CN111848360A - 一种浒苔中活性成分的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种浒苔中活性成分的制备方法，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化，采用高速逆流色谱进行分离纯化的步骤为，先采用在线收集模式获得按先后顺序获得组分I、组分II、组分III、组分IV、组分V、组分VI，再采用循环逆流色谱模式对组分I分离至少6次获得化合物3，采用循环逆流色谱模式对组分I分离至少5次，按照先后顺序依次获得化合物4、化合物1和化合物2。本发明提供的方法能够从浒苔中分离制备出多酚类化合物。

Description

一种浒苔中活性成分的制备方法
技术领域
本发明涉及浒苔有效成分的高效制备方法，具体涉及一种浒苔中活性成分的制备方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
浒苔属(Enteromorpha)，隶属绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)，藻体鲜绿色，细胞壁为单层细胞，围成中空管，细胞单核，片状叶绿体；广泛分布在海洋水体中，资源丰富，富含多糖、蛋白质、维生素、微量元素等，可用于食用、药用和饲料等。近年来，我国黄海海域连续多年发生绿潮灾害。自2007年来，以浒苔为主的绿潮暴发性的增殖、聚集、形成大规模灾害。造成海洋水体缺氧、鱼虾死亡，给生态环境带来直接和间接的经济损失。可为浒苔的经济价值和营养价值作进一步地探索。浒苔中活性成分的分离技术并不完善，传统技术具有效率低、耗时长、成本高的缺点。现如今，急需一种高效的技术应用于分离。
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前HSCCC技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术，适合于中小分子类物质的分离纯化。因此，浒苔中活性成分的分离结合高速逆流色谱技术具有广阔的发展前景。
然而经过发明人研究发现，浒苔中含有多种多酚类活性成分，采用高速逆流色谱不仅难以对多酚类活性成分进行检测，而且难以对其中的多酚类活性成分进行分离制备。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种浒苔中活性成分的制备方法，该方法能够从浒苔中分离制备出多酚类化合物。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种浒苔中活性成分的制备方法，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化，采用高速逆流色谱进行分离纯化的步骤为，先采用在线收集模式获得按先后顺序获得组分I、组分II、组分III、组分IV、组分V、组分VI，再采用循环逆流色谱模式对组分I分离至少6次获得化合物3，采用循环逆流色谱模式对组分III分离至少5次，按照先后顺序依次获得化合物4、化合物1和化合物2；组分II为化合物4，组分IV为化合物5，组分V为化合物6，组分VI为化合物7；
其中，高速逆流色谱的溶剂体系为由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按组成，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为1:8.5～9.5:0.9～1.1:8.5～9.5；
化合物1为对苯二酚，化合物2为没食子酸，化合物3为没食子儿茶素，化合物4为咖啡因，化合物5为(-)-表儿茶素，化合物6为(-)-表儿茶素没食子酸酯，化合物7为表儿茶素没食子酸酯。
经过试验发现，当采用本发明的溶剂体系时，能够对条浒苔的多酚类活性成分进行更好的分离，然而，仅采用溶剂体系进行难以对条浒苔的多酚类活性成分进行完全分离，因而本发明采用在线收集模式和循环逆流色谱模式组合的方式，实现对浒苔中活性成分的完全分离，从而实现对浒苔中活性成分的分离制备。
本发明的有益效果为：
本发明通过溶剂体系的选择，实现对条浒苔的多酚类活性成分的初步分离，再通过在线收集模式和循环逆流色谱模式组合实现浒苔中活性成分的完全分离，本发明的制备方法的成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从条浒苔中分离制备出纯度较高的多酚类单体化合物。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中条浒苔活性成分结构图；
图2为本发明实施例1条浒苔粗品分离的高速逆流色谱图；
图3为本发明实施例1条浒苔循环高速逆流色谱检测图，A为循环逆流模式检测的系统结构图，B为组分I的高速逆流色谱图，C为组分III的高速逆流色谱图；
图4为本发明实施例1条浒苔粗品与逆流各部分的高效液相色谱图，A为条浒苔乙酸乙酯粗提物，B为组分I，C为组分III，D为对苯二酚，E为没食子酸，F为没食子儿茶素，G为咖啡因，H为(-)-表儿茶素，I为(-)-表儿茶素没食子酸酯，G为表儿茶素没食子酸酯；
图5为本发明实施例2的逆流色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有技术难以对浒苔中的多酚类活性成分进行分离制备，本发明提出了一种浒苔中活性成分的制备方法。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种浒苔中活性成分的制备方法，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化，采用高速逆流色谱进行分离纯化的步骤为，先采用在线收集模式获得按先后顺序获得组分I、组分II、组分III、组分IV、组分V、组分VI，再采用循环逆流色谱模式对组分I分离至少6次获得化合物3，采用循环逆流色谱模式对组分III分离至少5次，按照先后顺序依次获得化合物4、化合物1和化合物2；组分II为化合物4，组分IV为化合物5，组分V为化合物6，组分VI为化合物7；
其中，高速逆流色谱的溶剂体系为由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按组成，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为1:8.5～9.5:0.9～1.1:8.5～9.5；
化合物1为对苯二酚，化合物2为没食子酸，化合物3为没食子儿茶素，化合物4为咖啡因，化合物5为(-)-表儿茶素，化合物6为(-)-表儿茶素没食子酸酯，化合物7为表儿茶素没食子酸酯。
经过试验发现，当采用本发明的溶剂体系时，能够对条浒苔的多酚类活性成分进行更好的分离，然而，仅采用溶剂体系进行难以对条浒苔的多酚类活性成分进行完全分离，因而本发明采用在线收集模式和循环逆流色谱模式组合的方式，实现对浒苔中活性成分的完全分离，从而实现对浒苔中活性成分的分离制备。
该实施方式的一些实施例中，条浒苔的醇提物采用体积分数为55～65％的乙醇进行提取。
在一种或多种实施例中，条浒苔的醇提物的提取过程为，将条浒苔粉末用55～65％的乙醇回流提取2～4次，每次2～4天，提取后过滤，再浓缩至无醇味获得条浒苔的醇提物。
该实施方式的一些实施例中，溶剂体系中，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水混合均匀后静置分层，获得上相溶剂和下相溶剂，将条浒苔提取物分别添加至上相溶剂和下相溶剂进行在线收集模式的分离。
在一种或多种实施例中，条浒苔提取物、上相溶剂和下相溶剂的添加比为35～45:0.9～1.1:1，mg：mL：mL。
在一种或多种实施例中，高速逆流色谱仪柱体积为250～350mL，上样量150～250mg，转速700～900转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速1.5～2.5mL/min，检测波长254±2nm。
该实施方式的一些实施例中，在线收集模式的进样过程为：采用高速逆流色谱仪的进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达700～900转/min时，设置流动相流速为1.5～2.5mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收组分I-VI。
该实施方式的一些实施例中，采用高效液相色谱对各步骤中产物进行分析。
在一种或多种实施例中，高效液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，紫外检测波长280±2nm，流速：0.5～1.5mL/min，进样量：5～15μL，流动相A相为乙腈，流动相B相为0.2％甲酸溶液。
在一种或多种实施例中，梯度条件为：0min，10％A；0–10min，10-40％A；10–20min，40-55％A。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1.样品的提取。
将干燥条浒苔(1kg)完全粉碎成粉末，用3L 60％乙醇回流提取3次，每次3d，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液并浓缩至无醇味，然后使用等量的乙酸乙酯萃取浓缩物。乙酸乙酯部分在55℃下旋转蒸发至干，得到10g粗样品，将其储存在4℃的冰箱中进行进一步的HSCCC纯化。
2.应用高速逆流色谱分离纯化条浒苔中多酚类化合物。
对于HSCCC分离，合适的两相溶剂体系是至关重要的条件，需要适当的分配系数以及良好的样品溶解度。较高的K值可能导致洗脱时间延长时间和过度宽的峰值，而较低的K值可能导致较差的峰值分辨率。
如表1所示。选择了一系列正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水和乙酸乙酯/正丁醇/水的溶剂体系。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(2:8:2:8和3:7:3:7，v/v)混合时，目标化合物的K值明显小于0.1。乙酸乙酯/正丁醇/水(0:1:1，v/v)时，目标化合物的K值明显大于10。因此，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1:9:1:9，v/v)是分离条浒苔多酚最合适的溶剂体系。
表1条浒苔K值结果
Figure BDA0002638386770000051
本实施例中，使用一次HSCCC结合循环HSCCC分离方法，从条浒苔的的乙酸乙酯提取物中成功分离出7种多酚类化合物。在第一步HSCCC分离中，两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:9:1:9，v/v)，成功分离化合物4-7，组分II为化合物4，组分IV为化合物5，组分V为化合物6，组分VI为化合物7。在该步骤中，组分I和组分III中存在化合物1-3分离不彻底的问题，其中，组分III和组分II挨得较近，组分II在组分III前面，收集的时候组分III中会有组分II的残余，导致少量化合物4存在于组分III中，没有实现完全分离。第二步中，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:9:1:9，v/v)作为溶剂系统纯化的化合物1-3。通过ESI-MS和NMR鉴定了7种化合物的化学结构。高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量200mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：
(1)将两相溶剂体系正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1:9:1:9，v/v)按比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取200mg粗品，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。采用高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收图2中组分I-VI；其中，组分I的接收时间为40～50min，组分II的接收时间为60～80min，组分III的接收时间为80～100min，组分IV的接收时间为105～115min，组分V的接收时间为120～160min，组分VI的接收时间为290～340min。
(2)将组分I-VI分别旋蒸成固体。
(3)将组分I的旋蒸成固体进行循环逆流，当收集完毕后，见图3B，组分I经过第6次分离，成功分离得到化合物3，化合物3的接收时间为580～640min。
(4)对组分III的旋蒸成固体进行循环逆流色谱分离，见图3C，经过第5次分离得到化合物1、化合物2和化合物4，其中，化合物4的接收时间为670～730min，化合物1的接收时间为730～780min，化合物2的接收时间为780min～840min。
