CN101112617A

CN101112617A - 新、支、流h9亚型三联灭活疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN101112617A
Application number: CNA2006100484984A
Authority: CN
Inventors: 孙进忠; 张许科; 乔荣岑; 舒德广; 闵亚杰; 孟照国; 李根龙
Original assignee: LUOYANG PULAIKE BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: LUOYANG PULAIKE BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-01-30

Abstract

一种新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：采用NDVLaSota株病毒液含量为10～22％；IBVM41株病毒液含量也为10～22％；AIVHL株毒液含量为8～15％；经浓缩、灭活方法；加入佐剂白油，免疫助剂吐温、司本、硬脂酸铝制成三联灭活疫苗；其实现了多联疫苗预防，达到一针防多病的目的，可用于大力发展养殖业，造福于人类，提高人们生活水平。

Description

新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法

技术领域：

本发明涉及禽类生物制药技术领域，一种新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法

背景技术：

禽流感于1878年首发于意大利，是有A型正粘病毒引起的病毒性传染病，根据流感病毒血凝素HA和神经氨酸酶NA抗原性的不同，可分成很多亚型，如H5N1、H9N2。本病主要侵害禽的呼吸、消化和泌尿生殖系统，临床主要表现为呼吸症状、产蛋率下降及出现不同程度的死亡，成为危害全球养殖业的第一大疫病，已被国际兽医局OIE定为A类传染病，其传播途径主要是通过水平传播，任何季节和不同日龄的鸡群均可发病；鸡新城疫俗称鸡瘟，是由鸡新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病，主要经呼吸道和消化道感染，各种年龄的鸡均可感染，以雏鸡最为严重，发病率和死亡率可达80％以上；鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道疾病，传播途径主要是经呼吸道感染，发病多集中在冬、春季，6周龄死亡率高，可达20％左右。鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性支气管炎三种传染病均对养禽业造成了巨大的损失。

疫苗是将病原微生物，如细菌、立克次氏体、病毒等，及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。灭活疫苗俗称“死疫苗”，是将病原微生物灭活后使其失去致病能力，但仍保留免疫原性而制成的，进入机体后可直接引起免疫应答，但不能繁殖，比较安全、稳定。具有生产方便，使用安全，易于保存的特点。根据疾病预防控制的长期战略构想，就传统疫苗而言，将会逐渐加大灭活疫苗的分量，减少活疫苗特别是中等毒力活疫苗的使用，由于新的传染病不断出现，疫苗品种越来越多，动物接种疫苗的种类和次数也越来越多，多针次、大剂量、多品种的灭活疫苗反复免疫接种将造成畜禽的应激反应，过敏反应，影响生产性能。同时，多次接种会增加劳动强度，加大生产成本。

浓缩可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度，常用的浓缩方法有离心沉淀法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法，但上述几种方法均有其缺点灭活的方法包括物理方法和化学方法。物理法如加热、射线照射等方法，化学法是用化学灭活剂进行的，是目前常用的灭活方法。常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯基亚胺、乙烯亚胺、β-丙酸内酯等。甲醛的灭活原理是它能使微生物的蛋白质、核酸变性，导致死亡，但不明显影响其免疫原性

佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原性，与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答，或者改变机体免疫应答类型。选择佐剂的同时应考虑其免疫增强作用和安全性。生物制品的佐剂，应符合以下条件：一是无致癌性和辅助致癌作用；二是无毒性；三是吸附力强、易于吸收；四是不含与机体有交叉免疫反应的物质，本身不引起机体的超敏反应，也不会与机体自身物质结合引起不良反应导致损伤；五是能经1～2年保存不变质、不明显降低效力、不出现不良反应。佐剂的类型一般由氢氧化铝胶、弗氏佐剂、白油佐剂、矿物油、水花生油乳剂、吐温-80、司盘、左旋咪唑、脂质体等，与抗原混合成悬浊状态，尽可能延长在注射部位的贮留时间，从而持续不断地刺激机体免疫系统，以产生较强的免疫应答；可出现免疫增强的作用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，以实现多联疫苗预防，达到一针防多病的目的，大力发展养殖业，造福于人类。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

该新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，采用NDVLaSota株病毒液含量为10～22％；IBVM41株病毒液含量也为10～22％；AIVHL株毒液含量为8～15％；经浓缩、灭活方法；加入佐剂白油，免疫助剂吐温、司本、硬脂酸铝制成联苗。

该新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其浓缩方法中采用纤维膜超滤浓缩法，本方法可是使效价大幅提高.

