CN107345233A - 732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ‑氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ‑氨基丁酸的方法，属于绿色生物制造技术领域；本发明分别以并联排列的732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ通过阀门控制交替作为辅助反应柱与固定化屎肠球菌细胞柱相偶联，并与其他辅助设施或设备连接形成循环反应系统，通过底物在732树脂辅助反应柱和固定化屎肠球菌细胞反应柱之间循环而进行高效催化反应，提高γ‑氨基丁酸产率；在一根732树脂柱辅助转化反应的同时，对另一根732树脂柱进行洗脱、再生和平衡，从而实现固定化屎肠球菌细胞柱在732树脂柱辅助下进行连续生产。与仅采用固定化细胞的单柱反应法相比，本发明提供的方法在相同反应时间和同等固定化屎肠球菌的条件下，单批循环的GABA产量提高178.83%。

Description

732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法，属于绿色生物制造领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)是一种具有4个碳原子的非蛋白质组成氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、镇静和改善睡眠等作用，已成为备受关注的药品和保健品成分。由于可以通过内酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此GABA还是生产生物塑料聚酰胺4的重要原料。

微生物生长繁殖快，以其生产GABA不受时间和空间限制，因此通过微生物 GAD(Glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)生产GABA备受关注。GAD是一种依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)的裂解酶，存在于细胞质中，是生物体催化L-谷氨酸(L-Glutamic acid,L-Glu)发生α-羧基脱羧作用生成GABA的唯一酶。由于GAD作用的底物(L-Glu)和产物(GABA)均为小分子，可以透过细胞膜，因此可以直接采用细胞转化法生产GABA，减少胞内酶的提取成本，简化生产工艺。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种、戊糖片球菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、大肠杆菌细胞转化法制备GABA的报道。但是由于游离细胞不易回收重复使用，因此仍需要不断重复培养高GAD活力的细胞用于生产，而通过固定化技术将细胞固定或包埋于固态载体上，即制备成固定化细胞，则可克服游离细胞的缺点，并可实现连续化生产。

赵景联等在文摘(生物工程学报，1989,5(2)：124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。间歇反应5h转化率达到了100％；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6mL/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；连续柱式反应器中进行，控制流速12mL/h，转化率达95％。

章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998,13(4)：433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了GABA含量达到了98.94％，收率为49.65％。

杨胜远等在中国专利(专利号200910114016.4)中公开了一种细胞转化法生产GABA的方法，它是以乳酸乳球菌的细胞作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠，生产高含量的GABA，或将乳酸乳球菌细胞采用海藻酸钠进行固定化，通过固定化细胞技术转化谷氨酸或谷氨酸钠生产GABA。

焦阳、汪建敏和杨胜远等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)中以唾液链球菌嗜热亚种Y-2为供试菌，考察了卡拉胶、明胶和海藻酸钙等材料将此菌株固定化的效果，并通过比较固定化细胞的GAD活性及γ-氨基丁酸的产量和载体机械强度，确定了海藻酸钙作为固定化细胞的适宜载体。优化后得到的最适固定化条件(w/v)为：海藻酸钠2％，CaCl2 14％, 菌体25％，凝胶平均颗粒直径1.64mm，在此条件下测得固定化细胞的GAD活性为游离细胞的1.2倍。细胞多批次应用稳定性试验证明：固定化细胞较游离细胞有着更稳定的GAD活性，反复使用60h后，固定化细胞GAD活性仍能保持其初始活性的90％以上，γ-氨基丁酸的积累量达到7.97g/L。

虽然以微生物合成GABA的公开技术较多，但是由于微生物GAD的活性普遍不高，GABA产量偏低，成本高，难以满足工业化生产需求。不管是游离酶、游离细胞或固定化细胞转化法，还是发酵法，GAD都是生物合成GABA的关键酶，其活性高低与GABA的产量直接相关。除了GAD的结构和微生物代谢产酶量外，催化反应的外部反应条件也是影响GAD 活性的重要因素。因此，如何提高微生物GAD活力、提高高活力GAD细胞的产量以及通过改善细胞转化反应体系或工艺条件，提高GABA的产量，降低生产成本，将是今后亟需解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过将732阳离子交换树脂柱与固定化屎肠球菌细胞柱偶联形成循环复合转化反应系统，通过732阳离子交换树脂对屎肠球菌GAD活性的促进作用，最终实现提高GABA产量的目的，解决生物合成GABA成本高居不下的问题，并通过采用2根732阳离子交换树脂柱交替使用，解决固定化屎肠球菌细胞柱连续生产的问题。

732树脂为强酸型阳离子交换树脂，对物质具有选择吸附特性，后处理简便，价廉易得、不污染环境、不腐蚀设备，容易分离及回收，可重复使用，已广泛用于物质的分离纯化。但是，作为辅助催化剂在生物酶催化反应体系中应用尚未报道。

本发明研究表明732阳离子交换树脂作为辅助催化剂，在与屎肠球菌游离细胞或游离 GAD混合进行共催化时，屎肠球菌GAD的催化活性大幅提高，说明732阳离子交换树脂对屎肠球菌游离细胞或游离GAD活性具有显著的促进作用。本发明进而对732阳离子交换树脂促进屎肠球菌游离细胞转化活性的作用机制进行了深入探讨，并在此基础上将固定化屎肠球菌细胞的反应柱与732阳离子交换树脂柱偶联，发明了可循环的双柱式反应方法。本发明的方法在GABA产量上较单一固定化屎肠球菌细胞反应柱可提高1.5～2倍，并且呈现固定化屎肠球菌细胞的GAD活性越强，732阳离子交换树脂提高GABA产量的幅度越大的趋势。

本发明的所使用的具有GAD活性的屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株分离自泡菜，已于2017年6月19日进行专利菌种保藏，其保藏编号为：GDMCC NO.60203，保藏名称为：Enterococcus faecium LNSF2，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

为了实现本发明的目的，发明人首先从反应体系pH值对屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD转化活性的影响进行了研究。结果表明细胞GAD的最适反应pH值为4.4，当反应体系的pH值大于4.4时，细胞GAD活性迅速下降；在pH 4.2～4.6范围内，屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD的转化活性相对较强。

L-Glu是GAD作用的底物，只有游离状态的L-Glu才能被GAD所催化，为此本发明对L-Glu和谷氨酸一钠(味精，Monosodium glutamate，MSG)在pH 4.2的0.2mol/L乙酸- 乙酸钠缓冲液中的溶解度进行了测定，结果40℃时，0.3mol/LMSG已经基本接近饱和溶液，为了防止MSG结晶析出影响，本发明选择GAD底物MSG或L-Glu的浓度为0.2mol/L。经对比试验表明，MSG较L-Glu更易溶解，配制更方便。

一些酶常具有底物抑制作用，为了考察底物L-Glu对屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD转化活性的影响，本发明对不同浓度的MSG溶液(溶于pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液)对细胞转化活性的影响进行了测定。结果表明，在0.025～0.25mol/L范围内，随着MSG溶液浓度增加，GAD转化活性增强，说明屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD不存在底物抑制作用，而且MSG溶液浓度增加有助于L-Glu进入细胞而提高屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD的转化活性。

一些酶常具有产物抑制作用，为了考察产物GABA对屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD转化活性的影响，本发明对采用含0.2mol/LMSG-1mol/L GABA(溶于pH 4.2的0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液)的混合溶液作为转化反应的初始底物溶液，结果屎肠球菌GDMCC60203细胞GAD的转化活性较不加GABA的对照组下降了20.56％，说明转化产物GABA对屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD的转化活性有抑制作用。

从上述研究表明，反应体系pH值、底物浓度和产物浓度是影响屎肠球菌GDMCC60203细胞GAD转化活性的重要因素，在生产中，如能及时调节反应体系pH值、底物浓度和产物浓度将可显著提高GABA的产量。L-Glu脱羧基生成GABA，会造成反应体系pH值升高，从而降低细胞GAD活性，特别是当以固定化细胞采用柱式进行转化反应制备GABA 时，固定化细胞柱中段和后段的转化液pH值往往较高，产物GABA浓度在中段和后段也较高，而底物L-Glu浓度则相对较低。

因此，在固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD的转化法生产GABA的方法中，固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞柱的催化效率从前段至后段是逐渐降低的。由于固定化反应柱是一个密闭系统，因此要在固定化细胞柱中实现调节反应体系pH值、底物浓度和产物浓度是非常困难的。为了解决这一问题，本发明通过固定化细胞柱与732阳离子交换树脂柱相偶联的循环反应法解决上述问题，取得了很好的效果，并通过采用2根732阳离子交换树脂柱交替使用，成功解决了固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞柱连续生产的问题。732 阳离子交换树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法的示意图如附图1。

为了实现减少屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD转化体系的转化液中游离的GABA 浓度的目的，本发明对不同性质D113阳离子交换树脂(弱酸型)和732阳离子交换树脂(弱酸型)对L-Glu和GABA的吸附能力及稳定反应体系的pH值的能力进行了测试。结果，以 732阳离子交换树脂的效果最佳，当以经过pH 4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的732 阳离子交换树脂按树脂质量与0.2mol/L L-Glu-0.2mol/L GABA混合溶液(溶于0.2mol/L乙酸 -乙酸钠缓冲液，pH 4.2)体积比为1∶2混合5min，结果732阳离子交换树脂对L-Glu和GABA 的均有吸附能力，当以树脂质量∶洗脱液体积为1∶20的0.15mol/L Na₂CO₃溶液进行洗脱，洗脱液中L-Glu和GABA分别为(21.31±0.09)mmol/L和(13.32±0.08)mmol/L。在pH 4.2～ 5.2范围内，随着乙酸-乙酸钠缓冲液pH值升高，GABA吸附量增加，L-Glu吸附量呈下降趋势。因此本发明选择732阳离子交换树脂作为固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞转化法生产GABA的辅助反应介质。

为了充分利用732阳离子交换树脂的特性，本发明对利用732阳离子交换树脂作为固体酸的前景进行了考察。当按树脂质量∶缓冲液体积为1∶2的比例在pH 4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中加入732阳离子交换树脂，然后测定缓冲液的pH值，结果加入树脂后，缓冲液的pH值很快由pH 4.2下降到3.59±0.04，40℃保温1h，缓冲液pH值可下降到3.32 ±0.03，可见发生离子交换后732阳离子交换树脂可释放的H⁺，而且酸性较强。如能有效利用，将可作为固体酸用于调节固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞转化液的pH。

谷氨酸脱羧基生成GABA后，会造成反应体系pH值升高，从而降低细胞GAD活性，特别是当以固定化细胞采用柱式进行转化反应制备GABA时，固定化细胞柱后段的转化液pH值往往较高，而通过酸碱调节固定化细胞柱内的转化体系pH值，是非常困难的，为了发挥固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD的活力，本发明选择固定化细胞柱的初始反应底物溶液pH值为4.2。虽然通过采用控制初始反应底物溶液pH值为4.2，在一定程度上对减缓固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞柱的中后段pH值升高有一定作用，但是由于固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞密度大，GAD活性高，反应体系的pH升高幅度较大，仅靠降低反应底物溶液的初始pH值以解决反应体系pH升高的问题是不现实的。通过加快流速，减少转化液在固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱中的停留时间，降低单次转化反应量，可以解决固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱pH值升高的问题，但是单次转化反应生成的 GABA产量低，转化液中GABA浓度低，不利于下游工艺对GABA的提取纯化和成本控制，而仅对转化液采用外源酸进行调节又无法解决GABA产物对屎肠球菌GDMCC 60203GAD反馈抑制的问题。在前述研究中本发明已经证实732阳离子交换树脂对GABA有很好的离子交换作用，可以通过离子交换吸附转化液的GABA并释放的H⁺，既可实现分离转化液中的 GABA的作用，又可实现转化液pH值的调节，因此本发明通过732阳离子交换树脂对GABA 和转化液pH值的进行调节控制，可以取得很好的效果。

本发明前述研究表明，732阳离子交换树脂对底物L-Glu也有一定的交换吸附能力， L-Glu被交换后，底物浓度降低，也不利于GABA生产，本发明主要通过用前先采用含0.2mol/L L-Glu的pH 4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液对732阳离子交换树脂进行平衡，可以避免732 阳离子交换树脂降低转化液底物的浓度。

由于732阳离子交换树脂发生离子交换释放的H⁺对固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞GAD转化液的pH值的调节作用有限，因此本发明将经732阳离子交换树脂交换后的流出液通入循环贮罐，采用3mol/L HCl进一步调节至pH 4.2，然后再进入固定化屎肠球菌GDMCC60203柱进行循环反应。高浓度的HCl调节pH值，由于浓度大、用量少，可以减少外源酸对底物浓度的稀释作用，同时循环贮罐中没有屎肠球菌GDMCC 60203，因此采用3mol/L HCl 调节pH值也不会因屎肠球菌GDMCC 60203受到酸损害而造成GAD失活，固定化屎肠球菌 GDMCC60203可处于温和的环境而发挥高效催化作用。

流速是影响底物L-Glu在固定化屎肠球菌GDMCC 60203柱中停留的时间，也是影响生产效率的重要因素，流速慢则单次反应转化生成GABA的量多，但是转化液的pH值升高幅度较大，容易影响中后段固定化屎肠球菌GDMCC 60203GAD活性；流速快，则可克服前述缺点，但是会增加后续工艺的负担，增加动力消耗。由于屎肠球菌GDMCC 60203产GAD 与发酵条件有很大关系，随着不同批次培养条件不尽相同而造成同样固定化屎肠球菌 GDMCC60203细胞柱床体积的GAD活力不同。因此，流速控制不能只根据柱床体积而定，本发明根据研究结果确定以固定化屎肠球菌GDMCC 60203柱流出液的pH值作为监测指标对流速进行调节控制，使流出液pH值不大于4.6。监测指标灵敏、快速，对流速调节反应及时。

由于循环反应后，树脂已交换有GABA产物，不能无限作为辅助介质用于生产，需要对产物GABA进行洗脱提取，同时好需要再生和平衡处理，时间长，不利于利用固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞柱进行连续生产，本发明在工艺上通过2根732阳离子交换树脂柱进行交替使用，可以很好的解决利用固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞柱进行连续生产的问题。

按照本发明上述的技术方法，在相同反应时间和同等固定化屎肠球菌GDMCC60203 的条件下，与仅采用固定化细胞的单柱反应法相比较，本发明单批循环的GABA产量提高 178.83％。

以上所述为本专利申请的研究过程示例，但不仅限于上述研究内容。

基于上述研究，形成了本发明的技术方案。

本发明的技术方案是：

参照焦阳、汪建敏和杨胜远等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)的细胞固定化方法，采用海藻酸钙细胞包埋法制备固定化屎肠球菌细胞，将固定化屎肠球菌细胞以pH4.2的0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液按照常规方法装柱制备成固定化细胞反应柱；将已再生或预处理的 732阳离子交换树脂以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂辅助反应柱，732阳离子交换树脂辅助反应柱设置2根，分别记为Ⅰ和Ⅱ；将固定化屎肠球菌细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，2根732 阳离子交换树脂辅助反应柱并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌细胞反应柱形成循环双柱反应系统；在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂辅助反应柱柱床体积的含0.2mol/L L-Glu或MSG的pH 4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，泵入732阳离子交换树脂辅助反应柱，分别对辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；将5倍固定化屎肠球菌细胞反应柱柱床体积的0.2mol/L MSG或L-Glu溶液(溶于pH 4.2的0.2mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液)用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3mol/L HCl调节pH为4.2；将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌细胞反应柱于40℃柱温进行反应；如此重复循环反应，通过检测转化液流出液的L-Glu浓度，以L-Glu的摩尔转化率大于85％作为循环转化反应的终点；第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ与固定化屎肠球菌细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ与固定化屎肠球菌细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；按第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌细胞反应柱柱床体积的0.2mol/L MSG或L-Glu溶液(溶于pH 4.2的0.2mol/L乙酸- 乙酸钠缓冲液)在屎肠球菌细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ之间进行新的循环反应；在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15mol/L Na₂CO₃溶液通过泵输送到732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂辅助反应柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂的再生方法和上述732阳离子交换树脂辅助反应柱的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和含0.2 mol/L L-Glu或MSG的pH 4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；按照上述的方法，交替使用732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌细胞反应柱的连续生产。

本发明的方法是：

本发明所述的一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步骤：

①将固定化屎肠球菌细胞以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌细胞反应柱；

②将已再生或预处理的732阳离子交换树脂以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂辅助反应柱，732阳离子交换树脂辅助反应柱设置2根；

③将固定化屎肠球菌细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，2根732阳离子交换树脂辅助反应柱并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌细胞反应柱形成循环双柱反应系统；

④在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂辅助反应柱柱床体积的0.2mol/L底物溶液，泵入732阳离子交换树脂辅助反应柱对732阳离子交换树脂进行平衡，备用；

⑤将5倍固定化屎肠球菌细胞反应柱柱床体积的0.2mol/L底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；

⑥将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3mol/L HCl调节pH为4.2；

⑦将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌细胞反应柱于40℃柱温进行反应；

⑧按⑥和⑦进行循环反应，通过检测转化液流出液的L-Glu浓度，以L-Glu的摩尔转化率大于85％作为循环转化反应的终点；

⑨第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ与固定化屎肠球菌细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ与固定化屎肠球菌细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌细胞反应柱柱床体积的0.2mol/L底物溶液在屎肠球菌细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ之间进行新的循环反应；

⑩在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15mol/L Na₂CO₃溶液通过泵输送到732 阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂辅助反应柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂的再生方法和步骤④所述的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和0.2mol/L底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；

按照④～⑩所述的方法，交替使用732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌细胞反应柱的连续生产。

上述所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠溶于0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，pH为4.2。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明选用的732阳离子交换树脂辅助反应柱可以通过与GABA离子交换而释放H⁺，具有固体酸的作用，减少调节转化液pH值的用酸量；同时，732阳离子交换树脂辅助反应柱交换 GABA后，实现了GABA与屎肠球菌分离，可以减少产物对GAD的反馈抑制作用及屎肠球菌下游酶对GABA的代谢，增加GABA产量。

本发明通过732阳离子交换树脂辅助反应柱可有效控制转化液的GABA和pH值，实现屎肠球菌GAD能始终在适宜的转化条件下发挥其催化活性，显著提高GABA的产量；在相同反应时间和同等固定化屎肠球菌的条件下，与仅采用固定化细胞的单柱反应法相比较，本发明单批循环的GABA产量提高178.83％。另外，732阳离子交换树脂对GABA的交换作用也是一种GABA纯化的过程，可以简化下游提取纯化工艺，降低生产成本。

附图说明

图1为732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法的示意图；

图1中：1.L-谷氨酸一钠或L-谷氨酸溶液调配罐；2.阀门；3.泵；4.高位罐；5.固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱；6.转化液贮罐；7.732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ；8.732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ；9.循环贮罐；10.平衡贮罐；11.洗脱液贮罐。

具体实施方式

本发明实施方式是以海藻酸钙细胞包埋法制备的固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞为例，装柱后与732阳离子交换树脂辅助反应柱组成连续循环转化反应体系生产GABA，但对不仅限于海藻酸钙细胞包埋法制备的固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞，对其他方法制备的固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞同样可以与732阳离子交换树脂辅助反应柱构成连续循环转化反应体系用于GABA生产。

实施例1

本发明所述的一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步骤：

①参照焦阳、汪建敏和杨胜远等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)的细胞固定化方法，采用海藻酸钙细胞包埋法制备固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞，然后将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱；

②将732阳离子交换树脂按照树脂说明书进行再生或预处理，然后以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂辅助反应柱，732阳离子交换树脂辅助反应柱设置2根，即732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ；

③将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ采用并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱形成循环双柱反应系统；

④在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂辅助反应柱柱床体积的底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；采用同样方法对辅助反应柱Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡；

⑤将5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；

⑥将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3mol/L HCl调节pH为4.2；

⑦将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱于40℃柱温进行反应；

⑧按⑥和⑦进行循环反应，通过检测转化液流出液的L-Glu浓度，以L-Glu的摩尔转化率大于85％作为循环转化反应的终点；

⑨第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；参照第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的底物溶液在屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ之间进行新的循环反应；

⑩在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15mol/L Na₂CO₃溶液通过泵输送到732 阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂辅助反应柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂说明书的再生方法和步骤④所述的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；

按照④～⑩所述的方法，交替使用732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱的连续生产。

上述所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠溶于0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，pH为4.2。

实施例2

本发明所述的一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步骤：

①参照沈俞等在文摘(精细化工，2008，25(5):459-462)的细胞固定化方法，采用卡拉胶与明胶复合载包埋制备固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞，然后将固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱；

②将732阳离子交换树脂按照树脂说明书进行再生或预处理，然后以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂辅助反应柱，732阳离子交换树脂辅助反应柱设置2根，即732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ；

③将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ采用并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱形成循环双柱反应系统；

④在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂辅助反应柱柱床体积的底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；采用同样方法对辅助反应柱Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡；

⑤将5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；

⑥将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3mol/L HCl调节pH为4.2；

⑦将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱于40℃柱温进行反应；

⑧按⑥和⑦进行循环反应，通过检测转化液流出液的L-Glu浓度，以L-Glu的摩尔转化率大于85％作为循环转化反应的终点；

⑨第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；参照第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的底物溶液在屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ之间进行新的循环反应；

⑩在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15mol/L Na₂CO₃溶液通过泵输送到732 阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂辅助反应柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂说明书的再生方法和步骤④所述的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；

按照④～⑩所述的方法，交替使用732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱的连续生产。

上述所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠溶于0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，pH为4.2。

实施例3

本发明所述的一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步骤：

①参照赵伟睿等在文摘(高校化学工程学报，2015，29(1):138-144)首先采用低介电常数(<6)、高疏水性(log P>0.68)的有机溶剂对屎肠球菌GDMCC 60203细胞进行透性化处理，再参照焦阳等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)的细胞固定化方法，采用海藻酸钙细胞包埋法制备固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞，然后将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞以 pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱；

②将732阳离子交换树脂按照树脂说明书进行再生或预处理，然后以pH 4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂辅助反应柱，732阳离子交换树脂辅助反应柱设置2根，即732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ；

③将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ采用并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱形成循环双柱反应系统；

④在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂辅助反应柱柱床体积的底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；采用同样方法对辅助反应柱Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡；

⑤将5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；

⑥将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3mol/L HCl调节pH为4.2；

⑦将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱于40℃柱温进行反应；

⑧按⑥和⑦进行循环反应，通过检测转化液流出液的L-Glu浓度，以L-Glu的摩尔转化率大于85％作为循环转化反应的终点；

⑨第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；参照第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的底物溶液在屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅱ之间进行新的循环反应；

⑩在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15mol/L Na₂CO₃溶液通过泵输送到732 阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂辅助反应柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂说明书的再生方法和步骤④所述的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；

按照④～⑩所述的方法，交替使用732阳离子交换树脂辅助反应柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱的连续生产。

上述所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠溶于0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，pH为4.2。

Claims (1)

1.一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，分别以并联排列的732阳离子交换树脂柱Ⅰ和732阳离子交换树脂柱Ⅱ通过阀门控制交替作为辅助反应柱与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱相偶联，并与其他辅助设施或设备连接形成循环反应系统，通过反应底物在732阳离子交换树脂柱和固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱之间循环而进行高效催化反应，提高γ-氨基丁酸产率；在一根732阳离子交换树脂柱辅助转化反应的同时，对另一根732阳离子交换树脂柱进行洗脱、再生和平衡，从而实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱在732阳离子交换树脂柱辅助下进行连续生产，所述方法包括以下步骤：

① 将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞以pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱；

② 将已再生或预处理的732阳离子交换树脂以pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂柱，732阳离子交换树脂柱设置2根，即732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ；

③ 将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ采用并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱形成循环双柱反应系统；

④ 在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂柱柱床体积的0.2 mol/L底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；采用同样方法对辅助反应柱Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡；

⑤ 将5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的0.2 mol/L 的底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；

⑥ 将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3 mol/L HCl调节pH为4.2；

⑦ 将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱于40℃柱温进行反应；

⑧ 按⑥和⑦进行循环反应，通过检测转化液流出液的底物浓度，以底物的摩尔转化率大于85%作为循环转化反应的终点；

⑨ 第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂柱Ⅰ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂柱Ⅱ与固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；参照第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的0.2 mol/L 底物溶液在屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂柱Ⅱ之间进行新的循环反应；

⑩ 在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15 mol/L Na₂CO₃溶液通过泵输送到732阳离子交换树脂柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂说明书的再生方法和步骤④所述的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和0.2 mol/L 底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；

按照④～⑩所述的方法，交替使用732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱的连续生产；

所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 为4.2。