CN108485669A - 海藻活性提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海藻活性提取物，其制备方法包括：预处理、脱脂、发酵、提取、纯化，首先将新鲜海藻经清洗、晾晒、干燥、粉碎得海藻干粉，在海藻干粉中加入分析纯丙酮进行脱脂，在脱脂残渣与蒸馏水的混合液中接种入海滨芽孢杆菌进行发酵，将发酵液脱水后先后进行醇提与水提，在提取浓缩液中加入氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯的混合溶液进行纯化，经洗涤干燥后即得海藻活性提取物。本发明还公开了海藻活性提取物在土壤土质改良剂中的用途。有益效果为：海藻活性提取物中海藻糖的含量可达93‑95%，大大提高了海藻糖的利用价值，海藻提取物应用于土壤土质改良剂中可改善土壤微环境，改善土壤土质。

Description

海藻活性提取物及其用途

技术领域

本发明涉及海藻深加工领域，尤其是涉及海藻活性提取物及其用途。

技术背景

“海藻”是海带、紫菜、裙带菜、石花菜等海洋藻类的总称，是生长在海中的藻类，是植物界的隐花植物，藻类包括数种不同类以光合作用产生能量的生物。它们一般被认为是简单的植物，主要特征为：无维管束组织，没有真正根、茎、叶的分化现象；不开花，无果实和种子；生殖器官无特化的保护组织，常直接由单一细胞产生孢子或配子；以及无胚胎的形成。由于与陆地植物有不同的代谢途径和代谢产物，海藻的化学成分复杂，种类多，据报道有60 多种，包括大量钙、铁、镁、锌等矿质营养元素，褐藻淀粉、岩藻多糖、褐藻糖胶、木聚糖、葡聚糖等海藻多糖，还有糖醇、氨基酸、维生素、细胞色素、甜菜碱以及酚类化合物等，此外，还含有生长素、细胞激动素、赤霉素、脱落酸等天然激素类物质。

发明内容

本发明的目的在于提供海藻活性提取物及其用途，海藻活性提取物的提取方法简单易行，提取过程强化了海滨芽孢杆菌的发酵能力，强化糖与结合蛋白的分离，提高了分离效率，还可以大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率，提高海藻糖的得率与含量，海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂。

本发明所用的微生物及其购买企业为：海滨芽孢杆菌，上海酶研生物科技有限公司。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：海藻活性提取物，其制备方法包括：预处理、脱脂、发酵、提取、纯化、洗涤，具体包括以下步骤：

预处理：将采获的新鲜海藻用自来水清洗4-5次，在26-30℃温度下晾晒3-5天，于55-60℃烘箱中烘48-60小时得到干燥海藻，粉碎后过80-120目筛得海藻干粉；预处理可将附着在海藻表层的盐分、贝类、沙土等污物清洗干净，然后将海藻制成粉状有助于后续操作；

脱脂：在海藻干粉中加入8-10倍分析纯丙酮，搅拌脱脂3-4小时，以4000-5000r/min离心5-8分钟，弃去上清液，沉淀中再加入海藻干粉4-5倍的分析纯丙酮，重复以上操作，最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收；以分析纯级丙酮脱脂简单易控，不会破坏海藻中活性物质的结构与性质，同时丙酮可以回收再利用，降低了成本；

发酵：将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18-20mL的固液比混合，调节混合液pH至6.5-6.8，121-122℃灭菌15-18分钟，待混合液温度降至室温后，接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵，种子液接种量为5-8%，在38-42℃、80-150r/min条件下发酵10-16小时，发酵结束后，离心取上清液即为海藻发酵液；通过海滨芽孢杆菌发酵处理，海藻脱脂残渣中的糖与结合蛋白会分离，蛋白质进一步降解为多肽及氨基酸等小分子，其中的活性糖分得以保留，方便后续对糖分的提取；

提取：将海藻发酵液低温脱水至密度为1.1-1.2g/mL得发酵液浸膏，按质量体积比为1g:5-10mL将体积分数90-95%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中，于65-70℃水浴中提取15-30分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次，收集滤渣；在滤渣中加入12-15倍重量份的蒸馏水，于55-60℃水浴中提取45-60分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次，合并滤液并低温浓缩得浓缩液；醇提与水提结合可以大大提高海藻多糖的得率，不会破坏多糖的结构，同时提取溶剂容易除去，不会增加除杂工序；

