗体，室温孵育45～60min；
2)在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
3)重复上面的操作，共进行2次；
4)在所有培养孔中加入100μl荧光标记的二抗，室温孵育45～60min；
5)在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
6)重复上面的操作，共进行2次；
7)用荧光显微镜检测每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈苹果绿荧光染色，则认为该孔为阳性。
(3)直接免疫酶染色
1)在所有培养孔中加入100μl猪瘟酶标记抗体，室温孵育45～60min；
2)在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
3)重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
4)在所有培养孔中加入适量DAB显色液，37℃显色5～10min，镜下控制显色程度，及时终止；
5)在显微镜下观察每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈棕黄色或棕褐色，则认为该孔为阳性。
(4)间接免疫酶染色
1)在所有培养孔中加入100μl猪瘟抗体，室温孵育45～60min；
2)在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
3)重复上面的操作，共进行2次；
4)在所有培养孔中加入100μl酶标记的二抗，室温孵育45～60min；
5)在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
6)重复上面的操作，共进行2次；
7)在所有培养孔中加入200μl DAB显色液，37℃显色5～10min，镜下控制显色程度，及时终止；
8)在显微镜下观察每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈棕黄色或棕褐色，则认为该孔为阳性。
5 效价计算
(1)如果有可见的污染或在待测疫苗所有稀释度的孔中都出现毒性，则实验无效；
(2)阳性对照和空白对照成立，则实验有效，否则实验无效；
(3)如果实验有效，则按照《规程》和/或《中国兽药典》中的有关方法计算病毒效价(TCID50/0.1ml)。
三、病毒效价与动物试验数量关系测定
1 待测疫苗选择
选择常用的3种猪瘟兔化弱毒活疫苗，包括淋脾苗、细胞苗和政府采购苗，每种疫苗均选择来源于3个厂家的不同批次。
2 病毒效价测定、兔体试验和猪体试验
(1)病毒效价测定按照步骤2进行。
(2)兔体试验将疫苗稀释成不同稀释度，按照《规程》和/或《中国兽药典》中的有关方法注射家兔，测定体温反应。按照出现体温反应的最高稀释度计算兔体感染量(RID)。
(3)猪体试验将疫苗稀释成不同稀释度，按照《规程》和/或《中国兽药典》中的有关方法免疫猪和攻毒，计算半数保护量(PD50)。
3 病毒效价与动物实验的数量关系
根据实验结果(见表1)，可以推算出兔体15个TCID50相当于1个兔体感染量(RID)或0.25个猪体半数保护量(PD50)。
表1 猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价与动物试验结果
4 实验结果判定
(1)根据数量关系计算实验结果
根据测出的病毒效价(TCID50/0.1ml)以及疫苗标明的头份和稀释情况计算出每头份疫苗的兔体感染量(RID)或猪体半数保护量(PD50)。
(2)结果判定
根据计算出的每头份疫苗的兔体感染量(RID)或猪体半数保护量(PD50)，及相关质量标准，判定该疫苗效力检验是否合格。
本发明的积极意义
本发明涉及一种猪瘟兔化弱毒活疫苗的体外效力检验方法。本发明通过测定疫苗的病毒效价，并根据病毒效价与兔体试验(或猪体试验)的数量关系计算和判断疫苗效力检验的结果，从而避免猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验常规方法采用的兔体试验或猪体试验。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)避免了动物品种、饲养状况、健康状况等个体差异的影响，提高了效力检验结果的准确性和可重复性；
(2)缩短了检验时间，将检验时间由7～10天缩短至4天；
(3)减少劳动强度，避免了饲养动物、观测动物等长时间、高强度劳动；
(4)降低了检验成本，避免了动物购买、动物房占用和人力成本等。
具体实施例
本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。
实施例1
1 试剂、材料
1.1 猪瘟参考病毒
猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和提供。
1.2 细胞系
兔肾细胞(RK-13)，按照《规程》检测不含外源病毒。
1.3 细胞培养液
90％MEM+10％胎牛血清，pH 7.2。
1.4 细胞维持液
98％MEM+2％胎牛血清+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.5 稀释液
99％MEM+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.6 固定液
50％丙酮-甲醇溶液(50％丙酮+50％甲醇)。
1.7 抗体
猪源猪瘟荧光抗体(由中国兽医药品监察所提供)。
2 猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价测定
2.1 细胞培养
将生长良好的细胞消化后加入适量培养液制成细胞悬液，接种至24孔组织培养板，每孔400μl，置37℃的CO2培养箱中培养成单层细胞。
2.2 接毒
2.2.1 根据疫苗说明书标明的含量，用稀释液将待测疫苗复溶并稀释至1ml/头份；
2.2.2 将稀释好的疫苗悬液10倍系列稀释至10-5；
2.2.3 吸去细胞培养板中的生长培养基；
2.2.4 每个稀释度的待测疫苗悬液以100μl/孔加入细胞培养板中，每个稀释度重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.5 稀释的参考病毒对照以100μl/孔加入细胞培养板中，重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.6 在细胞培养板上留3孔仅加入维持液作为细胞空白对照；
2.2.7 将接种过的培养板在CO2培养箱中吸附60min，每10min轻轻转动培养板1次使细胞避免干燥；
2.2.8 吸附完毕后，细胞培养板每个孔中加入300μl维持液，在37℃的CO2培养箱中静置培养3天。
2.3 固定
2.3.1 培养结束时，倒掉维持液，迅速用PBS轻轻洗涤细胞，再用去离子水洗涤，风干；
2.3.2 在培养板中加满细胞固定液，室温静置10～20min，弃去固定液，风干。
2.4 免疫染色
2.4.1 在所有培养孔中加入100μl猪瘟荧光抗体，室温孵育45～60min；
2.4.2 在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
2.4.3 重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
2.4.4 用荧光显微镜检测每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈苹果绿荧光染色，则认为该孔为阳性。
2.5 效价计算
结果所有孔无可见污染，并且在待测疫苗所有稀释度的孔中均未出现毒性，并且阳性对照和空白对照均成立，实验有效；按照《规程》的有关方法计算病毒效价为1.5×103TCID50/0.1ml。
3 结果判定
根据数量关系计算得出该疫苗的效力为1000RID/头份，大于质量标准所要求的750RID/头份，判定合格。
实施例2
1 试剂、材料
1.1 猪瘟参考病毒
猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和提供。
1.2 细胞系
兔肾细胞(RK-13)，按照《规程》检测不含外源病毒。
1.3 细胞培养液
90％MEM+10％胎牛血清，pH 7.2。
1.4 细胞维持液
98％MEM+2％胎牛血清+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.5 稀释液
99％MEM+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.6 固定液
50％丙酮-甲醇溶液(50％丙酮+50％甲醇)。
1.7 抗体
猪源猪瘟酶标记抗体(由中国兽医药品监察所提供)。
1.8 DAB显色液
1.8.1 0.05M TB：0.2M Tris-HCl 133ml加NaCl 6.20g，加去离子水至400ml，调至pH 7.6；
1.8.2 DAB显色液：DAB 500mg加入100ml 0.05M的TB中(先以少量TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀)过滤后备用；
1.8.3 显色前加入30％的H2O2 30～40μl，使其终浓度为0.01％。
2 猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价测定
2.1 细胞培养
将生长良好的细胞消化后加入适量培养液制成细胞悬液，接种至24孔组织培养板，每孔400μl，置37℃的CO2培养箱中培养成单层细胞。
2.2 接毒
2.2.1 根据疫苗说明书标明的含量，用稀释液将待测疫苗复溶并稀释至1ml/头份；
2.2.2 将稀释好的疫苗悬液10倍系列稀释至10-5；
2.2.3 吸去细胞培养板中的生长培养基；
2.2.4 每个稀释度的待测疫苗悬液以100μl/孔加入细胞培养板中，每个稀释度重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.5 稀释的参考病毒对照以100μl/孔加入细胞培养板中，重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.6 在细胞培养板上留3孔仅加入维持液作为细胞空白对照；
2.2.7 将接种过的培养板在CO2培养箱中吸附60min，每10min轻轻转动培养板1次使细胞避免干燥；
2.2.8 吸附完毕后，细胞培养板每个孔中加入300μl维持液，在37℃的CO2培养箱中静置培养3天。
2.3 固定
2.3.1 培养结束时，倒掉维持液，迅速用PBS轻轻洗涤细胞，再用去离子水洗涤，风干；
2.3.2 在培养板中加满细胞固定液，室温静置10～20min，弃去固定液，风干。
2.4 免疫染色
2.4.1 在所有培养孔中加入100μl猪瘟酶标记抗体，室温孵育60min；
2.4.2 在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
