CN108892698A - 一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法 - Google Patents

一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108892698A
CN108892698A CN201810517904.XA CN201810517904A CN108892698A CN 108892698 A CN108892698 A CN 108892698A CN 201810517904 A CN201810517904 A CN 201810517904A CN 108892698 A CN108892698 A CN 108892698A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fructus aurantii
high speed
adverse current
phase
current chromatogram
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810517904.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108892698B (zh
Inventor
唐其
陆英
程辟
郑亚杰
刘薇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Agricultural University
Original Assignee
Hunan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University filed Critical Hunan Agricultural University
Priority to CN201810517904.XA priority Critical patent/CN108892698B/zh
Publication of CN108892698A publication Critical patent/CN108892698A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108892698B publication Critical patent/CN108892698B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/18—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted otherwise than in position 3 or 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/28—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only
    • C07D311/30—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only not hydrogenated in the hetero ring, e.g. flavones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/40—Separation, e.g. from natural material; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Abstract

本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，具体包括如下步骤：制备枳壳粗提取液、初步纯化、分离纯化黄酮类化合物、分离纯化香豆素类化合物。本发明利用高速逆流色谱技术从中药枳壳中分离、提纯得到五种黄酮类化合物和三种香豆素类化合物，并且得到的功能成分纯度高，有利于对中药枳壳的进一步研究；并且，本发明公开的分离、提纯方法简单，重复性好，可用于化合物的大量制备，具有优异的发展前景。

Description

一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法
技术领域
本发明涉及天然产物活性成分的分离纯化技术领域，具体为一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法。
背景技术
枳壳(Fructusaurantii)是芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL)及其栽培变种的干燥未成熟果实,味苦、辛、酸，性微寒，归脾胃经，主治胸肋气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停及胃下垂等，是一种常用中药。现代研究表明，枳壳中主要含有黄酮类、香豆素、挥发油和少量生物碱等功能成分，是中药药效的物质基础，准确全面测定其含量是质量控制的关键。因此，如何快速、高效、稳定地从枳壳中分离出功能成分是枳壳现代化研究及质量控制的关键。
高速逆流色谱法是一种近年来快速发展的、连续高效的液液分配色谱技术，已在生物、医药、食品、材料等领域得到广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域倍受重视。
目前，本领域技术人员采用该技术从芸香科的不同植物中分离得到多个化合物。如“高速逆流色谱法分离制备化橘红中的柚皮苷、橙皮内酯水合物和异橙皮内酯.药物分析杂志，2011,31(5):831-834.”中公开了分别采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水作为溶剂体系，从化橘红的石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物中分离得到异橙皮内酯、橙皮内酯水合物和柚皮苷；“高速逆流色谱分离制备陈皮中的黄酮类化合物.2009,2(27):244-247”中公开了采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，从陈皮醇提取物中分离得到橙皮苷、桔皮素和5-羟基-6,7,8,3’，4’-五甲氧基黄酮；“高速逆流色谱分离制备广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的研究.中草药,2010,1(41)：52-55.”中公开了采用石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，从广陈皮乙酸乙酯萃取物中分离得到川陈皮素、3,5,6,7,8,3’，4’-七甲氧基黄酮及桔皮素；“高速逆流色谱分离制备橘皮中多甲氧基黄酮.中国食品学报,2015,6(15):117-122.”中公开了采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，从橘皮石油醚提取物中分离得到川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、橘红素和5-去甲基川陈皮素。但是，目前本领域技术人员从中药枳壳中仅获得四种黄酮类化合物如柚皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和桔皮素，一种香豆素类化合物即水合橘皮内酯，对于枳壳中含有的功能成分没有进行完全的分离提纯，从而对于枳壳的进一步研究造成了限制。
因此，提供一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，以实现从枳壳中分离得到更多的功能成分的技术效果，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，以实现从枳壳中分离得到更多黄酮类化合物以及香豆素类化合物的技术效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备枳壳粗提取液：由枳壳经过粉碎、乙醇浸提、减压浓缩制备得到枳壳粗提取液；
(2)初步纯化：利用大孔吸附树脂柱依次使用去离子水、质量浓度为70％的乙醇洗脱液和质量浓度为95％的乙醇洗脱液，对由步骤(1)制备得到的枳壳粗提取液进行洗脱处理，制备得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物；
(3)分离纯化70％乙醇洗脱物：利用高速逆流色谱对由步骤(2)制备得到的70％乙醇洗脱物进行分离提纯，得到三种黄酮类化合物和一种香豆素类化合物；
(4)分离纯化95％乙醇洗脱物：利用高速逆流色谱对由步骤(2)制备得到的95％乙醇洗脱物进行分离提纯，得到两种黄酮类化合物和三种香豆素类化合物。
本发明利用高速逆流色谱技术从中药枳壳中分离、提纯得到五种黄酮类化合物和三种香豆素类化合物，并且得到的功能成分纯度高，有利于对中药枳壳进行进一步的研究；并且，本发明公开的分离、提纯方法简单，重复性好，可用于化合物的大量制备，具有优异的发展前景。
