CN101481660B - 一株高产腺苷蛋氨酸的菌种 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高产腺苷蛋氨酸的菌种及其筛选方法，本发明筛选出的一株腺苷蛋氨酸高产菌株，命名为SAM0238，该菌株菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐。其分类名为Saccharomyces cerevisiae，保藏号为CGMCC No.2842，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，本发明菌株可以高产腺苷蛋氨酸，本发明还公开了使用该菌种制备腺苷蛋氨酸的方法。

Description

一株高产腺苷蛋氨酸的菌种

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高产腺苷蛋氨酸的菌种及其筛选方法，还公开了使用该菌种制备腺苷蛋氨酸的方法。 

背景技术

S-腺苷蛋氨酸又称活性甲硫氨酸，英文名为S-adenosylmethionine，缩略语为SAM、SAMe或AdoMet。其化学结构式如下图： 

它是一种广泛存在于生物体内、具有重要生理活性的中间代谢物，在细胞代谢中的重要性仅次于三磷酸腺苷(ATP)。作为一种重要的生理活性物质，它参与机体代谢的甲基化，并与包括基因调控、荷尔蒙活性、神经传导发育和解毒在内的众多关键的身体机能密切相关。研究表明SAM对多种疾病有明显疗效，如其对酒精性肝病、抑郁症，以及阿尔茨海默症等均具良好疗效(NEWMANPE 2000)。SAM是生物体内的一种天然分子。药用SAM由意大利基诺(Knoll)药厂首先用于临床。1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，迅速在美国成为最畅销的营养品之一。自1973年以来，对该药的临床特点进行了一系列研究，发现其对慢性肝脏疾病和抑郁症有较好的疗效。SAM治疗抑郁症的机理尚不清楚，但是可以肯定的是S-腺苷蛋氨酸是一种与已知其它抗抑郁药化学结构和作用机理均不相同的新型抗抑郁药。其疗效肯定，不良反应轻，耐受性良好，而且起效可能较快。这些都让我们看到了它在医药方面的巨大潜力。 

目前SAM的合成主要有化学合成法、酶促合成法和微生物发酵法，其中化学合成法是采用S-腺苷同型半胱氨酸和甲基供体合成。但是此法有产率低、反应物S-腺苷同型半胱氨酸价格昂贵、反应产物为(+)SAM的混消旋物、少量非活性(+)SAM难以分离等明显缺点，因而在实际生产中很少应用；酶促合成法是利用SAM合成酶催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成(-) 型SAM。该法虽具有反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短等优点，但是，SAM合成酶在动植物和微生物体内含量少、酶活性不高，且分离困难，因此一般只将其用于合成同位素标记的SAM；微生物发酵法是采用在培养基中添加L-蛋氨酸，利用微生物发酵，可以获得大量的SAM，再从中提取精制SAM。现国内外主要利用腺苷转移活性高的酵母菌发酵法制取SAM，但未见具体的SAM生产规模表达量的报道，主要是因为采用诱变后随机筛选的方法，效率低，偶然性非常大。我国浙江海正药业等已具备发酵法生产的能力，却因为表达或转化量还较低、分离纯化成本较高，大规模工业化与开拓市场还在探索中。因此高效率低成本获取SAM技术的研究具有重要的意义。 

发明内容

本发明的目的是针对以上现有技术的缺陷，提供一种高产腺苷蛋氨酸的菌种及其筛选方法，提高腺苷蛋氨酸的产量，解决在腺苷蛋氨酸生产过程菌种筛选效率低下的问题。 

本发明筛选出的一株腺苷蛋氨酸高产菌株，命名为SAM0238，该菌株菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，如图1所示。其分类名为Saccharomyces cerevisiae，保藏号为CGMCCNo.2842，保藏时间：2008年12月，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 

本发明的菌株SAM0238的筛选方法包括以下步骤： 

a.制备酿酒酵母菌悬液：取活化后的酿酒酵母经摇瓶培养至对数生长期后，加入磷酸盐缓冲液制成酿酒酵母菌悬液； 

b.诱变处理酿酒酵母菌：取适量菌悬液至灭菌平皿中，经过25W、距离为20～40cm紫外照射后，将菌液涂布至含有乙硫氨酸50～150μg/ml的缺硫培养基中，25～35℃培养30～40小时，得到具有乙硫氨酸抗性的突变株，其中所述缺硫培养基为：葡萄糖20.0g、尿素2.2g、K₂HPO₄6g、Na₂HPO₄2g和微量元素母液0.5～1.0ml琼脂粉15g，1000ml蒸馏水定容，pH4.0～6.5，115℃灭菌30min；微量元素母液中所含各组分及浓度：CoCl₂·6H₂O 0.9g/L，CuCl₂ 0.72g/L，ZnCl₂·7H₂O 8.2g/L，CaCl₂ 1.8g/L，NaMoO₄·2H₂O 0.9g/L，CaCl₂ 1.8g/L，NaMo₄·2H₂O 0.9g/L，FeCl₂·7H₂O 14.5g/L； 

c.筛选得到高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株：将所述具有乙硫氨酸抗性的突变株用摇瓶培养后得到发酵液，离心收集菌体，破壁，用HPLC法检测并筛选出高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株，即得。 

上述筛选方法中，其中c步骤中摇瓶培养条件优选：25～35℃下，100～300rpm培养24～36 小时得到发酵液；摇瓶培养基优选：葡萄糖35～45g、硫酸铵12～18g、磷酸二氢钾8～15g、磷酸氢二钾3～5g、七水硫酸镁3～5g、七水硫酸亚铁0.03～0.05g、酵母膏3～5g和玉米浆3～5g，1000ml蒸馏水定容，pH 4.0～6.5，115℃灭菌30min。 

上述c步骤中破壁方法优选为：取发酵液体，添加两倍体积1.0～1.5mol/L高氯酸，30～60℃水浴30～100min，离心，收集上清液。更优选的破壁方法是：取充分混匀后的发酵液按每2毫升加入1.5mol/L的高氯酸4mL，40℃水浴破碎0.5h；4000/min离心10min收集上清液。 

上述c步骤中HPLC法的色谱条件优选为：C18柱(250nm×4.6mm)；流动相：0.01mol/L的甲酸铵，pH 3.0；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：25℃；进样量：5μL。 

上述a步骤中菌悬液的浓度优选为50～100cfu/ml。 

本发明对破壁方法进行了系列研究，以下是试验过程： 

1.实验准备 

(1)配制培养基： 

摇瓶培养基：葡萄糖40g，硫酸铵15g，磷酸二氢钾9g，磷酸氢二钾3g，七水硫酸镁3g，七水硫酸亚铁0.03g，酵母膏3g，玉米浆3g，1000ml蒸馏水定容，pH 4.0～6.5，115℃灭菌20min，备用。 

斜面培养基：葡萄糖40g，硫酸铵15g，磷酸二氢钾9g，磷酸氢二钾3g，七水硫酸镁3g，七水硫酸亚铁0.03g，酵母膏3g，玉米浆3g，琼脂20g，1000ml蒸馏水定容，pH 4.0～6.5，115℃灭菌20min，备用。 

(2)试剂：蜗牛酶、溶菌酶、高氯酸 

2，实验方法： 

采用的酶为蜗牛酶和溶菌酶2种和1.5mol/L高氯酸进行破壁试验。将酵母液取出200μL加入Eppendorf管中，分别加入0.75mL检测酶液和400μL 1.5mol/L高氯酸，重点考察时间、温度对破壁效果的影响。 

3，试验步骤： 

3.1破壁效果的检测方法 

3.1.1酵母细胞计数法：利用显微镜，通过血球计数板测出反应前后细胞数即可。试验所用血球计数板为25×16型。 

3.1.2测定菌体浓度法：通过反应完毕后与反应前的酵母细胞OD值比较。 

3.1.3上清液蛋白浓度测定法：由于细胞内含有蛋白，所以通过测定离心后上清液蛋白浓度来检测酵母细胞的破壁效果。将反应后的细胞液离心，取上清液蛋白于595nm处测OD值，查阅所作蛋白标准曲线得到蛋白浓度。 

3.1.4腺苷蛋氨酸产量测定，HPLC法色谱条件：C18柱(250nm×4.6mm)；流动相：0.01mol/L的甲酸铵，用甲酸将pH值调至3.0；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：25℃；进样量：5μL。 

3.2影响因素试验 

3.2.1时间对蜗牛酶、溶菌酶效果影响 

实验选择10mg酶量为标准，40℃恒温反应，时间0h～5h。分别以上清液蛋白浓度和破壁率为指标。 

3.2.2温度对蜗牛酶和溶菌酶破壁效果影响 

选择10mg酶量为标准，反应时间为4h，温度34℃～44℃ 

3.2.3酶量对破壁效果的影响， 

反应温度为40℃，反应时间为4h，酶量定于0mg～10mg和10mg～50mg。 

由于酶液本身具有一定的蛋白浓度，应在破壁后酵母细胞OD值中减去酶液的OD值，方为酵母细胞OD值。又因离心后会有部分酶残留在上清液中，故测上清液蛋白浓度会受到影响。所以，以破壁后酵母细胞OD值为指标. 

3.2.4酸热法破壁效果研究：取发酵液体，添加两倍体积1.0～1.5mol/L高氯酸，30℃水浴恒温加热10min。由于高氯酸对蛋白破坏严重，以细菌OD值和细胞计数法来确定破壁率。 

结果显示上述两种酶法破壁率都低于30％，而酸热法比酶法破壁效果明显要好破壁率超过50％故重点考察酸热法破壁。试验过程如下： 

取充分混匀后的发酵液2ml加入1.5mol/L的高氯酸4mL，40℃水浴破碎1.5h，以4000r/min离心10min，收集上清液，即菌体。用HPLC法检测上清液中腺苷蛋氨酸的含量。检测条件为：C18柱(250nm×4.6mm)；流动相：0.01mol/L的甲酸铵，pH 3.0；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：25℃；进样量：5μL 

酸热法破壁效果如表1所示，最终确定确定1.5mol/高氯酸40℃，30min为最佳破壁条件。 

温度及时间对酸热法破壁效果的影响 

本发明还公开了一种制备腺苷蛋氨酸的方法，包括： 

1.发酵培养：取本发明的的酿酒酵母菌株SAM0238，活化后经摇瓶培养至对数生长期，得到发酵种子液。以5％接种量接种发酵种子液到发酵培养基中培养24～32h得到发酵液，培养条件为200～250rpm，30～35℃其中发酵培养基为：8％蔗糖，，0.5％NH₄NO₃，0.08％KH₂PO₄，0.03％CaCl₂，0.016％K₂HPO₄，0.01％MgSO₄·7H₂O，0.04％FeSO₄·7H₂O，pH 5.0，500mL锥形瓶装液量为100mL。 

2.发酵液预处理：发酵液混匀，发酵液与1.5mol/L高氯酸体积比1∶2混匀，40℃水浴30～60min，4000r/min离心15min，收集上清液。 

3.离子交换吸附、洗脱：步骤b中所得上清液中加入1.5～2.5％雷氏盐，静置至完全沉淀，弃去上清液，收集沉淀物。所得沉淀物中添加1mol/L的H₂SO₄丙酮溶液，待其完全溶解后上D155树脂吸附、洗脱，洗脱层析图见图3。洗脱液添加2～5倍体积丙酮沉淀，收集沉淀冻干即得。 

由于腺苷蛋氨酸稳定性较差，在碱性或者温度大于80℃度时迅速分解，即使在常温下也易分解，需要制备成大分子盐离子形式，通过增加其空间位阻来增加其稳定性，故本发明将腺苷蛋氨酸制备为腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸盐。 

具体方法为：将上述洗脱液添加2.5g～5.0g/L对甲苯磺酸，然后添加2～5倍体积丙酮沉淀。收集沉淀冻干，得到腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸盐，低温保存。 

本发明的菌株能够高产腺苷蛋氨酸，由于该菌株具有解除产物蛋氨酸的抑制作用，具有较高的蛋氨酸生产能力，而蛋氨酸为本发明的目的产物腺苷蛋氨酸的前体物质，可以在蛋氨酸大量积累的情况下生产积累浓度较高的腺苷蛋氨酸。本菌株与其他腺苷蛋氨酸生产中的菌株相比具有代谢机理明确，菌种遗传稳定性高，培养条件稳定便于控制的优点，并且产量达到较高水平，比普通酵母菌株腺苷蛋氨酸产量要高出3～9倍，如图2所示，是腺苷蛋氨酸较为理想的生物生产方法。 

附图说明

图1SAM0238菌落形态图 

图2本发明的菌株与其他菌株腺苷蛋氨酸产量对比(其中1为啤酒酵母(CICC1922)；2为酿 酒酵母(CICC1012)；3为面包酵母(ATCC13668)；4为本发明酿酒酵母(SAM0238)；5为酿酒酒酵母(CICC1226) 

图3发酵液经破壁后D155弱酸性阳离子树脂分离纯化层析图 

图4腺苷蛋氨酸标准品高效液相图谱 

图5本发明的菌株(SAM0238)制备得到的腺苷蛋氨酸高效液相图谱 

具体实施方式

实施例1 

高产腺苷蛋氨酸菌株的筛选 

本发明的筛选方法是紫外诱变育种的筛选方法，步骤如下：制备酿酒酵母菌悬液；取3mL菌悬液至直径6cm灭菌平皿，磁力搅拌；15W、30厘米距离紫外线照射；取0.5mL紫外照射后菌液涂布至含150μg/ml乙硫氨酸的缺硫平皿斜面培养基；30℃避光培养36小时。挑选具有乙硫氨酸抗性的突变株，解除生成腺苷蛋氨酸的反馈抑制作用，摇瓶培养，检测产腺苷蛋氨酸能力，筛选出具有高产腺苷蛋氨酸能力的菌株。 

1.实验准备 

(1)配制培养基： 

摇瓶培养基：葡萄糖40g，硫酸铵15g，磷酸二氢钾9g，磷酸氢二钾3g，七水硫酸镁3g，七水硫酸亚铁0.03g，酵母膏3g，玉米浆3g，1000ml蒸馏水定容，pH 4.0-6.5，115℃灭菌20min，备用。 

斜面培养基：葡萄糖40g，硫酸铵15g，磷酸二氢钾9g，磷酸氢二钾3g，七水硫酸镁3g，七水硫酸亚铁0.03g，酵母膏3g，玉米浆3g，琼脂20g，1000ml蒸馏水定容，pH 4.0-6.5，115℃灭菌20min，备用。 

缺硫培养基：葡萄糖20.0g、尿素2.2g、K₂HPO₄ 6g、Na₂HPO₄ 2g和微量元素母液0.8ml，琼脂份15g，1000ml蒸馏水定容，pH5，115℃灭菌30min；微量元素母液中所含各组分及浓度：CoCl₂·6H₂O 0.9g/L，CuCl₂0.72g/L，ZnCl₂·7H₂O 8.2g/L，CaCl₂ 1.8g/L，NaMoO₄·2H₂O 0.9g/L，CaCl₂ 1.8g/L，NaMo₄·2H₂O 0.9g/L，FeCl₂·7H₂O 14.5g/L。 

(2)HPLC法色谱条件：C18柱(250nm×4.6mm)；流动相：0.01mol/L的甲酸铵，用甲酸将pH值调至3.0；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm：柱温：25℃；进样量：5μL。 

2.实验步骤 

(1)制备酿酒酵母菌悬液：取待筛选的酿酒酵母或酒厂发酵用的酵母经新鲜斜面活化后，转入摇瓶培养，30℃，200rpm，培养24h，再取1ml培养液转接于摇瓶培养基中，30℃，200rpm 下培养至对数生长期后，离心回收菌体，加入pH 7.0的PBS磷酸缓冲液5ml，再以无菌生理盐水稀释到100cfu/mL，制备得菌悬液； 

(2)诱变处理酿酒酵母菌：取3ml上述菌悬液至直径为6cm的灭菌平皿中，进行磁力搅拌，均匀后，用15W的紫外灯经过距离为30cm紫外照射后，取0.5ml紫外照射过的菌液涂布至含有乙硫氨酸的缺硫培养基中，30℃避光培养36h，得到具有乙硫氨酸抗性的突变株。 

(3)筛选得到高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株：分离出具有乙硫氨酸抗性的突变株并将其接入斜面培养基中，30℃培养32h，做为斜面活化种子，再将斜面活化种子接入摇瓶培养，30℃，200rpm培养至对数生长期后，转接到装液量为50mL的三角烧瓶中，再30℃，200rpm培养18小时后得到发酵液。取充分混匀后的发酵液2ml加入1.5mol/L的高氯酸4mL，40℃水浴破碎1.5h，以4000r/min离心10min，收集上清液，即菌体。用HPLC法检测上清液中腺苷蛋氨酸的含量，并筛选出高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株，保藏号为CGMCC2842，其菌落形态图见图1。经传代并将该菌株转接斜面培养基，30℃培养24小时后至4℃冰箱保存。 

上述制备方法中，标准品(购自SIGMA公司)如图4所示，峰面积与浓度关系作出标准曲线，样品在254nm的峰面积代入标准曲线换算得到腺苷蛋氨酸的含量，由本发明菌株生产得到的腺苷蛋氨酸样品HPLC图谱如图5所示，产量达到4.5g/L。 

实施例2 

腺苷蛋氨酸的制备方法 

1.发酵培养：取实施例1中筛选到的酿酒酵母菌株(SAM0238)，活化后经摇瓶培养至对数生长期，得到发酵种子液。以5％接种量接种发酵种子液到发酵培养基中培养24h得到发酵液，培养条件为220rpm，30℃，其中发酵培养基为：8％蔗糖，，0.5％NH₄NO₃，0.08％KH₂PO₄，0.03％CaCl₂，0.016％K₂HPO₄，0.01％MgSO₄·7H2O，0.04％FeSO₄·7H₂O，pH 5.0，500mL锥形瓶装液量为100mL。 

2.发酵液预处理：取混匀后的发酵液1L，发酵液与1.5mol/L高氯酸体积比1∶2混匀，40℃水浴30min，4000r/min离心15min，收集上清液。 

3.离子交换吸附、洗脱：所得上清液中加入2％雷氏盐，静置至完全沉淀，弃去上清液，收集沉淀物。所得沉淀物中添加1mol/L的H₂SO₄丙酮溶液，待其完全溶解后上D155树脂吸附、洗脱，具体过程如下： 

3.1，树脂预处理 

称取一定量的D155树脂，蒸馏水浸泡过夜，去离子水洗至澄清去水后加4倍体积 2mol/LHCl，搅拌4h，除去酸液，去离子水洗至中性，加4倍体积2mol/LNaOH溶液搅拌4h，除去碱液，去离子水洗至中性备用。 

3.2，装柱、吸附 

3.2.1将步骤1中准备好的树脂装柱后装柱前，去离子水洗平衡20min。， 

3.2.2，加入经破壁、离心处理过的含腺苷蛋氨酸的离心所得上清液(pH3.0) 

3.3，冲洗 

先2倍柱床体积去离子水冲洗，然后用2.5倍柱床体积0.1mol/L乙酸洗脱杂质。 

3.4，解吸洗脱 

用0.35moL/L硫酸进行SAM洗脱。 

4.腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸盐制备所得洗脱液添加2.5g/L对甲苯磺酸，然后添加3倍体积丙酮沉淀。收集沉淀冻干，得到腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸盐27.8g，低温保存。 

Claims (2)

1.一株高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株，其分类命名为Saccharomyces cerevisiae，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号：CGMCC No.2842。

2.一种制备腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：

a.发酵培养：取权利要求1的酿酒酵母菌株，活化后经摇瓶培养至对数生长期，得到发酵种子液，以5％接种量接种发酵种子液到发酵培养基中培养24～32h得到发酵液，培养条件为200～250rpm，30～35℃，其中发酵培养基为：8％蔗糖，0.5％NH₄NO₃，0.08％KH₂PO₄，0.03％CaCl₂，0.016％K₂HPO₄，0.01％MgSO₄·7H2O，0.04％FeSO₄·7H₂O，pH 5.0，500mL锥形瓶装液量为100mL；

b.发酵液预处理：将步骤a中制得的发酵液混匀，发酵液与1.5mol/L高氯酸体积比1：2混匀，40℃水浴30～60min，4000r/min离心15min，收集上清液；

c.离子交换吸附、洗脱：步骤b中所得上清液中加入1.5～2.5％雷氏盐，静置至完全沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，所得沉淀物中添加1mol/L的H₂SO₄丙酮溶液，待其完全溶解后上D155树脂，洗脱；洗脱液添加到2～5倍体积丙酮中沉淀，收集沉淀冻干即得。 

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