2.4.3 重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
2.4.4 在所有培养孔中加入适量DAB显色液，37℃显色5～10min，镜下控制显色程度，及时终止；
2.4.5 在显微镜下观察每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈棕黄色或棕褐色，则认为该孔为阳性。
2.5 效价计算
结果所有孔无可见污染，并且在待测疫苗所有稀释度的孔中均未出现毒性，并且阳性对照和空白对照均成立，实验有效；按照《规程》的有关方法计算病毒效价为1.0×103TCID50/0.1ml。
3 结果判定
根据数量关系计算得出该疫苗的效力为667 RID/头份，大于质量标准所要求的150RID/头份，判定合格。
实施例3
1 试剂、材料
1.1 猪瘟参考病毒
猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和提供。
1.2 细胞系
兔肾细胞(RK-13)，按照《规程》检测不含外源病毒。
1.3 细胞培养液
90％MEM+10％胎牛血清，pH 7.2。
1.4 细胞维持液
98％MEM+2％胎牛血清+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.5 稀释液
99％MEM+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.6 固定液
50％丙酮-甲醇溶液(50％丙酮+50％甲醇)。
1.7 抗体
猪源猪瘟抗体(由中国兽医药品监察所提供)，荧光标记第二抗体(二抗，购于Sigma公司)。
2 猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价测定
2.1 细胞培养
将生长良好的细胞消化后加入适量培养液制成细胞悬液，接种至24孔组织培养板，每孔400μl，置37℃的CO2培养箱中培养成单层细胞。
2.2 接毒
2.2.1 根据疫苗说明书标明的含量，用稀释液将待测疫苗复溶并稀释至1ml/头份；
2.2.2 将稀释好的疫苗悬液10倍系列稀释至10-5；
2.2.3 吸去细胞培养板中的生长培养基；
2.2.4 每个稀释度的待测疫苗悬液以100μl/孔加入细胞培养板中，每个稀释度重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.5 稀释的参考病毒对照以100μl/孔加入细胞培养板中，重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.6 在细胞培养板上留3孔仅加入维持液作为细胞空白对照；
2.2.7 将接种过的培养板在CO2培养箱中吸附60min，每10min轻轻转动培养板1次使细胞避免干燥；
2.2.8 吸附完毕后，细胞培养板每个孔中加入300μl维持液，在37℃的CO2培养箱中静置培养3天。
2.3 固定
2.3.1 培养结束时，倒掉维持液，迅速用PBS轻轻洗涤细胞，再用去离子水洗涤，风干；
2.3.2 在培养板中加满细胞固定液，室温静置10～20min，弃去固定液，风干。
2.4 免疫染色
2.4.1 在所有培养孔中加入100μl猪源猪瘟抗体，室温孵育45～60min；
2.4.2 在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
2.4.3 重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
2.4.4 在所有培养孔中加入100μl荧光标记二抗，室温孵育45～60min；
2.4.5 在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
2.4.6 重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
2.4.7 用荧光显微镜检测每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈苹果绿荧光染色，则认为该孔为阳性。
2.5 效价计算
结果所有孔无可见污染，并且在待测疫苗所有稀释度的孔中均未出现毒性，并且阳性对照和空白对照均成立，实验有效；按照《规程》的有关方法计算病毒效价为1.5×103TCID50/0.1ml。
3 结果判定
根据数量关系计算得出该疫苗的效力为1000 RID/头份，大于质量标准所要求的750 RID/头份，判定合格。
实施例4
1 试剂、材料
1.1 猪瘟参考病毒
猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和提供。
1.2 细胞系
兔肾细胞(RK-13)，按照《规程》检测不含外源病毒。
1.3 细胞培养液
90％MEM+10％胎牛血清，pH 7.2。
1.4 细胞维持液
98％MEM+2％胎牛血清+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.5 稀释液
99％MEM+双抗(终浓度各100IU/ml)，pH 7.2。
1.6 固定液
50％丙酮-甲醇溶液(50％丙酮+50％甲醇)。
1.7 抗体
猪源猪瘟抗体(由中国兽医药品监察所提供)，酶标记二抗(购于Sigma公司)。
1.8 DAB显色液
1.8.1 0.05M TB：0.2M Tris-HCl 133ml加NaCl 6.20g，加去离子水至400ml，调至pH 7.6；
