CN111830257B - 一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用 - Google Patents

一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111830257B
CN111830257B CN202010699735.3A CN202010699735A CN111830257B CN 111830257 B CN111830257 B CN 111830257B CN 202010699735 A CN202010699735 A CN 202010699735A CN 111830257 B CN111830257 B CN 111830257B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lawsonia intracellularis
ipma
antigen
sodc
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010699735.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111830257A (zh
Inventor
范红结
蔺辉星
李敏雪
肖宁
李剑男
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Changji Biotechnology Co ltd
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Changji Biotechnology Co ltd
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Changji Biotechnology Co ltd, Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Changji Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010699735.3A priority Critical patent/CN111830257B/zh
Publication of CN111830257A publication Critical patent/CN111830257A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111830257B publication Critical patent/CN111830257B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90283—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide radicals as acceptor (1.15)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种猪源胞内劳森菌免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)抗原检测方法。利用纯化的重组SodC蛋白作为免疫原，制备了兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体，并检测其效价和反应原性。以猪胞内劳森菌阳性菌为包被原，制备的多克隆抗体为一抗，建立了一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法。本发明方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，不需要荧光倒置显微镜、酶标仪、PCR仪等昂贵仪器，操作简便，判断更为直观，染色后的微孔板可以长时间保存，适合大量样品的筛查，为胞内劳森菌在感染细胞中的定位及检测提供了新手段。

