CN104164408A

CN104164408A - 抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物及制备

Info

Publication number: CN104164408A
Application number: CN201310181203.0A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-05-15
Also published as: CN104164408B

Abstract

本发明涉及一种重组禽流感病毒株。该重组禽流感病毒株是通过遗传重组方法，将流感病毒株和禽流感病毒株进行重组构建而得，对鸡及鸡胚无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散度危险。本发明还涉及一种含有该重组禽流感病毒株的抗鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感的疫苗组合物。该疫苗组合物不仅可预防鸡新城疫、传染性支气管炎，对我国目前流行的大多数H9N2亚型禽流感病毒较好的交叉免疫性。因此，该疫苗组合物比目前商品化疫苗在H9N2亚型禽流感方面具有广泛的交叉保护性。

Description

抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物及制备

技术领域

本发明属于畜牧类生物制药技术领域，涉及一种重组禽流感病毒株，特别是涉及一种重组禽流感病毒株以及含有该毒株的抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物。

背景技术

禽流感（AI）是由正粘病毒科A型流感病毒引起禽类及其他鸟类的一种感染和/或疾病综合征，感染后的舍饲禽（包括家禽）可表现出临诊症状、呼吸系统疾病、产蛋量下降、致死率很高的急性出血性疾病，也可表现为亚临诊症状、轻的呼吸系统感染到无症状带毒等多种流行形式。其中H9N2亚型禽流感，我国自1994年首次报道从鸡群中分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，该亚型禽流感病毒已在我国广泛分布和流行，并且在家禽中不断变化。目前H9N2亚型禽流感是持续危害我国及世界养禽业发展的重要禽类传染病之一。我国目前主要流行的H9N2禽流感病毒属于h9.4.2分支，h9.4.2分可分为六个亚分支，其中流行范围较广的为第Ⅰ亚分支在华东、华北、西北和西南地区流行，其次为第Ⅳ亚分支在华中地区流行。

目前，对于家禽H9N2亚型禽流感感染的预防主要是使用H9N2亚型禽流感病毒制备的全病毒油乳剂灭活疫苗。我国有多种不同厂家研制和生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗，在我国大范围应用。疫苗的广泛使用使H9亚型禽流感的流行得到了有效控制，但禽群感染仍时有发生，甚至出现在免疫鸡群，特别是近年来呈现逐渐增多的趋势。目前商品化的H9亚型禽流感灭活疫苗或H9亚型禽流感相关联苗，均为油乳剂灭活疫苗。由于禽流感存在高度变异，因此，目前商品化疫苗免疫后对H9亚型禽流感的保护效果较差。同时，目前的商品化疫苗所使用的H9亚型疫苗抗原大多为灭活的野毒，即全病毒抗原，存在因灭活不完全而造成散毒危险。

因此，目前存在的问题是需要提供一株新的疫苗株，并基于该疫苗株研制新型H9亚型禽流感疫苗或H9亚型禽流感相关联苗，免疫后对H9亚型禽流感的保护效果较好，且不存在因灭活不完全造成散毒危险，以用于预防H9亚型禽流感及H9亚型禽流感相关疾病。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组禽流感病毒（RAIV）株。该重组禽流感病毒株是通过遗传重组方法，将流感病毒株和禽流感病毒株进行重组构建而得，对鸡及鸡胚无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散度危险。

本发明还提供了该重组禽流感病毒株在制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗中的应用。

本发明还进一步提供了一种含有该重组禽流感病毒株的抗新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感的疫苗组合物，该组合物不仅可预防新城疫、传染性支气管炎，对我国目前流行的大多数H9N2亚型禽流感病毒较好的交叉免疫性。因此，比目前商品化疫苗在H9N2亚型禽流感方面具有广泛的交叉保护性。

为此，本发明提供了一种重组禽流感病毒株，其具有禽流感病毒（AIV）的2个表面基因以及流感病毒（IV）的6个内部基因。

本发明中，所述禽流感病毒的2个表面基因分别为HA基因和NA基因。所述流感病毒的6个内部基因分别为PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因。

根据本发明，所述禽流感病毒可以为禽流感（H9N2亚型）病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007（H9N2）株、禽流感（H9N2亚型）病毒A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）株、禽流感（H9N2亚型）病毒A/Chicken/Hunan/S933/2008（H9N2）株、禽流感病毒为禽流感病毒（H9亚型）SZ株。

在一个优选实施例中，所述禽流感病毒为禽流感病毒（H9亚型）SZ株（Avian influenza virus(H9subtype)strain SZ），其保藏编号为：CCTCC NO：V201240，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号，武汉大学；保藏日期：2012年9月16日。

