CN101020054B

CN101020054B - 防制鸽禽i型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN101020054B
Application number: CN2007100270621A
Authority: CN
Inventors: 邹永新; 刘思迦; 余双祥; 肖智远; 黄爱芳; 罗映霞; 孙明华; 蔡弋; 李胜; 姜文联; 关建新; 吴林; 陈益填; 卢桂强; 邱深本; 李剑荣; 刘英强; 朱国锋; 凌育燊; 杨连楷
Original assignee: Guangdong institute of poultry science
Current assignee: Guangdong institute of poultry science
Priority date: 2007-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2027-03-06
Also published as: CN101020054A

Abstract

本发明提出一种防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法，所述的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗，是应用申请人所筛选出的免疫原性强、对流行毒株有高保护率的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605，接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原，将PA/PMV-I抗原灭活后，加入佐剂混配而成。本疫苗对防制鸽禽PA/PMV-I病，特异、安全、有效。

Description

防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及防治鸽禽I型副粘病毒病的疫苗及其制备方法。

背景技术

鸽禽I型副粘病毒(PA/PMV-I)病，俗称鸽瘟，又称鸽新城疫，是由禽I型副粘病毒(A/PMV-I)引起鸽的一种高度接触性、败血性的急性传染病。自从20世纪80年代初，在我国部分地区发现以来，现已普遍发生于我国各养鸽地区，且一直是鸽病中发生频率最高、危害性最大的一种疾病，在不同品种、龄期的鸽子中都能感染发病，且传播迅速，发病率高，死亡率一般为20％～80％之间，耐过者常因有神经症状而被迫淘汰，造成了很大的经济损失。此外，本病病原与鸡新城疫的病原(NDV)同属禽副粘病毒，现场发病情况及流行病学的研究证明本病病原对鸡的毒力较弱，NDV也能感染敏感鸽，并使之发病和死亡。因此本病病原对鸡等家禽也是一种严重的潜在威胁。

为防制本病，目前许多鸽场均应用鸡新城疫弱毒(NDV)疫苗或PA/PMV-I同源病毒制备的灭活疫苗免疫接种。应用鸡NDV疫苗免疫鸽群，一般不能获得满意的效果，只能获得低水平保护，保护率仅有20％左右，且免疫期短；而目前以PA/PMV-1同源病毒制备的灭活疫苗免疫，虽能为免疫鸽提供较为持久的免疫保护，但亦有免疫鸽群仍发生PA/PMV-I病。因此，安全、有效的PA/PMV-I疫苗的研究和开发显得非常迫切和重要。

为提高疫苗的免疫保护效果，在疫苗的制备过程中常采用添加免疫系统的调节剂及免疫佐剂。

发明内容

多年来，本申请人在防治禽病的临诊和开展科研工作的基础上，对PA/PMV-I进行了流行病学跟踪调查和现场防治实践，在此过程中从全国多个省市的不同地区、品种、龄期的发病鸽群中成功分离并鉴定到的23株PA/PMV-1中，筛选出1株免疫原性强、对流行毒株有高保护率的疫苗种毒。另外，在对家禽疫苗、抗体、免疫增强剂等生物制剂以及中药制剂等方面，进行了大量的研究，提出了疫苗、佐剂的研制方法和工艺；结果研制出了鸽禽I型副粘病毒病疫苗，经实验室及适度的现场试验，证明本疫苗安全，有效。

本发明的目的就是提出一种安全、有效的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法。

本发明所提出的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗，是应用申请人所筛选出的免疫原性强、对流行毒株有高保护率的疫苗种毒，该种毒被鉴定命名为：鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902，用该种毒接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原，将PA/PMV-I抗原灭活后，加入佐剂混配而制成所述的疫苗。

