CN1896259A

CN1896259A - 一种生产γ－氨基丁酸的方法及其专用反应柱

Info

Publication number: CN1896259A
Application number: CN 200610089485
Authority: CN
Inventors: 孙君社; 乔春楠; 刘萍
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Shandong Crystal Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2006-06-29
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: CN100562581C

Abstract

本发明公开了一种生产γ－氨基丁酸的方法。该方法，是将可表达谷氨酸脱羧酶的菌体破碎，用海藻酸钠固定化，形成固定化的谷氨酸脱羧酶，使固定化的谷氨酸脱羧酶和谷氨酸或谷氨酸盐在反应柱中进行酶催化反应，得到γ－氨基丁酸。本发明的方法利用具有生物活性的酶，只需提供合适的缓冲条件，转化体系中物质少，副产物少，无有害物质存在，作为食品、药品的原材料安全、可靠。整个工艺流程消耗的物质和能量少，产生的废弃物少，有利于环保。

Description

一种生产γ-氨基丁酸的方法及其专用反应柱

技术领域

本发明涉及一种生产γ-氨基丁酸的方法及其专用反应柱。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是一种天然活性成分，它不是组成蛋白质的常见氨基酸，故被称为非蛋白质氨基酸，广泛分布于动植物体内。目前研究已经证明GABA是中枢神经系统的抑制性传递物质，它是脑组织中最重要的神经递质之一，是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，在哺乳动物中枢神经系统中作为抑制性神经递质起作用，参与脑循环生理活动。此外γ-氨基丁酸还具有降血压，防止动脉硬化，调节心律失常，防止皮肤老化等众多作用。虽然GABA可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下转化而成，但是年龄的增长和精神压力的加大等诸多因素使GABA的积累异常困难，而通过日常饮食补充可有效改善这种状况，从而促进人体健康。

化学方法合成γ-氨基丁酸容易产生大量副产物，且不益用于食品和药品。目前γ-氨基丁酸的合成方法除化学方法外，主要利用微生物或微生物所产生的谷氨酸脱羧酶进行生物转化。在利用微生物转化方面，常用乳酸菌属、大肠杆菌属及部分植物乳杆菌作为微生物菌种进行转化，但是微生物转化需要额外消耗培养、维持微生物生长的培养基等物质，此外微生物个体不能反复利用，效率低下也是成为转化成本升高的一个主要因素。

附图说明

图1为生产γ-氨基丁酸的反应柱的纵切面示意图。

图2为γ-氨基丁酸的生产流程示意图

发明内容

本发明的目的是提供一种生产γ-氨基丁酸的方法及其专用反应柱。

本发明提供的生产γ-氨基丁酸的反应柱，包括螺旋状栅板，所述螺旋状栅板上设有固定化酶槽。

所述反应柱还包括外壳，所述螺旋状栅板位于外壳内。

所述螺旋状栅板外缘可设有挡板。

所述反应柱还可包括中心支持柱，所述中心支持柱位于所述螺旋状栅板的中心轴线上。

本发明所提供的生产γ-氨基丁酸的方法，是将可表达谷氨酸脱羧酶的菌体破碎，用海藻酸钠固定化，形成固定化的谷氨酸脱羧酶，使固定化的谷氨酸脱羧酶和谷氨酸或谷氨酸盐在上述反应柱中进行酶催化反应，得到γ-氨基丁酸。

所述方法中，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠。

所述可表达谷氨酸脱羧酶的菌株先在产酶培养基中培养，然后再进行破碎；所述产酶培养基含有质量百分含量为0.5％的谷氨酸钠，0.01-0.05mmol/L的维生素B6。

所述固定化的谷氨酸脱羧酶可按照如下方法获得：将可表达谷氨酸脱羧酶的菌株如大肠杆菌CICC 10003接种于活化培养基中(液体)，30℃培养10-12小时，共活化2次，然后以0.5-2％的体积比接种于产酶培养基中，30℃培养20-24小时，离心收集菌体，并用生理盐水洗涤2次，超声破碎(超声功率为300W，30次，每5秒间隔10秒)。破碎后的菌体用pH4.6-4.7的醋酸盐缓冲液悬浮(每5-10g湿菌体加100ml缓冲液)，悬浮好后另加入2-3％的海藻酸钠，搅拌均匀，4℃冰箱静置1小时除气泡，除气后混合液用注射器7号针头滴入0.1mol/L CaCl₂中，4℃冰箱静置过夜得到固定化酶。所述活化培养基为含有牛肉膏1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖1％，琼脂粉1.5-2.0％(固体培养基中)，pH7.0。所述产酶培养基为含有蛋白胨1％，氯化钠1％，酵母膏0.5％，谷氨酸钠0.5％，维生素B6(0.01-0.05mmol/L)的溶液。上述百分含量为质量百分含量。

所述方法中还包括对得到的γ-氨基丁酸采用阳离子交换柱吸附纯化、活性碳脱色、真空浓缩和重结晶的纯化步骤。

所述阳离子交换柱吸附纯化是进行阳离子交换树脂吸附GABA后，用1倍到1.5倍柱体积的0.2-2mol/L氨水对吸附的GABA进行洗脱，氨水浓度优选为0.2mol/L。