本发明中所述用语“禽流感（H9N2亚型）病毒”亦称为H9N2亚型禽流感病毒。

本发明中所述用语“禽流感病毒（H9亚型）SZ株（Avian influenzavirus(H9subtype)strain SZ）”亦称为禽流感病毒H9亚型SZ株或H9亚型禽流感病毒SZ株。

同样，本发明中所述用语“重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株（Avian influenza virus(H9 subtype)strain SZ）”亦称为重组禽流感病毒H9亚型SZ-1株或重组H9亚型禽流感病毒SZ-1株。

本发明中所述用语“禽流感毒（H9亚型）YZG4株”亦称为禽流感病毒（H9亚型）YZG4株（Avian influenza virus(H9 subtype)strainYZG4）或禽流感病毒H9亚型YZG4株或H9亚型禽流感病毒YZG4株，用于本发明中的攻毒保护试验。

禽流感毒（H9亚型）YZG4株（Avian influenza virus(H9 subtype)strain YZG4），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，其保藏编号为：CCTCC NO：V201227，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC）；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号，武汉大学；保藏日期：2012年6月14日。

根据本发明，所述流感病毒可以为流感病毒A/Harbin/LM/2009（H1N1）株、流感病毒A/Taiwan/126/2009（H1N1）株及流感病毒A/PR/8/34（H1N1）株。优选所述流感病毒为流感病毒A/PR/8/34（H1N1）株。

本发明中，所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株。所述重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株是通过遗传重组方法，将流感病毒A/PR/8/34（H1N1）和H9N2亚型禽流感流行株禽流感病毒（H9亚型）SZ株进行重组获得，并通过PCR和血清学方法对获得的重组病毒进行了鉴定。

具体地说，本发明中所述重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株是利用禽流感病毒（H9亚型）SZ株、流感病毒为流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株和人工自然重组技术构建的构建2:6重组病毒株。

本发明中所述用语“构建2:6重组病毒株”是指采用人工自然重组技术将禽流感病毒的2个表面基因和流感病毒的6个内部基因进行重组构建的重组禽流感病毒株。具体地说，是指采用人工自然重组技术将禽流感病毒的2个表面基因，如HA基因和NA基因，以及流感病毒的6个内部基因，如PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因进行重组构建的重组禽流感病毒株。

本发明所提供的重组禽流感病毒株，具有与HA和NA基因供体毒株禽流感病毒（H9亚型）SZ株一致的抗原性，不仅能够完全抵御同源毒株的攻击，而且意外地发现对我国目前流行的H9N2禽流感病毒异源毒株的攻击也可产生较好的免疫保护，具有广泛的交叉保护性。本发明所提供的重组禽流感病毒株的6个内部基因来自供体株流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株，意外地发现具有比流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株更优异的鸡胚高滴度生长特性，而且出人意料地，还发现本发明人工重组的重组禽流感病毒株对鸡及鸡胚完全无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散毒危险。简而言之，该重组禽流感病毒株对我国目前流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性、高滴度鸡胚适应性、对鸡及鸡胚无致病力。

本发明中所述用语“鸡新城疫（NewCastledisease，ND）”，是指由副粘病毒引起的高度接触性传染病，又称为新城疫（ND）。

本发明中所述用语“鸡新城疫病毒（NDV）”，亦称为新城疫病毒（NDV），属于副粘病毒科，副粘病毒属，核酸为单链RNA。

同样，本发明中所述用语“鸡新城疫病毒（NDV）株”，亦称为新城疫病毒（NDV）株。

本发明中所述用语“鸡传染性支气管炎Infectiousbronchitis，IB”，是指由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病毒性疾病，又称为传染性支气管炎（IB）。

本发明中所述用语“鸡传染性支气管炎病毒（IBV）”，亦称为传染性支气管炎病毒（IBV），是一种冠状病毒，有多个血清型，而且新的毒株不断出现。

同样，本发明中所述用语“鸡传染性支气管炎病毒（IBV）株”，亦称为传染性支气管炎病毒（IBV）株。

本发明还提供了根据本发明所述的重组禽流感病毒株在制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗中的应用。

本发明还进一步提供了一种含有本发明所述的重组禽流感病毒株的抗新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物，其中，还包括鸡新城疫病毒（NDV）株和传染性支气管炎病毒（IBV）株。

根据本发明，所述新城疫病毒株为鸡新城疫病毒（NDV）LaSota株。所述传染性支气管炎病毒株为传染性支气管炎病毒（IBV）M41株。所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株。

在本发明的一个实施例中，在所述疫苗组合物中，NDV LaSota株灭活浓缩液含量为10%～31.05%（体积）。优选在所述疫苗组合物中，NDV LaSota株灭活浓缩液含量为10%～20%（体积）。更为优选地，在所述疫苗组合物中，NDV LaSota株灭活浓缩液含量为10.35%（体积）。