优选的，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
①将枳壳经过粉碎后，备用；
②向上述枳壳中加入4～6质量倍数的乙醇，于常温避光条件下浸提12-24h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤渣和滤液备用；
③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；
④将步骤③中得到的合并后滤液，在45～55℃条件下减压浓缩，得到枳壳粗提液。
优选的，所述步骤②中乙醇的质量浓度为60～80％。
优选的，所述步骤④中得到的枳壳粗提取液与初始枳壳的质量比为1～2:1。
在本发明公开的制备枳壳粗提取液的方法中，通过枳壳、乙醇溶剂的相互配合提高提取效果，同时通过提取温度、提取次数的相互配合实现提高提取速度的效果。
优选的，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
(a)量取500～800mLD101大孔吸附树脂，装柱备用；
(b)取上述步骤(1)中制备得到的枳壳粗提液，先使用盐酸调节pH值至2～3；再以2～3BV/h流速上样，上样完成后静置20～40min；
(c)接着依次使用5～8BV水、8～10BV质量浓度为70％的乙醇和5～8BV质量浓度为95％的乙醇按照2～4BV/h流速进行洗脱处理；分别收集70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液；
(d)分别对步骤(c)中收集到的70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液进行减压浓缩和冷冻干燥处理，得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物。
本发明公开的初步纯化步骤，通过大孔吸附树脂、上样流速、粗提取液的酸碱度以及洗脱液的用量和浓度的相互配合，实现快速、高效的对枳壳粗提取液进行初步纯化的效果。
优选的，所述步骤(3)具体包括如下步骤:
(A)按照体积比为1:3:1.8:1:5分别量取正已烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
(B)设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
(C)以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.8～2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将80～120mg的70％乙醇洗脱物用20ml下相溶解，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
(D)在200～220min停泵，然后换上相作为流动相继续按照1.8～2mL/min流速洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
(E)将收集的流出液，经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到粉末状的新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、橙皮内酯。
优选的，所述步骤(C)中流速为1.8mL/min，所述步骤(D)中流速为1.8mL/min。
本发明采用的溶剂体系能够用于高速逆流色谱分离，提高分离效率和分离效果。并且，在分离过程中先将下相作为流动相，可以保证分离出多种化合物；在200～220min将上相换作流动相注入高速逆流色谱分离体系，实现反向洗脱，可以将正向洗脱时未能流出的化合物洗脱出来，同时也可以加快分离的速度，节省时间和成本。
优选的，所述步骤(4)具体包括如下步骤:
a、按照体积比为2:0.6:1:3量取正已烷、正丁醇、乙醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气后，得到上相和下相；所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
c、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.7～2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将100～150mg的95％乙醇洗脱物使用10ml上相和10ml下相组成的混合溶剂溶解，继续按照1.7～2mL/min流速进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
d、在320～340min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
e、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，分别得粉末状的橙皮内酯、水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯和桔皮素。
优选的，所述步骤c中流速为2mL/min，所述步骤d中流速为2mL/min。
本发明采用的溶剂体系能够用于高速逆流色谱分离，提高分离效率和分离效果。并且，在分离过程中先将下相作为流动相，可以保证分离出多种化合物；在320～340min将上相换作流动相注入高速逆流色谱分离体系，实现反向洗脱，可以将正向洗脱时未能流出的化合物洗脱出来，同时也可以加快分离的速度，节省时间和成本。
优选的，所述步骤(4)中还包括对川陈皮素进行第二次高速逆流色谱分离，具体包括如下操作步骤：
A、按照体积比为2:0.6:1:3分别量取正已烷、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂先混合均匀，再静置过夜，两相分离后再进行超声脱气，得到上相和下相；所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
C、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将步骤e中得到的粉末状川陈皮素使用40mL下相溶解形成样品溶液，取其中的20mL进行第一次进样，进样后采集高速逆流色谱图；
D、在140～160min将剩余的20mL样品溶液进行第二次进样，继续采集高速逆流色谱图，并根据峰形分段收集流出液；
E、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，得到粉末状的川陈皮素。
本发明通过对川陈皮素进行第二次高效液相色谱分离，可以提高川陈皮素的纯度，从而可以为进一步活性研究及质量控制提供物质基础。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，分离、提纯得到新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、桔皮素、川陈皮素、橙皮内酯、水合橙皮内酯和异橙皮内酯；并且，本发明分离、提纯得到的各种化合物其纯度相对较高，为枳壳的进一步活性研究及质量控制提供物质基础。并且，本发明提供的分离、提纯方法简单、高效，可重复性好，能够用于化合物的大量制备，具有优异的发展前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
附图1为实施例4分离纯化70％乙醇洗脱物的高速逆流色谱图；
附图2为实施例4分离纯化95％乙醇洗脱物的高速逆流色谱图；
附图3为实施例4分离纯化川陈皮素的高速逆流色谱图；
附图4为分离得到的新橙皮苷的高效液相色谱图；
附图5为分离得到的柚皮苷的高效液相色谱图；
附图6为分离得到的枸桔苷的高效液相色谱图；
附图7为分离得到的橙皮内酯的高效液相色谱图；
附图8为分离得到的水合橙皮内酯的高效液相色谱图；
附图9为分离得到的川陈皮素的高效液相色谱图；
附图10为分离得到的异橙皮内酯的高效液相色谱图；
附图11为分离得到的桔皮素的高效液相色谱图；
附图12为分离得到的橙皮内酯的高效液相色谱图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例1公开了一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)制备枳壳粗提取液
①将枳壳经过粉碎后，备用；
②向上述枳壳中加入4质量倍数的质量浓度为60％乙醇，于常温避光条件下浸提24h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤渣和滤液备用；
③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；
④将步骤③中得到的合并后滤液，在45℃条件下减压浓缩，得到枳壳粗提液。