Description

一种猪源胞内劳森菌IPMA抗原检测方法及其应用
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法及其应用。
背景技术
猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis,PPE),又称猪回肠炎，是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的一种传染性肠道疾病。该菌通常感染保育猪群，病变部位主要发生在回肠末端，临床上以增生和黏膜增厚为主要特征，可引起猪生长发育迟滞、料肉比重下降，给猪场造成严重的经济损失。该病呈现急性型、亚急性型和慢性型三种形式，临床上以亚急性型为主，一般不会引起感染猪的死亡。该病于1931年首次报道，广泛见于欧洲、北美、澳大利亚及亚洲的一些国家，呈世界规模流行。近年来，我国规模化猪场中该病的发生率呈不断升高趋势。胞内劳森菌是严格胞内寄生菌，培养要求较高，无法在体外进行培养，鸡胚上也无法生长，需要特殊的细胞培养技术，目前国内尚无胞内劳森菌分离、培养的报道，成功检测出细胞内胞内劳森菌是该菌分离的关键。
目前，国内外已经建立了该菌的PCR、qPCR、IFA等抗原检测方法。PCR虽然可以实现临床样品的快速检测，但是仅限于感染猪排菌期的粪便样品检测。此外，由于粪便中胞内劳森菌的含量不高，同时存在PCR抑制因子，因此可能造成一定的假阴性。IFA结果判读需用价格昂贵的荧光显微镜，检测结果也可能出现假阴性，没有检测出不能代表无LI，难以在所有实验室得到推广。而IPMA检测的优点则在于不需要荧光倒置显微镜、酶标仪、PCR仪等昂贵仪器，只需要简单的光学显微镜即可观察结果，操作简便，判断更为直观，特异性高，染色后的微孔板可以长时间保存，适合大量样品的筛查。
本发明旨在建立一种针对胞内劳森菌抗原的IPMA检测方法，为后续胞内劳森菌的实验室分离鉴定提供一种有效的技术手段，从而为进一步控制和防治猪回肠炎提供一定的参考依据。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种针对胞内劳森菌抗原的IPMA(免疫过氧化物酶细胞单层试验)检测方法，本发明方法具有操作简便，判断直观，特异性强，敏感性高，重复性好等优点，能够检测常规PCR无法检测的病料，为该病早期防控提供一种技术支持。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，包括以下步骤：
(1)获取兔抗胞内劳森菌过氧化物歧化酶C蛋白(SodC蛋白)多克隆抗体作为一抗，HRP(辣根过氧化物酶)标记羊抗兔IgG作为二抗；
(2)制备待测胞内劳森菌抗原样品；
(3)制备IPMA检测反应板：将胞内劳森菌的宿主细胞接种于细胞培养板内，采用含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液培养形成单层细胞，弃去培养液，取出细胞培养板；向细胞培养板中加入步骤(2)制备的待测胞内劳森菌抗原样品，感染胞内劳森菌的宿主细胞，设置不含胞内劳森菌抗原样品的阴性对照，阴性对照孔加入与待测胞内劳森菌抗原样品等量的DMEM培养液；细胞培养板培养，培养完成后，将细胞培养板固定、清洗，得到IPMA检测反应板，备用；
优选的，所述胞内劳森菌的宿主细胞为McCoy细胞，或IPEC-J2细胞，或IEC-18细胞；
(4)胞内劳森菌的IPMA检测：取步骤(3)制备的IPMA检测反应板，加入体积百分比为0.5％的Triton-100溶液，室温透化，PBS清洗；
将步骤(1)获取的一抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；
将步骤(1)获取的二抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；
每孔加入3-氨基-9-乙基咪唑(AEC)底物，室温显色，甩去AEC底物，PBS清洗，加入苏木素染色液，PBS清洗；
待IPMA检测反应板彻底干燥后用光学显微镜观察结果，当待测胞内劳森菌抗原样品为阳性，则胞核呈蓝色，胞浆呈棕红色；当待测胞内劳森菌抗原样品为阴性，则胞核呈蓝色，胞浆不着色。
进一步的，步骤(1)所述一抗通过以下方法制备获得：
(1-1)以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，设计一对特异性引物进行扩增；
优选的，所述特异性引物对序列如下：
SF：5’-GGATCCATGGAATAAAACAGAGTATAGG-3’(SEQ ID NO.1)；
SR：3’-CTCGAGCTAGTTTGGTATAACACCAC-5’(SEQ ID NO.2)；
胞内劳森菌sodc基因全长543bp(NCBI genbank:AB218757.1)，本发明以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，采用特异性引物截取115-543位点的氨基酸表达蛋白，软件分析显示，经本发明截短表达的SodC蛋白抗原性和亲水性均强于sodc基因全长表达的蛋白，因此制备的胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体特异性强，除了与胞内劳森菌发生反应外，与沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒等常见肠道菌和病毒均不发生反应。
(1-2)以pGex-6p-1为载体，连接步骤(1)扩增产物，构建pGex-6p-1-sodc重组质粒，转化BL21，得到重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21；
(1-3)将步骤(1-2)得到的重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，表达胞内劳森菌SodC蛋白，离心收集上清，使用GST亲和层析柱对SodC蛋白进行纯化。