在本发明的另一个实施例中，在所述疫苗组合物中，IBV M41株灭活浓缩液含量为10%～31.05%（体积）。优选在所述疫苗组合物中，IBV M41株灭活浓缩液含量为10%～20%（体积）。更为优选地，在所述疫苗组合物中，IBV M41株灭活浓缩液含量为10.35%（体积）。

在本发明又一实施例中，在所述疫苗组合物中，重组禽流感病毒（RAIV）（H9亚型）SZ-1株灭活浓缩液含量为10%～31.05%（体积）。优选在所述疫苗组合物中，重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株灭活浓缩液含量为10%～20%（体积）。更为优选地，在所述疫苗组合物中，重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株灭活浓缩液含量为10.35%（体积）。

本发明还进一步提供了一种根据本发明上文所述的疫苗组合物的制备方法，其包括：

步骤A：制备生产用毒种：分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株毒种稀释后，再分别接种于SPF鸡胚，孵育，分别收获NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的生产用毒种；

步骤B：制备制苗用病毒液：分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株生产用毒种稀释后，再分别接种易感鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液；

步骤C：制苗用病毒液的浓缩、灭活：分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株制苗用病毒液进行浓缩、灭活，分别获得NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液；

步骤D：制备疫苗组合物：将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液与吐温-80混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相进行混合乳化，制成疫苗组合物。

根据本发明方法，在步骤C中，所述浓缩、灭活是将NDV LaSota株、IBV M41株与重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的制苗用病毒液分别进行浓缩后，再用终浓度为0.05%～0.30%（体积）甲醛溶液，在35～37℃条件下，灭活12～20小时。上述灭活过程优选在浓缩后，采用0.20%（体积）甲醛溶液，在37℃条件下，灭活16小时。

本发明中所用术语“灭活浓缩液”，是指已灭活的浓缩病毒液或浓缩抗原。

在本发明的一个实施例中，在步骤A之前还包括构建重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的步骤。

本发明所提供的抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）疫苗组合物优选为一种三联灭活疫苗，可预防对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感，尤其对我国目前流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的交叉免疫性。

本发明所提供的重组禽流感病毒株HA效价与野毒相比，可提高2倍左右，以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。本发明所提供的重组禽流感病毒株，对鸡及鸡胚无致病力，比野毒株更安全，可有效避免因灭活不完全造成的散毒危险。

进一步来说，利用本发明的人工重组的重组禽流感病毒株作为疫苗株构建的抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）疫苗组合物，不仅可预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎，对我国目前流行的H9N2亚型禽流感病毒较好的交叉免疫性。因此，比目前商品化疫苗在H9N2亚型禽流感方面具有广泛的交叉保护性。

附图说明

图1是实施例2中重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR扩增；

图1中附图标记的含义如下：1～8泳道：重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株利用PR8的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物；M：DNA Marker2000；10～17泳道：重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株利用禽流感病毒（H9亚型）SZ株的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物。

图2是实施例3中重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株和野生型禽流感病毒（H9亚型）SZ株在最佳培养温度37℃测定的生长曲线。

菌种保藏

禽流感病毒（H9亚型）SZ株（Avian influenza virus(H9 subtype)strain SZ），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年9月16日，保藏编号：CCTCC NO：V201240。

禽流感毒（H9亚型）YZG4株（Avian influenza virus(H9 subtype)strain YZG4），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年6月14日，保藏编号：CCTCC NO：V201227。

具体实施方式

本发明是以下技术方案来实现的，首先是通过遗传重组方法，将流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株和禽流感病毒（H9亚型）SZ株进行重组，构建重组禽流感病毒株，并通过PCR和血清学方法对获得的重组病毒进行鉴定，获得重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株。

然后，应用所获得的重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株来制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗。

在一个具体的技术方案中，将重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株与NDV LaSota株、IBV M41株三病毒株作为抗原制备抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感疫苗组合物，其包括以下具体实施步骤：

步骤B：制备生产用毒种：分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株毒种稀释后，再分别接种于SPF鸡胚，孵育，分别收获NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的生产用毒种；

步骤C：制备制苗用病毒液：分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株生产用毒种稀释后，再分别接种易感鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液；

步骤D：制苗用病毒液的浓缩、灭活：分别将NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株制苗用病毒液浓缩3倍，然后用终浓度为0.05%～0.30%（体积）甲醛溶液，35～37℃，灭活12～20小时，分别获得NDV LaSota株、IBV M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液；

步骤E：制备疫苗组合物：将NDV LaSota株灭活浓缩液10%～31.05%（体积）、IBV M41株灭活浓缩液10%～31.05%（体积）和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液10%～31.05%（体积）与吐温-80，4%（体积）混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。