(2)初步纯化
(a)量取500mLD101大孔吸附树脂，装柱备用；
(b)取上述步骤(1)中制备得到的枳壳粗提液，先使用盐酸调节pH值至2；再以2BV/h流速上样，上样完成后静置20min；
(c)接着依次使用5BV水、8BV质量浓度为70％的乙醇和5BV质量浓度为95％的乙醇按照2BV/h流速进行洗脱处理；分别收集70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液；
(d)分别对步骤(c)中收集到的70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液进行减压浓缩和冷冻干燥处理，得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物。
(3)分离纯化70％乙醇洗脱物
(A)按照体积比为1:3:1.8:1:5分别量取正已烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
(B)设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20℃，检测器的检测波长为280nm；
(C)以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.8mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将80mg的70％乙醇洗脱物用20ml下相溶解后，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
(D)在200min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
(E)将收集的流出液，经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到粉末状的新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、橙皮内酯。
(4)分离纯化95％乙醇洗脱物
a、按照体积比为2:0.6:1:3量取正已烷、正丁醇、乙醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气后，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800rpm/min，恒温器温度为20℃，检测器的检测波长为280nm；
c、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.7mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将100mg的95％乙醇洗脱物使用10ml上相和10ml下相组成的混合溶剂溶解，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
d、在320min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
e、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，分别得粉末状的橙皮内酯、水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯和桔皮素。
为了进一步的优化技术方案，步骤(4)中还包括对川陈皮素进行第二次高速逆流色谱分离，具体包括如下操作步骤：
A、按照体积比为2:0.6:1:3分别量取正已烷、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂先混合均匀，再静置过夜，两相分离后再进行超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800rpm/min，恒温器温度为20℃，检测器的检测波长为280nm；
C、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将步骤e中得到的粉末状川陈皮素使用40mL下相溶解形成样品溶液，取其中的20mL进行第一次进样，进样后采集高速逆流色谱图；
D、在140min将剩余的20mL样品溶液进行第二次进样，继续采集高速逆流色谱图，并根据峰形分段收集流出液；
E、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，得到粉末状的川陈皮素。
实施例2
一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)制备枳壳粗提取液
①将枳壳经过粉碎后，备用；
②向上述枳壳中加入6质量倍数的质量浓度为80％乙醇，于常温避光条件下浸提12h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤渣和滤液备用；
③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；
④将步骤③中得到的合并后滤液，在55℃条件下减压浓缩，得到枳壳粗提液。
(2)初步纯化
(a)量取800mLD101大孔吸附树脂，装柱备用；
(b)取上述步骤(1)中制备得到的枳壳粗提液，先使用盐酸调节pH值至3；再以3BV/h流速上样，上样完成后静置40min；
(c)接着依次使用8BV水、10BV质量浓度为70％的乙醇和8BV质量浓度为95％的乙醇按照4BV/h流速进行洗脱处理；分别收集70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液；
(d)分别对步骤(c)中收集到的70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液进行减压浓缩和冷冻干燥处理，得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物。
(3)分离纯化70％乙醇洗脱物
(A)按照体积比为1:3:1.8:1:5分别量取正已烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
(B)设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为900rpm/min，恒温器温度为25℃，检测器的检测波长为280nm；
(C)以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将120mg的70％乙醇洗脱物用20ml下相溶解后，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
(D)在220min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
(E)将收集的流出液，经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到粉末状的新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、橙皮内酯。
(4)分离纯化95％乙醇洗脱物
a、按照体积比为2:0.6:1:3量取正已烷、正丁醇、乙醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气后，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为900rpm/min，恒温器温度为25℃，检测器的检测波长为280nm；
c、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入至两相平衡；然后，将150mg的95％乙醇洗脱物使用10ml上相和10ml下相组成的混合溶剂溶解，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
d、在340min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
e、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，分别得粉末状的橙皮内酯、水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯和桔皮素。
为了进一步的优化技术方案，步骤(4)中还包括对川陈皮素进行第二次高速逆流谱分离，具体包括如下操作步骤：
A、按照体积比为2:0.6:1:3分别量取正已烷、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂先混合均匀，再静置过夜，两相分离后再进行超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为900rpm/min，恒温器温度为25℃，检测器的检测波长为280nm；
