CN108220477A - 一种猪瘟活疫苗效力的检测方法 - Google Patents

一种猪瘟活疫苗效力的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：将培养好的ST细胞进行RNA提取，PCR反应，电泳和凝胶成像。本发明的优点是，检验周期为4天，检验不需要动物。在实验室即可完成，工作量小，效率高，影响因素可控，准确性高，操作简单，重现性高，检验成本仅为原方法的三分之一左右，具有很高的应用前景。

Description

一种猪瘟活疫苗效力的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种猪瘟活疫苗效力的检测方法。
背景技术
猪瘟活疫苗是利用猪瘟兔化弱毒株(CVCCAV1412)接种易感细胞培养，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成。用于预防猪瘟的一种疫苗。
猪瘟活疫苗效力检验常规检验方法是用实验兔，其检验周期为8天，检验过程繁琐，工作量大，成本高，而且受实验动物本身因素影响较大，实验结果经常出现可疑现象。
发明内容
本发明提出了一种效率高、准确性高的猪瘟活疫苗效力的检测方法。
本发明的技术方案是这样实现的：一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，包括以下步骤：将培养好的ST细胞进行RNA提取，PCR反应，电泳和凝胶成像；
所述PCR反应的体系为按每50ul反应物计，含有15ul双酶一管式RT-PCR 2倍缓冲稀释液(双酶一管式RT-PCR Buffer 2×)、2ul猪瘟病毒(CSFV)专性引物对、 3ul样品RNA、28ul超纯水和2ul逆转录酶与耐热酶的混合物(MMLV-Taq Mix)；
其中，双酶一管式RT-PCR 2倍缓冲稀释液、猪瘟病毒(CSFV)专性引物对、超纯水和逆转录酶与耐热酶的混合物均为市售产品。
所述PCR反应的设置为：
所述电泳是将经所述PCR反应所得的反应物加入市售的上样缓冲液，再加入至琼脂凝胶中，在V:130v、I:400mA、T:25min由负极至正极的条件下开始电泳。
作为优选，所述RNA提取包括以下步骤：
2.1加560ul裂解缓冲液(OVL Lysis Buffer)至1.5mlEP管中，再加5.6ul转运 RNA酶(Carry RNA)，再加10ulβ-巯基乙醇；
2.2加样：加280ul待检样品，振荡15秒，静置5min；
2.3加无水乙醇560ul，振荡15秒；
2.4将上述体系加入到2ml DNA收集管中，每次700ul，8000r/min离心1min，弃去下层液体；
2.5重复2.4步骤
2.6加多糖洗液(RWA wash Buffer)500ul，8000r/min离心1min，弃去下层液体；
2.7加蛋白洗液(RWB wash Buffer)500ul，8000r/min离心1min，弃去下层液体；
2.8重复2.7步骤
2.9空离：换新的1.5mlEP管，13000r/min离心2min；
2.10挥发：即换新的1.5mlEP管中，打开盖子，挥发5-10min；
2.11洗样：换新的1.5mlEP管，加入30ul DEPE水，放置2-3min。
作为优选，所述凝胶成像是将已电泳好的所述凝胶置于透射光为312nm处，打开凝胶成像系统软件进行拍摄编辑图像，判定结果。
在所述凝胶成像的工序后，还包括计算结果；根据Reed和Muench法计算TCID50
计算公式为：
logTCID50＝高于或等于50％的病毒稀释度的对数+距离比例(X)×稀释系数的对数(-1)
作为优选，在进行所述PCR反应的设置时，温度94℃、时间30s，温度55℃、时间30s，和温度72℃、时间30s的三个条件下循环30次。
作为优选，所述ST细胞的培育包括以下步骤：
(1)ST细胞制备：将ST细胞用含10％新生牛血清的MEM液将细胞配制成10-12 万个/ml，置细胞培养瓶中，放于含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养；细胞长成单层后，弃去培养液，用PBS液洗1次，再用EDTA分散液分散细胞，用含10％新生牛血清的MEM液将细胞配制成10-12万个/ml，将细胞分于48孔细胞培养板上，放于含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养，至长成细胞单层，得猪瘟活疫苗样品；
(2)样品稀释：用灭菌生理盐水将所述猪瘟活疫苗样品稀释成1头份/0.1ml，然后将这1头份按10倍稀释系列稀释至10-5；
(3)样品接种及培养：取10-3、10-4、10-5三个稀释度，每个稀释度接种48孔板5孔，每孔接种0.1ml，补加0.9ml含5％新生牛血清的MEM液，置含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养4天，然后置-20℃冷冻，备用。
作为优选，还包括所述ST细胞的前处理：从液氮罐中取出1支ST细胞冻存液，立即投入产37℃水中融化，1500r/min离心5分钟，弃去上清液，即得。
PCR法检测猪瘟活疫苗效力的方法原理如下：
由于猪瘟活疫苗是利用猪瘟兔化弱毒株(CVCCAV1412)接种ST细胞培养，收获培养物加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成。说明猪瘟病毒可以在ST细胞上稳定生长，一定量的猪瘟病毒可以感染ST细胞。感染的细胞可以用PCR法检出。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
本发明中，若无特别说明，％指的是体积百分比。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
利用猪瘟活疫苗可以在猪睾丸传代细胞(简称ST)上稳定生长，通过对猪瘟活疫苗稀释后，取适宜的3个稀释滴度接种于已生长好的ST细胞48孔板，每个滴度接种4孔，培养4天，再用PCR法分别测定是否有病毒感染，再根据Reed和Muench 法计算TCID50，即可计算猪瘟活疫苗效力，根据大量对比实验，15000RID/头份相当于104.2TCID50/头份。
通过PCR法检测猪瘟活疫苗效力，检验周期为4天，检验不需要动物。在实验室即可完成，工作量小，效率高，影响因素可控，准确性高，操作简单，重现性高，检验成本仅为原方法的三分之一左右，具有很高的应用前景。
附图说明
图1为本发明对比例1中的样品稀释流程图。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)ST细胞制备：从液氮罐中取出1支ST细胞冻存液，立即投入产37℃水中融化，1500r/min离心5分钟，弃去上清液，取出细胞用含10％新生牛血清的MEM 液将细胞配制成10-12万个/ml，置细胞培养瓶中，放于含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养。待细胞长成单层后，弃去培养液，用PBS液洗1次，再用EDTA分散液分散细胞，用含10％新生牛血清的MEM液将细胞配制成10-12万个/ml，将细胞分于48孔细胞培养板上，放于含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养。
(2)样品稀释：用灭菌生理盐水将猪瘟活疫苗样品稀释成1头份/0.1ml，然后将这1头份按10倍稀释系列稀释至10-5。
(3)样品接种及培养：取10-3、10-4、10-5三个稀释度，每个稀释度接种48孔板5孔，每孔接种0.1ml，补加0.9ml含5％新生牛血清的MEM液，置含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养培养4天。
(4)PCR法检验：
4.1将培养好的细胞板置-20℃冷冻，取出放置室温融化。
4.2RNA提取；(RNA提取试剂盒购于OMEGA bio-tek公司，批号为R6874-01)。
4.2.1加560μl裂解缓冲液至1.5mlEP管中，再加5.6μl转运RNA酶，再加 10μlβ-巯基乙醇。
4.2.2加样:加280μl待检样品，振荡15秒，静置5min。
4.2.3加无水乙醇560μl，振荡15秒。
4.2.4将上述体系加入到2ml DNA收集管中，每次700μl，8000r/min离心1min，弃去下层液体。
4.2.5重复4.2.4
4.2.6加多糖洗液500μl，8000r/min离心1min，弃去下层液体。
4.2.7加蛋白洗液500μl，8000r/min离心1min，弃去下层液体。
4.2.8重复4.2.7
4.2.9空离：换新的1.5mlEP管，13000r/min离心2min
4.2.10挥发：换新的1.5mlEP管，打开盖子，挥发5-10min
4.2.11洗样：换新的1.5mlEP管，加入30μl DEPE水，放置2-3min，
4.3PCR反应体系配制：
4.4PCR反应设置：
温度 时间 循环数
60℃ 30min
94℃ 2min
94℃ 30s
55℃ 30s 30次
72℃ 30s
72℃ 5min
4℃ 5min
4.5电泳
将上述反应物加上样缓冲液3μl，再将样品加入已制好的琼脂糖凝胶小孔中，每孔加5μl置电泳槽中电泳：设置：V:130v、I:400mA、T:25min由负极至正极开始。
4.6凝胶成像：放入已电泳好的胶条将光源调至透射光312nm处，打开凝胶成像系统软件进行拍摄编辑图像，判定结果。
4.7计算结果：根据Reed和Muench法计算TCID50
计算公式为：
logTCID50＝高于或等于50％的病毒稀释度的对数+距离比例(X)×稀释系数的对数(－1)
试验数据
按PCR法检测猪瘟活疫苗效力方法抽取成品样品，批号为2017002、2017003、2017004三批样品，分别按检验方法操作，检测结果如下表：
实验结果表明，用本发明所用的PCR法检测猪瘟活疫苗效力方法其检验周期为 4天，检验不受动物因素影响，影响因素可控，在实验室即可完成，一人即可完成，效率高，准确性高，操作简单，重现性高，因此，具有很高的应用前景。
对比例1
现有检测技术是用家兔检测，其检测方法受动物本身因素影响，且检测时间过长，工作量大。具体方法如下：
1准备
1.1实验动物1.5～3.0㎏家兔。动物质量标准应符合《生产检验用动物管理规程》。选择家兔时应选择眼睛明亮，毛色有光泽，无癣疾，肛门周围洁净，动作敏捷活泼，食欲良好，未怀孕。
1.2实验动物应记录其来源、观察天数，家兔接种前3天，每天上、下午各测体温一次，体温应在38.5～39.5℃，且温差波动不超过0.5℃。家兔的饲养管理按《检验用实验动物管理规程》进行。
1.3稀释及接种用器具：5ml移液枪1支及相应枪头、1ml移液枪2支相应枪头、 2ml注射器按需准备、7号针头配2ml注射器、中试管按需准备、75％酒精棉花、冰水、试管架、止血钳、记号笔等，凡直接接触样品的用具应按《实验器具清洁灭菌操作程序》清洁、灭菌。
1.4稀释液：无菌生理盐水置4℃冰箱过夜。
1.5仪器：涡流混合仪、体温计
2操作步骤
2.1样品稀释：
2.1.1编制样品检验目录：根据瓶签注明头份数及效力质量标准确定稀释倍数，并按顺序列表。如：20头份，效价为1/15000，稀释倍数为300000倍，列表为：
6×10×10×10×10×5
2.1.2稀释：
取样品1瓶，每瓶用灭菌生理盐水按列表顺序稀释于中试管内,每次混合10秒左右,稀释好的用记录号笔标记好序号，放冰水中待接种。如图1所示。
2.2.接种：将接种家兔耳静脉用75％酒精消毒，然后用2ml注射器将样品每兔耳静脉注射1ml，注射2只。
2.3.饲养观察：家兔接种后按《实验动物饲养管理规程》饲养。48小时前，每天上下午各测体温一次，48小时后，每隔6小时测体温一次，根据体温反应和攻毒结果进行热型判定。
2.3.1定型热反映(++)：潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3 个温次超常温1℃以上，并稽留18～36小时。如稽留42小时以上，可攻毒，攻毒后无反应可判为定型热。
2.3.2轻热反应(+)：潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温0.5℃以上，并稽留12～36小时。
2.3.3可疑反映(±)：潜伏期48～96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12 小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。
2.3.4体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+) 标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应。
2.3.5无反应(－)体温正常。
2.4结果判定
2.4.1注苗后，当2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只家兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判合格。
2.4.2注苗后，当1只家兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)；或2只兔均呈轻热反映(+)时，可在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干种毒)。攻毒时，设对照兔2只，攻毒剂量为50～100倍乳剂(即按组织量用灭菌生理盐稀释50～100倍)。每兔耳静脉注射1ml。按2.3饲养观察。
2.4.2.1攻毒后的体温反应标准如下：
2.4.2.1.1热反应(+)潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，稽留12～36小时。
2.4.2.1.2可疑反应(±)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。
2.4.2.1.3无反应(－)体温正常。
2.4.2.2攻毒后结果判定：攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1 只兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(－)，疫苗判合格。
2.4.3注苗后，如有1只兔呈定型热(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)或无热反应(－)，可对可疑反应兔或无反应兔采用剖杀或采心血分离病毒的方法，判明是否隐性感染；或注苗后，2只兔均呈轻热反映，亦可对其中一只兔分离病毒。方法是：接种疫苗后96～120小时之间，将兔剖杀，无菌法采取脾脏，用无菌生理盐水制成50倍稀释乳剂，脾乳剂按《无菌(纯粹)检验操作程序》进行无菌检验，应无菌；或采取心血(全血)，接种2只家兔，每只兔耳静脉注射1ml。凡有一只兔潜伏期24～72小时出现定型热反应(++)，疫苗可判合格。
2.4.4注苗后，出现其他反应情况无法判定时，可重检。用家兔做效检，不超过3次。
猪瘟活疫苗效力检验常规检验方法是用实验兔，其检验周期为8天，检验过程繁琐，工作量大，成本高，而且受实验动物本身因素影响较大，实验结果经常出现可疑现象。
用本发明所用的PCR法检测猪瘟活疫苗效力方法其检验周期为4天，检验不需要动物，在实验室即可完成，工作量小，效率高，影响因素可控，准确性高，操作简单，重现性高，检验成本仅为原方法的三分之一左右，具有很高的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：将培养好的ST细胞进行RNA提取，PCR反应，电泳和凝胶成像；
所述PCR反应的体系为按每50ul反应物计，含有15ul双酶一管式RT-PCR2倍缓冲稀释液、2ul猪瘟病毒专性引物对、3ul样品RNA、28ul超纯水和2ul逆转录酶与耐热酶的混合物；
所述PCR反应的设置为：
温度 时间 60℃ 30min 94℃ 2min 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 30s 72℃ 5min 4℃ 5min
所述电泳是将经所述PCR反应所得的反应物加入上样缓冲液，再加入至琼脂凝胶中，在V:130v、I:400mA、T:25min由负极至正极的条件下开始电泳。
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：所述RNA提取包括以下步骤：
2.1加560ul裂解缓冲液至1.5mlEP管中，再加5.6ul转运RNA酶，再加10ulβ-巯基乙醇；
2.2加样：加280ul待检样品，振荡15秒，静置5min；
2.3加无水乙醇560ul，振荡15秒；
2.4将上述体系加入到2ml DNA收集管中，每次700ul，8000r/min离心1min，弃去下层液体；
2.5重复2.4步骤
2.6加多糖洗液500ul，8000r/min离心1min，弃去下层液体；
2.7加蛋白洗液500ul，8000r/min离心1min，弃去下层液体；
2.8重复2.7步骤
2.9空离：换新的1.5mlEP管，13000r/min离心2min；
2.10挥发：换新的1.5mlEP管，打开盖子，挥发5-10min；
2.11洗样：换新的1.5mlEP管，加入30ul DEPE水，放置2-3min。
3.根据权利要求1所述的一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：所述凝胶成像是将已电泳好的所述凝胶置于透射光为312nm处，打开凝胶成像系统软件进行拍摄编辑图像，判定结果。
4.根据权利要求1所述的一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：在所述凝胶成像的工序后，还包括计算结果；根据Reed和Muench法计算TCID50
计算公式为：
logTCID50＝高于或等于50％的病毒稀释度的对数+距离比例(X)×稀释系数的对数(-1)
。
5.根据权利要求1所述的一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：在进行所述PCR反应的设置时，温度94℃、时间30s，温度55℃、时间30s，和温度72℃、时间30s的三个条件下循环30次。
6.根据权利要求1所述的一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：所述ST细胞的培育包括以下步骤：
(1)ST细胞制备：将ST细胞用含10％新生牛血清的MEM液将细胞配制成10-12万个/ml，置细胞培养瓶中，放于含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养；细胞长成单层后，弃去培养液，用PBS液洗1次，再用EDTA分散液分散细胞，用含10％新生牛血清的MEM液将细胞配制成10-12万个/ml，将细胞分于48孔细胞培养板上，放于含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养，至长成细胞单层，得猪瘟活疫苗样品；
(2)样品稀释：用灭菌生理盐水将所述猪瘟活疫苗样品稀释成1头份/0.1ml，然后将这1头份按10倍稀释系列稀释至10-5；
(3)样品接种及培养：取10-3、10-4、10-5三个稀释度，每个稀释度接种48孔板5孔，每孔接种0.1ml，补加0.9ml含5％新生牛血清的MEM液，置含5％二氧化碳37℃的培养箱中培养4天，然后置-20℃冷冻，备用。
7.根据权利要求6所述的一种猪瘟活疫苗效力的检测方法，其特征在于：还包括所述ST细胞的前处理：从液氮罐中取出1支ST细胞冻存液，立即投入产37℃水中融化，1500r/min离心5分钟，弃去上清液，即得。
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CN103616505A (zh) * 2013-12-10 2014-03-05 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法
CN106085946A (zh) * 2016-06-13 2016-11-09 金宇保灵生物药品有限公司 可以悬浮培养的猪睾丸细胞株st‑s及其获得方法与应用

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