所述的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902的相关特性测定结果如下：

1.1种毒的特性测定：

本病毒属副粘病毒科，为RNA病毒，电镜下观察病毒呈圆形、椭圆形或不规则的病毒粒子，在电镜下为有纤突的病毒粒子，直径均为120～200nm。对理化因素的抵抗力不强，经紫外线照射或在100℃条件下1min，55℃时20～60min可全部被灭活。对氯仿、乙醚、胰酶及酸敏感，能被二价镁离子保护。病毒的囊膜上具有HN纤突，具有凝集红细胞的能力，能凝集鸡、鸭、鹅、鸽、人、猪、牛、羊、豚鼠、小白鼠的红细胞。本病毒可在鸡(鸭)胚中繁殖，尿囊腔接种9～11日龄的易感鸡胚，37℃培养72h～96h，可致死鸡胚，收获胚液测定HA效价≥71og₂。分别取抗NDV、AI-H5、AI-H9和EDSV血清抗体，4～8个血凝单位的本病毒液为抗原，作HI试验，结果表明，本病毒能被抗NDV血清所抑制，而不能被抗AI-H5、AI-H9、AI-H7和EDSV血清抗体所抑制。

本病毒接种SPF鸡胚成纤维细胞单层后，44～48h出现细胞病变，形成多核巨细胞；空斑试验结果表明，分离毒于接种5d后形成3种大小不同的空斑，随着时间的延长，空斑日渐增大，最后连成一片。于接种7d后测量空斑大小为：大斑2.0～2.5mm，中斑1.3～1.8mm，小斑0.5～1.0mm。

1.2种毒毒力测定

1.2.1攻毒用种毒，选用本种毒毒株的原代毒，经SPF鸡胚传代，毒力在第6～13代内不变，用其200个ELD₅₀/0.2ml经肌肉注射攻击1月龄非免疫乳鸽(无特异抗体)，结果为乳鸽出现明显症状和病变，并有死亡。其鸡胚半数致死量(ELD₅₀)分别为10^-834/0.2ml，鸡胚平均致死时间(MDT)为104h，1日龄SPF雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.38，六周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为2.0。

1.2.2制苗用种毒

选用本病毒，经SPF鸡胚传代，在第20～28代内毒力不变，用其200个ELD₅₀/0.1ml分别经肌肉注射攻击1月龄非免疫乳鸽(无特异抗体)结果为乳鸽出现明显症状和病变，并有死亡。其鸡胚半数致死量(ELD₅₀)分别为10^-834/0.2ml、10^-852/0.2ml、10^-780/0.2ml，鸡胚平均致死时间(MDT)分别为96h，106h，98.4h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别为1.58、1.56、1.43，六周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为2.21、2.30、1.95。

1.2.3种毒纯净毒种没有细菌、霉菌、支原体、禽流感及其它外源病原污染。

1.2.4种毒保存湿毒：在-30℃不超过12个月，-15～-20℃不超过6个月；冻干毒：在-30℃不超过24个月，-15～-20℃不超过18个月。

所述的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902已于2006年9月8日寄交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：V200605。

本发明所述的新型灭活疫苗，所用的佐剂为油乳佐剂、蜂胶佐剂或中药复方佐剂。

所述的油乳佐剂，其组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝，其中，白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为：白矿油93％～96％、吐温-802％～3％、司本-802％～4％，硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1～3％。将各组分混配，煮溶后，高压灭菌。

所述的蜂胶佐剂，为纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶的质量浓度为10～50％。

所述的中药复方佐剂，其原料药的重量份配比为：黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份和蜂胶0.01～0.03份，由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95％乙醇浸液混配而成。

本发明所述的新型灭活疫苗的制备方法，包括下列步骤：

a)PA/PMV-I抗原的培养：将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902CCTCC V200605用无菌生理盐水作适当稀释，使每0.1ml～0.5ml含毒量约10^4.0～5.0EID₅₀，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，24小时前死胚为非特异性死亡废弃，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价2^7～9的鸡胚液，即得PA/PMV-I抗原，分装，—15℃～-20℃保存备用；

b)PA/PMV-I抗原的灭活：在每1000ml鸡胚液中加入1m1～3ml甲醛含量为37％～40％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；

c)将灭活抗原配入佐剂而成灭活疫苗。

在上述步骤c)中，如应用所述的油乳佐剂，其制备方法是：将灭活抗原与所述的油乳佐剂按1：1～2比例混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，即成为油乳剂灭活疫苗。

在上述步骤c)中，如应用所述的蜂胶佐剂，其制备方法是：按每1000毫升灭活抗原中加入所述的蜂胶佐剂20～50毫升，混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，即成为蜂胶佐剂灭活疫苗。

在上述步骤c)中，如应用所述的中药复方佐剂，其制备方法是：将灭活抗原与所述的中药复方佐剂混悬液按重量比1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温—80加入混悬液中，灭菌吐温—80的加入量为混悬液重量的1％～2％，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，即成为纯中药复合佐剂灭活疫苗。

本发明从生产实际出发，应用经筛选出的抗原性良好的1株地方流行病毒，作为制苗用种毒，辅以免疫佐剂(包括白矿油佐剂、蜂胶佐剂、复合中药免疫佐剂)研制成一系列安全、有效的灭活疫苗。研制的蜂胶佐剂、复合中药免疫佐剂PA/PMV-I灭活疫苗，均具有不损伤鸽体，易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，不影响胴体品质，且易于组织规模生产及成本低的优势。既适用于紧急免疫接种和受威胁区小日龄后备种鸽的免疫接种，也适用于种鸽的免疫。使之成为对防制鸽PA/PMV-I病，具有特异、效佳、安全、使用方便的新型系列灭活疫苗。

本发明达到的技术效果如下：

1、灭活疫苗的安全性试验

1.1取以上三种疫苗各5批，分别以单(0.5ml/羽份)免疫剂量，肌肉或颈皮下各接种10只30日龄非免疫鸽和10只1年龄非免疫产鸽，观察接种免疫鸽的反应，观察期15天。结果表明，接种鸽食欲、精神状况正常，均无不良反应。

1.2取以上三种疫苗各5批，分别以4倍(2ml/羽份)免疫剂量，肌肉或颈皮下各接种10只30日龄非免疫鸽和10只1年龄非免疫产鸽，观察接种免疫鸽的反应，观察期15天。结果表明，接种鸽食欲、精神状况正常，均无不良反应。

2、灭活疫苗的免疫效力试验

取30日龄非免疫鸽1320只，随机分成4个试验组，第1组(330只)肌肉接种中药佐剂灭活苗0.5ml/只，第2组(330只)肌肉接种蜂胶佐剂灭活苗0.5ml/只，第3组(330只)肌肉接种油佐剂灭活苗0.5ml/只，第4组(330只)不进行疫苗免疫以作为对照。在免疫前后定期(免疫前1天及免疫后3天、6天、9天、14天、21天、35天、60天、90天、120天、150天、180天)抽血lml分离血清，用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902为抗原，按常规微量法分别测定其HI价，其HI价结果判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点，以Xlog₂表示，每次测定均重复一次，取平均值。并于免疫后7天、14天、21天、35天、90天、120天、150天、180天，4个组各随机抽取20只，用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902强毒(200个ELD₅₀/0.1ml)进行攻击，隔离饲养，连续观察25天，以检测其免疫保护效果。试验结果表明，使用中药复合佐剂、蜂胶佐剂和油佐剂苗免疫后6天即可检出抗体，14天至30天维持最高峰(10.8～11.51og₂)，6个月仍能维持较高的抗体水平(6.9log₂)，且没有油苗的难于注射和局部形成硬结的问题。在实验室内，中药复合佐剂苗、蜂胶佐剂苗和油佐剂苗于免疫后21天、60天、90天、120天、150天、180天分别用强毒株200个ELD₅₀/0.1ml攻击，其保护指数分别为100％、100％、100％、94.4％、88.9％、83.5％；100％、96.7％、90.2％、83.7％、83.0％、80.2％和100％、100％、94.2％、83.7％、82.7％、81.1％。疫苗免疫21天后，用强毒攻击，均可得到100％的保护；此时，检测其血清抗体HI价，平均(10.5log2～11.51og₂)log₂以上。根据“HI抗体效价与攻毒保护率平行关系的试验报告”我们制定为免疫21天后测定HI效价平均应≥6log₂。