所述真空浓缩可将上述阳离子交换柱吸附纯化后的洗脱液在40℃真空度0.095MPa下浓缩后，去除氨水，再于50-65℃真空度0.095MPa下浓缩，直到浓度达到结晶浓度。

所述方法中，反应结束后的固定化的谷氨酸脱羧酶可用磷酸吡哆醛再生溶液再生；所述再生溶液为pH4.6，含0.05mol/L CaCl₂，0.01-0.05m mol磷酸吡哆醛，1-2.5mmol/LGlu或谷氨酸钠的溶液。

本发明选用高产谷氨酸脱羧酶的优秀菌种，通过对培养基及培养条件的优化，达到菌种最大程度生产谷氨酸脱羧酶；通过固定化谷氨酸脱羧酶和酶的磷酸吡哆醛再生，使谷氨酸脱羧酶可以稳定的反复用于转化生产γ-氨基丁酸；通过专用反应柱基本上解决了在转化过程中产生的二氧化碳气体的问题，并形成了连续转化的过程；最后通过纯化处理工艺使得整个转化可以达到最大产量和高纯度的γ-氨基丁酸。此外，因为整个过程是利用具有生物活性的酶，只需提供合适的缓冲条件，转化体系中参加反应的物质简单，副产物少，无有害物质存在，后期处理方便，不存在活菌问题，作为食品、药品的原材料安全、可靠。底物转化率高，反应液中产物的浓度高，便于后期的分离、纯化。固定化的酶通过酶再生技术可以反复利用节约成本，反应的溶液在经过离子交换柱吸附γ-氨基丁酸后依然可以回收利用，而真空蒸发所得的溶液也可反复利用，整个工艺流程消耗的物质和能量少，产生的废弃物少，有利于环保。而且本发明生产γ-氨基丁酸的方法中酶的转化和产物的分离纯化是一个连续的不间断的过程。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、固定化酶法反应生产γ-氨基丁酸

大肠杆菌CICC 10003：购自中国工业微生物菌种保藏中心(China Center ofIndustrial Culture Collection，CICC)。在琼脂斜面保存培养基中，置于4℃冰箱保存，每3个月传代一次。

保存培养基或活化培养基(CICC29#培养基)：牛肉膏1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖1％，琼脂粉1.5-2.0％(固体培养基中)，调节pH7.0。

产酶培养基：蛋白胨1％，氯化钠1％，酵母膏0.5％，谷氨酸钠0.5％，维生素B6(0.01-0.05mmol/L)。

固定化酶再生溶液：pH4.6，含0.05mol/L CaCl₂，0.01-0.05mM磷酸吡哆醛，1-2.5mm/L谷氨酸钠。

一、γ-氨基丁酸的生产

生产工艺流程如下：

菌种培养—超声破碎—酶固定化—酶解反应—离子交换—碳粒脱色—过滤—真空浓缩—结晶沉淀—分离—烘干—成品

1、固定化谷氨酸脱羧酶的生产：

将大肠杆菌CICC 10003接种于活化培养基中(液体)，30℃培养10小时，共活化2次，然后按1％的体积比接种于产酶培养基中，30℃培养20小时，离心收集菌体，并用生理盐水洗涤2次，用pH4.7的醋酸钠缓冲液悬浮(每5g湿菌体加100ml缓冲液)超声破碎(参数为超声功率为300W，30次，每5秒间隔10秒)。破碎后另加入2％的海藻酸钠，搅拌均匀，4℃冰箱静置1小时除气泡。除气后混合液用注射器7号针头滴入0.1mol/L CaCl₂中，4℃冰箱静置过夜得到固定化谷氨酸脱羧酶。

2、反应柱的制备：

反应柱纵切面示意图如图1所示；该反应柱设有外壳4，外壳4内部有螺旋状栅板1，螺旋状栅板1上设有固定化酶槽，螺旋状栅板1外缘设有挡板2，中心支持柱3位于螺旋状栅板1中心轴线。其中图1中所示箭头为反应液流的方向，固定化酶槽用于放置酶珠，挡板2防止酶珠流出。

反应柱的设计基本上解决了在转化过程中产生的二氧化碳气体的问题，并形成了连续转化的过程。反应液自反应柱上端流入后反复与置于固定化酶槽中的酶珠进行反应，反应生成的二氧化碳气体通过带有栅格的柱的空腔自行排除，解决了在普通柱反应中，反应生产的二氧化碳无法排除的问题；此外，罐式反应器反应不能实现连续化生产，一批原料需在反应罐中反应完全后才能进入到下一道工序，而该反应柱中，反应液逐步自上而下的转化，从下端流出的反应液直接进入到后续离子交换柱等工艺步骤，而与此同时柱上端又在转化新的反应液，即实现了连续化的生产。即用柱反应器实现了连续化生产，又通过柱内特定的栅格结构解决了反应中产生的二氧化碳难以排除反应柱的问题是本发明的重要特色之一。

3、γ-氨基丁酸的生产：

生产流程示意图如图2所示，图中5为单向泵，6为阀门，具体生产步骤如下：

将步骤1)得到的固定化谷氨酸脱羧酶(酶珠)装入反应柱中固定化酶槽内，从反应柱顶端泵入底物液(含有5％谷氨酸钠的水溶液pH4.6-4.7)，反应柱外通37℃循环水保温进行反应。

反应柱排出的液体(反应液)进入到阳离子交换柱中(采用强酸性阳离子交换树脂001*7(732))进行纯化。具体方法如下：取树脂，浸湿，用1mol/L HCl浸泡10-15分钟，蒸馏水清洗至中性后，用1mol/L NaOH浸泡10-15分钟，再用蒸馏水清洗至中性后装柱，用1到1.5倍体积的1mol/L HCl过柱，蒸馏水清洗至中性后吸附反应生成的γ-氨基丁酸，过柱液回收再次利用。用1倍柱体积的2mol/L氨水洗脱，收集洗脱液按1％体积加入提前处理好的活性碳粒并搅拌1h，过滤。

4、真空浓缩：

将步骤3得到的过滤液在40℃真空度0.095MPa下先浓缩(主要蒸发的是氨水)，再于50-65℃真空度0.095MPa下先浓缩(主要蒸发的是水)，当浓度达到结晶浓度时即停止。浓缩液经结晶干燥后可得γ-氨基丁酸的纯品。经计算，γ-氨基丁酸的产率为0.5795g γ-氨基丁酸/g谷氨酸钠。

反应结束后的反应柱固定化酶可用再生液浸泡，使谷氨酸脱羧酶可以稳定的反复用于转化生产γ-氨基丁酸。

二、上述γ-氨基丁酸的检测：

将步骤一得到的γ-氨基丁酸采用高效液相色谱法检测其纯度，色谱柱为Hypersil ODS C18柱(125mm×4.0mm，5μm)，流动相A为20mmol/L乙酸钠+0.02％三乙胺(pH7.3)；流动相B为100mmol/L乙酸钠(pH 7.2)∶乙腈∶甲醇(100∶175∶225)梯度洗脱；检测波长为338nm。衍生剂配制为：OPA衍生试剂(取邻苯二甲醛(OPA)20mg，加3-巯基丙酸(3-MPA)20μl和乙腈5ml制成OPA衍生剂)和硼酸缓冲液(0.4mol/L，pH值为10.4)。

精密量取硼酸缓冲液100μL，OPA衍生剂20μL和供试液(0.05g步骤一得到的γ-氨基丁酸，用100ml去离子水溶解)20μL混合反应5min后，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，通过建立的标准曲线获得供试液中γ-氨基丁酸的含量。

结果表明，供试液(0.05g步骤一得到的γ-氨基丁酸)含有0.0475gγ-氨基丁酸，表明步骤一得到的γ-氨基丁酸的纯度为95％。

Claims

1、一种生产γ-氨基丁酸的反应柱，包括螺旋状栅板，所述螺旋状栅板上设有固定化酶槽。

2、根据权利要求1所述的反应柱，其特征在于：所述反应柱还包括外壳，所述螺旋状栅板位于外壳内。

3、根据权利要求2所述的反应柱，其特征在于：所述螺旋状栅板外缘设有挡板。

4、根据权利要求2所述的反应柱，其特征在于：所述反应柱还包括中心支持柱，所述中心支持柱位于所述螺旋状栅板的中心轴线上。

5、一种生产γ-氨基丁酸的方法，是将可表达谷氨酸脱羧酶的菌体破碎，用海藻酸钠固定化，形成固定化的谷氨酸脱羧酶，使固定化的谷氨酸脱羧酶和谷氨酸或谷氨酸盐在权利要求1-4中任一所述反应柱中进行酶催化反应，得到γ-氨基丁酸。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述谷氨酸盐为谷氨酸钠。

7、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括对得到的γ-氨基丁酸采用阳离子交换柱吸附纯化、活性碳脱色、真空浓缩和重结晶的纯化步骤。

8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述阳离子交换柱吸附纯化是用强酸性阳离子交换树脂001*7(732)吸附反应生成的γ-氨基丁酸，用1倍到1.5倍柱体积的0.2-2mol/L氨水洗脱；所述氨水浓度优选为0.2mol/L；所述真空浓缩是将权利要求6所述阳离子交换柱吸附纯化后的洗脱液在40℃真空度0.095MPa下浓缩后，去除氨水，再于50-65℃真空度0.095MPa下浓缩，直到浓度达到结晶浓度。

9、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述可表达谷氨酸脱羧酶的菌先在产酶培养基中培养，然后进行破碎；所述产酶培养基含有质量百分含量为0.5％的谷氨酸钠，0.01-0.05mmol/L维生素B6。

10、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述固定化的谷氨酸脱羧酶用磷酸吡哆醛再生溶液再生；所述再生溶液为pH4.6，含0.05M/L CaCl₂，0.01-0.05mM磷酸吡哆醛，1-2.5mmol/L谷氨酸或谷氨酸钠的溶液。