经过两步HSCCC分离后共得6个多酚类化合物和1个咖啡因分别为：对苯二酚(0.56mg)；没食子酸(3.86mg)；儿茶素(5.8mg)；咖啡因(14.31mg)；(-)-表儿茶素(10.5mg)；(-)-表儿茶素没食子酸酯(98.26mg)；表儿茶素没食子酸酯(29.9mg)，见图4。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：waters-RP C18柱(4.6×250mm)，紫外检测波长280nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，流动相采用乙腈(A)和0.2％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0min，10％A；0–10min，10–40％A；10–20min，40-55％A。
结构鉴定：对分离得到的多酚应用Agilent 5973N质谱仪和Varian 600MHz核磁共振波谱仪分别进行MS、NMR谱的测定，所得数据如下：
峰1(化合物1)：ESI-MS(negative ion mode)m/z:109.0402.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:7.03(4H,s,H-2,H-3,H-5,H-6).13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:110.2(4CH,C-2,C-3,C-5,C-6),146.2(2C-OH,C-1,C-4).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为对苯二酚。
峰2(化合物2):ESI-MS(negative ion mode)m/z:169.0266.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:7.05(2H,s,H-2,H-6).13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:110.3(2CH,C-2,C-6),122.3(C-1),139.5(C-OH,C-4),146.4(2C-OH,C-3,C-5),170.6(COOH,C-7).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为没食子酸。
峰3(化合物3):ESI-MS(negative ion mode)m/z:305.0540.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:2.83(1H,dd,J＝4.51,16.74Hz,H-4),2.71(1H,dd,J＝2.62,16.72Hz,H-4),4.16(1H,br s,H-3),4.75(1H,br s,H-2),5.91(1H,d,J＝2.02Hz,H-8),5.94(1H,d,J＝1.86Hz,H-6),6.51(2H,s,H-2',6').13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:27.7(CH2,C-4),66.1(CH,C-3),78.4(CH,C-2),94.5(CH,C-3),95.0(CH,C-3),98.7(C-4a),105.6(CH,C-2',6'),130.1(C-1'),132.2(C-4'),145.2(C-3',5'),155.9(C-8a),156.2(C-7),156.5(C-5).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为没食子儿茶素。
峰4(化合物4):ESI-MS(positive ion mode)m/z:195.0774.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:3.33(1H,s,H-1),3.38(1H,s,H-3),3.96(1H,s,H-7),7.85(1H,s,H-6).13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:28.2(CH3,C-N1),30.1(CH,C-N3),33.9(CH,C-N7),108.8(C,C-8),144.0(CH,C-6),149.9(C-4),153.3(C-2),156.7(C-9).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为咖啡因。
峰5(化合物5):ESI-MS(negative ion mode)m/z:289.0605.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:2.84(1H,dd,J＝4.51,16.79Hz,H-4α),2.71(1H,dd,J＝2.47,16.79Hz,H-4β),4.17(1H,m,H-3),4.81(1H,br s,H-2),5.94(1H,d,J＝2.01Hz,H-8),5.91(1H,d,J＝2.06Hz,H-6),6.76(1H,d,J＝8.14Hz,H-5'),6.97(1H,d,J＝1.06Hz,H-2'),6.78(1H,dd,J＝8.24,1.22Hz,H-6').13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:29.2(CH2,C-4),67.5(CH,C-3),79.9(CH,C-2),95.9(CH,C-8),96.4(CH,C-6),100.1(C-4a),115.3(CH,C-5'),115.9(C-2'),119.4(C-6'),132.3(C-1'),145.80(C-4'),145.96(C-3'),157.39(C-8a),157.68(C-7),158.0(C-5).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为(-)-表儿茶素。
峰6(化合物6):ESI-MS(negative ion mode)m/z:457.3305.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:6.99(2H,s,H-2”,6”),6.56(2H,s,H-2',6'),6.02(2H,s,H-6,H-8),5.53(1H,brs,H-3),4.99(1H,br s,H-2),3.03(1H,dd,J＝4.46,17.45Hz,H-4α),2.91(1H,dd,J＝1.34,15.92Hz,H-4β).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:25.6(CH2,C-4),67.9(CH,C-3),76.4(CH,C-2),95.4(CH,C-6),94.2(CH,C-8),97.3(C-4a),105.4(CH,C-2',6'),108.6(CH,C-2”,6”),119.2(C-1”),128.5(C-1'),132.3(C-4'),138.4(C-4”),145.3(C-3”,5”),145.5(C-3',5'),155.5(C-5),156.4(C-7),156.4(C-8a),165.1(C-7”).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为(-)-表儿茶素没食子酸酯。