优选的，所述重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21与含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基的体积比例为1:100；
优选的，所述胞内劳森菌SodC蛋白表达条件为：将重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡培养至OD600nm值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG，于16℃、90r/min诱导18-24h，6000-10000rpm，4℃离心10-15min收集菌体，用PBS洗涤菌体3-5次，最后用PBS重悬沉淀，于-80℃反复冻融，冻融时间≥1h，进行超声破碎裂解，4℃，10000-12000×rpm离心20-30min,收集上清。
将纯化后的胞内劳森菌SodC蛋白与油佐剂按照1:1比例进行混合，乳化后制备成免疫原，将免疫原注射大白兔，三免后测定血清效价；优选的，所述测定血清效价的方法为：SodC蛋白包被浓度为5-20ug/ml，将待检测效价血清从体积比为1：100倍比稀释到1：100×230，TMB显色后测定OD450nm处的吸光值，以待检测效价血清孔的OD450nm值/阴性血清孔OD450nm值≧2.1判为阳性；
优选的，采用背部皮下多点注射免疫大白兔，免疫剂量为1mg/只，一免后第14d和21d各加强免疫一次，免疫剂量与免疫途径同首免；三免后第7天对兔子进行耳缘静脉采血，采用常规ELISA方法测定血清效价，SodC蛋白包被浓度为5-20ug/ml，将待检血清从1：100倍比稀释到1：100×230，稀释完成后，TMB显色后测定OD450nm处的吸光值，以待检血清孔的OD450nm值/阴性血清孔OD450nm值≧2.1判为阳性。
进一步的，步骤(2)所述待测胞内劳森菌抗原样品为细菌培养物或猪回肠组织匀浆液。
进一步的，步骤(3)中接种的胞内劳森菌宿主细胞密度为1×104个/mL-1×105个/mL；
所述胞内劳森菌的宿主细胞培养形成单层细胞的培养条件为：37℃、5％CO2培养箱培养24h；
所述细胞培养板培养操作为：将细胞培养板室温2000g离心10min，置于三气培养箱中培养3h后，更换为含万古霉素、新霉素和两性霉素B的含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，置于三气培养箱中培养，培养5天后取出细胞培养板，PBS清洗；优选的，所述含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液中万古霉素浓度为100ug/mL、新霉素浓度为50ug/mL、两性霉素B浓度为2ug/mL；
所述反应板固定采用预冷的体积比为4％多聚甲醛固定液，室温条件下固定10～20min，优选的，固定15min；
步骤(3)中加入的所述胞内劳森菌寄主细胞、步骤(2)制备的待测胞内劳森菌抗原样品、体积比为4％预冷的多聚甲醛固定液的加入量均为100uL/孔。
进一步的，步骤(4)中所述体积比为0.5％的Triton-100、稀释后的一抗、稀释后的二抗、AEC底物的加入量均为100uL/孔。
进一步的，步骤(4)中所述一抗稀释方法为：采用PBST进行稀释，一抗与PBST的体积稀释比为1:100-1:3200，优选的，一抗与PBST的体积比为1：1600，稀释后的一抗孵育时间为30min-120min，优选的，孵育时间为45min，孵育温度为37℃；
所述二抗的稀释方法为：采用PBST进行稀释，二抗与PBST的体积稀释比为1:1000-1:5000，优选的，二抗与PBST的体积比为1：2000，稀释后的二抗孵育时间为30min-120min，优选的，孵育时间为1h，孵育温度为37℃。
进一步的，所述猪回肠组织匀浆液通过以下方法制备获得：采集的猪回肠样品，用无菌剪刀剖开肠，刮取肠粘液至离心管中，并向离心管中加入胰蛋白酶溶液，37℃消化；向上述肠粘液中加入SPG溶液，置组织匀浆器中匀浆，匀浆后的肠粘液分别用滤纸和1.2μm、0.65μm孔径滤膜进行过滤，收集滤液，向滤液中加入终浓度体积比为10％的DMSO，制得猪回肠组织匀浆液。
本发明的第二个目的是提供前述的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法在实验室胞内劳森菌分离鉴定中的应用，所述待测胞内劳森菌抗原样品为细菌培养物。
在某一实施方式中，所述细菌培养物为胞内劳森菌培养物，所述胞内劳森菌培养物通过以下方式制备得到：
将McCoy细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水中融化，将融化后的细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2温箱中培养，待细胞长满单层后，弃培养液，用PBS漂洗3次，用用质量比为0.25％胰酶消化，待细胞有少量脱落时终止消化，加入含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，反复吹打数次至分散成单个细胞，吸取适量细胞液至另一细胞瓶中进行传代培养。
待McCoy培养至密度为30％左右时，弃培养液，加入经胞内劳森菌接种培养液10倍稀释后的猪胞内劳森菌弱毒疫苗阳性菌，将细胞培养板室温2000g离心10min，置于三气培养箱中培养3h后，更换为含万古霉素(100ug/mL)、新霉素(50ug/mL)和两性霉素B(2ug/mL)的含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，置于37℃，8％O2、8.8％CO2和83.2％N2的三气培养箱中培养，连续培养7d，期间每2-3d更换一次培养液。
本发明的第三个目的是提供前述的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法在防治胞内劳森菌引起的猪增生性肠炎中的应用，所述待测胞内劳森菌抗原样品为猪回肠组织匀浆液。
进一步的，所述猪回肠组织匀浆液通过以下方法制备获得：采集的猪回肠样品，用无菌剪刀剖开肠，刮取肠粘液至离心管中，并向离心管中加入胰蛋白酶溶液，37℃消化；向上述肠粘液中加入SPG溶液，置组织匀浆器中匀浆，匀浆后的肠粘液分别用滤纸和1.2μm、0.65μm孔径滤膜分别进行过滤，收集滤液，向滤液中加入终浓度体积比为10％的DMSO，制得猪回肠组织匀浆液。
本发明技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)胞内劳森菌sodc基因全长543bp，本发明截取115-543位点的氨基酸表达蛋白，软件分析显示截短表达的SodC蛋白抗原性和亲水性均强于sodc基因全长表达的蛋白，因此制备的胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体特异性强，除了与胞内劳森菌发生反应外，与沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒等常见肠道菌和病毒均不发生反应。
(2)目前国内外建立的IPMA检测方法均用于胞内劳森菌抗体检测，将胞内劳森菌弱毒疫苗作为包被原，待检血清作为一抗，从而检测血清中抗体水平；本发明是第一个建立胞内劳森菌抗原检测的IPMA方法，包被原是待检样品，主要为实验室胞内劳森菌分离鉴定以及确定胞内劳森菌在细胞中的分布定位提供检测手段。
(3)本发明建立的IPMA检测方法灵敏度可高达103个/mL，特异性和重复性检测结果表明，该方法具有良好的特异性和较高的重复性，仅需要光学显微镜即可观察结果，表明建立的IPMA检测方法简单直观有效，可以直接用于实验室胞内劳森菌分离鉴定和临床检测。
附图说明
图1为实施例1重组表达质粒pGex-6p-1-sodc/BL21表达产物的SDS-PAGE分析图；
M：蛋白分子量标准；1.pGex-6p-1空载体质粒；2.未诱导的重组表达质粒；3.诱导表达后的全菌液；4.诱导表达后的上清；5.诱导表达后的包涵体；6.纯化后的SodC。
图2为SodC蛋白的Western-blot分析图；
M：预染蛋白质分子质量标准；1.SodC纯化蛋白；2.GST标签蛋白。
图3为IPMA反应结果判定图；
A：兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体与细菌感染细胞反应；B：兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体与健康细胞反应。
图4为IPMA检测方法的特异性试验结果图；
A：LI；B：S.Cholerasuis；C：PRV；D：PEDV；E：TGEV；F：PCV。
图5为IPMA检测方法的敏感性试验；
A：1×107个/mL；B：1×106个/mL；C：1×105个/mL；D：1×104个/mL；E：1×103个/mL；F：1×102个/mL。
具体实施方式
若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。
本发明所用的材料来源：
DMEM高糖培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。
TMB显色液购自碧云天公司；
小鼠成纤维上皮细胞(murine fibroblast-like，McCoy)购自于ATCC；
猪胞内劳森菌阳性菌株，购于勃林格殷格翰。
HRP标记的羊抗兔抗体，购于武汉博士德生物工程有限公司；
AEC显色试剂盒为南京建成生物科技有限公司产品。
二氨基联苯胺(DAB)显色液及苏木素染色液购自凯基生物技术股份有限公司；
其他未列出的试剂都是能通过正规商业渠道购买；
具体实施案例：
实施例1：SodC蛋白的原核表达及纯化
(1-1)以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，设计一对特异性引物SF/SR进行扩增：
SF：5’-GGATCCATGGAATAAAACAGAGTATAGG-3’(SEQ ID NO.1)；
SR：3’-CTCGAGCTAGTTTGGTATAACACCAC-5’(SEQ ID NO.2)；
(1-2)以pGex-6p-1为载体，SacI、XhoI酶切pGex-6p-1，连接步骤(1)扩增产物，构建pGex-6p-1-sodc重组质粒，转化BL21，得到重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21；
将重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21按照1:100比例接种到3ml含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养至OD600nm值为0.5左右时，加入终浓度为0.5mMIPTG，于16℃，90rpm诱导18h，8000rpm，4℃离心10min收集菌体，用PBS洗涤菌体3次，每次10min，最后用裂解液重悬沉淀，于-80℃反复冻融3次，进行超声破碎裂解，4℃，10000×rpm离心20min，收集上清，用PBS重悬沉淀，分别取部分上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白的表达形式。按照上述表达条件大量表达重组SodC蛋白，离心收集上清，使用亲和层析柱对SodC蛋白进行纯化。
