CN104531662A - 包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：(1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用甘油浸润，然后加入去离子水，搅拌溶解后，加入聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到均一的海藻酸钠溶液；(2)将谷氨酸脱羧酶酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；(3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶匀速速度滴入到CaCl2溶液中搅拌固定；(4)过滤，PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，干燥，得到粒状固定化谷氨酸脱羧酶。本发明在海藻酸钠溶液中加入了甘油、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，有效提高了固定后谷氨酸脱羧酶的酶活力。

Description

包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法
技术领域
本发明涉及酶的固定化，尤其涉及一种用包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法，属于生物工程领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)存在于哺乳动物脑、脊髓中，是一种抑制性神经传递物质，由谷氨酸脱羧酶(谷氨酸脱羧酶)催化谷氨酸得到。GABA具有调节血压与心律、营养神经细胞、促进精神安定、促进脑部供血、促进长期记忆、促进激素分泌、肾功能活化等作用。
γ-氨基丁酸的生产基本采用化学合成、植物富集法和生物合成法。其中化学合成成本高且因使用有毒试剂，存在安全性差，且反应中间产物多，产物纯度难保证。生物合成法下游分离纯化难度高且难获得谷氨酸脱羧酶活性高的微生物菌株。植物富集法含量低，反应液天然成分复杂，同样存在纯化问题。筛选具有相对高活力的谷氨酸脱羧酶的微生物并扩大培养使其过量或高表达谷氨酸脱羧酶，进而催化谷氨酸底物生成γ-氨基丁酸，即酶催化方法逐渐受到研究者的亲睐，用于生产γ-氨基丁酸。
如果用化学或生物的方法将谷氨酸脱羧酶固定化。然后将固定化 谷氨酸脱羧酶作为催化剂，采用填充床反应器可连续制备γ-氨基丁酸。
谷氨酸脱酸酶固定多采用海藻酸钠固定。但是谷氨酸脱酸酶与载体结合不牢固，现有文献报道关于海藻酸钠固定方法酶活回收率最高到65.％，固定后酶活力低，效果不理想。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法，在本发明公布的方法中，在海藻酸钠溶液中加入了甘油、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，显著的提高了固定后谷氨酸脱羧酶的酶活力。
本发明所采用的技术方案如下：
一种包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：
步骤(1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用甘油浸润，然后加入去离子水，搅拌溶解后，加入聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到均一的海藻酸钠溶液；
步骤(2)将谷氨酸脱羧酶酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；
步骤(3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶以低于1mL/min的速度滴入到3-6％CaCl2中，15-25℃条件下搅拌2-4小时；
步骤(4)过滤，用pH为5.6-7.0的PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，15-25℃干燥，得到球状固定化谷氨酸脱羧酶。
优选的，本发明公布的均一的海藻酸钠溶液中，甘油的终浓度为10-20％，聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为1-2％，聚乙二醇的终浓度为0.5-1％，二硫苏糖醇的终浓度为0.1-1mM，海藻酸钠的终浓度为3.5-5％。
优选的，本发明公布的均一的海藻酸钠溶液中，甘油的终浓度为15％，聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为1.5％，聚乙二醇的终浓度为0.75％，二硫苏糖醇的终浓度为0.5mM，海藻酸钠的终浓度为4％。
优选的，本发明公布的方法中，步骤(2)所述的谷氨酸脱羧酶酶的比活大于等于100U/mg。
优选的，本发明公布的方法中，步骤(3)所述的CaCl2的浓度为5％。
优选的，本发明公布的方法中，步骤(3)的最适温度为25℃，步骤(4)的最适温度为20℃。
本发明的有益效果是：1、在海藻酸钠溶液中加入了甘油、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，有效提高了固定后谷氨酸脱羧酶的酶活力；2、采用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶滴入CaCl2溶液，制得的球状固定化谷氨酸脱羧酶颗粒均匀、大小可控；用本发明所述方法制得的固定化谷氨酸脱羧酶装柱，连续制备γ-氨基丁酸10，保留活性为90％。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如 此。
实施例一
海藻酸钠溶液组成：海藻酸钠4％，甘油15％、聚乙二醇辛基苯基醚(100)1.5％、聚乙二醇(8000)0.75％、二硫苏糖醇0.5mM、CaCl2溶液浓度5％。
大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶液比活为150U/mg，蛋白浓度为0.5mg/mL。
固定化谷氨酸脱羧酶制备方法：
(1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用甘油浸润，然后加入去离子水，搅拌溶解后，加入聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到均一的海藻酸钠溶液；(2)将谷氨酸脱羧酶酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；(3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶以低于1mL/min的速度滴入到4％CaCl2中，25℃条件下搅拌3小时；(4)过滤，用pH为5.6-7.0的PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，25℃干燥，得到粒状固定化谷氨酸脱羧酶。
比色法测定固定化谷氨酸脱羧酶活力。1个谷氨酸脱羧酶活力单位(U)定义为：在37℃，pH5.5条件下，每分钟每毫升酶液中催化谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成1μmol的GABA所需酶量。
测得谷氨酸脱羧酶回收率为75％。
实施例二
海藻酸钠溶液组成：海藻酸钠4％，甘油20％、聚乙二醇辛基苯 基醚1.5％、聚乙二醇1％、二硫苏糖醇1mM。
CaCl2溶液浓度6％。
大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶液比活为150U/mg，蛋白浓度为0.5mg/mL。
固定化谷氨酸脱羧酶制备方法同实施例1。
测得谷氨酸脱羧酶回收率为73.5％。
实施例三
海藻酸钠溶液组成：海藻酸钠3％，甘油10％、聚乙二醇辛基苯基醚1.5％、聚乙二醇1％、二硫苏糖醇1mM。
CaCl2溶液浓度2％。
大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶液比活为150U/mg，蛋白浓度为0.5mg/mL。
固定化谷氨酸脱羧酶制备方法同实施例1。
测得谷氨酸脱羧酶回收率为65％。
实施例四
固定化谷氨酸脱羧酶热稳定性
将实施例一所得的固定化谷氨酸脱羧酶60℃孵育2小时，对照为：谷氨酸脱羧酶酶液(比活为150U/mg，蛋白浓度为0.5mg/mL)60℃孵育2小时。
测得固定化谷氨酸脱羧酶60℃孵育2小时保留活性为71％，对照样品的保留活性为20％。
实施例五
将实施例一所得的固定化谷氨酸脱羧酶装柱，连续制备γ-氨基丁酸20次，在第5次、第10次、第15次、第20次检测保留活性。
制备γ-氨基丁酸最佳反应条件37℃，pH5.5，50mM PB，0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2，100mM NaCl。
保留活性为当前固定化谷氨酸脱羧酶活力与初始固定化谷氨酸脱羧酶活力的比值。
测得固定化谷氨酸脱羧酶连续制备γ-氨基丁酸5次后保留98％活性，10次后保留90％以上活性，15次后保留80％活性，20次后保留60％左右活性。 
实施例六
固定化谷氨酸脱羧酶保存
将实施例一所得固定化谷氨酸脱羧酶4℃保存半年，检测其保留活性，每月检测一次。
保留活性为当前固定化谷氨酸脱羧酶活力与初始固定化谷氨酸脱羧酶活力的比值。
表1 固定化谷氨酸脱羧酶4℃保存保留活性
结果表明，将固定化谷氨酸脱羧酶4℃保存3个月后，保留活性大于50％。
实施例七
固定化谷氨酸脱羧酶保存
将实施例1所得固定化谷氨酸脱羧酶用无菌过滤的pH为5.6-7.0的PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，超净工作台中25℃无菌干燥，装于灭菌西林瓶中抽真空，4℃保存半年，检测其保留活性，每月检测一次。
保留活性为当前固定化谷氨酸脱羧酶活力与初始固定化谷氨酸脱羧酶活力的比值。
表2固定化谷氨酸脱羧酶4℃保存保留活性
结果表明，将固定化谷氨酸脱羧酶4℃保存6个月后，保留活性大于50％以上。说明无菌条件对固定化谷氨酸脱羧酶长期保存很重要。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用甘油浸润，然后加入去离子水，搅拌溶解后，加入聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇，搅拌溶解；
步骤(2)将谷氨酸脱羧酶酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；
步骤(3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶以低于1ml/min的速度滴入到3％-6％CaCl2中，15-25℃条件下搅拌2-4小时；
步骤(4)过滤，用pH为5.6-7.0的PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，15℃-25℃干燥，得到粒状固定化谷氨酸脱羧酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的海藻酸钠溶液中，甘油的终浓度为10-20％，聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为1-2％，聚乙二醇的终浓度为0.5-1％，二硫苏糖醇的终浓度为0.1-1mM，海藻酸钠的终浓度为3.5％-5％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的海藻酸钠溶液中，甘油的终浓度为15％，聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为1.5％，聚乙二醇的终浓度为0.75％，二硫苏糖醇的终浓度为0.5mM，海藻酸钠的终浓度为4％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶酶的比活大于等于100U/mg。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CaCl2的浓度为5％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的最适温度为25℃，步骤(4)的最适温度为20℃。
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