CN102716478A - 新、支二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二联油乳剂疫苗的生产方法，具体地说，是鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的生产方法，包括：同胚接种，调整新城疫、传染性支气管炎两种病毒的浓度及比例，以达到合理搭配，并且通过调整疫苗中佐剂的成分，使其不含有硬脂酸铝。该疫苗能使新城疫及传染性支气管炎抗体同时产生，减少干扰现象，不含硬脂酸铝，能在较长时间内保持较高的抗体产生能力，并解决注射疫苗引起的动物的应激反应以及疫苗残留问题。

Description

新、支二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫病毒（Newcastledisease virus,NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎，但很快便康复。新城疫病毒被OIE规定为A类疫病，是一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率都在90%以上，1935年梁英、马闻天等首次证实我国有该病的流行，现在本病被我国列为Ⅰ类疫病。

新城疫病毒的所有毒株都能凝集多种禽类和哺乳动物的红细胞，在病毒的血凝试验中，鸡的红细胞最为常用。该病毒可在9-12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜上和尿囊腔中培养。

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bornchistis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bornchistis Virus，IBV）引起的一种急性、接触性、病毒性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等，其感染的主要特征是气管锣音、喷嚏和肾脏肿大。此外，该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降，但死亡率通常较低，雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。IBV能在9-11日龄的鸡胚中生长。

近年来，伴随着畜禽养殖规模的不断扩大，生物制品行业也得到了迅速发展，尤其是生物技术的不断更新使疫苗产品的种类显著增加，且品种多样，如多联疫苗，多价疫苗等，而多联疫苗的使用，扩大了一次接种的防病范围，提高了接种效率，减少了接种用器材及劳务费用，有利于免疫计划的安排。现有防治新城疫、传染性支气管炎两种病的二联疫苗只是两种单苗的简单组合，抗原的配比混乱，相容性不好，存在免疫反应的相互干扰现象，并不能达到预期的目的；而且生产工艺简单，生产技术粗糙，造成部分产品污染，抗原组合物中部分抗原效价降低，不能达到生产规程要求。并且目前生产的新城疫、传染性支气管炎二联疫苗中传染性支气管炎病毒对新城疫病毒存在干扰，因此，所生产的二联苗均采用不同鸡胚培养增殖病毒，然后将收获感染的尿囊液混合制备而成，这样就会费时费力，而且提高了成本。

因此，针对现有的鸡新城疫与传染性支气管炎二联灭活疫苗的生产方法，需要改进新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的组分搭配以及生产工艺中的缺陷，使新城疫、传染性支气管炎二联疫苗的免疫效果达到了单苗的效果，甚至超过了单苗的免疫效果，切实达到了一针防多病的目的。

另外，目前，预防和控制家禽传染病除生物安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特别是通过油乳剂疫苗的免疫。油性佐剂疫苗是已公认的可有效强化免疫性的疫苗。油乳剂疫苗的生物安全性高，具有用最小量的抗原，最少的接种次数，延长免疫刺激时间，使机体产生足够量的抗体的特点，所以乳化品质优良的油乳剂苗是保证免疫效果的前提。在现有的油乳剂疫苗(简称“油苗”)生产过程中，通常添加2%的硬脂酸铝来增加其稳定性，但其粘度较大引起免疫注射的应激反应较大，如导致严重接种反应、形成无菌性化脓损害和接种部位周围形成肉芽肿等，可产生外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死。而且人们怀疑在接种部位有残留的可能，这便妨碍了疫苗的使用，这种现象在肉鸡免疫中表现得尤为明显。基于这个原因，使用含有矿物油的油性佐剂的疫苗有时是受到一定限制的。

对于油性佐剂疫苗而言，已知这种疫苗不仅在免疫强化作用方面，而且在疫苗的稳定性方面，都在相当大的程度上受到乳剂类型、所用油性成分以及所结合的表面活性剂种类等因素的影响。尤其就灭活疫苗来说，制备出一种具有在较长时间内能诱导产生充分免疫保护作用，并有着良好再现性的疫苗，是非常困难的。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的生产方法，步骤包括：

1）调整新城疫、传染性支气管炎种毒的浓度，以达到合理搭配；

2）将调整后浓度的新城疫、传染性支气管炎种毒按比例混合；

3）将混合毒种接种于9-11日龄易感鸡胚；

4）孵化，收胚液；

5）将收获的胚液进行灭活；

6）灭活后加入佐剂乳化，即成新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗。

本发明的另一目的在于提供一种不含硬脂酸铝的新城疫、传染性支气管炎二联油乳剂灭活疫苗。

技术效果

本发明通过大量实验验证，创造性的发现新城疫、传染性支气管炎两种病毒共存的最佳浓度比例，克服了传染性支气管炎病毒对新城疫病毒产生干扰的不利影响，从而使两种病毒能同胚接种培养成为可能。本发明通过调整新城疫、传染性支气管炎种毒的浓度，以使新城疫、传染性支气管炎两种病毒能够产生共存，通过同胚接种技术生产两种病毒，简化生产工艺，节约了工时和原材料，并且操作更为简便和快速。

根据本发明实施例的结果，本发明生产的二联灭活疫苗在免疫鸡群后新城疫和传染性支气管炎免疫力同时产生，无任何干扰，提高了免疫质量，并且减少了免疫次数，真正实现了一针两防的功效。

本发明的禽用油乳剂疫苗，通过不断的探索研究，确定了添加了丙二醇、卵磷脂和异甘露醇单油酸脂三种成份，并以合适的比例构成，达到了替代硬脂酸铝的目的，降低了疫苗粘度更利于吸收，从而减少留存，在接种部位表现出优异的局部安全性，并且在较长时间内表现出较强的诱导抗体产生能力。通过调整油相和水相的配方及其比例，减少了免疫注射引起的应激反应，且不影响疫苗的稳定性及免疫效果，从而也就提高了疫苗质量。这种疫苗即使在低粘度区域稳定性也较高，副反应较小，诱导抗体产生能力以及保持高水平的抗体产生的能力都很强。

根据本发明实施例的结果，本发明油乳剂疫苗既使不含硬脂酸铝，它所显示的免疫作用比含硬脂酸铝疫苗的作用要好，且与含硬脂酸铝的油苗相比，本发明的疫苗有更好的局部吸收能力。此外，本发明实施例的结果也表明，按照本发明的方法制备的油乳剂疫苗同样具有高稳定性，在长时间内显示出极好的功效，同时粘度更低，易于注射，注射引起的应激反应更小，对动物体更安全，而且不会产生常规油佐剂疫苗所引起的较大应激反应，如常见的免疫注射部位浮肿、肿胀、硬结和坏死等问题都得以解决。另一方面，由于疫苗黏度降低，在接种家禽后，更容易吸收，不会产生药物残留的情况，符合食品安全的要求，有利于禽类产品的出口。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

本发明实施例中，除另有说明外，所有份数和百分比均按体积计算。

实施例1本发明制备的新、支二联灭活疫苗

制造本品用新城疫毒种LaSota株，效检用强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株（CVCC AV1611）。制苗及效检用传染性支气管炎毒株为M41株。

将新城疫毒种LaSota株毒种稀释成10⁴EID₅₀，传染性支气管炎毒株M41株稀释成10⁶EID₅₀，稀释后将两种病毒液以1:1的比例混合。将混合后毒种接种9-11日龄易感鸡胚，每胚接种尿囊腔0.1ml,用蜡封接种孔和气孔，37℃孵化，弃去72h前死亡胚，收集72-96h死亡胚和96h活胚胚液。

将胚液经0.1%甲醛37℃灭活20小时，以10:1的比例加入经3倍体积水稀释121℃灭菌30min的吐温-80混合均匀为水相。将白油、丙二醇、卵磷脂和异甘露醇单油酸脂以30：1:1:1的比例混合均匀为佐剂，再与司盘-80以10:1的比例混匀为油相，经121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。按油相∶水相=2∶1的体积比例，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为11,000rpm，温度18℃的情况下，水相加入油相的速度为0.6ml/s，再继续以速度15,500rpm乳化5min，制备三批疫苗，批号分别为1201、1202和1203。

实施例2常规异胚接种生产的含硬脂酸铝的新、支二联灭活疫苗

制造本品用新城疫毒种LaSota株，效检用强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株（CVCC AV1611）。制苗及效检用传染性支气管炎毒株为M41株。

2.将新城疫毒种LaSota株毒种，传染性支气管炎毒株M41株，分别接种9-11日龄易感鸡胚，每胚接种尿囊腔0.1ml,用蜡封接种孔和气孔，37℃孵化，弃去72h前死亡胚，收集72-96h死亡胚和96h活胚胚液。

3.将收获的胚液分别经0.1%甲醛37℃灭活20小时，后以3:2的比例将新城疫和传染性支气管炎病毒液混合。取96份混合后的抗原液，加入灭菌的吐温-804份，充分摇匀制备水相。油相制备取94份白油，加硬脂酸铝2份，再加司本-804份，混合后高压灭菌备用。乳化按油相∶水相=7∶3的体积比例，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为11,000rpm，温度18℃的情况下，水相加入油相的速度为0.6ml/s，再继续以速度15,500rpm乳化5min，制备三批疫苗，批号分贝为1211、1212、1213。

实施例3两种方法生产的新、支二联灭活疫苗性状比较

1.外观：两者均为乳白色均匀乳剂。

2.剂型：两者均呈油包水型。在洁净的水面上，滴一滴油乳剂，观察其形态、是否分散、分散开的时间。结果显示两者形状均为规则圆形、不扩散。

3.粘度：用1ml吸管(上口内径2.7mm，下口内径1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需要的时间。结果显示两者3次流出时间均在5s内，符合规程要求，以本发明方法制备的疫苗黏度更低，均在3s内。

4.稳定性：

(1)取10ml疫苗置于离心管中以3000r/min离心15min，管底析出的水相≤0.5ml。

(2)取疫苗在37℃左右放置21d，结果显示不分层，没有破乳现象。

5.安全性检验：

用14日龄SPF(无特定病原体)鸡，每种疫苗免疫10只鸡，每只腿部肌肉注射疫苗1ml，空白对照10只。每天观察免疫鸡只，接种后14天剖检鸡只，观察局部及全身反应，观察局部疫苗吸收情况。

两种方法制备的疫苗检测性状对比见表1。

表1两种疫苗检测性状对比

实施例4两种方法生产的新、支二联灭活疫苗效力及攻毒对比试验

试验鸡共分7组，即1201、1202、1203、1211、1212、1213、非免疫对照组，每组各30只鸡。免疫剂量为试验组每只雏鸡颈背皮下注射0.5ml，免疫前和免疫后每周采集血清测定抗体，第4周以后每2周采血一次，试验期为16周。免疫后第4周本发明二联苗组各抽16只，非免疫对照组抽8只，分别进行新城疫、传染性支气管炎强毒攻击保护试验，攻毒剂量为新城疫10⁵ELD₅₀肌注1ml，传染性支气管炎M41（10倍稀释）滴鼻2滴。攻毒后观察死亡、发病鸡剖检病理变化，计算其保护率。

本发明二联苗免疫3周后抗体明显上升，其新城疫HI抗体效价达6.0-7.0log2。常规异胚接种二联苗新城疫HI抗体水平明显低于本发明二联苗，试验期内抗体水平一直在4log2以下。本发明二联苗免疫后4周攻毒保护率为8/8，非免疫对照组4/4死亡。

本发明二联苗试验鸡在免疫后3周VN抗体可达1:8，与常规异胚接种二联苗差异不明显，免疫后4周攻毒，本发明三批二联苗保护率为8/8，非免疫对照组4/4死亡。

表2二联苗免疫后ND血凝抑制抗体（HI）抗体消长

表3二联苗免疫鸡IB中和抗体（VNT）消长

表4二联苗免疫鸡4周攻毒保护情况

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种新城疫、传染性支气管炎二联油乳剂灭活疫苗，其特征在于由1体积的水相与2体积的油相构成，其中水相由能够诱导宿主免疫应答的疫苗抗原、亲水性非离子型表面活性剂和水构成，油相由矿物油、卵磷脂、丙二醇、异甘露醇单油酸脂和亲油性非离子型表面活性剂构成。

2.根据权利要求1所述油乳剂灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗抗原为通过同胚接种而得到的新城疫、传染性支气管炎两种抗原混合物。

3.根据权利要求1所述油乳剂灭活疫苗，其特征在于，所述亲水性非离子型表面活性剂为吐温-80。

4.根据权利要求1所述油乳剂灭活疫苗，其特征在于，所述亲油性非离子型表面活性剂为司盘-80。

5.根据权利要求1所述油乳剂灭活疫苗，其特征在于，所述矿物油为白油佐剂。

6.一种如权利要求1~5任意一项的油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）调整新城疫、传染性支气管炎种毒的浓度，以达到合理搭配；

2）将调整后浓度的新城疫、传染性支气管炎种毒按比例混合；

3）将混合毒种接种于9-11日龄易感鸡胚；

4）孵化，收胚液；

5）将收获的胚液进行灭活；

6）灭活后加入佐剂乳化，即成新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述油乳剂灭活疫苗，其特征在于，步骤1）中新城疫种毒的稀释浓度为10⁴EID₅₀，传染性支气管炎种毒的稀释浓度为10⁶EID₅₀。

8.根据权利要求6所述油乳剂灭活疫苗，其特征在于，步骤2） 中新城疫、传染性支气管炎种毒的混合比例为1:1。