CN104357529A - 增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-l-古龙酸能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过对酮古龙酸菌（ Ketogulonogenium vulgarum ，小菌）代谢网络分析的研究结果，公开了一种在维生素C二步发酵法的混菌发酵过程中，通过添加更利于小菌利用的碳源（包括2碳单位如乙醇、乙醛及乙酸（盐）及6碳单位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖），从而增强小菌糖代谢效率，提高菌体数量，大幅度降低2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）发酵周期，提高生产效率的方法。在5L发酵罐中，可降低周期14.04%，提高收率3.40%。本发明的另一方面应用，是通过降低小菌将L-山梨糖作为碳源利用，亦提高了L-山梨糖转化为2-KGA的效率。该发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，是对我国将近四十年生物发酵法制备维生素C工艺的改造和提升。而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。

Description

增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-L-古龙酸能力的方法

技术领域:

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种通过对微生物碳源组成的选择与优化，使酮古龙酸菌产2-KGA(2-酮基-L-古龙酸)能力提高的方法，以及改造维生素C发酵工艺。

背景技术：

维生素C(VC)是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其应用范围广阔，市场规模巨大。

目前，全球90％以上的VC生产，均利用我国发明的“二步发酵法”。其第一步发酵是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。最后经过化学转化使2-KGA生成VC。

“二步发酵法”的主要特点是在第二步发酵过程中，由于芽孢杆菌Bacillus sp.(俗称大菌)的伴生作用，酮古龙酸菌Ketogulonigenium sp.(俗称小菌)的生长和2-KGA的产率得到很大提高，但大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作用是辅助小菌生长。故小菌作为2-KGA产生菌，对其代谢能力的增强一直是学者们的研究热点。

本发明前期通过对混菌培养种液培养基及发酵培养基营养成份的考察发现，其主要碳源为L-山梨糖，L-山梨糖即作为碳源被小菌自身生长代谢所需，又作为合成2-KGA的底物，而大菌则不能利用L-山梨糖作为碳源，主要是利用玉米浆中存在的少量碳源满足自身生长所需。故在实际发酵过程中，一方面由于小菌直接利用底物L-山梨糖作为碳源，导致产物2-KGA转化率降低，另一方面由于培养基中碳源种类单一，限制了菌体生长的数量与代谢能力，故亦直接影响了产2-KGA的发酵速率。

本发明分别是建立在对大小菌全基因组的测序与功能注释的基础上，通过对大小菌糖代谢网络的分析，发现并验证了一批可以在混菌发酵过程中，被小菌很好利用并具有促进菌体生长，提高发酵效率的廉价碳源，包括：二碳单位如乙醇、乙醛及乙酸(盐)及六碳单位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖。

本发明公开前，未见有将上述碳源应用在维生素C二步发酵混菌发酵的报道和专利。

发明内容：

本发明的目的在于利用廉价的除L-山梨糖外的小菌可利用的碳源，添加到常规种液或发酵液中，用以提高2-KGA收率、降低发酵周期。

实际上，本发明涉及一种通过对微生物碳源组成的选择与优化，使酮古龙酸菌产2-KGA能力提高的方法以及工艺。

进一步说，上述的碳源组成包括：二碳单位碳源、六碳单位碳源中的一种或几种，具体地，所述的碳源包括乙醇、乙醛、乙酸(盐)、D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖中的一种或几种。

本发明还提供了用于制备种液的培养基及用于发酵的培养基，该培养基包括制备种液及发酵液的常规培养基，其特征在于：培养基包括所述碳源中的至少一种物质，所述碳源物质在培养基中出现的方式包括直接加入也包括以其它混合物形式加入。

上述培养基中，所述各碳源物质加入量为0.02％-2％。当添加量低于下限，对混菌发酵促进作用不明显，当添加量高于上限时，或对菌体生长不利，或产2-KGA减少，或造成原料的浪费。

上述常规培养基一般来讲，既为目前VC二步发酵工业生产中使用的培养基，具体由下列成份组成：

1.常规种液培养基：1-3％L-山梨糖，0.3-1％玉米浆，0.1-0.5％葡萄糖，0.05-0.3％尿素，0.1-0.3％碳酸钙，pH 6.7-7.0，121℃灭菌20min。

2.常规发酵培养基：8-12％L-山梨糖、0.3-3％玉米浆、0.05-0.2％磷酸二氢钾,0.05-0.5％尿素，0.005-0.02％硫酸镁，0.1-0.5％碳酸钙，pH6.7-7.0，其中碳源(L-山梨糖)和氮源分开灭菌，灭菌条件为121℃，20min。