C、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入至两相平衡；然后，将步骤e中得到的粉末状川陈皮素使用40mL下相溶解形成样品溶液，取其中的20mL进行第一次进样，进样后采集高速逆流色谱图；
D、在160min将剩余的20mL样品溶液进行第二次进样，继续采集高速逆流色谱图，并根据峰形分段收集流出液；
E、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，得到粉末状的川陈皮素。
实施例3
一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)制备枳壳粗提取液
①将枳壳经过粉碎后，备用；
②向上述枳壳中加入5质量倍数的质量浓度为70％乙醇，于常温避光条件下浸提20h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤渣和滤液备用；
③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；
④将步骤③中得到的合并后滤液，在50℃条件下减压浓缩，得到枳壳粗提液。
(2)初步纯化
(a)量取650mLD101大孔吸附树脂，装柱备用；
(b)取上述步骤(1)中制备得到的枳壳粗提液，先使用盐酸调节pH值至2.5；再以2.5BV/h流速上样，上样完成后静置30min；
(c)接着依次使用6BV水、9BV质量浓度为70％的乙醇和7BV质量浓度为95％的乙醇按照34BV/h流速进行洗脱处理；分别收集70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液；
(d)分别对步骤(c)中收集到的70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液进行减压浓缩和冷冻干燥处理，得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物。
(3)分离纯化70％乙醇洗脱物
(A)按照体积比为1:3:1.8:1:5分别量取正已烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
(B)设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为22℃，检测器的检测波长为280nm；
(C)以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.9mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将100mg的70％乙醇洗脱物用20ml下相溶解后，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
(D)在210min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
(E)将收集的流出液，经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到粉末状的新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、橙皮内酯。
(4)分离纯化95％乙醇洗脱物
a、按照体积比为2:0.6:1:3量取正已烷、正丁醇、乙醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气后，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为850rpm/min，恒温器温度为22℃，检测器的检测波长为280nm；
c、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.9mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将130mg的95％乙醇洗脱物使用10ml上相和10ml下相组成的混合溶剂溶解，进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
d、在330min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
e、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，分别得粉末状的橙皮内酯、水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯和桔皮素。
为了进一步的优化技术方案，步骤(4)中还包括对川陈皮素进行第二次高效液相色谱分离，具体包括如下操作步骤：
A、按照体积比为2:0.6:1:3分别量取正已烷、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂先混合均匀，再静置过夜，两相分离后再进行超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为850rpm/min，恒温器温度为22℃，检测器的检测波长为280nm；
C、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将步骤e中得到的粉末状川陈皮素使用40mL下相溶解形成样品溶液，取其中的20mL进行第一次进样，进样后采集高速逆流色谱图；
D、在150min将剩余的20mL样品溶液进行第二次进样，继续采集高速逆流色谱图，并根据峰形分段收集流出液；
E、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，得到粉末状的川陈皮素。
实施例4
一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)制备枳壳粗提取液
①将枳壳经过粉碎后，备用；
②向上述枳壳中加入5质量倍数的质量浓度为65％乙醇，于常温避光条件下浸提24h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤渣和滤液备用；
③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；
④将步骤③中得到的合并后滤液，在52℃条件下减压浓缩，得到枳壳粗提液。
(2)初步纯化
(a)量取600mLD101大孔吸附树脂，装柱备用；
(b)取上述步骤(1)中制备得到的枳壳粗提液，先使用盐酸调节pH值至3；再以3BV/h流速上样，上样完成后静置40min；
(c)接着依次使用8BV水、10BV质量浓度为70％的乙醇和8BV质量浓度为95％的乙醇按照4BV/h流速进行洗脱处理；分别收集70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液；
(d)分别对步骤(c)中收集到的70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液进行减压浓缩和冷冻干燥处理，得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物。
(3)分离纯化70％乙醇洗脱物
(A)按照体积比为1:3:1.8:1:5分别量取正已烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
(B)设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为25℃，检测器的检测波长为280nm；
(C)以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.8mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将120mg的70％乙醇洗脱物用20ml下相溶解后，进样，并采集高速逆流色谱图如图1所示，根据色谱图峰形确定分别在108～118min、130～150min分段收集流出液；
(D)在210min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形确定分别在230～255min、293～303min分段收集流出液；
(E)将收集的流出液，经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到粉末状的新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、橙皮内酯。
(4)分离纯化95％乙醇洗脱物
a、按照体积比为2:0.6:1:3量取正已烷、正丁醇、乙醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气后，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为900rpm/min，恒温器温度为20℃，检测器的检测波长为280nm；
