CN111019861B - 一种纳豆芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种纳豆芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纳豆芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的纳豆芽孢杆菌是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为：CGMCC No.18081的纳豆芽孢杆菌FK001。利用分批补料的发酵工艺得到的纳豆芽孢杆菌FK001发酵液可应用于食品、保健品、肥料、饲料等。本发明提供的纳豆芽孢杆菌FK001培养方法简单，原料经济易得、菌体产量高、纳豆激酶活性高，综合生产成本低，具有工业应用前景。

Description

一种纳豆芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纳豆芽孢杆菌及其应用。
背景技术
纳豆芽孢杆菌Bacillus natto是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种好氧的革兰氏阳性菌。纳豆芽孢杆菌在食品纳豆发酵过程中起主要作用。
纳豆芽孢杆菌在食品和饲料中的应用较为普遍，在纳豆芽孢杆菌发酵的食品中含有的纳豆激酶具有显著的溶栓活性。在纳豆芽孢杆菌的发酵或基因工程技术改良过程中，不仅会产生纳豆激酶，还会产生一些其它重要的功能性活性物质，能够明显地改善食品和饲料的营养特性。
目前已公开的获得纯培养保藏的具备实际应用价值的纳豆芽孢杆菌种类并不多，对于本领域而言，充足的微生物资源储备毫无疑问对其产业化应用有重要的实际意义。
发明专利CN104946571B中公布了一种纳豆芽孢杆菌及其发酵液在芥菜酱加工中的应用，保藏编号为：CGMCC No.5769，生产的芥菜酱在口感和营养特性上都有很大的提升。此外，对于纳豆芽孢杆菌的研究中还发现，纳豆芽孢杆菌在发酵过程中可产生多种抗菌物质，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌，提高动物免疫力。其可以作为饲料的添加物，增大黄鳝的消化酶活性，提高黄鳝的增重率和特定增长率。
发明专利CN103966116A公开了一株纳豆芽孢杆菌，该纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)W-0923，菌种保藏号为CCTCC：M2012496。它可以用作溶解人体血栓的保健品。
发明专利CN104894027B公开了一株纳豆芽孢杆菌及其应用。该纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.10535。纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NF01-6发酵含大豆粕培养基得到的发酵产物的赖氨酸含量和粗蛋白含量比不接菌的对照显著增加。
发明专利CN101560478A公开了一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用。枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.Natto)，CCTCC NO:M208156。该菌种培养基使用胰蛋白胨、酵母提取物等价格昂贵，发酵周期需要72小时，时间过长，消耗大量能源，综合生产成本过高。
为提高纳豆激酶的产量，发明专利CN102586141A和CN105274078A都从发酵过程方面进行了优化。然而，一方面其二者在纳豆激酶提高方面的效果并不十分理想；另一方面，其培养过程复杂，发酵原料成本高，造成综合生产成本过高，难以实现工业化生产。
本申请从源头出发，解决上述技术问题，提供了一种新型高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌，其纳豆激酶、菌体产量高、且培养方法简单，综合生产成本低，具备良好的工业化前景。
发明内容
本发明提供了一种纳豆芽孢杆菌，以及其发酵培养方法，其作为饲料添加剂的用途、其作为肥料添加剂的用途、其作为食品添加剂的用途。
一方面，本发明提供的一种纳豆芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为：CGMCC No.18081的纳豆芽孢杆菌FK001(Bacillusnatto FK001)。
本发明的纳豆芽孢杆菌FK001(Bacillus natto FK001)于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18081。
另一方面，本发明提供了纳豆芽孢杆菌FK001的发酵工艺，采用分批补料发酵工艺，在对数生长期、产酶期和产孢期分别加入浓度分别为20％、10％和5％的糖蜜溶液，发酵后期加入钙镁混合溶液，可以同时提高纳豆芽孢杆菌FK001的菌体产量以及纳豆激酶产量。
发酵过程中，发酵培养基的碳氮源包括但不限于：豆饼粉、糖蜜、玉米浸渍液。
在一些具体的实施方案中，所述的发酵工艺包括以下步骤：
(1)菌种活化；
(2)一级种子液制备；
(3)发酵液制备。
具体地，所述的菌种活化使用的培养基包括糖蜜、酵母提取物、氯化钙、蛋白胨、维生素b12中的一种或多种。
具体地，所述的一级种子液制备使用的培养基包括：糖蜜、豆饼粉、氯化钙、硫酸铵、硫酸镁、玉米浸渍液、葡萄糖中的一种或多种。
具体地，所述的发酵液制备使用的培养基包括：糖蜜、豆饼粉、氯化钙、硫酸铵、硫酸镁、玉米浸渍液、磷酸二氢钾中的一种或多种。
再一方面，本发明还提供了纳豆芽孢杆菌FK001在制备饲料添加剂方面的应用。
具体地，所述应用包括但不限于将纳豆芽孢杆菌FK001的发酵液作为必要原料制备饲料添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将纳豆芽孢杆菌FK001的发酵液制备成纳豆芽孢杆菌FK001菌粉或蛋白酶粉，用于制备饲料添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将纳豆芽孢杆菌FK001用于植物蛋白饲料发酵。
再一个方面，本发明还提供了纳豆芽孢杆菌FK001在制备食品添加剂方面的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于利用纳豆芽孢杆菌FK001生产的纳豆激酶制备食品添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于纳豆芽孢杆菌FK001在酱菜加工中的应用。
更具体地，所述的应用包括但不限于纳豆芽孢杆菌FK001在黄豆发酵制品加工中的应用。
再一个方面，本发明还提供了纳豆芽孢杆菌FK001在制备肥料方面的应用。
再一个方面，本发明还提供了纳豆芽孢杆菌FK001在制备保健品上的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于在制备预防与治疗脑血栓的保健品方面的应用。
更具体地，所述的应用包括但不限于利用纳豆芽孢杆菌FK001产生的纳豆激酶在制备预防与治疗脑血栓的保健品方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于本发明提供的纳豆芽孢杆菌FK001培养方法简单，原料经济易得、菌体产量高、纳豆激酶活性高，综合生产成本低。
保藏说明
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏日期：2019年07月08日
菌种名称：纳豆芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus natto
菌株编号：FK001
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18081
附图说明
图1为纳豆芽孢杆菌FK001在血纤维蛋白培养基的培养结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1纳豆芽孢杆菌FK001的保藏与培养
纳豆芽孢杆菌FK001的保藏信息为：
纳豆芽孢杆菌FK001(Bacillus natto FK001)于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18081。
纳豆芽孢杆菌FK001的发酵培养：
方法1、对于斜面或冻干管纳豆芽孢杆菌FK001
(1)菌种活化
把斜面或冻干管纳豆芽孢杆菌FK001接种到配置好的营养琼脂平板，于32℃-40℃恒温培养箱，培养12-16小时；
营养琼脂平板培养基组成：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钙5g、琼脂15～20g、蒸馏水补足至1000mL；
(2)摇瓶菌种制备
挑取1-2环活化后的菌种接种于配制好的液体摇瓶培养基，于32℃-40℃恒温震荡摇床，培养12-16小时，即得摇瓶种子液；
液体摇瓶培养基组成：糖蜜10-100g/L、酵母提取物10-80g/L、氯化钙1-20g/L、蛋白胨10-80g/L、维生素b12 0.001-0.005g/L、蒸馏水补足至1000mL；
(3)一级种子制备
以接种量1％-15％将摇瓶种子液接种到一级种子培养基，温度32℃-40℃，转速80-200rpm，培养6-12小时，即得一级种子液；
一级种子培养基组成：糖蜜20-50g/L、豆饼粉3-10g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、玉米浸渍液10-40g/L、葡萄糖5-10g/L、pH6.0-7.0；
(4)发酵液制备
以接种量5％-20％将一级种子液接种到发酵培养基，温度37℃-42℃，转速150-250rpm，风量0.2-3vvm/min,培养25-35小时；发酵期间在对数生长期补加糖蜜和钙镁溶液直到菌体停止生长，此时进入高产纳豆激酶过程，整个发酵过程溶氧值控制在20-40％之间，即得纳豆芽孢杆菌FK001发酵液。
发酵培养基组成：糖蜜40-150g/L、豆饼粉40-100g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、玉米浸渍液30-60g/L、磷酸二氢钾0.5-3g/L、ph6.0-7.5；
采用国标有效活菌数的测定方法测得，纳豆芽孢杆菌FK001发酵液中有效活菌数在200-250*108/mL。
方法2、对于甘油管纳豆芽孢杆菌FK001
(1)一次菌种活化
取甘油管纳豆芽孢杆菌FK001菌种接种到配置好的摇瓶培养基，于32℃-40℃恒温培养箱，培养12-16小时；
摇瓶培养基组成：糖蜜10-50g/L、酵母提取物10-40g/L、氯化钙1-5g/L、蛋白胨5-15g/L、蒸馏水补足至1000mL；
(2)二次菌种活化
取适量一次活化后的菌种接种于配制好的摇瓶培养基，于32℃-40℃恒温震荡摇床，培养12-16小时；
摇瓶培养基组成：糖蜜10-100g/L、酵母提取物10-80g/L、氯化钙1-20g/L、蛋白胨10-80g/L、维生素b12 0.001-0.005g/L、蒸馏水补足至1000mL；
(3)一级种子制备
以接种量1％-15％把二次活化后的菌种接种到一级种子培养基，温度32℃-40℃，转速80-300rpm，培养6-12小时，即得一级种子液；
一级种子培养基组成：糖蜜20-50g/L、豆饼粉3-10g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、玉米浸渍液10-40g/L、葡萄糖5-10g/L、pH6.0-7.0；
(4)发酵液制备
以接种量5％-20％将一级种子液接种到生产培养基，温度32℃-40℃，转速80-120rpm，风量0.2-3vvm/min，培养25-35小时；期间使用糖蜜、蔗糖、维生素进行补料操作，以获得最大产出比，即得纳豆芽孢杆菌FK001发酵液；
发酵培养基组成：糖蜜40-150g/L、豆饼粉40-100g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、玉米浸渍液30-60g/L、磷酸二氢钾0.5-3g/L、pH6.0-7.5。
将得到的纳豆芽孢杆菌FK001发酵液采用高速离心机或自然沉降或加入沉降剂，分离获取清液(上清部分)和重液(下沉部分)，清液即为高含量纳豆激酶菌液，重液即为纳豆芽孢杆菌菌体；清液经过浓缩，添加本领域常规使用的蛋白保护剂后，喷雾干燥获得含纳豆激酶粉剂产品；重液添加本领域常规使用的蛋白保护剂和/或菌体保护剂后，喷雾干燥获得高含量纳豆芽孢杆菌粉剂产品。
将得到的纳豆芽孢杆菌FK001发酵液，添加本领域常规使用的蛋白保护剂和/或菌体保护剂后，喷雾干燥获得含有纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶的混合产品。
实施例2一种饲料添加剂
将按照实施例1方法1或方法2制备得到的纳豆芽孢杆菌FK001发酵液加入到冷水暂存罐，加入与发酵液的质量比为1:0.01-0.5的辅料，辅料为二氧化硅、沸石粉、硅藻土、麦芽糊精中的一种或几种，并搅拌均匀；使用高速离心喷雾干燥机，控制进口温度120-160℃，出口温度70-90℃，把上述混合液体喷雾干燥至水分含量≤10％；取喷干后菌粉适量与大米蛋白粉和玉米蛋白粉混合制成有效活菌数在200-2000*108cfu/g的饲料添加剂菌粉。
实施例3一种提纯的纳豆激酶及其相关应用
按照实施例1方法1或方法2制备得到的纳豆芽孢杆菌FK001发酵液，向其中加入辅料，辅料为按照占发酵液质量分数为0.05％聚丙烯酰胺、0.5％碳酸钙、1％硅藻土、0.5％沙石粉、0.5％聚谷氨酸中的一种或几种；静置，待出现明显分层现象后；使用高速离心机离心，收集离心清液，弃去下沉淀(去除菌体及残留培养基)；把离心清液经过板框压滤机再次过滤除渣，制备得到高纯度纳豆激酶发酵液，经过低温浓缩设备，浓缩至固形物为10％-30％；浓缩液中加入与浓缩液质量比为1:0.01-0.5的辅料，辅料为西瓜汁粉和麦芽糊精中的一种或几种，并搅拌均匀；使用高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，控制进口温度90-140℃，出口温度60-80℃，喷雾干燥至水分含量5％以下，即得纳豆激酶粉产品。可用作食品添加剂、保健品添加剂、饲料添加剂或药品添加剂。
实施例4一种肥料
按照实施例1方法1或方法2制备得到的纳豆芽孢杆菌FK001发酵液加入至腐殖酸溶液，搅拌均匀后，即得肥料产品，所得新型肥料有效活菌数可根据需要进行调配，使用此方式制备的新型肥料具有状态稳定、不分层，不胀气的特点；所述的腐殖酸溶液的制备方法为：制备浓度为10-40％的腐殖酸或腐殖酸钾或腐殖酸钠水溶液于搅拌罐，并调节pH至4.0-8.0；添加1-10％的分散剂NF，0.5-10％的甘油，并搅拌均匀。
实验例
现针对多个纳豆芽孢杆菌各项性能进行对比：
Figure BDA0002335530890000071
Figure BDA0002335530890000081

Claims (10)

1.一株纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌FK001，保藏编号为：CGMCC No.18081。
2.一种纳豆芽孢杆菌发酵液，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌发酵液由权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌FK001接种于培养基中培养得到。
3.根据权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌发酵液，其特征在于，所述的培养基为纳豆芽孢杆菌发酵培养基，所述的纳豆芽孢杆菌发酵培养基包括糖蜜、豆饼粉、氯化钙、硫酸铵、硫酸镁、玉米浸渍液、磷酸二氢钾中的一种或多种。
4.权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌或权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌发酵液在制备食品添加剂、保健品添加剂、饲料及其添加剂、肥料及其添加剂中的应用。
5.一种食品添加剂，其特征在于，所述的食品添加剂包括权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌的培养物。
6.一种食品添加剂，其特征在于，所述的食品添加剂包括权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌发酵液或其提取物。
7.一种饲料或饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料或饲料添加剂包括权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌的培养物。
8.一种饲料或饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料或饲料添加剂包括权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌发酵液或其提取物。
9.一种肥料或肥料添加剂，其特征在于，所述的肥料或肥料添加剂包括权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌的培养物。
10.一种肥料或肥料添加剂，其特征在于，所述的肥料或肥料添加剂包括权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌发酵液或其提取物。
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