在种液培养基及发酵培养基中加入上述至少一种二碳及六碳单位是本发明的重点。这些物质既可以在培养基配制的时候添加，也可以在发酵开始后以补料方式加入。

本发明的技术方案见实施例。

实验发现，在常规种液中单独或者复合添加二碳或六碳单位碳源，能明显提高种液中大小菌的数量，并在进一步的发酵过程中降低发酵周期，但转化率提升不大。在常规发酵液中单独或者复合添加二碳或六碳单位碳源亦可提高大小菌数量，并在降低发酵周期的同时，明显提高2-KGA转化率。

本发明揭示了在添加二碳单位或六碳单位碳源后，可以增强菌体对碳源的利用率，进而明显提高菌体生长及产2-KGA效率，该发明将对工业水平上进一步提高产率，降低生产成本起到积极的作用。

附图说明

下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步详细说明：

图1是基于小菌全基因组测序及代谢网络分析构建的小菌主要碳代谢途径。其中实线框里的物质代表本专利涉及到的六碳与二碳单位，双向箭头代表反应可逆，单向箭头代表反应不可逆，箭头上的数字代表该反应酶的EC编号，虚线箭头代表省略的代谢步骤。

如图1，基于对酮古龙酸菌的碳代谢网络分析可知，小菌体内存在完整的三羧酸循环途径(TCA)及磷酸戊糖途径(PPP)，而酵解途径(ED)中因缺乏将6P-果糖转化为1,6-2P-果糖的6P-果糖激酶(EC 2.7.1.11)，故导致小菌不能直接利用D-葡萄糖经酵解途径转化为丙酮酸并进一步转化成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，而是通过进入PPP途径将碳源转化为3P-甘油醛，一部分3P-甘油醛逆ED途径转化为6P-葡萄糖重新流入PPP途径，另一部分3P-甘油醛则进入ED途径下半程，经丙酮酸转化为乙酰辅酶A进入TCA循环。

故在小菌体内L-山梨糖的代谢途径是先经磷酸转运系统(PTS)跨膜磷酸化后再转化为6P-山梨醇，并进一步转化为6P-果糖后参与碳代谢过程。基因组注释表明，小菌PTS系统亦可转运D-山梨糖、D-甘露醇与D-甘露糖，并且这3种六碳单位进入体内磷酸化后只经一步便转化为6P-果糖，故认为这3种碳源具有比L-山梨糖更好的利用程度。

同时亦发现，在酵解的后半程，小菌缺乏将乙酰辅酶A转化为乙酸的乙酰辅酶裂解酶(EC 6.2.1.13)，故不能通过乙酰辅酶A转化为乙酸，但是却存在乙酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.1)可将乙酸转化为乙酰辅酶A，同时该代谢途径中，乙酸、乙醛及乙醇亦可相互转化，故认为小菌可以利用二碳单位乙酸、乙醛及乙醇作为碳源。

为了更好的阐明六碳单位及二碳单位对提高产2-KGA水平的应用，下面将描述本发明的四个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。

实施实例1：单因素条件下考察常规种液中添加二碳及六碳单位对产2-KGA能力的影响

分别在各个常规种子培养基中加入的上述二碳及六碳单位碳源，浓度均依次为0.02％，0.2％，2％。

常规种子培养基为：2％L-山梨糖，0.5％玉米浆,0.2％葡萄糖,0.1％尿素0.2％碳酸钙，pH6.7-7.0。

常规发酵培养基为：8％L-山梨糖,1.5％玉米浆,0.1％磷酸二氢钾,0.1％尿素，0.01％硫酸镁，0.5％碳酸钙，pH6.7-7.0。

培养条件：混菌培养的斜面分别接种于添加了不同二碳或六碳单位的普通种液培养基中，30℃220转/分，摇瓶培养20h制成种液，10％接种于普通发酵培养基中，30℃220转/分，摇瓶培养至底物L-山梨糖小于1mg/L发酵结束。实验结果见表1.

表1.单因素条件下种液中添加0.02％，0.2％及2％的二碳及六碳单位碳源对发酵的影响.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表1可知，上述6种碳源均对小菌的生长具有明显的促进作用，其中六碳单位亦对大菌的生长具有明显的促进作用。由于种液中菌体数量的大幅提高，从而明显的缩短了进一步的发酵周期，但转化率与对照组比较差异不大。

实施实例2：单因素条件下考察常规发酵液中添加二碳及六碳单位对产2-KGA能力的影响

分别在各个常规发酵培养基中加入上述二碳及六碳单位碳源，浓度为0.025％，0.25％及2.5％。

常规种子培养基：参见实例1.

常规发酵培养基为：参见实例1.

培养条件：参见实例1.实验结果见表2.