纯化：将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比80-85:12-15:1:0.2-0.25的比例混合均匀得混合溶液，酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.5-15.8:1；在不断搅拌下，按照体积比2-4:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中，密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌20-30分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出变性蛋白，按上述步骤重复操作2-3次，使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液；氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白转变为不溶性物质，经离心去除，可以达到去除海藻糖中蛋白质的目的；特定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用，可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用，因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量，大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率，提高海藻糖的得率与含量，降低提取成本；

洗涤：向海藻糖粗提液加入5-8倍体积分数为95-98%的乙醇溶液，静置过夜后离心，分离出固形物，分别以98-99%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物，冷冻干燥，即得海藻活性提取物；海藻活性提取物中海藻糖的含量可达93-95%，大大提高了海藻糖的利用价值；海藻糖类分子链上含有大量的羟基与羧基，均带负电荷，与金属离子络合成高分子量的复合物，这些复合物的吸水能力强劲，可以有效增强土壤的保水能力，同时，海藻提取物本身又具有一定粘性，能改善土壤团粒结构，提高土壤通气性，土壤水分含量及通气状况发生改变，其氧化还原状态随之发生改变，因此，海藻提取物能间接影响土壤微生物数量、活性及群落结构。

作为优选，发酵步骤的蒸馏水中含有0.5-0.8‰的4-羟基苯甲醇与0.1-0.16‰的间氯苯丙酮；特殊配比的4-羟基苯甲醇与间氯苯丙酮具有协同增效作用，该作用可以作用于体系中的海滨芽孢杆菌，并促使海滨芽孢杆菌增强糖酵解反应，提供更多的活化乙酸，进而提高体系中乙酰辅酶A的含量，增多乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸的量，进一步强化海滨芽孢杆菌的柠檬酸循环，促进海滨芽孢杆菌的生长繁殖，提高对海藻脱脂残渣的发酵，强化糖与结合蛋白的分离，提高分离效率。

海藻活性提取物的用途，海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂，海藻活性提取物及其复合物具有较高的吸水、保水能力，同时其粘性特征使其有助于改善土壤团粒结构，提高土壤通气性，能够间接影响土壤微生物数量、活性及其群落结构，可改善土壤微环境，改善土壤土质。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）本发明在发酵的同时会强化海滨芽孢杆菌的柠檬酸循环，促进海滨芽孢杆菌的生长繁殖，提高对海藻脱脂残渣的发酵，强化糖与结合蛋白的分离，提高分离效率；

2）定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用，可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用，因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量，大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率，提高海藻糖的得率与含量，降低提取成本；

3）海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂，海藻活性提取物及其复合物具有较高的吸水、保水能力，同时其粘性特征使其有助于改善土壤团粒结构，提高土壤通气性，能够间接影响土壤微生物数量、活性及其群落结构，可改善土壤微环境，改善土壤土质。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

海藻活性提取物，其制备方法包括以下步骤：

1）将采获的新鲜海藻用自来水清洗4次，在26℃温度下晾晒3天，于55℃烘箱中烘48小时得到干燥海藻，粉碎后过80目筛得海藻干粉；2）在海藻干粉中加入8倍分析纯丙酮，搅拌脱脂3小时，以4000r/min离心5分钟，弃去上清液，沉淀中再加入海藻干粉4倍的分析纯丙酮，重复以上操作，最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收；3）将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18mL的固液比混合，调节混合液pH至6.5，121℃灭菌15分钟，待混合液温度降至室温后，接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵，种子液接种量为5%，在38℃、80r/min条件下发酵10小时，发酵结束后，离心取上清液即为海藻发酵液；4）将海藻发酵液低温脱水至密度为1.1g/mL得发酵液浸膏，按质量体积比为1g:5mL将体积分数90%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中，于65℃水浴中提取15分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次，收集滤渣；在滤渣中加入12倍重量份的蒸馏水，于55℃水浴中提取45分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次，合并滤液并低温浓缩得浓缩液；5）将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比80:12:1:0.2的比例混合均匀得混合溶液，酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.5:1；在不断搅拌下，按照体积比2:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中，密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌20分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出变性蛋白，按上述步骤重复操作2次，使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液；6）向海藻糖粗提液加入5倍体积分数为95%的乙醇溶液，静置过夜后离心，分离出固形物，分别以98%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物，冷冻干燥，即得海藻活性提取物。

实施例2：

海藻活性提取物，其制备方法包括以下步骤：

1）预处理：将采获的新鲜海藻用自来水清洗5次，在30℃温度下晾晒5天，于60℃烘箱中烘60小时得到干燥海藻，粉碎后过120目筛得海藻干粉；预处理可将附着在海藻表层的盐分、贝类、沙土等污物清洗干净，然后将海藻制成粉状有助于后续操作；

2）脱脂：在海藻干粉中加入10倍分析纯丙酮，搅拌脱脂4小时，以5000r/min离心8分钟，弃去上清液，沉淀中再加入海藻干粉5倍的分析纯丙酮，重复以上操作，最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收；以分析纯级丙酮脱脂简单易控，不会破坏海藻中活性物质的结构与性质，同时丙酮可以回收再利用，降低了成本；

3）发酵：将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g: 20mL的固液比混合，调节混合液pH至6.8，122℃灭菌18分钟，待混合液温度降至室温后，接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵，种子液接种量为8%，在42℃、150r/min条件下发酵16小时，发酵结束后，离心取上清液即为海藻发酵液；通过海滨芽孢杆菌发酵处理，海藻脱脂残渣中的糖与结合蛋白会分离，蛋白质进一步降解为多肽及氨基酸等小分子，其中的活性糖分得以保留，方便后续对糖分的提取；

4）提取：将海藻发酵液低温脱水至密度为1.2g/mL得发酵液浸膏，按质量体积比为1g:10mL将体积分数95%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中，于70℃水浴中提取30分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取3次，收集滤渣；在滤渣中加入15倍重量份的蒸馏水，于60℃水浴中提取60分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取3次，合并滤液并低温浓缩得浓缩液；醇提与水提结合可以大大提高海藻多糖的得率，不会破坏多糖的结构，同时提取溶剂容易除去，不会增加除杂工序；

5）纯化：将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比85:15:1: 0.25的比例混合均匀得混合溶液，酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.8:1；在不断搅拌下，按照体积比4:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中，密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌30分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出变性蛋白，按上述步骤重复操作3次，使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液；氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白转变为不溶性物质，经离心去除，可以达到去除海藻糖中蛋白质的目的；特定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用，可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用，因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量，大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率，提高海藻糖的得率与含量，降低提取成本；

6）洗涤：向海藻糖粗提液加入8倍体积分数为98%的乙醇溶液，静置过夜后离心，分离出固形物，分别以99%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物，冷冻干燥，即得海藻活性提取物；海藻活性提取物中海藻糖的含量可达95%，大大提高了海藻糖的利用价值；海藻糖类分子链上含有大量的羟基与羧基，均带负电荷，与金属离子络合成高分子量的复合物，这些复合物的吸水能力强劲，可以有效增强土壤的保水能力，同时，海藻提取物本身又具有一定粘性，能改善土壤团粒结构，提高土壤通气性，土壤水分含量及通气状况发生改变，其氧化还原状态随之发生改变，因此，海藻提取物能间接影响土壤微生物数量、活性及群落结构。

实施例3：

海藻活性提取物，其制备方法包括：预处理、脱脂、发酵、提取、纯化、洗涤，具体包括以下步骤：

预处理：将采获的新鲜海藻用自来水清洗4次，在28℃温度下晾晒4天，于55℃烘箱中烘48小时得到干燥海藻，粉碎后过100目筛得海藻干粉；预处理可将附着在海藻表层的盐分、贝类、沙土等污物清洗干净，然后将海藻制成粉状有助于后续操作；

脱脂：在海藻干粉中加入8倍分析纯丙酮，搅拌脱脂4小时，以4500r/min离心6分钟，弃去上清液，沉淀中再加入海藻干粉5倍的分析纯丙酮，重复以上操作，最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收；以分析纯级丙酮脱脂简单易控，不会破坏海藻中活性物质的结构与性质，同时丙酮可以回收再利用，降低了成本；

发酵：将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18mL的固液比混合，调节混合液pH至6.7，121℃灭菌15分钟，待混合液温度降至室温后，接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵，种子液接种量为6%，在40℃、120r/min条件下发酵15小时，发酵结束后，离心取上清液即为海藻发酵液；通过海滨芽孢杆菌发酵处理，海藻脱脂残渣中的糖与结合蛋白会分离，蛋白质进一步降解为多肽及氨基酸等小分子，其中的活性糖分得以保留，方便后续对糖分的提取；

提取：将海藻发酵液低温脱水至密度为1.1g/mL得发酵液浸膏，按质量体积比为1g:8mL将体积分数94%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中，于68℃水浴中提取25分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次，收集滤渣；在滤渣中加入14倍重量份的蒸馏水，于55℃水浴中提取45分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次，合并滤液并低温浓缩得浓缩液；醇提与水提结合可以大大提高海藻多糖的得率，不会破坏多糖的结构，同时提取溶剂容易除去，不会增加除杂工序；

纯化：将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比84:14:1:0.2的比例混合均匀得混合溶液，酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.6:1；在不断搅拌下，按照体积比3:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中，密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌25分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出变性蛋白，按上述步骤重复操作3次，使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液；氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白转变为不溶性物质，经离心去除，可以达到去除海藻糖中蛋白质的目的；特定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用，可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用，因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量，大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率，提高海藻糖的得率与含量，降低提取成本；

洗涤：向海藻糖粗提液加入7倍体积分数为96%的乙醇溶液，静置过夜后离心，分离出固形物，分别以98%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物，冷冻干燥，即得海藻活性提取物；海藻活性提取物中海藻糖的含量可达93-95%，大大提高了海藻糖的利用价值；海藻糖类分子链上含有大量的羟基与羧基，均带负电荷，与金属离子络合成高分子量的复合物，这些复合物的吸水能力强劲，可以有效增强土壤的保水能力，同时，海藻提取物本身又具有一定粘性，能改善土壤团粒结构，提高土壤通气性，土壤水分含量及通气状况发生改变，其氧化还原状态随之发生改变，因此，海藻提取物能间接影响土壤微生物数量、活性及群落结构。

发酵步骤的蒸馏水中含有0.6‰的4-羟基苯甲醇与0.12‰的间氯苯丙酮；特殊配比的4-羟基苯甲醇与间氯苯丙酮具有协同增效作用，该作用可以作用于体系中的海滨芽孢杆菌，并促使海滨芽孢杆菌增强糖酵解反应，提供更多的活化乙酸，进而提高体系中乙酰辅酶A的含量，增多乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸的量，进一步强化海滨芽孢杆菌的柠檬酸循环，促进海滨芽孢杆菌的生长繁殖，提高对海藻脱脂残渣的发酵，强化糖与结合蛋白的分离，提高分离效率。

海藻活性提取物的用途，海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂，海藻活性提取物及其复合物具有较高的吸水、保水能力，同时其粘性特征使其有助于改善土壤团粒结构，提高土壤通气性，能够间接影响土壤微生物数量、活性及其群落结构，可改善土壤微环境，改善土壤土质。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.海藻活性提取物，其制备方法包括：预处理、脱脂、发酵、提取、纯化、洗涤，其特征在于：所述发酵步骤为：将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18-20mL的固液比混合，调节混合液pH至6.5-6.8并灭菌，待混合液温度降至室温后，接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵，种子液接种量为5-8%，发酵结束后，离心取上清液即为海藻发酵液。

2.根据权利要求1所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述发酵步骤的蒸馏水中含有0.5-0.8‰的4-羟基苯甲醇与0.1-0.16‰的间氯苯丙酮。

3.根据权利要求1所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述发酵步骤中的发酵温度为38-42℃，摇床转速为80-150r/min，发酵时间为10-16小时。

4.根据权利要求1所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述预处理步骤为：将采获的新鲜海藻用自来水清洗，晾晒后于55-60℃烘箱中烘48-60小时得到干燥海藻，粉碎后过80-120目筛得海藻干粉。

5.根据权利要求1所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述脱脂步骤为：在海藻干粉中加入8-10倍分析纯丙酮，搅拌脱脂3-4小时，离心弃去上清液，沉淀中再加入海藻干粉4-5倍的分析纯丙酮，重复以上操作，最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收。

6.根据权利要求1所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述提取步骤为：将海藻发酵液低温脱水得发酵液浸膏，按质量体积比为1g:5-10mL将体积分数90-95%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中，于65-70℃水浴中提取15-30分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次，收集滤渣；在滤渣中加入12-15倍重量份的蒸馏水，于55-60℃水浴中提取45-60分钟，过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次，合并滤液并低温浓缩得浓缩液。

7.根据权利要求6所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述提取步骤中，发酵液浸膏的密度为1.1-1.2g/mL。

8.根据权利要求1所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述纯化步骤为：将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯混合均匀得混合溶液，在不断搅拌下，按照体积比2-4:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中，密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌20-30分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出变性蛋白，按上述步骤重复操作2-3次，使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液。

9.根据权利要求8所述的海藻活性提取物，其特征在于：所述纯化步骤中，氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯的体积比为80-85:12-15:1:0.2-0.25，酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.5-15.8:1。

10.海藻活性提取物的用途，其特征在于：所述海藻活性提取物及其复合物在土壤土质改良剂中的用途。