CN103698518A - 一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法 - Google Patents

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王朝伟
张静
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Abstract

本发明属于生物检疫的技术领域，具体的涉及一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法。该种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步骤：(1)准备传代细胞；(2)测定猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量；(3)荧光染色接毒细胞。该方法通过用间接免疫荧光检测活疫苗在传代细胞中病毒，以达到快速准确、简单有效的检测出猪瘟活活疫苗病毒含量的目的。

Description

一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法
技术领域
本发明属于生物检疫的技术领域，具体的涉及一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法。
背景技术
猪瘟（Classical swine fever，CSF或hog cholera），又称经典猪瘟或古典猪瘟，是感染猪的一种高传染性疾病。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，并可能带有神经症状。母猪可能会流产或产下死猪崽。猪瘟为世界动物卫生组织所列的A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性传染病。许多国家和地区使用猪瘟活疫苗强制接种免疫，也是目前防治猪瘟的最佳方法。
目前，我国生产猪瘟活疫苗病毒含量的检测方法都是采用兔体反应热法，该法存在费时费力，操作复杂，成本较高，重复性差等缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的缺陷而提供一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，该方法通过用间接免疫荧光检测活疫苗在传代细胞中病毒，以达到快速准确、简单有效的检测出猪瘟活活疫苗病毒含量的目的。
本发明的技术方案为：一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步骤：
(1)准备传代细胞
将长满单层的细胞，用EDTA一胰酶消化分散，利用血清浓度为0.5%的细胞培养液终止消化，按照1:1传代比例获得传代细胞悬液，将细胞悬液铺96孔细胞培养板，每孔50uL；
(2)测定猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量
取4℃预冷细胞基础培养液，在冰盒上将猪瘟活疫苗进行10倍的倍比稀释，将不同稀释度的病毒悬液加入到（1）中96孔细胞培养板上的细胞悬液中，置于37℃温箱中吸附，2h后取出，每孔补加含1.5～2倍血清浓度的细胞培养液，每孔100uL，将培养板重新置于培养箱中培养72h，同时设立不接毒正常细胞对照；
(3)荧光染色接毒细胞
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；
②加入-20℃下预冷的甲醇，在4℃条件下固定20～30min；
③弃去甲醇，室温下自然挥干5min，PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；
④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清一抗，在37℃条件下吸附50min；
⑤弃去猪瘟阳性血清一抗，PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；
⑥加入PBS稀释的兔抗猪荧光二抗，在37℃下吸附40min；
⑦弃去兔抗猪荧光二抗，PBS洗涤2～3次，每次2～3min；
⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗感染滴度。
所述步骤(2)中猪瘟活疫苗稀释在0～4℃低温环境下进行。
所述步骤(2)中病毒接细胞后72h进行间接免疫荧光检测。
所述步骤(3)中猪瘟阳性血清一抗的稀释倍数为40倍，兔抗猪荧光二抗的稀释倍数为32倍。
所述步骤(1)中预冷细胞基础培养液为MEM培养基。
本发明的有益效果为：本发明所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，通过用间接免疫荧光检测活疫苗在传代细胞中病毒，所选用的条件参数使得检测结果更加准确，具有以下特点：
（1）检测时间短，只需要1天，而通常用兔体感染剂量检测至少需要11天。
（2）用细胞感染病毒，操作相对简单，成本低，不需要买大量的实验动物，同时不需要专人测定实验动物体温。
（3）利用细胞感染病毒，条件均一、稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验结果差异显著。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的说明。
一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步骤：
(1)准备传代细胞
将长满单层的细胞，用EDTA一胰酶消化分散，利用血清浓度为0.5%的细胞培养液终止消化，按照1:1传代比例获得传代细胞悬液，将细胞悬液铺96孔细胞培养板，每孔50uL；
(2)测定猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量
将猪瘟兔化弱毒株接种ST细胞，将收获的病毒抗原液-80℃保存，取4℃预冷MEM培养基，在冰盒上将猪瘟活疫苗进行10倍的倍比稀释，将10-2～10-6稀释度的病毒悬液加入到（1）中96孔细胞培养板上的细胞悬液中，置于37℃温箱中吸附，2h后取出，每孔补加含1.5～2倍血清浓度的细胞培养液，每孔100uL，每个稀释度做4～6孔重复，将培养板重新置于CO2培养箱中在33～35℃条件下培养72h，同时设立不接毒正常细胞对照；
(3)荧光染色接毒细胞
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用0.005mol/L，pH值为7.4的PBS洗涤3次，每次2min，并轻轻甩干；
②加入-20℃下预冷的甲醇，在4℃条件下固定30min。
③弃去甲醇，室温下自然挥干5min，0.005mol/L，pH值为7.4的PBS洗涤2次，每次3min，并轻轻甩干；
④加入用0.005mol/L，pH值为7.4的PBS稀释40倍的猪瘟阳性血清一抗，每孔45uL，在37℃条件下吸附50min；
⑤弃去猪瘟阳性血清一抗，用0.005mol/L，pH值为7.4PBS洗涤3次，每次2min，并轻轻甩干；
⑥加入用0.005mol/L，pH值为7.4的PBS稀释40倍的兔抗猪荧光二抗，每孔40uL，在37℃下吸附40min；
⑦弃去兔抗猪荧光二抗，用0.005mol/L，pH值为7.4PBS洗涤3次，每次2min；
⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，记录荧光孔数，判定猪瘟活疫苗感染滴度，按照Reed一Muench法计算TCID50。。
所述步骤(2)中猪瘟活疫苗稀释在0～4℃低温环境下进行。
所述步骤(2)中病毒接细胞后72h进行间接免疫荧光检测。间接免疫荧光(IFA)观察及毒价计算结果见下表：
Figure BDA0000450438470000041

Claims (5)

1.一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步骤：
(1)准备传代细胞
将长满单层的细胞，用EDTA一胰酶消化分散，利用血清浓度为0.5%的细胞培养液终止消化，按照1:1传代比例获得传代细胞悬液，将细胞悬液铺96孔细胞培养板，每孔50uL；
(2)测定猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量
取4℃预冷细胞基础培养液，在冰盒上将猪瘟活疫苗进行10倍的倍比稀释，将不同稀释度的病毒悬液加入到（1）中96孔细胞培养板上的细胞悬液中，置于37℃温箱中吸附，2h后取出，每孔补加含1.5～2倍血清浓度的细胞培养液，每孔100uL，将培养板重新置于培养箱中培养72h，同时设立不接毒正常细胞对照；
(3)荧光染色接毒细胞
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；
②加入-20℃下预冷的甲醇，在4℃条件下固定20～30min；
③弃去甲醇，室温下自然挥干5min，PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；
④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清一抗，在37℃条件下吸附50min；
⑤弃去猪瘟阳性血清一抗，PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；
⑥加入PBS稀释的兔抗猪荧光二抗，在37℃下吸附40min；
⑦弃去兔抗猪荧光二抗，PBS洗涤2～3次，每次2～3min；
⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗感染滴度。
2.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中猪瘟活疫苗稀释在0～4℃低温环境下进行。
3.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中病毒接细胞后72h进行间接免疫荧光检测。
4.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中猪瘟阳性血清一抗的稀释倍数为40倍，兔抗猪荧光二抗的稀释倍数为32倍。
5.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中预冷细胞基础培养液为MEM培养基。
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