CN213875706U

CN213875706U - 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN213875706U
Application number: CN202022716844.XU
Authority: CN
Inventors: 陶思锐; 查银河; 舒建洪; 陈勇锋; 童夏霞; 盛敏成
Original assignee: Zhejiang Hailong Biotechnology Co ltd; Zhejiang University Of Science And Technology Shaoxing Biomedical Research Institute Co ltd; Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Hailong Biotechnology Co ltd; Zhejiang University Of Science And Technology Shaoxing Biomedical Research Institute Co ltd; Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2030-11-23

Abstract

本实用新型公开了一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，所述的试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被板存放槽(2)、质控品存放槽(3)、阳性对照液孔槽(4)、阴性对照液孔槽(5)、羊抗猪IgG酶标抗体孔槽(6)、浓缩洗涤液孔槽(7)、样品稀释液孔槽(8)、显色液孔槽(9)、终止液孔槽(10)和操作说明书存放槽(11)；抗原包被板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，各孔槽中(3‑10)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(11)内放置操作说明书。本实用新型的试剂盒引入质控品，从而确保试剂盒的每次检测都是准确和可控的，进一步加强试剂盒的质量控制和准确性控制。此外，本实用新型的试剂盒稳定性好、灵敏度高、特异性强，能够适用于大规模临床检测。

Description

猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus,PCV-2)被认为是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪皮肤与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等疾病的主要病原，统称猪圆环病毒2型相关疾病，而且PCV-2感染引起免疫抑制，极易导致其它病原混合感染或继发感染，是目前严重危害养猪业的病原之一。在我国，目前几乎100％猪场为猪圆环病毒2型阳性。

PCV2是目前已知的最小的病毒之一，其基因组是一条共价闭合的单链DNA，约1.76kb～ 1.77kb。PCV2有11个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，然而仅有三个开放阅读框被认为可以编码蛋白。其中ORF2又称为Cap基因，位于互补链上，呈逆时针方向，负责编码唯一的结构蛋白Cap，其氨基酸长度为233aa～234aa。Cap蛋白也是PCV2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生。因此，Cap蛋白是目前PCV2免疫评价最为理想的靶蛋白。

但是，目前市面流行的用于评价PCV2免疫效果的试剂盒仅有阳对和阴对，不带有质控品，不能确保每一次检测的准确性和重复性，因此对PCV2疫苗免疫后的实际情况的评价可能存在一定的误测。

实用新型内容

为了弥补现有技术的不足，本实用新型的目的是提供一种能够准确评价PCV2-Cap蛋白的抗体的试剂盒，以弥补现有试剂盒技术的不足。

因此，本实用新型一方面提供了一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，所述的试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被板存放槽(2)、质控品存放槽(3)、阳性对照液孔槽(4)、阴性对照液孔槽(5)、羊抗猪IgG酶标抗体孔槽(6)、浓缩洗涤液孔槽(7)、样品稀释液孔槽(8)、显色液孔槽(9)、终止液孔槽(10)和操作说明书存放槽(11)；抗原包被板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，各孔槽中(3-10)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(11)内放置操作说明书。

优选地，本实用新型所述的抗原包被板为包被有PCV2-Cap蛋白的酶标板，所述的抗原包被板上PCV2-Cap蛋白的包被浓度为200ng/孔/100μL，每个试剂盒含有2块或5块抗原包被板。

优选地，本实用新型所述的样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液，每个试剂盒含有80mL/瓶或200mL/瓶。

优选地，本实用新型所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液，在使用前稀释到1×PBST溶液，每个试剂盒含有30mL/瓶或60mL/瓶。

优选地，本实用新型所述的羊抗猪IgG酶标抗体为使用样品稀释液对商品化的羊抗猪IgG 酶标抗体进行20000倍稀释后所得，每个试剂盒含有25mL/瓶或60mL/瓶。

优选地，本实用新型所述的显色液为TMB单组分溶液，每个试剂盒含有25mL/瓶或60 mL/瓶。

优选地，本实用新型所述的终止液为2M H₂SO₄溶液，每个试剂盒含有12mL/瓶或30mL/ 瓶。

优选地，本实用新型所述的阳性对照为PCV2抗体OD450nm值在0.9～1.5之间的阳性血清；所述的阴性对照为PCV2抗体OD450nm值小于0.2的阴性血清；每个试剂盒阳性对照和阴性对照均含有1mL/管或3mL/管。

优选地，本实用新型所述的质控品包括质控品1、质控品2和质控品3，所述的质控品1 为S/P值在1.5～2.0之间的强阳性血清；所述的质控品2为S/P值在0.5～1.0之间的弱阳性血清；所述的质控品3为S/P值小于0.35的阴性血清；每个试剂盒质控品1、质控品2、质控品3均含有1mL/管或3mL/管。

本实用新型的试剂盒引入质控品(质控品1、质控品2、质控3)，对试剂盒的每次检测不仅仅有阴、阳性对照的校正外，还有3个质控品(强阳、弱阳和阴性)的校正，从而确保试剂盒的每次检测都是准确和可控的，进一步加强试剂盒的质量控制和准确性控制。此外，本实用新型的试剂盒稳定性好、灵敏度高、特异性强，能够适用于大规模临床检测。

附图说明

图1试剂盒模式图。

图2质控品存放槽(3)中质控品的具体摆放位置。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的较佳实施例进行详细阐述，以使本实用新型的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本实用新型的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1 PCV2-Cap蛋白的制备

本实用新型所用的PCV2-Cap蛋白来源于专利号为201710602362.1的发明专利，具体制备方法参考该专利的相关实施例。

实施例2猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的制备与使用

1抗原包被板的制备

1.1酶联反应板的来源及标准购自美国Corning公司的COSTAR酶标板，规格为8孔×12 列。

1.2包被将PCV2-Cap蛋白用包被缓冲液(称取0.15g碳酸钠、0.293g碳酸氢钠，溶解后调节pH值到9.6，然后加双蒸水至100mL，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)稀释到2μg/mL，混匀后加入酶标板，100μL/孔，37℃湿盒内(工厂化生产，空气湿度保持65％～70％)孵育1小时后4℃过夜(12～14小时)。取出，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤 3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干。

1.3封闭向酶标板内加入封闭液(称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.5mL吐温-20、终浓度为0.01％(m/V) 的ProClin 300和终浓度为1％(m/V)BSA，溶解后调节pH值到7.2，然后加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)300μL/孔，37℃湿盒中(工厂化生产，空气湿度保持65％～70％)孵育120分钟。取出弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒。

1.4干燥酶标板装架，37℃条件下烘干30分钟。

1.5装袋将酶标板、干燥剂装入铝箔袋，真空后密封。

2阳性对照的制备

2.1制备用动物：3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行PEDV、CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪；

2.2免疫原的制备：取商品化的猪圆环病毒2型灭活疫苗，按时说明书进行稀释；

2.3免疫程序：对3头猪进行颈部肌肉多点注射重组疫苗1mL，14日后进行二免，方法及剂量与首次相同，二免后每隔7天采血，采用IFA法进行血清PCV2抗体检测；

2.4效价测定：采用IFA法测定血清效价，选择PCV2 IFA抗体不低于1:100的猪用于阳性血清制备；

2.5阳性血清制备：对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，每头猪的血液保存在一个灭菌的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管；

2.6阳性对照制备：用样品稀释液将检验合格的阳性血清稀释成1:200、1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400，各稀释度均用制造的试剂盒进行检测，选择OD450nm值≥1.1的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。

2.7阳性对照的检验将2.6制备的阳性血清使用本实用新型制备的试剂盒进行检测，其中OD450nm值应在0.9～1.5之间。但是根据2.6的要求，结合试剂盒的实际检测要求，优先地，阳性对照的OD450nm值在1.1～1.2之间。

3阴性对照的制备

3.1制备用动物：3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行PEDV、CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪。

3.2血清制备与分装：对猪进行颈动脉放血致死，血液置于灭菌洁净的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管。

3.3阴性对照制备：将阴性血清用样品稀释液稀释100倍，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。

3.4阴性对照的检验：将3.3制备的阴性血清使用本实用新型制备的试剂盒进行检测， OD450nm值均小于0.2。但是结合试剂盒的实际检测要求，优先地，阴性对照的OD450nm值均小于0.1。

4样品稀释液的制备称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、 8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.05％的吐温-20(V/V)、终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300 sigma(V/V)和终浓度为2％BSA(m/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm 滤膜过滤除菌，定量分装。

5浓缩洗涤液(25×)的制备称取6.8g磷酸二氢钾、5g氯化钾、89.5g十二水合磷酸氢二钠、198.7g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加1.25％的吐温-20(V/V)和终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300(V/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

6羊抗猪IgG酶标抗体的制备

6.1来源购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

6.2羊抗猪IgG酶标抗体的制备用样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG进行 1:30,000(V/V)稀释，再加入终浓度为0.01g/L的酚红，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

7显色液的制备与检验

7.1来源购自北京索莱宝生物科技有限公司。

7.2显色液的制备单组份TMB显色液或其他通用显色液，定量分装。

8终止液的制备与检验

8.1来源国药集团。

8.2终止液的制备取21.74mL浓硫酸缓缓加到含有178.26mL双蒸水的烧杯中，搅拌混匀后，定量分装。

9质控品的制备与检验

9.1质控品1的制备来源于阳性血清，用样品稀释液将检验合格的阳性血清稀释成1:50、 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400等，各稀释度均用制造的试剂盒(含阳性对照、阴性对照)进行检测，选择S/P值在1.5～2.0之间的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/ 管或3mL/管。

9.2质控品2的制备来源于阳性血清，用样品稀释液将检验合格的阳性血清稀释成1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800等，各稀释度均用制造的试剂盒(含阳性对照、阴性对照)进行检测，选择S/P值在0.5～1.0之间的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。

9.3质控品3的制备来源于阴性血清，将检验合格的阴性血清用样品稀释液稀释1:5、 1:10、1:20、1:40、1:80等，各稀释度均用制造的试剂盒(含阳性对照、阴性对照)进行检测，选择S/P值小于0.35的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。

10试剂盒组装

10.1将检验合格的各试剂盒组份按下表进行组装

10.2试剂盒的包装用合适的外包装盒包装，贴加标签，标签上应包含标识名称、批号、生产日期、有效期和生产单位等信息。

11用法与判定

11.1用法

11.1.1材料的准备

11.1.1.1待检试剂盒包括抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液、羊抗猪IgG酶标抗体、显色液、终止液、质控品1、质控品2、质控品3。

11.1.1.2其他材料酶标仪、移液器、定时钟、待检血清等。

11.1.2试剂的准备

11.1.2.1试剂的准备用前将所有的试剂和样品恢复至室温(15～25℃)，试剂应轻轻地旋转或震荡予以混合。

11.1.2.2洗涤液的配制将1份浓缩洗涤液加入到24份双蒸水中，混匀。配制好的洗涤液，应在3日内用完。

11.1.2.3待检血清的稀释用样品稀释液将待检血清按1:100(V/V)进行稀释。

11.1.3检验

11.1.3.1加样

根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，加入稀释好的待检血清100μL/孔，同时设阳性对照、阴性对照各2孔，质控品1、质控品2、质控品3、空白对照各1孔；包被板上对照样品和待检样品添加位置如下图所示。

(注：“P”为阳性对照，“N”为阴性对照，根据检测样品的数量可以调整加样位置)

11.1.3.2孵育：置37℃温箱孵育30分钟；

11.1.3.3洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；

11.1.3.4二抗孵育：对应孔中分别加入羊抗猪IgG酶标抗体，100μL/孔，置37℃温箱孵育30分钟；

11.1.3.5洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；

11.1.3.6显色：加入显色液，100μL/孔，置37℃温箱避光孵育10分钟；

11.1.3.7终止：加入终止液，50μL/孔，轻微震荡混合均匀；

11.1.3.8读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取 OD450nm值；

11.1.3.9 S/P值计算：按照以下计算公式，计算S/P值：

11.1.3.10试验有效性断判：阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3，空白对照OD450nm读数＜0.1，质控品1的S/P值在1.5～2.0之间，质控品2的S/P值在0.5～1.0之间，质控品3的S/P值＜0.35；

11.1.3.11结果判定：当S/P值大于0.399时判为阳性；当S/P值小于等于0.399时判为阴性。

12注意事项

12.1试剂盒应2～8℃运输及保存。

12.2贮存时，所有的板条一定要用封口膜密封，防止潮气对包被板的损伤。

12.3仔细阅读说明书。

12.4不要使底物溶液接触强光和氧化物。所有试剂取出后，均不得再加回瓶中。

12.5不要使用过期的组分或者不同批次试剂混合使用。

12.6稀释浓缩洗涤液时，如发现结晶，置37℃使其溶解后再使用。

12.7注意加样和洗涤过程，以确保试验的准确度。不能用嘴吸液。

12.8待检血清发生腐败时勿用于检测。

12.9检验用器皿必须清洁，操作过程避免与金属类器物接触。

12.10应严格按照试剂盒说明书进行操作，严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。

13贮藏和有效期2～8℃保存，有效期为12个月。

14规格(1)2块板(192孔/盒)(2)5块板(480孔/盒)。

实施例4猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的性能评价

按照实施例3制备了5批试剂盒，使用这5批试剂盒进行性能评价。

1特异性检验随机挑选3批试剂盒，用7种特异性质控血清样品对试剂盒进行特异性检验，具体结果见下表：

2重复性检验

2.1批内重复性检验采用5批试剂盒对挑选出来的临床样品进行了批内和批间的重复性检测。其中，批内重复性是按照说明书用5批试剂盒分别对3份质控样品进行检测，每份样品重复检测4次，分别计算每份血清的S/P值平均值，标准差和变异系数，测得结果后计算批内变异系数，结果显示，5批试剂盒检测结果批内变异系数均＜10％，符合要求，具体数据见下表。

2.2批间重复性检验从每一批试剂盒中分别随机抽取1盒，按照说明书分别对3份质控样品进行检测，每份样品重复检测4次，分别计算每份血清的S/P值平均值，标准差和变异系数，测得结果后计算批间变异系数。结果显示，各样品的变异系数均＜10％，符合要求，具体数据见下表。

3敏感性检验用1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600共5份不同稀释度的敏感性质控血清(即实施例3中的阳性血清)分别进行检测。结果见下表：

4无菌检验将试剂盒中阳、阴性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液、羊抗猪IgG酶标抗体、质控品1、质控品2、质控品3各组份按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。结果见下表。

5临床样品检测挑选一批本试剂盒对临床采集的血清样本进行PCV2抗体的检测，其结果显示，本试剂盒与某进口试剂盒综合符合率为100％，具体结果见下表。

以上所述仅为本实用新型的实施例，并非因此限制本实用新型的专利范围，凡是利用本实用新型说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本实用新型的专利保护范围内。

Claims

1.一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被板存放槽(2)、质控品存放槽(3)、阳性对照液孔槽(4)、阴性对照液孔槽(5)、羊抗猪IgG酶标抗体孔槽(6)、浓缩洗涤液孔槽(7)、样品稀释液孔槽(8)、显色液孔槽(9)、终止液孔槽(10)和操作说明书存放槽(11)；抗原包被板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，各孔槽中(3-10)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(11)内放置操作说明书。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原包被板为包被有PCV2-Cap蛋白的酶标板，所述的抗原包被板上PCV2-Cap蛋白的包被浓度为200ng/孔/100μL，每个试剂盒含有2块或5块抗原包被板。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液，每个试剂盒含有80mL/瓶或200mL/瓶。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液，在使用前稀释到1×PBST溶液，每个试剂盒含有30mL/瓶或60mL/瓶。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的羊抗猪IgG酶标抗体为使用样品稀释液对商品化的羊抗猪IgG酶标抗体进行30000倍稀释后所得，每个试剂盒含有25mL/瓶或60mL/瓶。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的显色液为TMB单组分溶液，每个试剂盒含有25mL/瓶或60mL/瓶。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2M H₂SO₄溶液，每个试剂盒含有12mL/瓶或30mL/瓶。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为PCV2抗体OD450nm值在0.9～1.5之间的阳性血清；所述的阴性对照为PCV2抗体OD450nm值小于0.2的阴性血清；每个试剂盒阳性对照和阴性对照均含有1mL/管或3mL/管。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品包括质控品1、质控品2和质控品3，所述的质控品1为S/P值在1.5～2.0之间的强阳性血清；所述的质控品2为S/P值在0.5～1.0之间的弱阳性血清；所述的质控品3为S/P值小于0.35的阴性血清；每个试剂盒质控品1、质控品2、质控品3均含有1mL/管或3mL/管。