CN103497933B - 一株h9n2型禽流感毒株在疫苗开发上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离与鉴定以及在疫苗开发上的应用。禽流感A型流感病毒H9N2亚型，已于2012年10月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC？No.6659。本发明提供的禽流感A型流感病毒H9N2亚型株经过鸡胚扩增，利用甲醛灭活，与新型605佐剂混合制备成灭活疫苗后，经过血清学方法和免疫攻毒法进行免疫评估，并且比市场商品苗(禽流感病毒SS株，F株，HP株)产生抗体时间早，持续时间长，在最高峰产生的抗体水平较高，对禽群具有很好的保护效果。本发明对于禽流感病毒的防治具有重要的价值。

Description

一株H9N2型禽流感毒株在疫苗开发上的应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株的分离与鉴定及利用该毒株制备用的预防禽流感的灭活疫苗。

技术背景

禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科流感病毒属成员。根据流感病毒的核蛋白和基质蛋白的不同，可分为A、B、C三种血清型。禽流感病毒属于A型流感病毒。A型流感病毒粒子呈球形，直径100nm左右。病毒具有囊膜，囊膜上有12～14nm的纤突，有两种不同类型即HA和NA。病毒的核衣壳呈螺旋对称，核酸为单股负链RNA，可分成8个片段，总长约13.6kb。禽流感病毒的囊膜表面具有血凝素(HA)，能够凝集多种动物的红细胞，并且能被特异的抗血清所抑制。AIV根据其致病性可分为高致病性AIV和低致病性AIV，感染家禽的高致病性和低致病性AIV分别以H5和H9为主。

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在，是当前禽流感流行的主要型别之一。H9N2亚型禽流感最早在北美的火鸡体内被发现，1994年我国家禽中开始出现。此型禽流感呈地方性流行、持续存在等特征，严重危害我国养禽业的发展，造成了巨大的经济损失。H9N2属于低致病性禽流感毒株，感染后并不一定造成禽群的大规模的死亡，但会使禽群的免疫力下降，对各种病原的抵抗力降低，常常易发生并发或继发感染。H9N2的感染主要引起呼吸道感染或产蛋率下降等症状，当伴有其他病原感染后，主要引起青年鸡、产蛋鸡的呼吸道、生殖道、肾或胰腺的严重损伤。所以低致病性的禽流感同样对养禽业存在着严重的威胁。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践表明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用，所以选择免疫保护力好的H9N2禽流感病毒疫苗株，才能使得疫苗的免疫效果得到保证。

发明内容

本发明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株的分离与鉴定及利用该毒株制备用的预防禽流感的灭活疫苗，所制备的疫苗是针对禽H9N2亚型流感病毒的疫苗。

禽H9N2亚型流感病毒已于2012年1月9日由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定，命名为禽流感A型流感病毒H9N2亚型。该毒株于2012年10月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.6659。禽流感A型流感病毒H9N2亚型CGMCCNo.6659简称为AIV-JD株。

本发明中制备禽流感病毒疫苗，其有效成分为灭活后的AIV-JD株病毒。所制备的疫苗是针对禽流感A型流感病毒H9N2亚型的疫苗。所述禽流感疫苗的制备方法包括AIV-JD株病毒液的灭活终浓度0.2％的甲醛，37℃灭活24h，灭活液与新型605佐剂4：6的混合，得到禽流感病毒灭活苗。

本发明中制备禽流感疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的禽流感灭活疫苗疫苗对禽具有很好的保护力。

具体实施方式

实施例1

AIV-JD株的分离与鉴定

1.病毒分离

将采集的喉头、气管和肺脏混合、剪碎、研磨，按W/V为1∶5比例用无菌PBS稀释，4000rpm离心10min，取上清液过滤，经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚。鸡胚接种后置37℃孵化器继续孵化，孵育24h后观察鸡胚存活情况，24小时内死亡鸡胚视为非特异死亡，弃去不用，连续孵化96小时，收获尿囊液。

2.病毒的鉴定

2.1血凝试验(HA)

将收集的尿囊液作为被检样品，进行HA试验，观察凝集反应，试验设PBS阴性对照。血凝价大于1∶16判定为阳性。结果显示，鸡胚尿囊液对1％鸡红细胞的凝集效价为1∶1024。

2.2血凝抑制试验(HI)

根据凝集试验的测定结果，用灭菌PBS配制4个工作单位的抗原。用PBS(pH7.0～7.2)分别将禽流感H1～H16亚型、新城疫阳性血清及SPF鸡阴性血清做连续倍比稀释后，做HI试验。结果表明，分离毒株禽流感H1～H8和H10～H16及新城疫阳性血清、阴性血清均没有交叉反应，而与H9亚型禽流感抗血清有交叉反应(1∶256)。

2.3病毒神经氨酸酶活性测定(NA)

取1.5ml管9支，2～9#每管加入10ulPBS(pH5.9)，1#管加入20ul病毒，2～8#管依次进行倍比稀释1∶2、1∶4、1∶8直至1∶128，9#管为对照管；每管加入20ul胎蛋白工作液，充分振荡，37℃水浴16～18小时；从水浴中取出试管，室温冷却，每管加入20ul过碘酸钠，充分混合，室温孵育30min；每管加入200ul砷试剂，混匀；硫代巴比妥酸试剂加热溶解，每管加入500ul，混匀；将试管置于水浴中煮沸10～15min，取出后观察颜色变化，粉红色代表具有神经氨酸酶活性，淡粉色表示有部分活性，浅黄色或无色代表没有活性，颜色改变的前一管的稀释度为1个酶单位。结果显示，底物对照组呈白色，其余各管随样品稀释度升高，颜色逐渐从粉红色向白色改变，试验结果成立。病毒在1∶64稀释度颜色明显改变为淡粉色，判定该毒株酶活性为1∶32。

2.4病毒神经氨酸酶活性抑制试验(NI)

血清灭活：56℃灭活30分钟；取1.5ml管12支，1～9#管为阳性血清管，每管分别加入10ulN1～N9阳性分型血清，10#管加入10ul阴性血清，11#管加入30ulPBS，12#管为病毒对照管；病毒配制成1个酶单位，向1～10#和12#管内加入20ul病毒，37℃作用30～60min；取出加入20ul胎蛋白，充分混合，37℃作用16～18小时；取出，室温冷却，每管加入20ul过碘酸钠，混匀，室温作用20min；每管加入200ul砷试剂，混匀；每管加入500ul硫代巴比妥酸，混匀；置于沸水浴中10～15分钟，取出后立即观察颜色，判定病毒活性。粉红色代表病毒神经氨酸酶活性没有受到抑制，判为阴性，浅黄色或无色代表病毒神经氨酸酶活性受到抑制，判为阳性。结果显示，PBS对照管呈白色，阴性血清对照管、1个酶单位病毒管呈粉红色，试验结果成立。N2亚型阳性血清可以完全抑制1个酶单位病毒活性，而N1、N3～N9亚型阳性血清均不能抑制病毒的酶活性。

2.5病毒回归试验

用PBS将分离的病毒100倍稀释，以0.5ml/只的剂量经滴鼻途径接种10只SPF鸡，将试验鸡置于SPF鸡隔离器中饲养。攻毒后5天采集咽拭子，接种SPF鸡胚，进行病毒重分离。攻毒后14天采血分离血清，利用禽流感分型抗原进行血清HI抗体效价测定。结果表明，病毒接种SPF鸡后5天，10只SPF鸡的病毒分离阳性率为100％(10/10)。攻毒后14天，10只SPF鸡的血清仅与H9N2亚型HI抗原发生特异性反应。

结果显示，分离到一株H9N2亚型禽流感病毒。

实施例2

AIV-JD株种毒的制备

禽流感病毒AIV-JD株毒种制备将种毒用生理盐水作10^-3稀释，尿囊腔内接种9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。接种后持续观察鸡胚，弃去48h死亡的鸡胚，选取48～96h内死亡的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装入灭菌处理的容器中。对收集的鸡胚液进行无菌检测和血凝价检测，对无菌检测合格和血凝价不低于1∶256(微量法)的鸡胚液混合，分装于盐水瓶中，冷冻保存，注明收获日期及毒种代次。

实施例3

AIV-JD株制苗用病毒液的制备

取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-3稀释，接种9日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每日照蛋1次，将48小时前死亡的鸡胚奔去。此后每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上垂直，置于2～8℃冷却24小时。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液。对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败，胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌容器内，每组抽样测定血凝价，血凝价低于1∶256(微量法)者应奔去。同时作无菌检查，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃左右保存，应不超过5日。

实施例4

AIV-JD病毒液的灭活及半成品检验与疫苗的制备

1.将收获的无菌胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内，吸出数毫升样品备测毒价。其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入10％的甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活24小时(以瓶内温度达到37℃开始计时)。期间震摇3～4次。在2～8℃保存，应不超过1个月。

2.取灭活胚液按现行《中国兽药典》附录方法进行，应无菌生长。

3.灭活检验取10日龄无禽流感病毒抗体的鸡胚10枚，每胚接种0.2ml，置37℃继续孵育，剔除24h内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异性死亡不应超过2枚。收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚的胎儿病变，应全部为阴性。对所有胚液分别测定血凝价，应均不出现血凝，认为灭活完全。

4.毒价测定将灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度分别接种9日龄无鸡禽流感病毒抗体的鸡胚5个，每胚尿囊液内0.1ml，每日照蛋2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价≥1∶64(微量法)以上者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥107^.0EID₅₀，方可用于制苗。

5.灭活疫苗制备将605佐剂按照各种物质配比后，混匀，高压灭菌4度保存备用。将灭活禽流感病毒液与佐剂按照4∶6比例进行混合。

表1：灭活疫苗的组份

按比例加入后，以500～1000rpm的搅拌速度搅拌，搅拌时间不少于30分钟。在终止搅拌前加入1％的硫柳汞溶液防腐，使其最终浓度为0.005％。

6.分装定量分装，加盖密封。

实施例5

疫苗安全效果检测

实验组用30～60日龄SPF鸡10只，每只腿部肌肉注射疫苗1.0ml，观察14日，疫苗应不引起局部和全身不良反应。同时设生理盐水对照组和商品苗组。结果显示，实验组基本无残留，不引起局部反应；商品苗组有较多残留，并且有局部炎症反应(附图)。

实施例6

疫苗免疫效果检测

1.血清学检测

用3～5周龄SPF鸡，其中10只各颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只作对照。同时设商品苗对照组。接种后7日～42日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。结果显示，在14d产生具有保护力的抗体，直到42d抗体效价仍很高，具有很高的保护力。并且比市场商品苗(禽流感病毒SS株，F株，HP株)产生抗体时间早，持续时间长，在最高峰产生的抗体水平较高。变化趋势见附2。

表3：血清中禽流感抗体水平变化(Log2)

说明：抗体的HI效价水平为各组的几何平均数

2.免疫攻毒法

用3～5周龄SPF鸡，其中10只各颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只作对照。同时设商品苗对照组，商品苗1、2和3。接种后21～28日，用1：10稀释的H9亚型AIV-JD株毒种进行翅静脉注射，每只鸡0.5ml。攻毒后第5日，分别采集每只鸡的泄殖腔棉拭子，将同一只鸡的泄殖腔棉拭子经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每枚0.2ml，观察5日，逐胚测定鸡胚液的HA效价。结果显示，实验组10只鸡的棉拭子接种的5枚鸡胚的HA效价均不超过1，对照组的HA效价在5～8之间，商品苗组的HA效价在1～2之间，分离阳性的商品苗组一枚鸡胚HA效价为7。免疫鸡后，实验组10只病毒分离全部为阴性，商品苗1和2组9只病毒分离为阴性，商品苗3组10只病毒分离为阴性，对照组5只病毒分离阳性。疫苗免疫后，产生的抗体能够保护AIV-JD株的感染，并且本研究的疫苗保护效果高于商品苗组。

图1：疫苗安全性检测SPF鸡剖检图

Fig1对照组腿部正常

Fig2商品苗组腿部残留较多，且局部有炎症反应

Fig3实验组腿部残留较少，无局部炎症

图2：血清中禽流感抗体水平变化。

Claims (4)

1.一株禽流感A型流感病毒(AvianInfiuenzaVirus)H9N2亚型AIV-JD株，其特征在于保藏号为CGMCCNo.6659。

2.一种禽流感灭活疫苗，其特征在于，采用权利要求1所述毒株接种鸡胚培养，收获感染的胚液，经甲醛灭活后与无油佐剂按照4∶6的比例混合制成所述禽流感灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述疫苗，其中无油佐剂制备方法为：取磷酸氢二钠2～5g、磷酸二氢钾0.2～1g、氯化钠3～10g、海藻糖2～10g、黄芪多糖2～10g、谷氨酸钠1～5g、明胶5～20g、聚乙二醇30003～10g，葡聚糖1～5g溶解于1000ml注射用水中，采用均质机处理后，经121℃，高压灭菌20min后备用。

4.权利要求1所述禽流感A型流感病毒H9N2亚型AIV-JD株用于制备禽流感疫苗的用途。