c、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将150mg的95％乙醇洗脱物使用10ml上相和10ml下相组成的混合溶剂溶解，进样，并采集高速逆流色谱图如图2所示，根据色谱图峰形确定分别在62～74min、123～135min、148～173min、226～260min分段收集流出液；
d、在340min停泵，然后换上相作为流动相继续洗脱，并根据峰形确定在382～400min收集流出液；
e、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，分别得粉末状的橙皮内酯、水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯和桔皮素。
为了进一步的优化技术方案，步骤(4)中还包括对川陈皮素进行第二次高速逆流色谱分离，具体包括如下操作步骤：
A、按照体积比为2:0.6:1:3分别量取正已烷、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂先混合均匀，再静置过夜，两相分离后再进行超声脱气，得到上相和下相；冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
C、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将步骤e中得到的粉末状川陈皮素使用40mL下相溶解形成样品溶液，取其中的20mL进行第一次进样，进样后采集高速逆流色谱图；
D、在140min将剩余的20mL样品溶液进行第二次进样，继续采集高速逆流色谱图如图3所示，并根据峰形确定分别在155～185min、312～325min分段收集流出液；
E、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，得到粉末状的川陈皮素。
一、检测本发明在高速逆流色谱分离过程中采用的溶剂体系
1、对于本发明在分离纯化70％乙醇洗脱物时采用的溶剂体系，进行实验验证：
实验通过高效液相色谱(HPLC)测定在不同配比的正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇(乙醇)-水(0.05％乙酸)体系下，化合物的分配系数(K值)，结果如表1所示。
表1
由表1可知，本发明采用的溶剂体系的K值最为合适，分离度大于1.5，橙皮内酯与枸桔苷K值较大，但通过改变洗脱方式，即以上相为流动相，也可洗脱流出，从而有利于通过高速逆流色谱分离得到新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷和橙皮内酯。
2、对于本发明在分离纯化95％乙醇洗脱物时采用的溶剂体系，进行实验验证：
实验通过高效液相色谱(HPLC)分别测定在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(0.05％乙酸)体系、正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水(0.05％乙酸)、正己烷-正丁醇-乙醇-水(0.05％乙酸)和不同配比的正己烷-正丁醇-甲醇-水(0.05％乙酸)体系下，不同化合物的分配系数(K值)结果如表2所示。
表2
由表2可知，体系4、5中三个化合物K值较为合适，最后一个化合物K值偏大，可采用上相作流动相洗脱出来，本发明选择体4、5作为后续分离体系先用体系4制备得到3个高纯度化合物和一个较低纯度化合物，再采用体系5将低纯度化合物纯化，从而可以获得高纯度的水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯、桔皮素。
二、对上述实施例4中分离得到的化合物进行检测。
1、步骤(C)中在108～118min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z611.1979，有质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C28H34O15；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果：
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δH:11.91(1H,s,5-0H),9.12(1H,s,3’-OH),6.95(1H,s,H-5’),6.93(1H,s,H-2’),6.88(1H,dd,J＝10.0,1.5Hz,H-6’),6.11(1H,s,H-6),6.08(1H,s,H-8),5.52(1H,dd,J＝4.0,2.0Hz,H-2),5.33(1H,s,OH),5.12(1H,d,J＝2.0Hz,H-1”),5.11(1H,s,H-1”’),4.74(1H,s,OH),4.60(1H,s,OH),4.52(1H,OH),3.77(3H,s,4’-OCH3),3.67(3H,m),3.45(4H,m),3.35(1H,m,H-3α),3.20(1H,m),2.76(1H,dd,J＝4.0,2.0Hz,H-3β),1.14(3H,d,J＝6.5Hz,H-6”’)；
13C-NMR(DMSO-d6)δ：78.58(C-2),42.51(C-3),197.09(C-4),162.59(C-5),96.43(C-6),165.07(C-7),95.30(C-8),162.78(C-9)，117.97,103.20(C-10),131.10(C-1’)，112.22(C-2’),146.70(C-3’),148.17(C-4’),114.31(C-5’),100.57(C-1”)，76.26(C-2”),77.33(C-3”),69.78(C-4”),77.09(C-5”),97.61(C-1”’),70.56(C-2”’),70.65(C-3”’),72.01(C-4”’),68.46(C-5”’),18.22(C-6”’),55.88(4’-OCH3),60.61。
由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为新橙皮苷。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图4所示。由图4经过面积归一法测定化合物的纯度为95.1％。
2、步骤(C)中在130～150min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z581.1877；由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C27H32O14。
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果：
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δH:12.03(1H,s,5-0H),9.64(1H,s,4’-OH),7.33(2H,dd,J＝8.5,4.0Hz,H-2’,6’),6.80(2H,d,J＝8.5Hz,H-3’,5’),6.11(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.08(1H,t,J＝6.0Hz,H-6),5.51(1H,m,H-1”),5.12(1H,m,H-1”’),3.18(1H,m,H-3),2.72(1H,m,H-6”’),3.67(3H,m),3.45(4H,m),3.35(1H,m,H-3α),3.20(1H,m),4.68(1H,s,OH),4.59(1H,OH)。
13C-NMR(DMSO-d6)δ：79.09(C-2)，42.33(C-3)，197.43(C-4)，163.41(C-5)，96.78(C-6)，165.08(C-7)，95.57(C-8)，163.23(C-9)，103.45(C-10)，129.10(C-1’)，129.01(C-2’)，115.54(C-3’)，158.34(C-4’)，115.68(C-5’)，128.91(C-6’)，97.94(C-1”),77.61(C-2”),77.36(C-3”),69.79(C-4”),76.54(C-5”),60.89(C-6”),100.85(C-1”’),70.85(C-2”’),70.93(C-3”’),72.33(C-4”’),68.75(C-5”’),18.51(C-6”’)。由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为柚皮苷。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图5所示。由图5经过面积归一法测定化合物的纯度为98.5％％。