峰7(化合物7):ESI-MS(negative ion mode)m/z:441.3305.1H-NMR(MeOH-d4,400MHz)δ:3.01(1H,dd,J＝4.51,17.43Hz,H-4α),2.87(1H,dd,J＝1.17,17.25Hz,H-4β),5.52(1H,s,H-3),5.02(1H,s,H-2),5.96(2H,s,H-6,H-8),6.95(2H,s,H-2”,6”),6.93(1H,d,J＝1.35Hz,H-2'),6.68(1H,d,J＝8.17Hz,H-5'),6.80(1H,dd,J＝8.20,1.31Hz,H-6').13C-NMR(MeOH-d4,100MHz)δ:26.8(CH2,C-4),70.0(CH,C-3),78.6(CH,C-2),95.9(CH,C-6),96.6(CH,C-8),99.4(C-4a),110.2(CH,C-2”,6”),115.1(C-2'),116.0(CH,C-5'),119.4(CH,C-6'),121.4(C-1”),131.5(C-1'),139.8(C-4”),146.0(C-3',4'),146.3(C-3”,5”),157.3(C-8a),157.8(C-5),157.9(C-7),167.6(C-7”).对照MS、1H和13C NMR数据鉴定为表儿茶素没食子酸酯。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，逆流色谱选择乙酸乙酯/水(1:1，v/v)溶剂系统，其余步骤和实施例1相同，结果如图5所示。
由图5可以看出，将溶剂系统的比例发生了改变或者溶剂系统的组分发生改变，都会导致各有效成分之间不能分离。发明人通过实验发现只有本发明的实验条件才能将多酚类单体很好的分离出来。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，对条浒苔的醇提物进行乙酸乙酯萃取获得条浒苔提取物，对条浒苔提取物高速逆流色谱进行分离纯化，采用高速逆流色谱进行分离纯化的步骤为，先采用在线收集模式获得按先后顺序获得组分I、组分II、组分III、组分IV、组分V、组分VI，再采用循环逆流色谱模式对组分I分离至少6次获得化合物3，采用循环逆流色谱模式对组分I分离至少5次，按照先后顺序依次获得化合物4、化合物1和化合物2；组分II为化合物4，组分IV为化合物5，组分V为化合物6，组分VI为化合物7；
其中，高速逆流色谱的溶剂体系为由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按组成，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为1:8.5～9.5:0.9～1.1:8.5～9.5；
化合物1为对苯二酚，化合物2为没食子酸，化合物3为没食子儿茶素，化合物4为咖啡因，化合物5为(-)-表儿茶素，化合物6为(-)-表儿茶素没食子酸酯，化合物7为表儿茶素没食子酸酯。
2.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，条浒苔的醇提物采用体积分数为55～65％的乙醇进行提取。
3.如权利要求2所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，条条浒苔的醇提物的提取过程为，将条浒苔粉末用55～65％的乙醇回流提取2～4次，每次2～4天，提取后过滤，再浓缩至无醇味获得条浒苔的醇提物。
4.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，溶剂体系中，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水混合均匀后静置分层，获得上相溶剂和下相溶剂，将条浒苔提取物分别添加至上相溶剂和下相溶剂进行在线收集模式的分离。
5.如权利要求4所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，条浒苔提取物、上相溶剂和下相溶剂的添加比为35～45:0.9～1.1:1，mg：mL：mL。
6.如权利要求4所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，高速逆流色谱仪柱体积为250～350mL，上样量150～250mg，转速700～900转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速1.5～2.5mL/min，检测波长254±2nm。
7.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，在线收集模式的进样过程为：采用高速逆流色谱仪的进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达700～900转/min时，设置流动相流速为1.5～2.5mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收组分I-VI。
8.如权利要求1所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，采用高效液相色谱对各步骤中产物进行分析。
9.如权利要求8所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，高效液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，紫外检测波长280±2nm，流速：0.5～1.5mL/min，进样量：5～15μL，流动相A相为乙腈，流动相B相为0.2％甲酸溶液。
10.如权利要求9所述的浒苔中活性成分的制备方法，其特征是，梯度条件为：0min，10％A；0–10min，10–40％A；10–20min，40-55％A。
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