该新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其灭活方法中NDVLaSota株病毒液与AIVHL株病毒液用0.05～0.15％甲醛溶液，35～38℃，灭活12～17小时；IBVM41株病毒液采用2-8℃低温灭活，120-145小时，可彻底灭活病毒，而且不影响其免疫原性。

该新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘；实验证明：含油相和水相乳化剂的疫苗比仅含油相的疫苗免疫效果好，可使抗原充分混合均匀，不易分层，在37℃条件下更稳定，黏度也低。

由于本发明采用了如上所述的技术方案，其具有如下优越性：

本发明提出了适当的组分、配比，并改进了生产工艺.改进了成品检验中传支病毒的检验方法。本联苗所用禽流感H9亚型和AIV(H9)HL株，系本申请人自行研究分离，经哈尔滨兽医研究所动物流感中心鉴定为A型禽流感H9N2亚型毒珠，并被命名为AIV(H9)HL株河南洛阳株，本毒珠具有独特的培养特性与免疫原性。

该发明在生产工艺中独创的将三种毒珠液同时接种同一鸡胚的方法比起三种毒珠液分别接种鸡胚，节省了鸡胚的使用数量，减少了疫苗生产的操作步骤，避免了毒种污染机会，而且省去了疫苗制作中的浓缩环节，节省时间，提高效率；找到了三种毒珠液最佳的配合比例，并解决了两种病毒液之间的互相干扰问题.可使现在的一次接种代替以往的三次接种，并且使原来的二次收获、灭活合并为一次完成，大大的节省了人力物力。

本发明的联苗是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗，联苗可简化接种程序，减少接种动物应激反应的次数.此外对于产蛋鸡，尤其是种鸡应尽可能避免或减少在产蛋期间做免疫接种，而鸡新城疫、禽流感H9亚型、传染性支气管炎三联灭活疫苗，主要是在开产前使用，使用剂量与单苗相当，但其效力与单苗相同，具有使用简便、接种程序简单等优点，减少疫苗的免疫次数，避免家禽产生不必要的应激；联苗复配最关键的是抗原最佳配比问题.

佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原性，与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答，或者改变机体免疫应答类型。选择佐剂的同时应考虑其免疫增强作用和安全性。生物制品的佐剂，应符合以下条件：无致癌性和辅助致癌作用；无毒性；吸附力强、易于吸收；不含与机体有交叉免疫反应的物质，本身不引起机体的超敏反应，也不会与机体自身物质结合引起不良反应导致损伤；能经1～2年保存不变质、不明显降低效力、不出现不良反应。与抗原混合成悬浊状态，尽可能延长在注射部位的贮留时间，从而持续不断地刺激机体免疫系统，以产生较强的免疫应答；可出现免疫增强的作用。

本发明成品检验中传染性支气管炎检验采用血清学的方法判定效力，比常规的功毒检测方法使结果更为准确、直观可靠.

具体实施方式一：

生产用毒种的制备：NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备：NDVLaSota株、IBV M41株和AIVHL毒株液分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育；收获毒种.分别浓缩、灭活；灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但不影响其免疫原性；灭活中取制苗用NDVLaSota毒株液10％，IBVM41毒株液10％，AIVHL毒株液9％，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1∶1.5一起乳化，分装，帖签，装箱，入库。

具体实施方式二：

生产用毒种的制备NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备：NDVLaSota株、IBV M41株和AIVHL毒株液分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种：分别浓缩，灭活，取制苗用NDVLaSota毒株液11％，IBVM41毒株液11％，AIVHL毒株液10％，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1∶3，一起乳化，分装，帖签，装箱，入库。

具体实施方式三：

生产用毒种的制备NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒株液分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育收活毒种.分别浓缩、灭活.取制苗用NDVLaSota毒株液12％和IBVM411毒株液12％和AIVHL毒株液11％加吐温-80制成水相.用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相.水相与油相之比为1∶4一起乳化.分装、帖签，装箱、入库.

Claims

1.一种新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：采用NDVLaSota株病毒液含量为10～22％；IBVM41株病毒液含量也为10～22％；AIVHL株毒液含量为8～15％；经浓缩、灭活方法；加入佐剂白油，免疫助剂吐温、司本、硬脂酸铝制成三联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：其浓缩方法中采用纤维膜超滤浓缩法。

3.根据权利要求1所述的新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：其灭活方法中NDVLaSota株病毒液与AIVHL株病毒液用0.05～0.15％甲醛溶液，35～38℃，灭活12～17小时；IBVM41株病毒液采用2-8℃低温灭活，120-145小时，可彻底灭活病毒，而且不影响其免疫原性。

4.根据权利要求1所述的新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘。

5.根据权利要求1所述的新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备：NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒株液分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育；收获毒种.分别浓缩、灭活；灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但不影响其免疫原性；灭活中取制苗用NDVLaSota毒株液10％，IBVM41毒株液10％，AIVHL毒株液9％，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1∶1.5一起乳化，分装，帖签，装箱，入库。

6.根据权利要求1所述的新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备：NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒株液分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种：分别浓缩，灭活，取制苗用NDVLaSota毒株液11％，IBVM41毒株液11％，AIVHL毒株液10％，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1∶3，一起乳化，分装，帖签，装箱，入库。

7.根据权利要求1所述的新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备：NDVLaSota株、IBVM41株和AIVHL毒株液分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育收活毒种.分别浓缩、灭活.取制苗用NDVLaSota毒株液12％和IBVM41毒株液12％和AIVHL毒株液11％加吐温-80制成水相.用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相.水相与油相之比为1∶4一起乳化.分装、帖签，装箱、入库.