重组表达质粒pGex-6p-1-sodc/BL21表达产物进行SDS-PAGE分析，将配置好的10％蛋白胶安装放入电泳槽中，加入1×SDS电泳缓冲液。将蛋白样品按照10，000×g离心5min后加入孔道中，并加入2uL蛋白标准，接通电源后开始电泳，上层浓缩胶按照低电压80V电泳30min，下层分离胶使用较高电压120V电泳90min左右。结果显示：在40kDa左右可见一条蛋白条带，与目的蛋白大小一致，且表达量较高，而空载体和未诱导的重组质粒在该位置无蛋白条带，表达后菌体进行超声破碎，经SDS-PAGE电泳分析发现SodC蛋白主要以上清形式表达，SodC蛋白经纯化后，纯化后的蛋白杂带较少，其纯度高达90％以上，浓度达1.02mg/ml,说明纯化出的目的蛋白效果较好，可作为免疫原免疫动物(见图1)
实施例2：SodC蛋白的多克隆抗体的制备及Western-blot分析
将纯化后的SodC蛋白与油佐剂(ISA206油佐剂)按照1:1比例进行混合，乳化后制备成免疫原，采用背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔，免疫剂量为1mg/只，一免后第14d和21d各加强免疫一次，免疫剂量与免疫途径同首免。三免后第7天对兔子进行耳缘静脉采血，采用常规ELISA方法测定血清效价，SodC蛋白包被浓度为20ug/ml，将待检效价血清从1：100倍比稀释到1：100×230，HRP标记的羊抗兔IgG稀释倍数为1：5000，TMB显色后测定OD450nm处的吸光值，以待检效价血清孔的OD450nm值/阴性血清孔OD450nm值≧2.1判为阳性。纯化后的SodC蛋白经SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，用5％脱脂乳4℃封闭过夜，PBST洗膜3次，加入1：500稀释的兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体，37℃摇床孵育1h，PBST洗膜3次，加入1：5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃摇床孵育1h，PBST洗膜3次，用二氨基联苯胺(DAB)显色，蒸馏水终结反应，分析SodC蛋白的反应原性，设置GST标签蛋白作为阴性对照。Western-blot结果分析显示：SodC蛋白与其多克隆抗体发生了特异性结合，并产生与预期大小一致的单一蛋白条带，而作为阴性对照的GST标签蛋白并不能与兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体发生特异性反应，说明本实验制备的兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体具有良好的特异性(见图2)。
实施例3：胞内劳森菌的培养
(1)将McCoy细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水中融化，将融化后的细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2温箱中培养24h，待细胞长满单层后，弃培养液，PBS清洗3次，用质量比为0.25％胰酶消化，待细胞有少量脱落时终止消化，加入含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，反复吹打数次至分散成单个细胞，吸取适量细胞液至另一细胞瓶中进行传代培养。
(2)待McCoy培养至密度为30％左右时，弃所述含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，加入经胞内劳森菌接种培养液10倍稀释后的猪胞内劳森菌弱毒疫苗阳性菌，将细胞培养板室温2000g离心10min，置于三气培养箱中培养3h后，更换为含万古霉素(100ug/mL)、新霉素(50ug/mL)和两性霉素B(2ug/mL)的含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，置于37℃，8％O2、8.8％CO2和83.2％N2的三气培养箱中连续培养7d，期间每2d更换一次培养液。
实施例4：IPMA检测反应板的制备
将生长状态良好的McCoy细胞接种于96孔细胞培养板内，消化后调整细胞密度为1×104个/mL-1×105个/mL，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱，采用含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液培养24h形成单层细胞，弃去培养液，取出细胞培养板，加入浓度为107个/mL的胞内劳森菌弱毒疫苗阳性菌，每孔100μL，阴性对照孔加入等量的DMEM培养液，室温2000g离心10min，置于三气培养箱中培养3h后，更换为含万古霉素(100ug/mL)、新霉素(50ug/mL)和两性霉素B(2ug/mL)的含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液，5d后取出96孔细胞培养板，PBS清洗3次，每次5min，加入100μL体积比为4％预冷的多聚甲醛，室温固定15min，PBS清洗3次，干燥后于4℃保存备用。
实施例5：胞内劳森菌的IPMA检测
取出IPMA反应板于室温预热，PBS清洗3次，加入体积比为0.5％的Triton-100溶液，每孔100μL，置于室温透化10min，PBS清洗3次，每次5min，按1：1600比例加入PBST稀释的兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体，每孔100μL，置于37℃孵育45min，PBS清洗3次，按1：2000比例加入PBST稀释的HRP标记羊抗兔IgG，每孔100μL，置于37℃孵育1h，PBS清洗3次，每孔加入AEC底物100μL，置室温显色20min，甩去底物，每孔加入100μL，PBS清洗1次，加入苏木素染液染色30s，PBS清洗3次，彻底干燥后用光学显微镜观察结果。
实施例6：IPMA结果判定标准
实施例5光学显微镜观察显示：显微镜下可观察到细胞形态良好，阳性样品细胞边界清楚，胞核呈蓝色，感染胞浆内有明显的棕红色着染，而健康细胞无着染(见图3)。
阳性判定标准：兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体与细菌感染细胞反应，胞核呈蓝色，胞浆呈棕红色；
阴性判定标准：兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体与健康细胞对照孔反应，胞核呈蓝色，胞浆不着色。
实施例7：IPMA反应条件的确定
(1)一抗工作浓度的测定
制备IPMA检测反应板(96孔反应板)，用PBST将一抗进行稀释，稀释比例分别为1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，然后加至96孔板中，按照IPMA操作程序，加入1：2500稀释的二抗，将显色结果最好的一组浓度作为一抗的最佳稀释度，结果显示，一抗与PBST的体积比为1:100-1:3200条件下，显色结果均良好，1：1600稀释比例下，显色结果最佳。
(2)二抗工作浓度的测定
制备IPMA检测反应板(96孔反应板)，用PBST将一抗稀释到已确定的工作浓度，然后加至96孔板中，按照IPMA操作程序，加入1：1000，1：1500，1：2000，1：2500，1：3000，1：3500，1：4000倍稀释的二抗。将显色结果最好的一组浓度作为二抗的最佳稀释度，结果显示，二抗与PBST的体积比为1:1000-1:5000条件下，显色结果均良好，1：2000稀释比例下，显色结果最佳。
(3)一抗最佳孵育时间的确定
制备IPMA检测反应板(96孔反应板)5块，用PBST将一抗稀释到已确定的工作浓度，分别于37℃作用30min、45min、60min、90min、120min，按照IPMA操作程序，通过显色效果，确定一抗最佳孵育时间，结果显示，孵育时间为30min-120min，显色结果均良好，孵育时间为45min时，显色结果最佳。
(4)二抗最佳孵育时间的确定
制备IPMA检测反应板(96孔反应板)5块，用PBST将二抗稀释到已确定的工作浓度，分别于37℃作用30min、45min、60min、90min、120min，按照IPMA操作程序，通过显色效果，确定二抗最佳孵育时间，结果显示，孵育时间为30min-120min，显色结果均良好，孵育时间为60min时，显色结果最佳。
实施例8：IPMA检测方法的特异性试验
用S.Cholerasuis，PRV，PEDV，TGEV，PCV2，分别进行IPMA检测，以确定该方法的特异性。
结果显示，除接种胞内劳森菌的细胞胞质呈红棕色，胞核呈蓝色外，接种S.Cholerasuis，PRV，PEDV，TGEV，PCV2的细胞胞质均不染色，仅胞核呈蓝色，即均呈阴性，表明该实验建立的IPMA检测方法具有良好的特异性(见图4)。
实施例9：IPMA检测方法的敏感性试验
将胞内劳森菌纯培养物进行10倍比稀释后，按照最优的IPMA检测方法进行敏感性试验，设置无细菌感染组为阴性对照，确定该方法最低检测限度。
结果显示，当胞内劳森菌的包被浓度为103个/mL时，光学显微镜下可检测到胞质呈红棕色，当胞内劳森菌的包被浓度为102个/mL时，光学显微镜下已检测不到胞质中的红棕色，表明该实验建立的IPMA检测方法的最低检测限度为103个/mL(见图5)。
实施例10：IPMA检测方法的重复性试验
取不同批次和相同批次制备的IPMA 96孔抗体检测反应板进行3次IPMA试验，评价该方法的稳定性。
结果显示，胞内劳森菌IPMA抗原检测方法变异系数＜2％，表明该方法重复性较好，稳定性高。
实施例11：IPMA对临床样品的检测
为了验证该方法对临床样品的检测效果，分别从江苏周边3个不同地区屠宰场共采集146份猪回肠组织样品，分别采用实施例6优化后的的IPMA方法和普通PCR对临床样品进行检测，同时比较两种方法的阳性符合率。
肠组织匀浆液的制备方法如下：
从-70℃冰箱取出事先采集的猪回肠样品，待融化后用无菌剪刀剖开肠，刮取肠粘液至15mL离心管中，并向其中加入一定体积的胰蛋白酶溶液，37℃进行消化；随后，向上述肠粘液中加入SPG溶液，置组织匀浆器中匀浆，匀浆后将肠黏液分别用滤纸和1.2μm、0.65μm孔径滤膜进行过滤，收集滤液，并向其中加入终浓度为10％的DMSO，1mL每管分装于1.5mLEP管中，-70℃冰箱保存。
结果显示，用优化后的IPMA检测方法猪回肠组织样品进行检测，146份病料中共检测出92份阳性样品，3个不同地区屠宰场的阳性样品检出率分别为62.3％，56.8％和46.3％，总体阳性率为63.0％。普通PCR方法检测出共87份阳性样品，两种方法的阳性符合率为94.6％，阴性符合率为91.5％。(见表1)。
表1
结论：
综上所述，通过对IPMA反应条件的优化，最终确定一抗最佳稀释度为1：1600，37℃作用45min，二抗最佳稀释度为1：2000，37℃作用60min时，检测效果为最佳。该方法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于实验室胞内劳森菌分离鉴定和临床样品检测。
上述实施例仅本发明的部分实施例，但并不作为对本发明的限制，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载为准。
序列表
<110> 南京农业大学
南京昌吉生物科技有限公司
<120> 一种猪源胞内劳森菌IPMA抗原检测方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccatgg aataaaacag agtatagg 28
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgagctag tttggtataa caccac 26

Claims (16)

1.一种非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获取兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗兔IgG作为二抗；其中，以NCBI genbank:AB218757.1的115-543位点的氨基酸表达蛋白作为免疫原免疫大白兔获得一抗；
（2）制备待测胞内劳森菌抗原样品；
（3）制备IPMA检测反应板：将胞内劳森菌的宿主细胞接种于细胞培养板内，采用含有体积比为10%FBS的DMEM细胞培养液培养形成单层细胞，弃去培养液，取出细胞培养板；向细胞培养板中加入步骤（2）制备的待测胞内劳森菌抗原样品，设置不含胞内劳森菌抗原样品的阴性对照，阴性对照孔加入与待测胞内劳森菌抗原样品等量的DMEM培养液；细胞培养板培养，培养完成后，将细胞培养板固定、清洗，得到IPMA检测反应板，备用；
所述细胞培养板培养操作为：将细胞培养板室温2000g离心10min，置于8％O2、8 .8％CO2和83 .2％N2的三气培养箱中培养3h后，更换为含万古霉素、新霉素和两性霉素B的含有体积比为10%FBS的DMEM细胞培养液，置于三气培养箱中培养，培养5天后取出细胞培养板，PBS清洗；
所述胞内劳森菌的寄主细胞为McCoy细胞；
（4）胞内劳森菌的IPMA检测：取步骤（3）制备的IPMA检测反应板，加入体积百分比为0.5%的Triton-100溶液，室温透化，PBS清洗；
将步骤（1）获取的一抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；
将步骤（1）获取的二抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；
每孔加入AEC底物，室温显色，甩去AEC底物，PBS清洗，加入苏木素染色液，PBS清洗；
待IPMA检测反应板彻底干燥后用光学显微镜观察结果，当待测胞内劳森菌抗原样品为阳性，则胞核呈蓝色，胞浆呈棕红色；当待测胞内劳森菌抗原样品为阴性，则胞核呈蓝色，胞浆不着色 。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（1）所述一抗通过以下方法制备获得：
（1-1）以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，设计特异性引物对进行扩增；
（1-2）以pGex-6p-1为载体，连接步骤（1）扩增产物，构建pGex-6p-1-sodc重组质粒，转化BL21，得到重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21；
（1-3）将步骤（1-2）得到的重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，表达胞内劳森菌SodC蛋白，离心收集上清，使用GST亲和层析柱对SodC蛋白进行纯化；
将纯化后的胞内劳森菌SodC蛋白与油佐剂按照体积比为1:1比例进行混合，乳化后制备成免疫原，将免疫原注射大白兔，三免后测定血清效价。
3.根据权利要求2所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（1-1），所述特异性引物对序列如下：
SEQ ID NO.1所示SF：5’-GGATCCATGGAATAAAACAGAGTATAGG -3’；
SEQ ID NO.2所示SR：5’-CTCGAGCTAGTTTGGTATAACACCAC -3’。
4.根据权利要求2所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（1-2），所述测定血清效价的方法为：SodC蛋白包被浓度为5-20ug/ml，将待检测效价血清稀释到1：100×230， TMB显色后测定OD450nm处的吸光值，以待检测效价血清孔的OD450nm值/阴性血清孔OD450nm值≧2.1判为阳性。
5.根据权利要求2所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（1），步骤（1-3）中所述胞内劳森菌SodC蛋白表达条件为：将重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180 rpm震荡培养至OD600nm值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG，于16℃、90 r/min诱导18-24h，6000 -10000rpm、4℃离心10-15min收集菌体，用PBS洗涤菌体3-5次，最后用PBS重悬沉淀，于-80℃反复冻融，每次冻融时间≥1h，进行超声破碎裂解，4℃、10000-12000 rpm离心20-30min；收集上清。
6.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（2）所述待测胞内劳森菌抗原样品为细菌培养物或猪回肠组织匀浆液。
7.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（3）中接种的胞内劳森菌寄主细胞密度为1×104个/mL-1×105个/mL；
所述胞内劳森菌的寄主细胞培养形成单层细胞的培养条件为：37℃、5%CO2培养箱培养24h；所述含有体积比为10%FBS的DMEM细胞培养液中万古霉素浓度为100ug/mL、新霉素浓度为50ug/mL、两性霉素B浓度为2ug/mL；
所述反应板固定采用预冷的体积比为4%多聚甲醛固定液，室温条件下固定10~20min；
所述胞内劳森菌寄主细胞、步骤（2）制备的待测胞内劳森菌抗原样品、 体积百分比为4%预冷的多聚甲醛固定液的加入量均为100uL/孔。
8.根据权利要求7所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，固定时间为15min。
9.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述体积比为0.5%的Triton-100、稀释后的一抗、稀释后的二抗、AEC底物的加入量均为100uL/孔。
10.根据权利要求2至6任意一项权利要求所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述一抗稀释方法为：采用PBST进行稀释，一抗与PBST的体积比为1:100-1:3200；
稀释后的一抗孵育时间为30min-120min；
所述二抗的稀释方法为：采用PBST进行稀释，二抗与PBST的体积比为1:1000-1:5000；
稀释后的二抗孵育时间为30min-120min。
11.根据权利要求10所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，一抗与PBST的体积比为1：1600。
12.根据权利要求10所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，一抗孵育时间为45min；一抗孵育温度为37℃。
13.根据权利要求10所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，二抗与PBST的体积比为1：2000。
14.根据权利要求10所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，二抗孵育时间为1h，二抗孵育温度为37℃。
15.根据权利要求6所述的非疾病诊断和治疗用途的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，所述猪回肠组织匀浆液通过以下方法制备获得：采集的猪回肠样品，用剖开肠，刮取肠粘液至离心管中，并向离心管中加入胰蛋白酶溶液，37℃消化；向上述肠粘液中加入SPG溶液，匀浆，匀浆后的肠粘液分别用滤纸和1.2μm、0.65μm孔径滤膜进行过滤，收集滤液，向滤液中加入终浓度为体积比为10%的DMSO，制得猪回肠组织匀浆液。
16.权利要求1至15中任意一项权利要求所述的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法在实验室胞内劳森菌分离鉴定中的应用，其特征在于，所述待测胞内劳森菌抗原样品为细菌培养物。
CN202010699735.3A 2020-07-17 2020-07-17 一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用 Active CN111830257B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010699735.3A CN111830257B (zh) 2020-07-17 2020-07-17 一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010699735.3A CN111830257B (zh) 2020-07-17 2020-07-17 一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111830257A CN111830257A (zh) 2020-10-27
CN111830257B true CN111830257B (zh) 2023-10-24

Family

ID=72924569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010699735.3A Active CN111830257B (zh) 2020-07-17 2020-07-17 一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111830257B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112611865A (zh) * 2020-12-07 2021-04-06 新乡学院 一种pcv2的ipma中和抗体检测方法
CN112595846A (zh) * 2020-12-07 2021-04-02 新乡学院 一种pcv2的ipma抗体检测方法
CN113376375A (zh) * 2021-06-07 2021-09-10 南京农业大学 一种胞内劳森菌的ipma抗体检测方法
CN113292651B (zh) * 2021-07-01 2022-04-22 南京农业大学 一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000069903A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED SodC POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
CN104619720A (zh) * 2012-08-29 2015-05-13 英特维特国际股份有限公司 标记疫苗
CN110967480A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 洛阳普泰生物技术有限公司 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000069903A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED SodC POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
CN104619720A (zh) * 2012-08-29 2015-05-13 英特维特国际股份有限公司 标记疫苗
CN110967480A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 洛阳普泰生物技术有限公司 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李磊.胞内劳森菌IPMA抗体检测方法的建立及猪源性胞内劳森菌在小鼠体内的复制.《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》.2016, *
猪传染性胃肠炎病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验原位检测方法的建立;朱蕴暖 等;《中国预防兽医学报》;第237-239页 *
胞内劳森菌IPMA抗体检测方法的建立及猪源性胞内劳森菌在小鼠体内的复制;李磊;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20160615;说明书第5-59页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111830257A (zh) 2020-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111830257B (zh) 一种猪源胞内劳森菌ipma抗原检测方法及其应用
CN107022548A (zh) 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN111848786A (zh) 一种单克隆抗体、其制备方法及用途
CN112724208A (zh) 一种SADS-CoV重组S蛋白胞外段及其制备方法与应用
CN114716540A (zh) 一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用
CN108148814B (zh) 一种用于检测牛轮状病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其应用
CN107312088B (zh) 猪流行性腹泻病毒特异性SIgA ELISA检测试剂盒及其应用
WO2023109535A1 (zh) 抗马立克氏病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒应用
CN112362880A (zh) 一种prrsv的ifa中和抗体检测方法
CN113801854B (zh) 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN111073859B (zh) 一种检测牛细小病毒的双抗体夹心elisa试剂盒及其应用
CN110607282B (zh) 牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用
CN110484511B (zh) 杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用
CN109374886A (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用
CN113817054A (zh) 一种特异性结合猪轮状病毒vp6蛋白的鼠单克隆抗体5b11及其应用
CN112379105A (zh) 一种prrsv的ipma中和抗体检测方法
CN112011517A (zh) 大熊猫lbp单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN113063942B (zh) 一种检测摩氏摩根菌抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN113980126B (zh) 一种多杀性巴氏杆菌毒素单克隆抗体及其阻断elisa试剂盒
CN114874295B (zh) 用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆B细胞的ELISpot试剂盒及其应用
CN113176406B (zh) 一种PCV4 cap单克隆抗体及其双单抗夹心ELISA检测试剂
CN113376375A (zh) 一种胞内劳森菌的ipma抗体检测方法
CN110542755A (zh) 一种利用免疫标记法检测塞尼卡谷病毒的试剂盒及其检测方法
Priya et al. Standardization and application of immunofluorescence and immunoperoxidase tests for detection of bluetongue virus antigen
CN113292651B (zh) 一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Fan Hongjie

Inventor after: Lin Huixing

Inventor after: Li Minxue

Inventor after: Xiao Ning

Inventor after: Li Jiannan

Inventor before: Fan Hongjie

Inventor before: Li Minxue

Inventor before: Xiao Ning

Inventor before: Li Jiannan

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant