CN113416757A - 生物发酵制备表没食子儿茶素的方法 - Google Patents

生物发酵制备表没食子儿茶素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，属于微生物发酵工程领域。以枯草芽孢杆菌作为发酵菌在以浒苔为原料的培养基中进行生物发酵制备发酵液，所述发酵液经过纯化得到表没食子儿茶素。本发明的方法有助于提高浒苔的综合应用能力，提高了浒苔的经济价值。

Description

生物发酵制备表没食子儿茶素的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程领域，尤其涉及生物发酵制备表没食子儿茶素的方法。
背景技术
国内外大量研究报道儿茶素具有清除体内自由基、抗氧化、预防心脑血管疾病、抑制肿瘤生长和抗病毒、防辐射等显著生理药理活性，广泛应用于食品饮料和日用化工领域。
表没食子儿茶素【(-)-Epicatechin,EC】(CAS:490-46-0)具有降脂减肥、预防心脑血管疾病、防癌抗突变等多种生理活性功效，与其他儿茶素类成分相比较，尤其能够显著提高中老年受试对象的空间记忆与认知功能，从而引起了国内外学者的极大兴趣。但是，表没食子儿茶素的主要来源是茶叶，不可避免的限制了其大规模产业化生产。
本申请申请人的在先授权专利CN111732483B公开了一种浒苔生物肥的发酵方法；包括步骤：水解多糖，接种发酵和生物肥的制备；本发明采用一种负载型杂多酸水解助剂在双氧水和无机盐存在的条件下，将浒苔细胞表面浒苔多糖溶解，解离被包裹的藻体纤维素和蛋白等物质，有效释放浒苔内部的营养元素，能够有效地促进作物的生长和品质的提高；该授权发明以来源广泛，生物资源量巨大的大型绿潮藻浒苔固体为主要原料，采用发酵的方法制备一种生物肥，具有产物转化率高，适宜规模化制备的特点；发酵的方法具有生物安全性好，对环境不存在潜在危害，产物的活性成分含量高以及快速高效专一的特点。然而，上述授权专利所采用的微生物为细菌粉末、真菌粉末、放线菌粉末按照质量比0.8-1.5:0.6-1.1:1配制，其存在成本高、发酵时间长等缺点。
芽孢杆菌作为土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病的作用。许多性状优良的分离菌株已经成功应用于植物的病害生物防治领域。枯草芽孢杆菌通过定殖到植物根际、体表或体内，与病原菌竞争养分，并分泌抗菌物质的方式来抑制病原菌生长；同时诱导植物的防御系统来抵御病原菌的入侵，从而达到生防的目的。
在本申请申请人的在先专利申请CN111733119A公开了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵的方法，该方法具体步骤包括：枯草芽孢杆菌摇瓶培养，接种到一级种子罐，温度30-35℃，转速160～200rpm/min，pH为6.7～7.9条件下发酵培养18h，作为二级培养种子液接种到二级种子罐，温度30～35℃，转速160～200rpm/min，pH为6.7～7.9条件下发酵培养36h，作为发酵种子液接种到发酵罐，温度30～35℃，转速160～200rpm/min，pH为6.7～7.9条件下发酵培养48h，得到枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
本申请的发明人在后期研究过程中发现，以高密度枯草芽孢杆菌作为浒苔的发酵微生物所产生的发酵产物中，其含有一定量的表没食子儿茶素，本发明正是基于这一发现得以实现的。
发明内容
本发明是为了解决上述不足，提供了一种生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，通过使用枯草芽孢杆菌，以浒苔为原料，能够生产高纯度的表没食子儿茶素。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明涉及一种生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，其特征在于以枯草芽孢杆菌作为发酵菌以浒苔为原料进行发酵制备发酵液，所述发酵液经过纯化得到表没食子儿茶素。
在本发明的一个优选实施方式中，所述纯化过程包括如下步骤：
（1）发酵液的制备，将得到的发酵物进行固液分离，得到的滤液部分即为发酵液；
（2）制备表没食子儿茶素粗品：发酵液经离心过滤，取澄清液减压浓缩至8-12%（w/v）浓度后，用离心喷雾塔喷雾干燥，产品即为表没食子儿茶素粗品；
（3）将上述表没食子儿茶素（EC）粗品经反相填料层析色谱分离纯化：加入纯水溶解EC粗品配置成浓度为8-12%（w/v）的上柱料液，反相聚合物填料柱层析分离纯化；上柱流速：80-120cm/h；解吸溶剂：15-25%乙醇洗脱1BV，50-70%乙醇解析2BV，收集50-70%解析馏分；解吸流速：80-120cm/h；最大操作压力<4MPa；反渗透膜浓缩50-70%解吸馏分，操作温度控制在40℃以下，进膜压力控制在15Bar以下，离心喷雾干燥得到高含量（75-85wt%）表没食子儿茶素；
（4）将上述高含量表没食子儿茶素产品用5~6倍量（w/v）10-30%乙醇溶解，0-4℃放置结晶，待晶体充分生长，使用离心机离心脱除母液，4℃冷水洗涤晶体至洗涤液无色，将得到的晶体冷冻干燥，得到白色或类白色固体的表没食子儿茶素的含量≥90wt%。
在本发明的一个优选实施方式中，所述浒苔通过如下步骤进行预处理：水解多糖，选取100-200份的浒苔，初步切碎后放入到水解釜中，加入20-50份的水，0.1-0.5份的无机盐，2-8份的双氧水和0.1-0.6份的负载型杂多酸水解助剂，混合搅拌均匀后，在50℃-80℃下反应2-6小时，反应结束后降温到室温；所述负载型杂多酸水解助剂采用11-溴十一基三甲氧基硅烷对钛硅分子筛进行表面处理；所述负载型杂多酸水解助剂，其制备方法如下：按照质量份数，将100-150份的钛硅分子筛浸渍在200-400份的质量份数为3.5%-7%的盐酸溶液中，控温40℃-60℃处理10-15h，洗涤后分散到600-1000份的去离子水中，加入15-20份的二水合钨酸钠，1-4份的11-溴十一基三甲氧基硅烷，搅拌混合20-30min；调节溶液pH值为6-8，继续搅拌60-120min，转入高压反应釜中在120℃-150℃下反应5-10h，完成后冷却至室温，用0.1-0.5mol/L的磷酸调节体系pH值为2-3，搅拌3-7h，过滤，烘干，得到负载型杂多酸水解助剂。
在本发明的一个优选实施方式中，所述生物发酵包括如下步骤：接种发酵，降温到室温的浒苔中加入100-200份的水，2-6份的氮磷钾肥，10-15份的豆粕，6-12份的硅藻土，0.5-3份的腐植酸，0.1-0.5份的黄腐酸钾和5-18份的石秸秆，混合均匀后接种0.8%-3%体积的高密度枯草芽孢杆菌，控制发酵温度为30-35℃，发酵4-6天；所述高密度枯草芽孢杆菌是指活菌数为1.0~2.0×1010cfu/mL的枯草芽孢杆菌。
有益效果：本发明通过以枯草芽孢杆菌作为发酵菌，以浒苔作为发酵原料，所生成的发酵液经过纯化得到表没食子儿茶素，有助于提高浒苔的综合应用能力，提高了浒苔的经济价值。
附图说明
图1为实施例1表没食子儿茶素粗品的高效液相色谱图；
图2为实施例1离心喷雾干燥得到高含量表没食子儿茶素产品的高效液相色谱图；
图3为实施例1重结晶之后表没食子儿茶素的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：
（1）参照CN111733119A所公开的实施例，培养48h后得到活菌数为1.7×1010cfu/mL，成孢率为90%的高密度枯草芽孢杆菌。
（2）水解多糖，选取100g浒苔，初步切碎后放入到水解釜中，加入20g水，0.1g无机盐，2g双氧水和0.1g负载型杂多酸水解助剂，混合搅拌均匀后，于50℃反应2小时，反应结束后降温到室温。
（3）接种发酵，降温到室温的浒苔中加入100g水，2g氮磷钾肥，10g豆粕，6g硅藻土，0.5g腐植酸，0.1g黄腐酸钾和5g石秸秆，混合均匀后接种0.8%体积的高密度枯草芽孢杆菌，控制发酵温度为32℃，发酵5天。
（4）发酵液的制备，将得到的发酵物进行固液分离，得到的滤液部分即为发酵液。
（5）制备表没食子儿茶素粗品：发酵液经1000r/min三足离心机离心过滤，取澄清液减压浓缩至10%（w/v）浓度后，用离心喷雾塔喷雾干燥，产品即为表没食子儿茶素粗品（EC=1wt%，其高效液相色谱图如图1所示）。
（6）将上述表没食子儿茶素（EC）粗品经反相填料层析色谱分离纯化：加入纯水溶解EC粗品配置成浓度为10%（w/v）的上柱料液，反相聚合物填料柱层析分离纯化（上样量2：1，EC粗品重量（Kg）/填料用量（L）；上柱流速：100cm/h；解吸溶剂：20%乙醇洗脱1BV，60%乙醇解析2BV，收集60%解析馏分；解吸流速：100cm/h；最大操作压力<4MPa）。反渗透膜浓缩60%解吸馏分，操作温度控制在40℃以下，进膜压力控制在15Bar以下。离心喷雾干燥得到高含量表没食子儿茶素（EC>80%）产品，其高效液相色谱图如图2所示。
（7）将上述高含量表没食子儿茶素（EC>80%）产品用5~6倍量（w/v）20%乙醇溶解，4℃放置结晶，待晶体充分生长，使用三足式离心机离心脱除母液，4℃冷水洗涤晶体至洗涤液无色，将得到的晶体冷冻干燥，得白色或类白色固体，即为表没食子儿茶素（EC）单体，与表没食子儿茶素（EC）标准品对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测为EC≥92%，如图3所示。
所述的一种负载型杂多酸水解助剂，其制备方法如下：
将100g的钛硅分子筛浸渍在200g的质量百分比浓度为3.5%的盐酸溶液中，控温40℃处理10h，洗涤后分散到600g的去离子水中，加入15g的二水合钨酸钠，1g的11-溴十一基三甲氧基硅烷，搅拌混合20min后；调节溶液pH值为6，继续搅拌60min，转入高压反应釜中在120℃下反应5h，完成后冷却至室温，用0.1mol/L的磷酸调节体系pH值为2，搅拌3h，过滤，烘干，得到负载型杂多酸水解助剂。
所述的无机盐为硫酸锌。
所述的双氧水质量百分比浓度为10%。
所述的固液分离采用板框式过滤器过滤。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (4)

1.一种生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，其特征在于：以枯草芽孢杆菌作为发酵菌在以浒苔为原料的培养基中进行生物发酵制备发酵液，所述发酵液经过纯化得到表没食子儿茶素。
2.根据权利要求1所述的生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，其特征在于：所述纯化过程包括如下步骤：
（1）发酵液的制备，将得到的发酵物进行固液分离，得到的滤液部分即为发酵液；
（2）制备表没食子儿茶素粗品：发酵液经离心过滤，取澄清液减压浓缩至8-12%（w/v）浓度后，用离心喷雾塔喷雾干燥，产品即为表没食子儿茶素粗品；
（3）将上述表没食子儿茶素粗品经反相填料层析色谱分离纯化：加入纯水溶解表没食子儿茶素粗品配置成浓度为8-12%（w/v）的上柱料液，反相聚合物填料柱层析分离纯化；上柱流速：80-120cm/h；解吸溶剂：15-25%乙醇洗脱1BV，50-70%乙醇解析2BV，收集50-70%解析馏分；解吸流速：80-120cm/h；最大操作压力<4MPa；反渗透膜浓缩50-70%解吸馏分，操作温度控制在40℃以下，进膜压力控制在15Bar以下，离心喷雾干燥得到高含量表没食子儿茶素；
（4）将上述高含量表没食子儿茶素产品用5~6倍量（w/v）的10-30%乙醇溶解，0-4℃放置结晶，待晶体充分生长，使用离心机离心脱除母液，4℃冷水洗涤晶体至洗涤液无色，将得到的晶体冷冻干燥，得到白色或类白色固体的表没食子儿茶素的含量≥90wt%。
3.根据权利要求1所述的生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，其特征在于：所述浒苔通过如下步骤进行预处理：水解多糖，选取100-200份的浒苔，初步切碎后放入到水解釜中，加入20-50份的水，0.1-0.5份的无机盐，2-8份的双氧水和0.1-0.6份的负载型杂多酸水解助剂，混合搅拌均匀后，在50℃-80℃下反应2-6小时，反应结束后降温到室温；所述负载型杂多酸水解助剂采用11-溴十一基三甲氧基硅烷对钛硅分子筛进行表面处理；所述负载型杂多酸水解助剂，其制备方法如下：按照质量份数，将100-150份的钛硅分子筛浸渍在200-400份的质量份数为3.5%-7%的盐酸溶液中，控温40℃-60℃处理10-15h，洗涤后分散到600-1000份的去离子水中，加入15-20份的二水合钨酸钠，1-4份的11-溴十一基三甲氧基硅烷，搅拌混合20-30min；调节溶液pH值为6-8，继续搅拌60-120min，转入高压反应釜中在120℃-150℃下反应5-10h，完成后冷却至室温，用0.1-0.5mol/L的磷酸调节体系pH值为2-3，搅拌3-7h，过滤，烘干，得到负载型杂多酸水解助剂。
4.根据权利要求1所述的生物发酵制备表没食子儿茶素的方法，其特征在于：所述生物发酵包括如下步骤：接种发酵，降温到室温的浒苔中加入100-200份的水，2-6份的氮磷钾肥，10-15份的豆粕，6-12份的硅藻土，0.5-3份的腐植酸，0.1-0.5份的黄腐酸钾和5-18份的石秸秆，混合均匀后接种0.8%-3%体积的高密度枯草芽孢杆菌，控制发酵温度为30-35℃，发酵4-6天；所述高密度枯草芽孢杆菌是指活菌数为1.0~2.0×1010cfu/mL的枯草芽孢杆菌。
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