3、灭活疫苗的保存期试验

将批号为200305的蜂胶佐剂灭活苗、中药复方佐剂灭活苗和油佐剂灭活苗分别分成10小瓶，10毫升/瓶，置4℃～8℃冰箱内保存，并分别于第90天、120天和180天抽取保存的疫苗各1瓶，按0.5毫升/只的剂量各免疫30天龄青年鸽10只，于免疫后21天，各抽检HI抗体水平及用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902强毒(200个ELD₅₀/0.1毫升)攻击，免疫鸽均得到保护，且疫苗的性状和免疫特性不变。个别油佐剂灭活苗保存12个月后表面有少量的白油析出，摇匀后又成为均匀的乳白色油苗，不影响效价。蜂胶佐剂灭活疫苗和中药复方佐剂灭活疫苗保存180天后，瓶底均有少许沉淀，但在使用前摇匀，不影响效价。

4、灭活疫苗的免疫期试验

研制的中药复合佐剂疫苗、蜂胶佐剂疫苗和油佐剂疫苗分别作了180天的免疫攻毒试验，证实其免疫期分别至少6个月以上。在实验室内，使用蜂胶佐剂灭活苗、中药复方佐剂灭活苗、油乳剂灭活疫苗免疫后4天可产生抗体，6～9天即可达较高抗体水平，分别至14天、14天、21天时达最高峰(10.5log₂、11.0log2、11.51og₂)，6个月仍能维持较高的抗体水平(5.91og₂、6.21og₂、7.21og₂)，于免疫后21天、30天、60天、90天、180天用强毒株200个ELD₅₀/0.1毫升攻击，其保护指数分别是油佐剂苗为100％、100％、100％、94.4％、94.4％：蜂胶佐剂苗为100％、100％、100％、88.9％、88.9％；中药复方佐剂苗为100％、100％、100％、94.4％、88.9％。在试验过程中，使用本三种疫苗后，均没发生鸽新城疫病毒的感染。

具体实施方式

实施例一

按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病油乳佐剂灭活疫苗：

1、PA/PMV-I抗原的制备

a)PA/PMV-I抗原的培养：将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释，使每0.5ml含毒量约10^4.0～5.0EID50，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价2^7～9的鸡胚液，分装，—15℃～-20℃保存备用；

b)PA/PMV-I抗原的灭活：在每1000ml鸡胚液中加入2ml甲醛含量为37％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；

2、油乳佐剂的制备

将960ml白矿油、20ml吐温-80、20ml司本-80和200克硬脂酸铝配合，煮溶后，高压灭菌，制得油乳佐剂。

3.PA/PMV-I油乳佐剂灭活疫苗的配制

经效价测定调至合格的抗原与油乳佐剂按1∶1.5比例混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为油乳剂灭活疫苗。

实施例二

按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病蜂胶佐剂灭活疫苗：

1、PA/PMV-I抗原的制备

a)PA/PMV-I抗原的培养：将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP19990C CTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释，使每0.2ml含毒量约10^4.0～50EID₅₀，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价2^7～9的鸡胚液，分装，—15℃～-20℃保存备用；

b)PA/PMV-I抗原的灭活：在每1000ml鸡胚液中加入1ml～3ml甲醛含量为40％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；

2、蜂胶佐剂的制备

纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶质量浓度为50％。

3、PA/PMV-I蜂胶佐剂灭活疫苗的配制

经效价测定调至合格的抗原每1000毫升中加入蜂胶佐剂20毫升，混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为蜂胶佐剂灭活疫苗。

实施例三

按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病纯中药复合佐剂灭活疫苗：

1、PA/PMV-I抗原的制备

a)PA/PMV-I抗原的培养：将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释，使每0.3ml含毒量约10^4.0～5.0EID₅₀，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价2^7～9的鸡胚液，分装，—15℃～—20℃保存备用；

2、纯中药复合佐剂的制备

原料药的重量份配比：纯蜂胶0.01份、黄芪1份、扶芳藤1份、党参1份和灵芝1份，将黄芪、扶芳藤、党参和灵芝的提纯浸液与蜂胶的95％乙醇浸液混配而成纯中药复合佐剂混悬液。

3、PA/PMV-I纯中药复合佐剂灭活疫苗的配制

经效价测定调至合格的抗原后与中药复方佐剂混悬液1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温一80按1％～2％加入混悬液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为纯中药复合佐剂灭活疫苗。

上述三个实施例所制得蜂胶佐剂、中药复方佐剂PA/PMV-I灭活疫苗为棕黑色混悬液，均匀度好，粘度低，通针性良好；在4℃下存放2月以上，瓶底可能有少许沉淀，但在使用前摇匀，不影响效价；油乳剂PA/PMV-I灭活疫苗为油包水型乳白色乳剂苗。以上三种疫苗均不含其它病原；无菌；分别以4倍免疫剂量(2ml/只)和单免疫剂量(0.5ml/只)，肌肉注射免疫10只30日龄鸽，观察20天，无不良反应，安全，有效。胚液抗原HA效价达27以上。

所制得的PA/PMV-I灭活疫苗的使用方法：

预防：肌肉或皮下注射0.5ml/羽份；

紧急防疫接种：肌肉或皮下注射0.8ml～1.0ml/羽份。

Claims

1.一种防制鸽禽I型副粘病毒病灭活疫苗，其特征在于用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原，将PA/PMV-I抗原灭活后，加入佐剂混配而成。

2.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于所述的佐剂为油乳佐剂，其组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝，其中，白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为：白矿油93％～96％、吐温-802％～3％、司本-802％～4％，硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1～3％。

3.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于所述的佐剂为蜂胶佐剂，该佐剂为纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶的质量浓度为10～50％。

4.一种防制鸽禽I型副粘病毒病灭活疫苗，其特征在于用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原，将PA/PMV-I抗原灭活后，与中药复方佐剂混悬液1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80按1％～2％加入混悬液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为中药复合佐剂灭活疫苗，所述的佐剂为中药复方佐剂，该佐剂的原料药重量份配比为：黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份和蜂胶0.01～0.03份，由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95％乙醇浸液混配而成。

5.权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

a)PA/PMV-I抗原的培养：将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水作适当稀释，使每0.1ml～0.5ml含毒量约10^4.0～5.0EID₅₀，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，24小时前死胚为非特异性死亡废弃，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价2^7～9的鸡胚液，分装，-15～-20℃保存备用；

b)PA/PMV-I抗原的灭活：在每1000ml鸡胚液中加入1ml～3ml甲醛含量为37％～40％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原；

c)将灭活抗原配入佐剂而成灭活疫苗。

6.根据权利要求5所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤c)中，将灭活抗原与油乳佐剂按1∶1～2比例混合均匀，再倾入匀浆泵乳化而成油乳剂灭活疫苗，所述的油乳佐剂的组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝，其中，白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为：白矿油93％～96％、吐温-802％～3％、司本-802％～4％，硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1～3％。

7.根据权利要求5所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤c)中，按每1000毫升灭活抗原中加入蜂胶佐剂20～50毫升，混合均匀，再倾入匀浆泵乳化而制成灭活疫苗，所述的蜂胶佐剂为纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶的质量浓度为10～50％。

8.根据权利要求5所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤c)中，将灭活抗原与中药复方佐剂混悬液按重量比1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80加入混悬液中，灭菌吐温-80的加入量为混悬液重量的1％～2％，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化而制成中药复合佐剂灭活疫苗，所述的中药复方佐剂的原料药重量份配比为：黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份和蜂胶0.01～0.03份，由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95％乙醇浸液混配而成。