3、步骤(D)中在230～255min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z595.1676，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C28H34O14；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：12.03(1H,s,5-OH),7.45(2H,d,J＝9.0Hz,H-2’,6’),6.98(2H,d,J＝8.5Hz,H-3’,5’),6.13(1H,d,J＝2.5Hz,H-8),6.10(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.59(1H,dd,J＝12.5,2.0Hz,H-2),5.14(1H,d,J＝7.0Hz,H-1”),5.11(1H,s,J＝9.5Hz,H”’),3.77(3H,s,4’-OCH3),2.78(1H,dd,J＝12.5,3.5Hz,H-3β),1.14(3H,d,J＝6.5Hz,H-6”’-CH3).3.26-3.40(10H)；
13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ：,197.53(C-4),165.35(C-7),163.39(C-5),163.11(C-9),160.00(C-4’),103.20(C-10),130.86(C-2’，6’)，128.83(C-1’),114.29(C-3’，5’),100.78(C-1”’)，97.76(C-1”),96.90(C-6),95.62(C-8),78.83(C-2),77.42(C-5”),76.54(C-3”),72.27(C-2”),70.93(C-2”’),70.84(C-4”),70.04(C-3”’),68.75(C-5”’),60.83(C-6”),42.56(C-3),18.5(C-6”’),55.67(4’-OCH3)。
由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为枸桔柑。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图6所示。由图6经过面积归一法测定化合物的纯度为92.4％。
4、步骤(C)中在293～303min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z261.1105，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C15H16O4；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.97(1H,d,J＝8.0Hz,H-4),7.56(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),7.05(1H,d,J＝8.5Hz,H-6),6.26(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),3.51(1H,m,H-2’),2.89(1H,dd,J＝12.5,2.0Hz,H-1’),2.80(1H,dd,J＝12.5,2.0Hz,H-1’),3.88(3H,s,7-OCH3),1.14(6H,d,J＝3.0Hz,4’-CH3,5’-CH3)。
13C-NMR(DMSO-d6)δ：161.05(C-2)，160.97(C-7),153.61(C-9),145.25(C-4),127.41(C-5),108.34(C-8),116.57(C-10),113.01(C-3),112.59(C-6),56.71(OCH3),76.70(C-2’),72.43(C-3’),26.13(C-1’),26.00(3’-CH3),25.53(3’-CH3)。由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为橙皮内酯。
(2)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图7所示。由图7经过面积归一法测定化合物的纯度为97.7％。
5、步骤c中在123～135min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z278.1396，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C15H18O5；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.98(1H,d,J＝9.5Hz,H-4),7.61(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.95(1H,m,H-6),6.27(1H,d,J＝8.5Hz,H-3),4.65(3H,d,J＝9.6,7-OCH3),3.77(1H,m,-CH),3.24(1H,d,J＝2.0HzOH),3.50(1H,s,OH),3.05(1H,d,J＝13.2Hz,1’-CH2),1.02(3H,s,4’-CH3),0.92(3H,s,5’-CH3)；
13C-NMR(DMSO-d6)δ：162.17(C-2)，160.79(C-7),155.85(C-9),144.82(C-4),129.89(C-5),118.84(C-8),113.36(C-8),112.84(C-3),101.82(C-6),77.35(C-2’),71.95(C-3’),29.50(C-1’),26.93(C-4’),24.89(C-5’)。
由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为水合橙皮内酯。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图8所示。由图8经过面积归一法测定化合物的纯度为95.79％。
6、步骤D中在155～185min和312～325min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z403.1468，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C21H22O8。
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：6.87(1H,s,H-3),7.55(1H,d,J＝1.5Hz,H-2’),7.16(1H,d,J＝8.5Hz,H-5’),7.65(1H,dd,J＝8.5,1.5Hz,H-6’),4.03(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3)，3.85(3H,s,OCH3)，3.84(3H,s,OCH3),3.78(3H,s,OCH3)；
13C-NMR(DMSO-d6)δ：160.76(C-2),106.28(C-3),176.31(C-4),144.00(C-5),149.49(C-6),138.01(C-7),148.08(C-8),147.64(C-9),109.39(C-10),123.61(C-1’),111.33(C-2’),152.15(C-3’),151.37(C-4’),114.76(C-5’),119.81(C-6’),62.38(5-OCH3)，62.29(6-OCH3)，62.00(7-OCH3)，61.89(8-OCH3)，56.20(3’-OCH3)，56.16(4’-OCH3)。
由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为川陈皮素。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图9所示。由图9经过面积归一法测定化合物的纯度为95.3％。
7、步骤c中在226～260min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z261.1115，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C15H16O4；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.97(1H,d,J＝9.0Hz,H-4),7.63(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),7.09(1H,dd,J＝2.5Hz,H-6),6.27(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),3.91(1H,s,H-2’),2.83(1H,m,H-1’),3.94(3H,s,7-OCH3),1.11(3H,s,4’-CH3)，1.10(3H,s,5’-CH3)；
13C-NMR(DMSO-d6)δ：210.72(C-2’)，160.48(C-2)，128.53(C-5)，112.96(C-8),112.74(C-10),111.64(C-3),160.46(C-7),153.14(C-9),145.18(C-4),108.34(C-6),19.99(C-4’,C-5’)34.88(C-1’)，56.79(OCH3)。
由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为异橙皮内酯。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图10所示。由图10经过面积归一法测定化合物的纯度为91.2％。
8、步骤c中在226～260min收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z373.1343，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C20H20O7；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ：6.77(1H,s,H-3),8.00(2H,d,J＝3.5Hz,H-2’,H-6’),7.14(2H,d,J＝5.1Hz,H-3’,H-5’),4.02(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),3.86(3H,s,OCH3),3.84(3H,s,OCH3),3.78(3H,s,OCH3)；
13CNMR(DMSO-d6)δ：162.50(C-2)，106.57(C-3),176.16(C-4),144.06(C-5),151.41(C-6),138.23(C-7),147.94(C-8),128.25(C-2’,C-6’),123.59(C-1’),115.17(C-3’,C-5’),114.80(C-10),147.61(C-9),160.86(C-4’),62.37(5-OCH3),62.33(6-OCH3),61.98(7-OCH3),61.87(8-OCH3),56.01(4’-OCH3)。
由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为桔皮素。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图11所示。由图11经过面积归一法测定化合物的纯度为92.9％。
9、步骤c中在62～74min流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。
(1)对上述得到的粉末状化合物采用质谱检测，结果Q-TOFMS分析化合物的[M+H]+为m/z261.1105，由质谱检测的结果可以得知该化合物的分子式为C15H16O4；
(2)对上述得到的粉末状化合物采用核磁共振波谱检测，结果:
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.97(1H,d,J＝8.0Hz,H-4),7.56(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),7.05(1H,d,J＝8.5Hz,H-6),6.26(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),3.51(1H,m,H-2’),2.89(1H,dd,J＝12.5,2.0Hz,H-1’),2.80(1H,dd,J＝12.5,2.0Hz,H-1’),3.88(3H,s,7-OCH3),1.14(6H,d,J＝3.0Hz,4’-CH3,5’-CH3)。
13C-NMR(DMSO-d6)δ：161.05(C-2)，160.97(C-7),153.61(C-9),145.25(C-4),127.41(C-5),108.34(C-8),116.57(C-10),113.01(C-3),112.59(C-6),56.71(OCH3),76.70(C-2’),72.43(C-3’),26.13(C-1’),26.00(3’-CH3),25.53(3’-CH3)。由核磁共振波谱检测结果可以得知，该化合物为橙皮内酯。
(3)对上述得到的粉末状化合物进行高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图12所示。由图12经过面积归一法测定化合物的纯度为98.4％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备枳壳粗提取液：由枳壳经过粉碎、乙醇浸提、减压浓缩制备得到枳壳粗提取液；
(2)初步纯化：利用大孔吸附树脂柱依次使用去离子水、质量浓度为70％的乙醇洗脱液和质量浓度为95％的乙醇洗脱液，对由步骤(1)制备得到的枳壳粗提取液进行洗脱处理，制备得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物；
(3)分离纯化70％乙醇洗脱物：利用高速逆流色谱对由步骤(2)制备得到的70％乙醇洗脱物进行分离提纯，得到三种黄酮类化合物和一种香豆素类化合物；
(4)分离纯化95％乙醇洗脱物：利用高速逆流色谱对由步骤(2)制备得到的95％乙醇洗脱物进行分离提纯，得到两种黄酮类化合物和三种香豆素类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
①将枳壳经过粉碎后，备用；
②向上述枳壳中加入4～6质量倍数的乙醇，于常温避光条件下浸提12-24h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤渣和滤液备用；
③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；
④将步骤③中得到的合并后滤液，在45～55℃条件下减压浓缩，得到枳壳粗提液。
3.根据权利要求2所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤②中乙醇的质量浓度为60～80％。
4.根据权利要求2所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤④中得到的枳壳粗提取液与初始枳壳的质量比为1～2:1。
5.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
(a)量取500～800mLD101大孔吸附树脂，装柱备用；
(b)取上述步骤(1)中制备得到的枳壳粗提液，先使用盐酸调节pH值至2～3；再以2～3BV/h流速上样，上样完成后静置20～40min；
(c)接着依次使用5～8BV水、8～10BV质量浓度为70％的乙醇和5～8BV质量浓度为95％的乙醇按照2～4BV/h流速进行洗脱处理；分别收集70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液；
(d)分别对步骤(c)中收集到的70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗脱液进行减压浓缩和冷冻干燥处理，得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物。
6.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下步骤:
(A)按照体积比为1:3:1.8:1:5分别量取正已烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
(B)设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
(C)以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.8～2mL/min流速泵入主机直至两相平衡；然后，将80～120mg的70％乙醇洗脱物用20ml下相溶解并进样，进样后采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
(D)在200～220min停泵，然后换上相作为流动相，继续按照1.8～2mL/min流速洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
(E)将收集的流出液，经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到粉末状的新橙皮苷、柚皮苷、枸桔苷、橙皮内酯。
7.根据权利要求5所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤(C)中流速为1.8mL/min，所述步骤(D)中流速为1.8mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括如下步骤:
a、按照体积比为2:0.6:1:3量取正已烷、正丁醇、乙醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂混合均匀后静置过夜，然后进行两相分离和超声脱气，得到上相和下相；所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
