CN101234198A - 猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“sd1株”的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法，该疫苗是由水相和油相按下述重量百分比含量配制而成：水相，由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒“SD1株”培养液96份，加入4份吐温－80，充分混匀而成，水相占疫苗总量的33％；油相，由94份10号白油和6份司本－80混合，再按总量加入2％硬脂酸铝搅拌至透明，于116℃高压灭菌制成，油相占疫苗总量的67％。本疫苗保存期达12个月，对猪繁殖与呼吸综合症易感动物安全可靠，适用于不同品种、各种日龄猪，免疫保护率达80％以上，免疫有效期持续6个月以上。疫苗安全性和免疫效力达国际同类产品先进水平。

Description

猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法

1、技术领域

本发明涉及兽医生物制品中猪繁殖与呼吸综合症疫苗领域，具体是猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法。

2、背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称“蓝耳病”，是上世纪80年代末出现的一种新的猪病毒性传染病。病原PRRS病毒(PRRSV)为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组长度约为15Kb，含有9个开放阅读框(ORFs)。PRRSV可侵害各年龄阶段的猪，造成种猪精液质量下降，母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄猪不同程度的呼吸道症状。PRRS现已遍布全球，成为当前危害国内外养猪业最为严重的疫病之一。另外，PRRSV能够侵害猪的免疫系统，引起免疫抑制，一旦感染将影响到其它疫苗的免疫效果，造成免疫失败。在养猪生产中，PRRS与其他病毒或细菌性疾病的混合感染非常普遍，引起的临床症状更为复杂，给本病的诊断和综合防治带来更大难度。

我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份，在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80％以上，感染十分普遍，造成母猪繁殖水平不高，产仔率和仔猪成活率远远低于正常水平。自2006年6月初以来，在我国南方几个省份相继爆发高致病性猪蓝耳病，引起大批生猪发病或死亡，使我国的养猪业蒙受了更为严重的经济损失，造成目前猪肉价格长时间居高不下，已经引起了政府和社会上的高度关注。

选择压力导致近年来我国不同地区的PRRSV流行株呈较大的遗传及抗原变异，PRRS在一些地区未能得到有效控制。疫苗免疫是预防PRRS积极有效的措施之一，目前PRRS疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗两种，弱毒疫苗因其安全性问题备受争议，丹麦曾经因使用弱毒疫苗而导致大面积爆发蓝耳病，造成严重的经济损失。普通灭活疫苗虽然安全性较高，但往往由于抗原含量不足而无法发挥有效的免疫保护作用。因此研发交叉保护性好、免疫原性强、安全性高的PRRS疫苗是当前预防和控制PRRS的迫切需要。

3、发明内容

本发明的目的是提供一种可预防PRRS的安全、高效、可靠的猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法，用于PRRS的免疫预防和紧急接种。

本发明的目的猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法是按以下方式实现的。

本发明的猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”是由水相和油相按下述重量百分比含量配制而成：水相是由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症“SD1株”病毒培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成，水相占疫苗总量的33％；油相，由94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2％硬脂酸铝搅拌至透明，于116℃高压灭菌制成，油相占疫苗总量的67％。

上述含量原料按照下述工艺方法和顺序制备而成：

a、生产用毒种制备；

b、病毒增殖；

c、病毒灭活；

d、病毒浓缩；

e、半成品检验，包括：1)无菌检验；2)灭活检验；

f、疫苗配制程序：先配制油相，将94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2％硬脂酸铝随加随搅拌至透明为止，116℃高压灭菌后，取占疫苗总量67％的油相加入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，在搅动油相的同时，缓慢地加入占疫苗总量33％的水相，加完后再以10000r/min搅拌3-5min，在终止搅拌前加入0.01％硫柳汞。水相由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒“SD1株”培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成。g、成品检验，包括：1)物理性状；2)无菌检验；3)甲醛、硫柳汞含量测定；4)安全检验；5)效力检验包装既为成品。

在对PRRSV“SD1株”细胞培养生物学特性研究的基础上，我们对PRRS灭活疫苗生产工艺进行了研究，包括毒种标准及毒种繁殖、病毒增殖、病毒灭活、乳化工艺、安全检验等内容。将效价大于10^7.0TCID₅₀/mL的病毒液用终浓度为0.1％的甲醛于37℃灭活20h，加入4％吐温-80，然后用美国PALL浓缩仪将病毒浓缩2倍作为水相，与油相(按油水比2∶1的比例)于胶体磨中乳化而成。疫苗性状为油包水型，对不同品种、各种曰龄猪安全可靠，无毒副作用及不良反应。仔猪免疫剂量为2ml/头，成年猪免疫剂量为4ml/头。仔猪与母猪注射PRRS疫苗后能够产生较强的免疫力，免疫保护率达80％以上。仔猪经过一次免疫，母猪经过两次免疫后，在免疫2个月后中和抗体水平达到最高峰，免疫有效期达6个月以上。2～8℃条件下疫苗保存期暂定为12个月。疫苗安全性和免疫效力达到国际同类产品先进水平。选用3批猪繁殖与呼吸综合症油乳剂灭活疫苗“SD1株”进行田间试验，免疫接种了662头母猪，6844头仔猪，随后在GMP车间中间试制了6批PRRS灭活疫苗“SD1株”，共免疫成年猪2200头，仔猪20000余头，结果证明疫苗安全可靠，效力确实，有着广阔的应用前景。

4、具体实施方式

猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法，具体制备步骤如下：由水相和油相按下述重量百分比含量配制而成：水相，由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒“SD1株”培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成，水相占疫苗总量的33％；油相，由94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2％硬脂酸铝搅拌至透明，于116℃高压灭菌制成，油相占疫苗总量的67％。以上原料按照下述工艺方法和顺序实现。

1)、毒种选择

制苗用毒种为猪繁殖与呼吸综合症病毒PRRSV“SD1株”，美洲型(B型)。将PRRSV“SD1株”以含2.5％小牛血清的MEM作十倍递进稀释，取10^-3，10^-4，…，10^-86个稀释度，分别接种已经长成单层的Marc-145细胞，每个稀释度接种8孔，0.1mL/孔，同时设不接毒对照，连续观察5-7d，记录每个稀释度出现CPE的孔数。按Reed-Muench法计算半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)，每毫升病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀。

2)病毒增殖

2.1制苗材料的制备：将MEM配制成除菌滤过溶液，以7.5％NaHCO₃调pH至7.2-7.4，加入8％新生牛血清、100μ/mL青霉素和链霉素，混匀，配制成生长液。维持液的血清含量为2.5％，其他成分与生长液相同。取长成单层的Marc-145细胞，倾去生长液，加入适量0.025％胰蛋白酶与EDTA消化分散液(pH7.6-8.0)，于37℃消化至贴壁细胞分散，倒去残余液后加入生长液进行吹打、分散细胞。然后调整细胞密度为10-15万/mL，分装后置37℃培养，转瓶培养时转速为6-8转，约48h形成细胞单层。

2.2病毒接种：将细胞瓶内的生长液弃去，接种1％PRRSV“SD1株”，37℃吸附30min。然后加入维持液，置37℃继续培养。每天观察细胞变化与CPE情况，当CPE达80％左右时收毒。反复冻融3次后混匀病毒悬液，抽取小样，用96孔细胞培养板测定，病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀/mL。置-20℃保存。

3)病毒灭活

向病毒液中加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，充分混匀后置37℃灭活20h，其间每隔4-6h摇动病毒悬液一次，并更换瓶塞。

4)病毒浓缩

采用美国PALL浓缩仪将灭活后的病毒浓缩2倍。

5)半成品检验

5.1无菌检验：对灭活病毒液按《中国兽药典》附录第15页进行检验，应无细菌生长。

5.2灭活检验：取灭活毒液，用0.2％的焦亚硫酸钠作为中和剂终止灭活，接种长成单层的Marc-145细胞，换成维持液，逐日观察细胞形态，连续6d，应不出现CPE。盲传一代，亦不应出现CPE。

6)疫苗配制

先配制油相，将94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2％硬脂酸铝随加随搅拌至透明为止，116℃高压灭菌后，取占疫苗总量67％的油相加入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，在搅动油相的同时，缓慢地加入占疫苗总量33％的水相，加完后再以10000r/min搅拌3-5min，在终止搅拌前加入0.01％硫柳汞。水相由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒”SD1株”培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成。

7)成品检验

7.1物理性状检查：外观为乳白色的乳剂，剂型为油包水型(W/O)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。用1mL吸管(出口内径为1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需时间，应不超过8s。37℃放置21日，应无破乳、分层现象；将疫苗加入离心管，经3000r/min离心15min，应不出现分层。

7.2无菌检验：按《中国兽药典》附录15页进行检验，应无细菌生长。

7.3甲醛、硫柳汞含量测定：分别按《中国兽药典》附录25、24页进行，应符合兽用生物制品通则的规定。

7.4安全检验：下列两种方法任选其一

7.4.1仔猪安全检验：用5头3～4周龄仔猪，颈部皮下或肌肉注射疫苗4mL，观察4周，应无不良反应。

7.4.2母猪安全检验：用5头妊娠85～90d的母猪，颈部皮下或肌肉注射疫苗8mL，观察4周，应无不良反应，产仔应正常。

7.5效力检验：下列两种方法任选其一

7.5.1中和抗体测定：取3～4周龄PRRS抗体阴性的健康仔猪5头，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2mL。4周后，连同条件相同的对照仔猪3头，采血，分离血清，测定血清中和抗体效价。免疫猪至少有4头应≥1∶10，对照猪应为阴性。

7.5.2免疫攻毒试验：取3～4周龄PRRS抗体阴性的健康仔猪5头，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2mL，另外3头条件相同的对照仔猪不免疫。4周后，用强毒PRRS-S₁5攻毒，每头滴鼻4mL(4×10^5.5TCID₅₀)。免疫猪应至少保护4头，对照猪应至少2头发病或死亡。

Claims (1)

1、猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法，其特征在于由水相和油相按33％∶67％重量百分比配制而成：其中水相，是由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症“SD1株”病毒培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成；水相占疫苗总量的33％；油相，是由94份10号白油和6份司本-80混合，再按油相总量加入2％硬脂酸铝搅拌至透明，于116℃高压灭菌制成，油相占疫苗总量的67％；

制备步骤如下：

a生产用毒种制备；制苗用毒种为猪繁殖与呼吸综合症病毒PRRSV“SD1株”，美洲型(B型)，将PRRSV“SD1株”以含2.5％小牛血清的MEM作十倍递进稀释，取10^-3，10^-4，…，10^-86个稀释度，分别接种已经长成单层的Marc-145细胞，每个稀释度接种8孔，0.1mL/孔，同时设不接毒对照，连续观察5-7d，记录每个稀释度出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)，每毫升病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀；

b、病毒增殖和制苗材料的制备：将MEM配制成除菌滤过溶液，以7.5％NaHCO₃调pH至7.2-7.4，加入8％新生牛血清、100μ/mL青霉素和链霉素，混匀，配制成生长液，维持液的血清含量为2.5％，其他成分与生长液相同，取长成单层的Marc-145细胞，倾去生长液，加入适量0.025％胰蛋白酶与EDTA消化分散液(pH7.6-8.0)，于37℃消化至贴壁细胞分散，倒去残余液后加入生长液进行吹打、分散细胞，然后调整细胞密度为10-15万/mL，分装后置37℃培养，转瓶培养时转速为6-8转，约48h形成细胞单层；

c、病毒接种：将细胞瓶内的生长液弃去，接种1％PRRSV“SD1株”，37℃吸附30min，然后加入维持液，置37℃继续培养，每天观察细胞变化与CPE情况，当CPE达80％左右时收毒，反复冻融3次后混匀病毒悬液，抽取小样，用96孔细胞培养板测定，病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀/mL。置-20℃保存；

d、病毒灭活；向病毒液中加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，充分混匀后置37℃灭活20h，其间每隔4-6h摇动病毒悬液一次，并更换瓶塞；

e、病毒浓缩；采用美国PALL浓缩仪将灭活后的病毒浓缩2倍；

f、半成品检验

1)无菌检验：对灭活病毒液按《中国兽药典》附录第15页进行检验，应无细菌生长；

2)灭活检验：取灭活毒液，用0.2％的焦亚硫酸钠作为中和剂终止灭活，接种长成单层的Marc-145细胞，换成维持液，逐日观察细胞形态，连续6d，应不出现CPE；盲传一代，亦不应出现CPE；

g、疫苗配制

先配制油相，将94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2％硬脂酸铝随加随搅拌至透明为止，116℃高压灭菌后，取占疫苗总量67％的油相加入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，在搅动油相的同时，缓慢地加入占疫苗总量33％的水相，加完后再以10000r/min搅拌3-5min，在终止搅拌前加入0.01％硫柳汞，水相由灭活20小时、浓缩2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症“SD1株”病毒培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成；

h、成品检验，包括：

1)物理性状；

2)无菌检验；

3)甲醛、硫柳汞含量测定；

4)安全检验；

5)效力检验包装既为成品。