CN103333267A - 具有生物活性的浒苔硒多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有生物活性的浒苔硒多糖，其特征在于：其为一种主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和硒化基团组成的杂多糖。本发明还公开了所述浒苔硒多糖的制备方法和应用。本发明制备出高附加值的、具有生物活性的浒苔硒多糖纯品，提高多糖的含硒量，使硒和浒苔多糖的生理和药理功能得到优化，活性高于硒和浒苔多糖，更利于被机体吸收利用，变废为宝，具有良好的社会效益和经济效益，具有广阔的应用前景。

Description

具有生物活性的浒苔硒多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有生物活性的浒苔硒多糖，尤其涉及一种浒苔硒多糖的制备方法和应用，属于生物制剂技术领域。

背景技术

浒苔是一种大型绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、浒苔属。浒苔中含有较多的水溶性硫酸多糖，浒苔多糖是浒苔中所含主要活性成分之一，具有降血脂、抗疲劳、抗菌、抗病毒及增强免疫力等生物活性。在我国野生藻类中浒苔资源丰富，自然繁殖能力极强，爆发时会造成自然灾害。

由于全球气候变化、水体富营养化等原因，造成海洋大型海藻浒苔绿潮频频暴发，带来很多不良影响。大量繁殖的浒苔能遮蔽阳光，影响海底藻类的生长；大量浒苔漂浮聚集到岸边，阻塞航道；浒苔大量堆积后腐烂繁殖时需要消耗大量氧气，并散发出恶臭气味，有研究表明，浒苔分泌的化学物质很可能会对其它海洋生物造成不利影响。众所周知，2008年青岛近海海域及沿岸遭遇了突如其来、历史罕见的浒苔自然灾害，不仅严重影响景观，干扰旅游观光和水上运动，还一度对2008年夏季奥运会帆船运动员海上训练造成影响。通常，浒苔作为垃圾丢弃，处理成本增加，浪费资源，并且造成环境污染。因此，针对浒苔的研究开发利用是治理海洋环境、优化资源利用的迫切需要。

硒是人体所必需元素，能够在机体内合成含硒谷胱甘肽过氧化物酶、含硒转移核糖核酸等，具有防癌抗癌、延缓衰老、提高机体免疫力、预防和治疗心血管疾病等生物功能。据中国农科院调查表明，中国有三分之二以上地区半数人口处于缺硒、低硒带，靠日常膳食所摄入的硒量达不到最低需求量，使得与缺硒有关的疾病发病率大大提高。但硒不能由生物体自主合成，只能通过体外吸收获得。无机硒毒性大，活性和毒性范围窄，利用率较低。而有机硒毒性低、副作用小，能更好地发挥硒的生理活性。

硒多糖是硒与活性多糖键合的化合物，具有合适的稳定性和溶出性能，硒多糖不但具有无机硒的多种活性，还具有多糖的各种生理功能，使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。硒多糖的活性高于硒和多糖，更有利于被机体吸收利用，其开发利用已经引起国际的广泛关注。实验证明，硒多糖具有抗金属中毒、抗氧化、抗癌细胞和病毒、免疫调节、抗衰老等药理作用。随着社会的不断进步，人们的生活水平逐渐提高，对自身的健康越来越关注，这就迫不急待的要求更多的硒多糖药品和保健品上市。

硒多糖分布在许多动植物和微生物体内，但即使在高硒地区的富硒植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相对较低。可以通过人工方法在适宜培养条件下将无机硒添加到真菌、藻类等的培养基中，通过真菌、藻类等的生长代谢，对硒进行富集和生物转化来获得硒多糖。另外，多糖含有自由羟基、醛基或酮基等多种基团，这些基团能够与其它化合物发生特定的反应，使多糖的硒化修饰或合成成为可能。目前，国内发现或人工合成的硒多糖种类还很有限，主要有大蒜硒多糖、黄芪硒多糖、灵芝硒多糖、枸杞硒多糖等，对于浒苔硒多糖的研究尚未见报道，并且硒化多糖的结构复杂，对硒多糖化学结构的确定以及体内作用机制尚不完全清楚。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题之一是，提供一种具有生物活性的浒苔硒多糖及其制备方法，使硒和浒苔多糖的生理和药理功能得到优化，活性明显高于硒和浒苔多糖，并有利于被机体吸收利用。

为解决所述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种具有生物活性的浒苔硒多糖，其为一种主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和硒化基团组成的杂多糖；由下述方法制备：

A.提取浒苔活性粗多糖：

(1)浒苔脱脂、脱醇溶性物质：将浒苔粉碎，过孔径为0.4mm筛，然后用乙醚脱脂，干燥后得脱脂样品，再用95％乙醇回流3次，将醇不溶物烘干；

(2)酶法脱蛋白：

在制备的醇不溶物中加适量蒸馏水，调节pH至6.5，加入相当于醇不溶物质量1.5％的木瓜蛋白酶，于60℃恒温磁力搅拌器中保温2h，真空浓缩，浓缩液中加入乙醇，使其体积分数为80％，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，干燥，得粗多糖初产品；

(3)活性炭脱色：

取经脱蛋白的粗多糖初产品溶入蒸馏水中，加入溶液质量0.5％的活性炭，超声15min，过滤，浓缩，无水乙醇沉淀，离心，真空干燥，得浒苔活性粗多糖。

B.合成浒苔硒多糖：

取制备的浒苔粗多糖放入烧瓶中，加入硝酸溶液，加热搅拌溶解；然后加入亚硒酸钠，加热搅拌，反应一定时间后，冷却，过滤，离心除去沉淀，所得溶液用对流水透析，除去小分子，减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，冷冻过夜，离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤，真空冷冻干燥，得硒化浒苔粗多糖；

C.浒苔硒多糖的纯化：

将G-10凝胶置于1％氯化钠溶液中，充分浸泡两天后取出，再用1％氯化钠溶液冲洗4个柱体积至流出液无浑浊；利用Sephadex凝胶柱色谱分离出浒苔硒多糖部分，透析除去小分子物质，用1％氯化钠溶液将去离子浒苔硒多糖洗脱，收集洗脱液浓缩，醇沉，抽滤，冷冻干燥得浒苔硒多糖纯品。

将上述浒苔硒多糖用于制备保健品。

将上述浒苔硒多糖用于制备抗辐射或抑肿瘤的药物。

本发明通过真空冷冻干燥，在低温条件下对浒苔硒多糖进行干燥，以保证产品的纯度和生物活性。用硫酸-蒽酮法测定每一步产品中多糖含量；用采用考马斯亮蓝法测蛋白含量；用石墨炉原子吸收法测定硒含量。

本发明以海洋副产物浒苔为原料，开发浒苔多糖产品。利用浒苔多糖含有自由羟基、醛基或酮基等基团，制备出高附加值的、具有生物活性的浒苔硒多糖纯品，提高多糖的含硒量，不但具有无机硒的多种活性，还具有浒苔多糖的各种生理功能，使硒和浒苔多糖的生理和药理功能得到优化，活性高于硒和浒苔多糖，更利于被机体吸收利用，变废为宝。通过对浒苔硒多糖及水解片段进行体内抗S-180肉瘤活性实验和抗辐射实验等药理研究，将浒苔硒多糖用于制备保健品或抗辐射、抑肿瘤的药物。具有良好的社会效益和经济效益，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例1

提取浒苔活性粗多糖：

(1)浒苔脱脂、脱醇溶性物质：将浒苔粉碎，过孔径为0.4mm筛，然后用乙醚脱脂，干燥后得脱脂样品，再用95％乙醇回流3次，将醇不溶物烘干；

(2)酶法脱蛋白：

在制备的醇不溶物中加适量蒸馏水，调节pH至6.5，加入相当于醇不溶物质量1.5％的木瓜蛋白酶，于60℃恒温磁力搅拌器中保温2h，真空浓缩，浓缩液中加入乙醇，使其体积分数为80％，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，干燥，得粗多糖初产品；

(3)活性炭脱色：

取经脱蛋白的粗多糖初产品溶入蒸馏水中，加入溶液质量0.5％的活性炭，超声15min，过滤，浓缩，无水乙醇沉淀，离心，真空干燥，得浒苔活性粗多糖。

实施例2

合成浒苔硒多糖：

取制备的浒苔粗多糖放入烧瓶中，加入硝酸溶液，加热搅拌溶解；然后加入亚硒酸钠，加热搅拌，反应一定时间后，冷却，过滤，离心除去沉淀，所得溶液用对流水透析，除去小分子，减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，冷冻过夜，离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤，真空冷冻干燥，得硒化浒苔粗多糖。

实施例3

浒苔硒多糖的纯化：

将G-10凝胶置于1％氯化钠溶液中，充分浸泡两天后取出，再用1％氯化钠溶液冲洗4个柱体积至流出液无浑浊；利用Sephadex凝胶柱色谱分离出浒苔硒多糖部分，透析除去小分子物质，用1％氯化钠溶液将去离子浒苔硒多糖洗脱，收集洗脱液浓缩，醇沉，抽滤，冷冻干燥得浒苔硒多糖纯品。

实施例4

浒苔硒多糖的结构表征：

对实施例3制备的浒苔硒多糖进行核磁共振检测，获得氢谱的信息；取甲基化衍生物作快速原子轰击质谱(FAB-MS)；用阿尔迪醋酸酯(取样品完全水解液NaBH4室温下还原，冰醋酸中和后减压浓缩，甲醇处理多次，抽干，100℃烘15min，醋酐乙酰化，甲苯处理，减压浓缩至干，氯仿溶解，水洗涤多次，氯仿层无水硫酸钠干燥，减压浓缩)实行部分甲基化衍生，或选择性地降解，并用GC-MS检测；应用Nilsson法，进行高碘酸盐氧化反应，接着降解、甲基化，用FAB-MS检测。对样品的纯度做出估计，得到糖的组成、在糖分子中每种糖的数量及连接位置、在样品中是否存在支链、是否有的糖基具有非糖取代等信息。采用HPLC法测定浒苔硒多糖的分子量；在4000～400cm^-1范围内进行红外扫描，确定吡喃环或呋喃环形式；用糖苷酶水解、核磁共振、激光拉曼光谱等方法分析浒苔硒多糖的α、β结构。

实施例5

浒苔硒多糖的药理作用研究：

对浒苔硒多糖以及水解片段进行小鼠体内抗S-180肉瘤活性实验和抗辐射等药理实验，得到浒苔硒多糖以及水解片段的构效关系，确定活性靶点，用于制备保健品或抗辐射、抑肿瘤的药物。

本发明通过真空冷冻干燥，在低温条件下对浒苔硒多糖进行干燥，以保证产品的纯度和生物活性。用硫酸-蒽酮法测定每一步产品中多糖含量；用采用考马斯亮蓝法测蛋白含量；用石墨炉原子吸收法测定硒含量。本发明以海洋副产品浒苔为原料，通过将含硒的功能基团接枝到浒苔多糖上，制备出高附加值的、具有生物活性的浒苔硒多糖纯品。浒苔硒多糖不仅具有无机硒的多种活性，还具有浒苔多糖的各种生理功能，使硒和浒苔多糖的生理和药理功能得到优化，活性明显高于硒和浒苔多糖，并有利于被机体吸收利用。通过对浒苔硒多糖的分子量、单糖组成、链接方式、多糖基团等进行结构表征，获得浒苔硒多糖的详细结构信息；并对浒苔硒多糖及其水解片段进行小鼠体内抗S-180肉瘤活性实验和抗辐射实验等临床前药理研究，探讨其构效关系，为浒苔硒多糖的临床试验提供科学依据。具有良好的社会效益和经济效益，具有广阔的应用前景。

Claims (4)

1.一种具有生物活性的浒苔硒多糖，其特征在于：其为一种主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和硒化基团组成的杂多糖；由下述方法制备：

A.制备浒苔活性粗多糖：

(1)浒苔脱脂、脱醇溶性物质：将浒苔粉碎，过孔径为0.4mm筛，然后用乙醚脱脂，干燥后得脱脂样品，再用95％乙醇回流3次，将醇不溶物烘干；

(2)酶法脱蛋白：

在制备的醇不溶物中加适量蒸馏水，调节pH至6.5，加入相当于醇不溶物质量1.5％的木瓜蛋白酶，于60℃恒温磁力搅拌器中保温2h，真空浓缩，浓缩液中加入乙醇，使其体积分数为80％，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，干燥，得粗多糖初产品；

(3)活性炭脱色：

取经脱蛋白的粗多糖初产品溶入蒸馏水中，加入溶液质量0.5％的活性炭，超声15min，过滤，浓缩，无水乙醇沉淀，离心，真空干燥，得浒苔活性粗多糖；

B.合成浒苔硒多糖：

取制备的浒苔粗多糖放入烧瓶中，加入硝酸溶液，加热搅拌溶解；然后加入亚硒酸钠，加热搅拌，反应一定时间后，冷却，过滤，离心除去沉淀，所得溶液用对流水透析，除去小分子，减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，冷冻过夜，离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤，真空冷冻干燥，得硒化浒苔粗多糖；

C.浒苔硒多糖的纯化：

将G-10凝胶置于1％氯化钠溶液中，充分浸泡两天后取出，再用1％氯化钠溶液冲洗4个柱体积至流出液无浑浊；利用Sephadex凝胶柱色谱分离出浒苔硒多糖部分，透析除去小分子物质，用1％氯化钠溶液将去离子浒苔硒多糖洗脱，收集洗脱液浓缩，醇沉，抽滤，冷冻干燥得浒苔硒多糖纯品。

2.一种权利要求1所述浒苔硒多糖的制备方法，包括下列内容：

A.提取浒苔活性粗多糖：

(1)浒苔脱脂、脱醇溶性物质：将浒苔粉碎，过孔径为0.4mm筛，然后用乙醚脱脂，干燥后得脱脂样品，再用95％乙醇回流3次，将醇不溶物烘干；

(2)酶法脱蛋白：

在制备的醇不溶物中加适量蒸馏水，调节pH至6.5，加入相当于醇不溶物质量1.5％的木瓜蛋白酶，于60℃恒温磁力搅拌器中保温2h，真空浓缩，浓缩液中加入乙醇，使其体积分数为80％，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，干燥，得粗多糖初产品；

(3)活性炭脱色：

取经脱蛋白的粗多糖初产品溶入蒸馏水中，加入溶液质量0.5％的活性炭，超声15min，过滤，浓缩，无水乙醇沉淀，离心，真空干燥，得浒苔活性粗多糖；

B.合成浒苔硒多糖：

取制备的浒苔粗多糖放入烧瓶中，加入硝酸溶液，加热搅拌溶解；然后加入亚硒酸钠，加热搅拌，反应一定时间后，冷却，过滤，离心除去沉淀，所得溶液用对流水透析，除去小分子，减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，冷冻过夜，离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤，真空冷冻干燥，得硒化浒苔粗多糖；

C.浒苔硒多糖的纯化：

将G-10凝胶置于1％氯化钠溶液中，充分浸泡两天后取出，再用1％氯化钠溶液冲洗4个柱体积至流出液无浑浊；利用Sephadex凝胶柱色谱分离出浒苔硒多糖部分，透析除去小分子物质，用1％氯化钠溶液将去离子浒苔硒多糖洗脱，收集洗脱液浓缩，醇沉，抽滤，冷冻干燥得浒苔硒多糖纯品。

3.将权利要求1所述浒苔硒多糖用于制备抗辐射或抑肿瘤的药物。

4.将权利要求1所述浒苔硒多糖用于制备保健品。