b、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
c、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照1.7～2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将100～150mg的95％乙醇洗脱物使用10ml上相和10ml下相组成的混合溶剂溶解进样，并采集高速逆流色谱图，根据色谱图峰形分段收集流出液；
d、在320～340min停泵，然后换上相作为流动相，继续按照1.7～2mL/min流速洗脱，并根据峰形分段收集流出液；
e、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，分别得粉末状的橙皮内酯、水合橙皮内酯、川陈皮素、异橙皮内酯和桔皮素。
9.根据权利要求8所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤c中流速为2mL/min，所述步骤d中流速为2mL/min。
10.根据权利要求5所述的一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法，其特征在于，所述步骤(4)中还包括对川陈皮素进行第二次高速逆流色谱分离，具体包括如下操作步骤：
A、按照体积比为2:0.6:1:3分别量取正已烷、正丁醇、甲醇和冰乙酸水溶液，备用；将称量好的溶剂先混合均匀，再静置过夜，两相分离后再进行超声脱气，得到上相和下相；所述冰乙酸水溶液中冰乙酸的体积百分数为0.05％；
B、设置高速逆流色谱的技术参数：主机转速为800-900rpm/min，恒温器温度为20～25℃，检测器的检测波长为280nm；
C、以下相作为流动相、上相作为固定相，下相按照2mL/min流速泵入直至两相平衡；然后，将步骤e中得到的粉末状川陈皮素使用40mL下相溶解形成样品溶液，取其中的20mL进行第一次进样，进样后采集高速逆流色谱图；
D、在140～160min将剩余的20mL样品溶液进行第二次进样，继续采集高速逆流色谱图，并根据峰形分段收集流出液；
E、将收集到的流出液先旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，得到粉末状的川陈皮素。
CN201810517904.XA 2018-05-25 2018-05-25 一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法 Active CN108892698B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810517904.XA CN108892698B (zh) 2018-05-25 2018-05-25 一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810517904.XA CN108892698B (zh) 2018-05-25 2018-05-25 一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108892698A true CN108892698A (zh) 2018-11-27
CN108892698B CN108892698B (zh) 2021-12-31

Family

ID=64343232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810517904.XA Active CN108892698B (zh) 2018-05-25 2018-05-25 一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108892698B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110613739A (zh) * 2019-07-31 2019-12-27 湖州耕香生物科技有限公司 基于高速逆流色谱分离木芙蓉中黄酮类化合物的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何英杰等: "酸橙类中药材枳实和枳壳化学成分研究进展", 《中药材》 *
宋玉鹏等: "高速逆流色谱法分离制备枳壳中水合橘皮内酯等3个标准物质的研究", 《药物分析杂志》 *
胡昌盛等: "采用高速逆流色谱法快速制备积壳中高纯度柚皮苷和新橙皮苷的研究", 《临床合理用药》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110613739A (zh) * 2019-07-31 2019-12-27 湖州耕香生物科技有限公司 基于高速逆流色谱分离木芙蓉中黄酮类化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108892698B (zh) 2021-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wei et al. Separation of patuletin-3-O-glucoside, astragalin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin from Flaveria bidentis (L.) Kuntze by elution-pump-out high-performance counter-current chromatography
Shi et al. Systematic separation and purification of 18 antioxidants from Pueraria lobata flower using HSCCC target-guided by DPPH–HPLC experiment
CN101353363B (zh) 高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法及产品
CN103145677B (zh) 一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法
CN104031013B (zh) 一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸b和迷迭香酸的方法
CN103830306B (zh) 一种忍冬叶有效提取物的制备方法
CN109503373B (zh) 一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法
CN106957310B (zh) 一种山楂叶中黄酮类单体的高效制备方法
CN110526952A (zh) 一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法
CN108892698A (zh) 一种利用高速逆流色谱分离枳壳中化合物的方法
CN105131063B (zh) 从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化多种黄酮类成分的方法
CN106831892B (zh) 一种山楂叶中黄酮单体的制备方法
CN111718318B (zh) 一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法
CN103113439A (zh) 从对叶大戟中制备山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法
CN104744489B (zh) 一种以冬凌草为原料制备高纯度冬凌草甲素的方法
CN107721857A (zh) 一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法
CN109369382B (zh) 一种银杏酸类成分的制备方法
CN107698637B (zh) 一种白檀果化合物高速逆流色谱制备方法
CN105085453A (zh) 一种利用高速逆流色谱法从马蔺子中分离制备低聚芪类化合物的方法
CN112194690B (zh) 钩毛茜草中3个化合物及提取分离方法
CN105713005B (zh) 一种水线草中耳草酮a的提取分离方法
CN109721636A (zh) 一种新三萜皂苷化合物细柱五加苷s及其制备方法
CN105646426B (zh) 一种利用hsccc法分离艾叶中异泽兰黄素的方法
CN105085498B (zh) 从广金钱草中提取分离异牡荆素的方法和系统
CN111718356B (zh) 一种分离制备墨旱莲单体的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant