CN113376375A - 一种胞内劳森菌的ipma抗体检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，包括以下步骤：(1)利用McCoy细胞进行胞内劳森菌的培养；(2)制备IPMA反应板：将步骤(1)培养的胞内劳森菌加入到含McCoy细胞的细胞板中培养，连续培养4‑5d，之后依次进行固定、通透和封闭；(3)在步骤(2)所得的IPMA反应板中加入待测血清，同时分别加入阳性对照血清和阴性对照血清，孵育；加入过氧化物酶标记的二抗，孵育；加入显色液，反应，干燥；(4)显微镜下观察，当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阳性时，则被胞内劳森菌感染的阳性细胞胞质将被染为棕红色；而当待测猪血清样品为胞内劳森菌抗体阴性时，则被胞内劳森菌感染的McCoy细胞胞质不着色。该法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点。

Description

一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法

技术领域

本发明属于胞内劳森菌抗体检测技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法。

背景技术

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy,PPE)，俗称猪回肠炎，是由胞内劳森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)感染引起的以回肠、盲肠、结肠粘膜增厚为主要特征的一种重要猪肠道性疾病。被感染的上皮细胞一般不能发育为成熟的肠上皮细胞，随着时间推移，成熟的肠上皮细胞在衰老后被感染的不成熟的细胞取代，导致受感染动物不具备正常的吸收功能，造成病猪生长发育变缓，饲料转化率下降，养殖成本增加，使养殖户遭受严重的经济损失。据报道，在美国，每年因PPE造成的经济损失高达2000万美元，英国每年的损失约为400万英镑。此外，丹麦、瑞典、越南、菲律宾和日本的养猪场PPE阳性率分别为94％、48％、77％、86％和94％。在韩国、泰国和马来西亚等国家更为严重，患病率高达100％，上述结果表明，PPE在世界各地猪场中普遍存在，已成为现代养猪业中一种重要的肠道疾病，且严重影响养猪业的健康发展。

胞内劳森菌无法在无细胞培养条件下生长，适合其生长的细胞系有Hep-2、IPEC-J2、IEC-18和McCoy等。此外，胞内劳森菌的生长环境极其苛刻，需要在微需氧环境(83.2％N₂，8.8％CO₂和8.0％O₂)中生长。导致全球只有少数实验室具备成功分离、培养胞内劳森菌的能力。因此，胞内劳森菌的分离、培养和鉴定具有一定的困难性。此外，胞内劳森菌的分离、培养和鉴定需要昂贵仪器和专业人员，且缺乏统一的分离、培养和鉴定体系标准，故对胞内劳森菌的研究并不深入。

然而，鉴于PPE严重危害养猪业的健康发展，为攻克这一项重大难题，准确掌握中国PPE流行情况，深入了解PPE在中国的感染率及感染时间点显得十分必要。国内目前对胞内劳森菌的检测主要是以活体诊断方法为主，但该方法目前还不够完善；此外，众多学者分别采用间接ELISA和PCR检测方法对猪血清和猪粪便中的LI抗体及LI抗原进行检测。但间接ELISA法特异性差，检测结果容易产生假阳性；PCR检测方法由于检测限低，加之粪便中存下PCR抑制因子，使得检测结果容易出现假阴性。尽管国外已有商品化的检测猪血清中LI抗体的ELISA试剂盒，至今并未在中国猪场得到广泛应用。免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)已被广泛应用于胞内劳森菌的血清学检测，该方法不需要昂贵试验仪器，成本低，且操作简便，特异性强，灵敏度高，适用于群体化筛查，在国外已被广泛使用。国内，李磊等人使用猪PPE弱毒疫苗中的LI为检测原，成功建立了检测猪血清中LI抗体的IPMA检测方法，该方法可用于评估商品化PPE疫苗的免疫效果。但该研究也存在一定的局限性。例如，与造成猪群感染发病的LI野毒株相比，商品化PPE疫苗中的菌株已经过人工致弱，在一定程度上其与猪群自然感染的野毒株存在差异，因此，以弱毒疫苗为检测源，往往无法反应猪群感染的最真实状态，更无法区分猪血清中的抗体是来自野毒感染，还是疫苗免疫的结果。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，为胞内劳森菌血清流行病学调查及胞内劳森菌疫苗免疫效果评价奠定基础。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，包括以下步骤：

(1)利用McCoy细胞进行胞内劳森菌的培养；

(2)制备IPMA反应板：将步骤(1)培养的胞内劳森菌加入到含McCoy细胞的细胞板中培养，连续培养4-5d，之后依次进行固定、通透和封闭；

(3)在步骤(2)所得的IPMA反应板中加入待测血清，同时分别加入阳性对照血清和阴性对照血清，孵育；加入过氧化物酶标记的二抗，孵育；加入显色液，反应，干燥；

(4)显微镜下观察，当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阳性时，则被胞内劳森菌感染的阳性细胞胞质将被染为棕红色；而当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阴性时，则被胞内劳森菌感染的McCoy细胞胞质不着色。

优选的，步骤(1)中，所述胞内劳森菌选自胞内劳森菌LJS19051，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉，保藏日期为2020年7月21，保藏编号为CCTCC NO：V202046。

优选的，步骤(1)中，胞内劳森菌先用接种培养液稀释后加至McCoy细胞中培养，之后更换为培养用培养液，进行培养。

优选的，步骤(2)中，将步骤(1)培养的胞内劳森菌先用接种培养液稀释后加入到含McCoy细胞的细胞板中培养，之后更换为培养用培养液，连续培养4-5d。

进一步优选的，上述接种培养液，以培养液总体积计，由以下组分组成：

％代表体积百分比。

进一步优选的，上述培养用培养液，以培养液总体积计，由以下组分组成：

％代表体积百分比。

优选的，步骤(2)中，所述的McCoy细胞的密度为30％～35％，在35-39℃，4-6％CO₂培养箱中培养不应超过24h；所述连续培养4-5d，是将培养物置于35-39℃，7-9％O₂、8-10％CO₂和78-88％N₂的微需氧环境下培养。

优选的，步骤(2)中，采用多聚甲醛进行室温固定；采用Triton X-100进行室温通透；采用含4-6％BAS的PBST溶液进行封闭。

优选的，步骤(3)中，所述性对照血清和阴性对照血清，分别选自猪源胞内劳森菌标准阳性血清和标准阴性血清；所述过氧化物酶标记的二抗选自HRP标记的羊抗猪酶标二抗；所述显色液选自AEC显色液，所述反应为避光反应15-25min。

优选的，步骤(3)中，所述二抗的稀释倍数为1:(500-1500)，优选为1:1000；所述二抗的孵育时间为50-70min，优选为60min；所述显色液显色时间为15-25min，优选为20min。

优选的，步骤(1)之前还包括McCoy细胞传代培养，具体为：

无菌条件下，将复苏的McCoy细胞转入细胞培养瓶中，加入含有10％FBS的HDMEM培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞长满单层后，用0.25％胰酶消化，细胞有少量脱落时终止消化，弃消化液，加入含有10％FBS的HDMEM细胞培养液，反复吹打数次至分散成单个细胞，吸取适量细胞液至另一细胞瓶中进行传代培养，待细胞适应培养环境后使用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)现有研究中所用的胞内劳森菌为德国勃林格猪回肠炎弱毒疫苗中的菌株，该菌株已经过传代致弱，与自然感染的菌株基因组上有所差异，该法可用于评价商品化回肠炎疫苗的免疫效果；而本发明中使用的胞内劳森菌菌株为本实验室前期从患出血性肠炎的病猪肠道中分离、鉴定与保存，该检测方法的应用将更能够反映国内猪场猪回肠炎感染情况。

2)本发明培养胞内劳森菌的细胞系为McCoy，其可以在显微镜下观察到细胞形态，IPMA检测阳性的细胞胞质被染为红棕色，这与胞内劳森菌存在肠上皮细胞胞浆中的特性相符。

3)本发明培养胞内劳森菌时仅仅培养了4-5d，此时被感染的细胞多为单层，而培养时间过长(如现有技术中的7d)的细胞出现抱团现象，不利于后续结果的观察，如图7所示。因此，将大大降低检测成本，同时提高检测效率。

4)现有技术中的检测方法中无封闭这一过程，无法保证检测结果的特异性，封闭的目的是排除细胞板中的抗原与一抗发生非特异性结合，因为IPMA反应板经固定、通透后，将暴露细菌蛋白的结合位点，若不对IPMA反应板进行封闭，直接孵育一抗，则抗体将会与细菌蛋白中多余的位点进行结合，结果正如图8a所示；为进一步提高本发明中IPMA检测方法测的特异性，IPMA反应板经通透后，本发明用5％BSA封闭反应板上多余的抗原结合位点，从而保证抗体只与反应板中特异性的全菌蛋白发生特异性结合，最终提高检测结果的特异性和准确性(图8b)，实现抗体对细菌总蛋白的特异性识别。此外，现有技术也未将其建立的检测方法结果与商品化猪胞内劳森菌抗体检测试剂盒的检测结果进行比较，因此，无法证明其建立的检测方法准确性。而在本发明中，我们分别使用本研究建立的IPMA抗体检测方法和商品化猪胞内劳森菌抗体检测试剂盒对461份猪血清样品进行检测，发现本发明建立的IPMA抗体检测方法与商品化ELISA检测试剂盒符合率为96.0％，说明IPMA抗体检测方法的检测结果可信。

5)本发明建立的IPMA检测方法特异性强、灵敏度高，重复性好，使用光学显微镜或肉眼即可观察结果，表明建立的IPMA检测方法简单直观有效，可以直接用于临床上猪血清样本中胞内劳森菌抗体的大量检测。

6)本发明所提出的一种猪胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，制备的IPMA反应板可在-20℃长期保存，成本低，操作简便。

附图说明

图1为IPMA抗体检测方法中胞内劳森菌最佳接种浓度的确定，其中：图A-F分别指LJS19051 1:10，1:20,1:40，1:80，1:160和1:320倍稀释后IPMA检测结果

图2为IPMA抗体检测方法中二抗最佳稀释倍数的确定，其中：图A～E分别指二抗1:500，1:1000，1:2000，1:3000和1:4000倍稀释后IPMA检测结果；

图3为IPMA抗体检测方法中二抗最佳反应时间的确定，其中：图A～D指二抗分别孵育30min，60min，90min和120min后IPMA检测结果；

图4为IPMA抗体检测方法中AEC最佳显色时间的确定，其中：图A～E分别指AEC显色液分别于37℃反应5min，10min，15min，20min和30min后IPMA检测结果；

图5为IPMA抗体检测方法中特异性检测结果，其中：图A～E分别指待测样品分别为胞内劳森菌，大肠杆菌，沙门氏菌，猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗体阳性，经IPMA检测后结果；图F为胞内劳森菌阴性血清；

图6为IPMA抗体检测方法中灵敏性检测结果，其中：图A～E分别指胞内劳森菌标准阳性血清1:50，1:100，1:200，1:400和1:800倍稀释后IPMA检测结果；

图7为胞内劳森菌培养不同时间后IPMA检测结果，其中，a：培养5d；b：培养7d。

图8为封闭前后IPMA检测结果，其中，a：未封闭的IPMA检测结果；b：5％BSA封闭后的IPMA检测结果。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

本发明所用的材料来源：

HDMEM培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。

小鼠成纤维上皮细胞(murine fibroblast-like，McCoy)购自于ATCC；

猪胞内劳森菌菌株LJS19051由本实验室分离、鉴定与保存，菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉武汉大学，保藏日期为2020年7月21，保藏编号为CCTCC NO：V202046。

HRP标记的羊抗猪抗体为北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品；

AEC显色试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。

两性霉素B、新霉素、万古霉素购于上海翊圣生物科技有限公司；

猪胞内劳森菌标准阳性血清，猪胞内劳森菌阴性血清和商品化猪胞内劳森菌抗体ELISA检测试剂盒(L.Intracellularis/Ileitis-Ab)购自SVANOVIR公司；

其他未列出的试剂都是能通过正规商业渠道购买；

实施例1

(1)McCoy细胞传代培养

无菌条件下，将复苏的McCoy细胞转入细胞培养瓶中，加入含有10％FBS的HDMEM培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞长满单层后，用0.25％胰酶消化，细胞有少量脱落时终止消化，弃消化液，加入含有10％FBS的HDMEM细胞培养液，反复吹打数次至分散成单个细胞，吸取适量细胞液至另一细胞瓶中进行传代培养，待细胞适应培养环境后使用。

(2)胞内劳森菌的培养

将1×10⁵个/mL McCoy细胞培养至融合度为30％左右时，弃培养液，加入经LI接种培养液10倍稀释后的实施例1制备的胞内劳森菌分离物，置于37℃，8％O₂、8.8％CO₂和83.2％N₂的三气培养箱中培养，3h后更换为LI培养用培养液，连续培养7d，期间每2～3d更换一次培养液；待胞内劳森菌在McCoy细胞中培养7d后，弃旧培养液，加0.1％KCI，37℃，作用10min；弃0.1％的KCI，加入4mL含10％FBS的DMEM培养液，细胞铲刮下细胞，巴氏吸管吹打混匀后将细胞悬液转移至一50mL离心管中，20号无菌注射器针头反复吹打细胞悬液10次左右，以充分裂解细胞，100×g，室温离心5min，重复3次，并取部分上清加至新鲜的细胞密度约30％的McCoy细胞单层上，随后置于三气培养箱中继续进行下一代次培养；向剩余上清中加入终浓度为10％的DMSO，充分混匀后1mL/管分装于冻存管中，-80℃冰箱保存。

(3)IPMA反应板的制备

将收获的胞内劳森菌LJS19051与胞内劳森菌接种培养液按1:10稀释后加至含McCoy细胞的96孔板中培养，3h后更换为胞内劳森菌培养用培养液，连续培养5d，期间每2～3d更换一次培养液，5d后细胞板从三气培养箱中取出，用无菌PBS洗3次，5min/次；随后用4％多聚甲醛室温固定15min，无菌PBS洗3次，5min/次，拍干；每孔分别加入100μL 0.3％Triton X-100室温通透10min，无菌PBS洗3次，5min/次，拍干；每孔加入200μL含5％BSA的PBST溶液，37℃封闭2h；无菌PBS洗3次，5min/次，拍干，-20℃保存，备用；

(4)IPMA基本操作步骤

IPMA反应板于室温预热，每孔加入100μL待检血清，以1：100稀释的猪源胞内劳森菌标准阳性血清和标准阴性血清分别作为阳性对照和阴性对照，37℃孵育1h；PBST洗5次，5min/次，每孔加入100μL1:2500稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗，37℃孵育1h，PBST洗5次，5min/次，拍干，每孔加入100μL AEC显色液，37℃避光反应15min，用无菌超纯水洗2次，拍干，将反应板置于37℃培养箱中吹干，肉眼或用倒置显微镜观察结果。当待测猪血清样品为胞内劳森菌抗体阳性时，则被胞内劳森菌感染的阳性细胞胞质将被染为棕红色；当待测猪血清样品为胞内劳森菌抗体阴性时，则被胞内劳森菌感染的McCoy细胞胞质不着色。

实施例2 IPMA最佳反应条件的确定

1、胞内劳森菌最佳接种浓度及HRP标记的羊抗猪酶标二抗工作浓度的确定

将接种了McCoy细胞的96孔细胞培养板从培养箱中取出，弃细胞培养液，用胞内劳森菌接种培养液分别对胞内劳森菌原液(1×10⁶个/mL)进行倍比稀释，稀释比例分别为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160和1:320，100μL/孔加至长有细胞单层的96孔板中，其中96孔细胞培养板的第1行每孔依次加入100μL胞内劳森菌接种用培养液，第2行每孔依次加入100μL未稀释的LJS19051原液，第3～8行每孔依次加入100μL不同稀释比例的LJS19051稀释液，按实施例3的方法制备IPMA反应板，每孔加入100μL 1:100倍稀释的猪源胞内劳森菌标准阳性血清，37℃孵育1h；PBST洗5次，5min/次，拍干；依次在96孔细胞培养板的第1～2列的各孔加入100μL PBST溶液；在第3～4列的各孔加入100μL 1:500倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗；在第5～6列的各孔加入100μL 1:1000倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗；在第7～8列的各孔加入100μL 1:2000倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗；在第9～10列的各孔加入100μL 1:3000倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗；第11～12列的各孔加入100μL 1:4000倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗，37℃孵育1h，PBST洗5次，5min/次，拍干；每孔加入100μL AEC显色液，37℃避光反应15min，用无菌超纯水洗2次，拍干，将反应板置于37℃培养箱中吹干，倒置显微镜下拍照、观察结果。将显色效果最好的一组胞内劳森菌接种浓度和二抗稀释倍数作为IPMA反应的最佳胞内劳森菌接种浓度及二抗最佳稀释倍数。结果如图1所示，当LJS19051稀释倍数为1:10，1:20和1:40时，阳性感染细胞均具有较好的显色效果(图1A～C)，因此，本研究中我们选择1:40倍稀释为胞内劳森菌最佳接种浓度；而随着稀释倍数的增加，胞质中可检测到的阳性感染细胞数越来越少(图1D～F)；此外，当二抗稀释倍数为1:500和1:1000时，胞质中阳性感染细胞数显色效果无显著差异(图2A～B)，因此，确定二抗最佳稀释倍数为1:1000；此外，随着二抗稀释倍数的增加，胞质中可检测到的阳性感染细胞数越来越少(图2C～E)。

2、最佳孵育时间的确定

以最佳胞内劳森菌稀释浓度制备IPMA反应板，按照IPMA操作程序操作，HRP标记的羊抗猪酶标二抗分别于37℃孵育30min，60min，90min和120min，最终根据显色结果，确定二抗最佳反应时间。结果显示，当二抗孵育时间为30min，McCoy细胞胞质中阳性感染细胞数较少(图3A)，而当二抗孵育时间延长至60min，90min和120min时，胞质中阳性感染细胞数越来越多，此时胞质呈棕红色，且显色效果无显著差异(图3B～D)，因此，确定二抗最佳孵育时间为60min。

3、AEC最佳显色时间的确定

以胞内劳森菌最佳接种浓度制备IPMA反应板，100μL/孔分别加入1:100倍稀释的标准阴阳性血清，37℃作用1h，PBST洗5次，5min/次，每孔依次加入100μL 1:1000稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗，37℃孵育1h，PBST洗5次，5min/次，每孔加入100μL AEC显色液，37℃避光依次反应5min，10min，15min，20min和30min。根据显色结果，确定AEC最佳显色时间。结果如图4所示，当AEC显色时间为5min，10min和15min时，被胞内劳森菌感染的细胞数量较少(图4A～C)；当AEC显色液于37℃反应20min和30min时，被胞内劳森菌感染的细胞胞质显色效果最好(图4D～E)，因此确定AEC显色液最佳显色时间为20min。

实施例3 IPMA的特异性、敏感性、重复性试验

用由本实验室鉴定并保存的猪大肠杆菌、猪沙门氏菌、PEDV、TEGV阳性血清，分别进行IPMA试验，以检测该方法的特异性。结果显示，除接种胞内劳森菌的McCoy细胞胞质呈红棕色外，接种大肠杆菌，沙门氏菌，PEDV，TGEV的细胞胞质均不显色，表明该实验建立的IPMA检测方法具有良好的特异性(见图5)。将胞内劳森菌标准阳性血清按照1:50，1:100，1:200，1:400和1:800倍稀释后进行IPMA试验，确定该方法的灵敏性。结果显示，当胞内劳森菌标准阳性血清经1：50，1:100；1:200和1:400倍稀释后，光学显微镜下仍可检测到被LI感染的McCoy细胞胞质呈红棕色；而当胞内劳森菌标准阳性血清经1:800倍稀释后，光学显微镜下几乎检测不到被LI感染的细胞，上述结果表明该实验建立的猪源胞内劳森菌IPMA抗体检测方法的灵敏度达1:400(见图6)；取不同批次和相同批次制备的IPMA抗体检测反应板进行3次IPMA试验，评价该方法的稳定性。结果显示，胞内劳森菌IPMA抗体检测方法变异系数＜2％，表明该方法具有较好的重复性，稳定性高。

实施例4 IPMA抗体检测方法符合率测定

分别使用本发明建立的IPMA抗体检测方法以及商品化猪胞内劳森菌抗体ELISA检测试剂盒对来自中国主要养猪省份的461份血清样品进行检测，结果如表1所示，461份猪血清样品中，IPMA检测出268份阳性，193份阴性，阳性检出率为58.1％；而使用商品化ELISA检测试剂盒共检测出279份阳性，182份阴性，阳性检出率为60.5％，本发明建立的IPMA抗体检测方法与商品化ELISA检测试剂盒符合率为96.0％，说明IPMA方法检测结果可信，可用于临床猪血清样本中胞内劳森菌抗体的检测。

表1 IPMA抗体检测方法与商品化ELISA试剂盒检测方法检测结果的对比

两种方法的阳性符合率为96.0％

上述的实施例中PBS缓冲液通过以下步骤得到：

取十二水合磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、氯化钠8g；将以上成分混合后，溶于1000mL超纯水中，并用0.1M的HCI调pH至7.4-7.6，经0.22μm的滤膜进行过滤所得，4℃保存备用。

上述的实施例中PBST溶液通过以下步骤得到：

取十二水合磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、氯化钠8g；将以上成分混合后，溶于1000mL超纯水中，并用0.1M的HCI调pH至7.4-7.6，加入500μL Tween-20，混匀后所得，4℃保存备用。

上述的实施例中McCoy细胞完全培养液通过以下步骤得到：

HDMEM培养液 90V/V％

胎牛血清 10V/V％

上述的实施例中LI接种用培养液通过以下步骤得到：

HDMEM培养液 92V/V％

胎牛血清7 V/V％

两性霉素B 20μg/mL

L-谷氨酰胺 1V/V％

上述的实施例中LI培养用培养液通过以下步骤得到：

HDMEM培养液 92V/V％

胎牛血清 7V/V％

两性霉素B 20μg/mL

L-谷氨酰胺 1V/V％

新霉素 50μg/L

万古霉素 100μg/mL

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (10)

1.一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用McCoy细胞进行胞内劳森菌的培养；

(2)制备IPMA反应板：将步骤(1)培养的胞内劳森菌加入到含McCoy细胞的细胞板中进行培养，连续培养4-5d，之后依次进行固定、通透和封闭；

(3)在步骤(2)所得的IPMA反应板中加入待测血清，同时分别加入阳性对照血清和阴性对照血清，孵育；加入过氧化物酶标记的二抗，孵育；加入显色液，反应，干燥；

(4)显微镜下观察，当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阳性时，则被胞内劳森菌感染的阳性细胞胞质将被染为棕红色；而当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阴性时，则被胞内劳森菌感染的McCoy细胞胞质不着色。

2.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胞内劳森菌选自胞内劳森菌LJS19051，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉，保藏日期为2020年7月21，保藏编号为CCTCC NO：V202046。

3.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，胞内劳森菌先用接种培养液稀释后加至McCoy细胞中培养，之后更换为培养用培养液，进行培养。

4.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)培养的胞内劳森菌先用接种培养液稀释后加入到含McCoy细胞的细胞板中培养，之后更换为培养用培养液，连续培养4-5d。

5.根据权利要求3或4所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，所述接种培养液，以培养液总体积计，由以下组分组成：

％代表体积百分比。

6.根据权利要求3或4所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，所述培养用培养液，以培养液总体积计，由以下组分组成：

％代表体积百分比。

7.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的McCoy细胞的密度为30％～35％，在35-39℃，4-6％CO₂培养箱中培养不应超过24h；所述连续培养4-5d，是将培养物置于35-39℃，7-9％O₂、8-10％CO₂和78-88％N₂的微需氧环境下培养。

8.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(2)中，采用多聚甲醛进行室温固定；采用Triton X-100进行室温通透；采用含4-6％BAS的PBST溶液进行封闭。

9.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述阳性对照血清和阴性对照血清，分别选自猪源胞内劳森菌标准阳性血清和标准阴性血清；所述过氧化物酶标记的二抗选自HRP标记的羊抗猪酶标二抗；所述显色液选自AEC显色液，所述反应为避光反应15-25min。

10.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述二抗的稀释倍数为1:(500-1500)，优选为1:1000；所述二抗的孵育时间为50-70min，优选为60min；所述显色液显色时间为15-25min，优选为20min。

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