在一个优选实施方式中，在步骤E中，将NDV LaSota株灭活浓缩液10%（体积）、IBV M41株灭活浓缩液10%（体积）和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液10%（体积）与吐温-80，4%（体积）混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。

在另一个优选实施方式中，在步骤E中，将NDV LaSota株灭活浓缩液20%（体积）、IBV M41株灭活浓缩液20%（体积）和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液20%（体积）与吐温-80，4%（体积）混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。

在又一优选实施方式中，在步骤E中，将NDV LaSota株灭活浓缩液10.35%（体积）、IBV M41株灭活浓缩液10.35%（体积）和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液10.35%（体积）与吐温-80，4%（体积）混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相按照1:2的比例进行混合乳化，制成疫苗组合物。

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：禽流感病毒（H9亚型）SZ株的分离与鉴定与免疫原性分析

1.样品

由普莱柯生物工程股份有限公司进行分离和鉴定。

2.病毒分离

将从山东采集的鸡拭子样品，3000rpm离心5分钟后，按0.2ml/胚的剂量，无菌操作以尿囊腔途径接种10日龄SPF（无特定病原体，Specefic pathogen Free,SPF）鸡胚。置37℃继续孵育。每日照蛋，弃去24小时内死亡的鸡胚，检测孵育48～72小时死亡及72小时存活的所有鸡胚。

3.病毒鉴定

（1）红细胞凝集实验

按照常规方法测定收获的鸡胚液的HA效价，HA效价为1:256。

（2）病毒亚型鉴定

将该毒株分别与禽流感H1-H16的16种血凝素（H）分型血清进行HI试验，与N1-N9的9种神经氨酸酶（N）分型血清进行NI试验，进行病毒的H和N亚型的鉴定。鉴定结果见表1，该毒株为H9N2亚型禽流感病毒。

表1毒株亚型鉴定结果

注：“-”表示检验结果为阴性，“＋”表示检验结果为阳性

（3）电镜观察

鸡胚液采用高速离心法处理，进行负染电镜观察，结果见到直径为100nm左右、呈球形或丝状体形态的病毒粒子，具有典型的A型禽流感病毒粒子的特征。

（4）毒力测定

①接种致病指数(IVPI)测定

接种后鸡在观察期内全部存活，经计算，毒株IVPI值为0，根据世界动物卫生组织（OIE）制定的禽流感判定标准，该毒株为低致病性禽流感病毒株。

②雏鸡的攻毒试验

将病毒10倍稀释，以0.1ml鼻腔感染6周龄SPF鸡10只，观察14日，接种鸡精神正常，无发病、死亡出现。

4.结论

（1）从山东省活禽市场拭子样品中分离到血凝性分离物，命名为禽流感病毒（H9亚型）SZ株；电镜观察，病毒直径为100nm左右、呈球形或丝状体形态的病毒粒子，具有典型的A型禽流感病毒粒子的特征。

（2）分离到的毒株实验室感染3周龄SPF鸡未引起可见的临床症状，IVPI为0，属于低致病性禽流感。

实施例2：重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的构建

本发明提供了一株重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株，是利用禽流感病毒（H9亚型）SZ株和人工自然重组技术构建的2:6重组病毒株，其2个表面基因来自供体株禽流感病毒（H9亚型）SZ株，6个内部基因来自供体株流感病毒PR8(H1N1)株。

1.共感染-使两个病毒基因组发生重组

100μl的禽流感病毒（H9亚型）SZ株病毒液和50μl的流感（H1N1亚型）A/PR/8/34株病毒液混合后加入850μl PBS（0.01mol/L，pH值7.0～7.4）中，共同经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚进行自然重组，35℃培养24小时，收获尿囊液。

2.抗体筛选-除去表面基因来源于流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株的病毒

取50μl在上述特定的人工条件下收获的尿囊液和600μl倍比（4倍）稀释的抗流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株血清混合，室温作用30分钟，每个稀释度接种3枚鸡胚。接着，接种的鸡胚在35℃培养箱中培养48小时，按现行《中国兽药典》附录进行，测定每个稀释度接种的鸡胚尿囊液的血凝价，收集并保留低稀释度的抗流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株血清处理后接种且有血凝价的鸡胚尿囊液。然后，相同方法做第二次的抗血清处理，同样收集并保留低稀释度的抗流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株血清处理后接种且有血凝价的鸡胚尿囊液。

3.稀释纯化-除去内部基因来源于禽流感病毒（H9亚型）SZ株的病毒

按照上述方法处理得到的病毒在鸡胚上进行3代有限克隆纯化，利用Trizol强裂变剂法，提取病毒RNA，进行反转录，然后用设计的流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株和禽流感病毒（H9亚型）SZ株的各8对特异性鉴别引物进行RT-PCR扩增。然后，对扩增产物进行核酸凝胶电泳，鉴定得到的重组病毒的各个基因的来源。重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR扩增后电泳结果见图1，1～8泳道：重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株利用流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物；M：DNA Marker 2000；10～17泳道：重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株利用禽流感病毒（H9亚型）SZ株的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物。

结果显示得到的重组病毒2个表面基因HA和NA基因来自于禽流感病毒（H9亚型）SZ株，6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS基因来自于流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株，将该重组病毒命名为重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株。

4.重组病毒的序列鉴定

利用DNASTAR软件对测定的重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的序列与野生禽流感病毒（H9亚型）SZ株和流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株的序列进行比较，发现重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的基因组均没有任何核苷酸的变化，表明重组病毒的2个表面基因HA和NA基因来自于禽流感病毒（H9亚型）SZ株；6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS基因来自于流感（H1N1亚型）病毒A/PR/8/34株。

实施例3：重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的鉴定

本发明提供的重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株具有广泛的交叉免疫性，具有高滴度鸡胚适应性，对鸡及鸡胚无致病力。

1.重组病毒生长曲线的测定

将亲本禽流感病毒（H9亚型）SZ株和重组病毒各接种5组SPF鸡胚，在37℃条件下分别培养24、48、72和96小时，取上述培养不同时间的鸡胚进行血凝价测定，检测亲本禽流感病毒（H9亚型）SZ株和重组病毒的生长曲线。结果见图2。制备禽流感疫苗株，不但要求其具有良好的免疫原性，而且要求在生产中具有良好的生长特性，从重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株在37℃培养条件下测定的生长曲线可以看出，重组病毒生长滴度较亲本毒株禽流感病毒（H9亚型）SZ株有明显提高，血凝效价提高到原来的2倍，为1:1024。这说明我们制备出了一株高生长滴度的重组病毒，将为以后的批量生产带来可观的经济利益。

2.重组病毒的特异性分析

取重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株E1、E5、E8和E11代毒种作为抗原，分别与抗H9亚型禽流感病毒、H7禽流感病毒及H5亚型禽流感病毒特异性血清、抗鸡新城疫病毒和鸡产蛋下降综合征病毒特异性抗血清用微量法进行HI试验，测定病毒特异性。结果重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株E1、E5、E8和E11代毒种对抗H9亚型禽流感病毒特异性抗血清为阳性反应，对抗H7亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、抗鸡新城疫病毒和鸡产蛋下降综合征病毒特异性抗血清均为阴性反应。

3.重组病毒的抗原性分析

将亲本禽流感病毒（H9亚型）SZ株与重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的抗原和血清进行交叉HI试验，鉴定重组病毒的抗原性的变化。结果见表2。结果表明，同一血清对重组前后毒株的HI效价相同，说明重组后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性。

表2亲本毒株禽流感病毒（AIV）（H9亚型）SZ株与重组禽流感病毒（RAIV）（H9亚型）SZ-1株的抗原性分析

同时，对重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株在SPF鸡胚上连续传代至E11代，并测定各代次毒种的血凝价（HA）和病毒含量（EID₅₀）。在连续传代的过程中，各代次毒种接种的SPF鸡胚均不引起死亡。各代次毒种的血凝价（HA）为1:512～1:2048，每0.1ml病毒含量为10^8.5EID₅₀/0.1ml～10^9.2EID₅₀/0.1ml，表明种子批的重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株毒价稳定。详见表3。

表3E2～E11各代次HA和EID₅₀的测定的结果

4.重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的毒力

（1）对鸡胚的毒力

重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株毒种在传代及EID₅₀的测定过程中，所接种鸡胚除接种24内死亡的鸡胚外，均未出现鸡胚死亡现象。

（2）静脉接种致病指数

取重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株E1、E5、E8和E11代毒种，测定IVPI，结果IVPI均为0。

（3）对雏鸡的毒力

将重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株E1、E5、E8和E11代毒种10倍稀释，鼻腔感染21日龄SPF鸡10只，每只0.1ml（约含10^7.0EID₅₀），另取条件相同的SPF鸡10只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观察14日。所有SPF鸡精神良好，食欲饮水正常，未出现死亡或明显异常反应。

5.重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的免疫原性

将E1、E5、E8和E11代毒种制成油乳剂灭活疫苗后，各颈部皮下注射3周龄SPF鸡10只，每只0.3ml。接种后21日，连同对照鸡5只，分别采血，分离血清，按照微量法测定HI抗体效价，结果将E1、E5、E8和E11代毒种制备灭活疫苗免疫SPF鸡21日后，所激发的HI抗体效价几何平均值为1:446～1:549（8.8～9.1log₂），结果见表4。上述免疫鸡和对照鸡，免疫后21日，静脉注射禽流感病毒（H9亚型）SZ株病毒液，0.2ml/只（含2×10^7.0EID₅₀）。攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，将同一只鸡的两种拭子液混合后作为一个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察72小时，无论死胚、活胚均测定鸡胚液HA效价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1:16（微量法），即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，盲传1次后再进行判定。结果免疫鸡病毒分离阳性率均为0/10，对照鸡病毒分离阳性率为5/5。结果详见表5。表明重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株免疫后对效检株禽流感病毒（H9亚型）SZ株产生较理想的免疫保护作用。

表4不同代次毒种免疫21日龄SPF鸡21日后HI抗体效价测定结果

注：“/”表示此项无内容。

表5不同代次毒种制备疫苗免疫21日龄SPF鸡后攻毒保护试验结果

6.重组病毒的交叉保护性

将E7代毒种制成油乳剂灭活疫苗后，各颈部皮下注射3周龄SPF鸡60只，每只0.3ml。免疫后21日，连同对照鸡20只，分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。各组免疫鸡血清中针对疫苗抗原的HI抗体效价几何平均值为1:549～1:724（9.1～9.5log₂）；接种后21日，连同对照鸡20只，分别等分为6个亚组，每个亚组包括10羽免疫鸡+5只对照鸡，用6株不同毒株进行攻毒，禽流感病毒（H9亚型）SZ株、HL株、SS/94株、LH11株、ZZ11株、YZG4株，分别静脉接种病毒液0.2ml(含2×10⁷EID₅₀)。并在攻毒后第3和5日采集每组鸡的喉头和泄殖腔拭子，将同一只鸡的两种拭子液混合后作为一个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察72小时，无论死胚、活胚均测定鸡胚液HA效价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1:16（微量法），即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，盲传1次后再进行判定。结果见表6，攻毒后第3和5日，免疫鸡全部保护，对照鸡全部排毒。结果表明，重组禽流感（H9亚型）病毒灭活疫苗（RAIV（H9亚型）SZ-1）不仅能够完全抵御同源毒株的攻击，而且对其他的5株流行病毒也能起到良好的免疫保护作用。

表6重组禽流感病毒灭活疫苗（RAIV（H9亚型）SZ-1）免疫鸡攻击不同毒株后病毒分离结果

实施例4：抗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）疫苗组合物的制备

本发明提供了一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗及其制备方法。疫苗毒株分别为NDV La Sota株、IBVM41株、RAIV（H9亚型）SZ-1株。

1.制苗用病毒液的制备

NDV LaSota株生产种子批毒种，用无菌生理盐水稀释至10^-4，经尿囊腔接种鸡胚，每胚0.1ml，密封，置37℃继续孵育，直至120小时，无菌收获，收获的NDV LaSota株病毒液的HA为1:512，病毒含量为10^8.8EID₅₀/0.1ml，2～8℃暂存，作为制苗用病毒液用。

IBV M41株生产种子批毒种，用无菌生理盐水作10^-2稀释，经尿囊腔接种鸡胚，每胚0.1ml，密封，置37℃继续孵育，直至48小时，无菌收获，收获的IBV M41株病毒液的病毒含量为10^6.7EID₅₀/0.1ml，2～8℃暂存，作为制苗用病毒液用。

RAIV（H9亚型）SZ-1株生产种子批毒种，用无菌生理盐水作10^-4稀释，经尿囊腔接种鸡胚，每胚0.1ml，用蜡密封接种孔，置37℃继续孵育，直至96小时，无菌收获，收获的RAIV（H9亚型）SZ-1株病毒液的HA效价为1:512，病毒含量为10^8.5EID₅₀/0.1ml，2～8℃暂存，作为制苗用病毒液用。

2.制苗用抗原的浓缩、灭活

NDV LaSota株、IBV M41株和RAIV（H9亚型）SZ-1株病毒株液分别3倍浓缩，终浓度为0.2%（体积）的甲醛溶液，37℃灭活16小时。

3.疫苗制备

油相制备：取注射用白油94份，加司本-80 6份混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌后备用，即为油相。

水相制备：将3种抗原按体积比1:1:1比例混合于无菌容器中，加入4%（体积）灭菌并冷却后的吐温-80，边加边搅拌，使吐温-80完全溶解为止，即为水相。

乳化，水相与油相之比为1:2一起乳化，分装，帖签，装箱，入库。

4.疫苗的性状检验

制备的三联灭活疫苗进行性检验，其外观为乳白色均匀乳剂，剂型为油包水型，稳定性（3000r/min离心15min，管底无水相析出，黏度60.7cP，无菌检验均无细菌和霉菌污染，因此制备的疫苗外观、剂型、稳定性、黏度、无菌检验均合格。

5.疫苗的安全性检验

10只14日龄SPF鸡，每只注射制备的三联灭活疫苗0.6ml，注射后逐日观察14日，所有鸡免疫后精神及采食正常，无任何全身反应，14日后剖检，注射局部可见部分未吸收疫苗，无坏死、脓肿或感染发生。表明疫苗的安全性符合要求。

6.效力检验

（1）新城疫部分效力检验：对制备的三联灭活疫苗，采用测抗体和攻毒两种方式进行效力检验。

血清学法：制备的三联灭活疫苗，用30日龄SPF鸡10只，各肌肉注射疫苗20μl，同时另设5只不免疫作对照。免疫后28日，每只鸡各采血，分离血清，测定ND HI抗体效价。免后28日，免疫鸡产生了较高的ND HI抗体效价，产生的ND HI抗体效价几何平均值为1:84（6.4log₂），不低于1:16，而对照鸡均不高于1:4，说明制备的三联灭活疫苗鸡新城疫部分血清学效力检验符合要求。结果见表7。

表7三联苗鸡新城疫部分效力试验结果（血清学法）

攻毒法：将上述免疫鸡与对照鸡，用鸡新城疫强毒北京株进行攻毒。攻毒前用无菌生理盐水将含毒尿囊液进行适当稀释，每只肌肉注射经无菌生理盐水稀释后的病毒液0.2ml（含10^5.0ELD₅₀）。攻毒后逐日观察并记录攻毒鸡的发病及死亡情况，逐日观察14日。判定标准：凡出现精神沉郁、食欲减退、神经症状之一，或死亡者均判为不保护。攻毒保护结果为，免疫组鸡完全保护（10/10保护），对照组鸡均不保护（0/5保护），说明制备的三联灭活疫苗新城疫部分攻毒保护效力检验符合要求。结果见表8。

表8三联苗新城疫部分效力试验结果（攻毒法）

（2）传染性支气管炎部分效力检验

一次免疫攻毒法：制备的三联灭活疫苗，用14日龄SPF鸡10只，各皮下注射三联苗0.3ml，同时另设10只不免疫作为对照。免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，进行IB HI抗体效价测定。同时连同对照鸡10只，每只滴鼻接种鸡传染性支气管炎M41株强毒病毒液0.1ml（含10^3.0EID₅₀）。逐日观察并于攻毒后第5日，采集每只鸡的气管拭子，置3ml含抗生素的肉汤中。每份样品经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚接种0.2ml进行病毒分离，置37℃孵育144小时，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚体出现失水、蜷缩、发育小等特异性病痕者判为病毒分离阳性。结果免后21日，免疫鸡产生了较高的IB HI抗体效价，产生的IB HI抗体效价几何平均值为1:97（6.6log₂），攻毒后第5日病毒分离阳性率为0/10，达到了完全保护，而对照鸡产生的IB HI抗体效价几何平均值为1:2（1.3log₂），攻毒后第5日病毒分离阳性率为10/10，不保护。说明制备的三联灭活疫苗鸡传染性支气管炎部分一次免疫攻毒法效力检验符合要求。结果见表9。

表9三联苗传染性支气管炎部分效力试验结果（一次免疫攻毒法）

二次免疫抗体监测法：用21日龄SPF鸡10只，滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗（H120株）1羽份，免疫后21日，每只鸡各采血，分离血清，各加强免疫接种（肌肉注射）灭活疫苗0.5ml（1羽份），28日后每只鸡各采血，分离血清，分别测定2次血清的IB HI抗体效价。结果，二免血清IB HI抗体效价的几何平均值为首免血清IB HI抗体效价几何平均值的5.7倍，高于4倍。表明制备的三联灭活疫苗传染性支气管炎部分二次免疫抗体监测法效力检验符合要求。结果见表10。

表10三联苗传染性支气管炎部分效力试验结果（二次免疫抗体监测法）

（3）禽流感部分效力检验：对制备的三联灭活疫苗，采用测抗体和攻毒两种方式进行效力检验。

血清学方法：

取21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，同时另设5只不接种作为对照。免疫后21日，每只鸡各采血，分离血清，分别测定禽流感H9亚型HI抗体效价。结果免后21日，免疫鸡产生了较高的AI HI抗体效价，产生的AI HI抗体效价几何平均值为1:512（9.0log₂），不低于1:90，而对照鸡均不高于1:4，说明制备的三联灭活疫苗禽流感部分血清学效力检验符合要求。结果见表11。

免疫攻毒法：

上述免疫鸡和对照鸡，于免疫后21日，静脉注射禽流感病毒（H9亚型）SZ株病毒液，0.2ml/只（含2×10^7.0EID₅₀）。攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，将同一只鸡的两种拭子液混合后作为一个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察72小时，无论死胚、活胚均测定鸡胚液HA效价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1:16（微量法）。结果，攻毒后5日，免疫鸡病毒分离阳性率为0/10，对照鸡病毒分离阳性率为5/5，说明制备的三联灭活疫苗禽流感部分攻毒保护效力检验符合要求。结果见表11。

表11三联苗禽流感部分效力试验结果

（4）禽流感部分攻毒保护试验

取21日龄SPF鸡40只，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，同时另设20只不接种作为对照。免疫后21日，每只鸡各采血，分离血清，分别测定禽流感H9亚型HI抗体效价，免疫鸡血清中针对疫苗抗原的HI抗体效价几何平均值为1:955（9.9log₂），对照组鸡血清中针对疫苗抗原的HI抗体效价均小于1:4。上述免疫鸡和对照鸡，于免疫后21日，分别等分为4个亚组，每个亚组包括10羽免疫鸡+5只对照鸡，用4株不同毒株进行攻毒，SZ株、HL株、SS/94株、LH11株，每只鸡静脉注射病毒液0.2ml(含2×10⁷EID₅₀)。攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，将同一只鸡的两种拭子液混合后作为一个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察72小时，无论死胚、活胚均测定鸡胚液HA效价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1:16（微量法）。结果，攻毒后第5日，各组免疫鸡病毒分离阳性率均为0/10，各组对照鸡病毒分离阳性率为4/5～5/5，说明制备的三联灭活疫苗免疫后，禽流感部分不仅能够完全抵御同源毒株的攻击，而且对2010～2011年的3株流行病毒也能起到良好的免疫保护作用。结果见表12。

表12三联苗免疫鸡攻击不同毒株后病毒分离结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组禽流感病毒株，其含有禽流感病毒的2个表面基因以及流感病毒的6个内部基因。

2.根据权利要求1所述的重组禽流感病毒株，其特征在于：

所述禽流感病毒的2个表面基因分别为HA基因和NA基因；

所述流感病毒的6个内部基因分别为PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因。

3.根据权利要求1或2所述的重组禽流感病毒株，其特征在于：所述禽流感病毒为禽流感病毒（H9亚型）SZ株，其保藏编号为：CCTCCNO：V201240；

所述流感病毒为流感病毒A/PR/8/34（H1N1）株；

所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株。

4.根据权利要求1到3中任意一项所述的重组禽流感病毒株在制备防治动物和人类H9N2亚型流感的疫苗中的应用。

5.一种含有权利要求1到3中任意一项所述的重组禽流感病毒株的抗鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感疫苗组合物，其特征在于，还包括鸡新城疫病毒株和传染性支气管炎病毒株。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于:

所述鸡新城疫病毒株为鸡新城疫病毒LaSota株；

所述传染性支气管炎病毒株为传染性支气管炎病毒M41株；

所述重组禽流感病毒株为重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株。

7.根据权利要求5或6所述疫苗组合物，其特征在于：在所述疫苗组合物中，鸡新城疫病毒LaSota株灭活浓缩液的含量为10%～31.05%（体积）；传染性支气管炎病毒M41株灭活浓缩液的含量为10%～31.05%（体积）；重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株灭活浓缩液的含量为10%～31.05%（体积）。

8.根据权利要求7所述疫苗组合物，其特征在于：在所述疫苗组合物中，鸡新城疫病毒LaSota株灭活浓缩液的含量为10%～20%（体积）；传染性支气管炎病毒M41株灭活浓缩液的含量为10%～20%（体积）；重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株灭活浓缩液的含量为10%～20%（体积）。

9.根据权利要求8所述疫苗组合物，其特征在于：在所述疫苗组合物中，鸡新城疫病毒LaSota株灭活浓缩液的含量为10.35%（体积）；传染性支气管炎病毒M41株灭活浓缩液的含量为10.35%（体积）；重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株灭活浓缩液的含量为10.35%（体积）。

10.根据权利要求5到9中任意一项所述的疫苗组合物的制备方法，其包括：

步骤A：制备生产用毒种：分别将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株毒种稀释后，再分别接种于SPF鸡胚，孵育，分别收获鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的生产用毒种；

步骤B：制备制苗用病毒液：分别将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株生产用毒种稀释后，再分别接种易感鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液；

步骤C：制苗用病毒液的浓缩、灭活：分别将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株制苗用病毒液进行浓缩、灭活，分别获得鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液；

步骤D：制备疫苗组合物：将鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和重组禽流感病毒（H9亚型）SZ-1株的灭活浓缩液与吐温-80混合制成水相，然后再与由白油、司本-80、硬脂酸铝制成的油相进行混合乳化，制成疫苗组合物。