1.8.2 DAB显色液：DAB 500mg加入100ml 0.05M的TB中(先以少量TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀)过滤后备用；
1.8.3 显色前加入30％的H2O2 30～40μl，使其终浓度为0.01％。
2 猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价测定
2.1 细胞培养
将生长良好的细胞消化后加入适量培养液制成细胞悬液，接种至24孔组织培养板，每孔400μl，置37℃的CO2培养箱中培养成单层细胞。
2.2 接毒
2.2.1 根据疫苗说明书标明的含量，用稀释液将待测疫苗复溶并稀释至1ml/头份；
2.2.2 将稀释好的疫苗悬液10倍系列稀释至10-5；
2.2.3 吸去细胞培养板中的生长培养基；
2.2.4 每个稀释度的待测疫苗悬液以100μl/孔加入细胞培养板中，每个稀释度重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.5 稀释的参考病毒对照以100μl/孔加入细胞培养板中，重复3个孔，轻轻地转动培养板使之铺匀；
2.2.6 在细胞培养板上留3孔仅加入维持液作为细胞空白对照；
2.2.7 将接种过的培养板在CO2培养箱中吸附60min，每10min轻轻转动培养板1次使细胞避免干燥；
2.2.8 吸附完毕后，细胞培养板每个孔中加入300μl维持液，在37℃的CO2培养箱中静置培养3天。
2.3 固定
2.3.1 培养结束时，倒掉维持液，迅速用PBS轻轻洗涤细胞，再用去离子水洗涤，风干；
2.3.2 在培养板中加满细胞固定液，室温静置10～20min，弃去固定液，风干。
2.4 免疫染色
2.4.1 在所有培养孔中加入100μl猪源猪瘟抗体，室温孵育60min；
2.4.2 在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
2.4.3 重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
2.4.4 在所有培养孔中加入100μl酶标记二抗，室温孵育60min；
2.4.5 在各孔中加满PBS洗涤5min，倒掉；
2.4.6 重复上面的操作，共进行3次，风干或自然干燥；
2.4.7 在所有培养孔中加入适量DAB显色液，37℃显色5～10min，镜下控制显色程度，及时终止；
2.4.8 在显微镜下观察每个培养孔，如果看到典型的细胞浆(细胞质)呈棕黄色或棕褐色，则认为该孔为阳性。
2.5 效价计算
结果所有孔无可见污染，并且在待测疫苗所有稀释度的孔中均未出现毒性，并且阳性对照和空白对照均成立，实验有效；按照《规程》的有关方法计算病毒效价为1.0×103TCID50/0.1ml。
3结果判定
根据数量关系计算得出该疫苗的效力为667 RID/头份，大于质量标准所要求的150RID/头份，判定合格。
实施例5
可以用兔源猪瘟荧光抗体或猪瘟单克隆荧光抗体替代实施例1中的猪源猪瘟荧光抗体。
实施例6
可以用兔源猪瘟酶标记抗体或猪瘟单克隆酶标记抗体替代实施例2中的猪源猪瘟酶标记抗体。
实施例7
可以用兔源猪瘟抗体或猪瘟单克隆抗体替代实施例3、4中的猪源猪瘟抗体。
实施例8
可以用猪肾细胞(SK-6)、猪肾细胞(PK-15)、猪睾丸细胞(ST)、牛肾细胞(MDBK)和牛睾丸细胞(BT)中任何一种细胞替代实施例1、2、3、4、5、6、7中的兔肾细胞(RK-13)。
Claims (4)
1.一种猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)选择细胞系用于测定疫苗的病毒效价；
(2)细胞的传代与培养：将上述细胞消化并用培养液制成细胞悬液，接种24孔组织培养板，在CO2培养箱中培养成单层细胞；
(3)将疫苗10倍系列稀释后接种至细胞培养板，同时设立阴性、阳性对照；
(4)病毒吸附后加入维持液在CO2培养箱中静置培养3天；
(5)培养结束时，用固定液固定细胞；
(6)用标记的猪瘟特异性抗体进行免疫染色；
(7)观察结果，计算病毒效价(TCID50/0.1ml)。
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价的测定方法，其特征在于用于测定疫苗病毒效价的细胞系为猪肾细胞、猪睾丸细胞、牛肾细胞、牛睾丸细胞和兔肾细胞中的任一种细胞。
3.根据权利要求1所述的一种猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价的测定方法，其特征在于所涉及的猪瘟特异性抗体为荧光或酶标记的猪瘟单克隆抗体、荧光或酶标记的猪瘟多克隆抗体，荧光或酶标记的第二抗体与猪瘟单克隆抗体或多克隆抗体联用，以上猪瘟多克隆抗体为猪源或兔源。
4.根据权利要求1所述的一种猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒效价的测定方法，其特征在于通过病毒效价TCID50/0.1ml计算猪瘟兔化弱毒活疫苗兔体感染量RID或猪体半数保护量PD50并判断疫苗效力检验是否合格的方法：
(1)15个TCID50相当于1 RID和/或0.25 PD50；
(2)根据测出的病毒效价以及疫苗标明的头份和稀释情况计算出每头份疫苗的RID和/或PD50；
(3)根据计算出的每头份疫苗的RID和/或PD50，判断该疫苗效力检验是否合格。
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