表2.考察单因素条件下，发酵液中添加0.025％，0.25％及2.5％二碳及六碳单位碳源对发酵的影响

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表2可知，上述6种碳源均对小菌的生长具有明显的促进作用，其中六碳单位亦对大菌的生长具有明显的促进作用，由于发酵液中菌体数量的大幅提高，从而明显的缩短了发酵周期，该趋势与实例1相似。在发酵液中添加其它碳源后可以明显的降低L-山梨糖的损失，进而提高了2-KGA的产量。

实施实例3：优化后的二碳及六碳单位组合添加到种液或发酵液中对产2-KGA能力的影响

常规种子培养基：参见实例1.

常规发酵培养基为：参见实例1.

培养条件：参见实例1.

利用正交分析法在种液中添加不同二碳及六碳单位组合，以发酵液发酵周期为结果，考察种液中添加不同二碳及六碳单位组合对最终发酵周期的影响，实验结果见表3.

表3.L₃₂(4^6)4水平6因素种液添加二碳及六碳单位组合正交分析结果.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表3.可知，加入常规种液培养基中的最佳碳源组合为：0.15％D-甘露醇，0.05％D-甘露糖，0.15％乙醇及0.1％乙酸钠。

利用正交分析法在发酵液中添加不同二碳及六碳单位组合，以发酵液2-KGA转化率为结果，考察种液中添加不同二碳及六碳单位组合对最终发酵收率的影响，实验结果见表4.

表4.L₃₂(4^6)4水平6因素发酵液添加二碳及六碳单位组合正交分析结果.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表4.可知，加入常规发酵培养基中的最佳碳源组合为：0.15％D-山梨醇，0.1％D-甘露醇，0.1％D-甘露糖，0.05％乙醛及0.1％乙酸钠。

进一步考察并验证三种情况下优选碳源组合对产2-KGA的影响：

实验组1：只在常规种液中添加碳源组合；

实验组2：只在常规发酵液中添加碳源组合；

实验组3：在常规种液及发酵液中均添加碳源组合。

结果见表5.

表5.优化后的二碳及六碳单位组合添加到种液或发酵液中对发酵能力的影响.

由表5可知，无论是只在种液中添加最佳碳源组合还是在发酵液中添加最佳碳源组合均较只添加单一组分碳源对产2-KGA的促进作用强。只在种液中添加碳源组合较对照组发酵可降低周期12.78％，但收率未见明显提升(较对照组提高1.39％)；只在发酵液中添加碳源组合可较对照组降低发酵周期17.11％，同时2-KGA转化率较对照组提高5.22％；进一步的在种液及发酵液中均添加碳源组合，可以进一步将周期降低18.14％，同时2-KGA转化率提升6.03％。

实施实例4：将优化后的二碳六碳组合应用于采用流加工艺的5L发酵系统中对产2-KGA能力的影响

常规种子培养基：参见实例1.

常规流加工艺发酵培养基：

(1)基液：2％L-山梨糖，2％玉米浆，0.1％磷酸二氢钾,0.12％尿素，0.01％硫酸镁，pH6.7-7.0。

(2)流加液1：30％L-山梨糖

(3)流加液2：25％碳酸钠

(4)流加液3：5％泡敌

进一步优化工艺，确定种子培养基添加物质与实例3一致。发酵液中基液中添加的最佳碳源组合为：0.15％D-山梨醇、0.05％甘露糖及0.05％乙酸钠；流加液1中添加的最佳碳源组合为：0.1％D-山梨醇及0.05％乙酸钠。

培养条件：将制好的种液(种液的制备参见实例3)10％接种于5L发酵罐基底中，培养8h后，开始流加底物L-山梨糖(流加液1)，流加期间保证L-山梨糖的浓度为2-4％，流入的总糖量为终点发酵液的10％。发酵期间，溶氧(DO)控制在20-30％，利用流加液2控制在pH 6.7-7.0，温度维持在28-30℃，当底物L-山梨糖小于1mg/L发酵结束。

分别考察三种情况下碳源组合对产2-KGA的影响：

实验组1：只在种液中添加碳源组合；

实验组2：只在发酵液中添加碳源组合；

实验组3：在种液及发酵液中均添加碳源组合。

实验结果见表4.

表6.优化后的二碳及六碳单位组合在5L发酵罐中对产2-KGA能力的影响

由表6可知，无论是只在种液中添加碳源组合还是在发酵液中添加碳源组合均较对照组对产2-KGA的促进作用强。只在种液中添加碳源组合可以明显的降低发酵周期(降低11.54％)但对转化率的提升影响不大(提升0.23％)；只在发酵液中添加碳源组合虽然2-KGA转化率明显提高(提升2.72％)，但发酵周期比情况1延长，但仍较对照降低10.57％；在种液和发酵液中均添加碳源组合后，发酵周期亦进一步缩短(较对照降低14.04％)，优于情况1与情况2，同时转化率较对照提高3.40％，故提示该发酵工艺具有良好的应用价值。

本发明所用的碳源物质组合较为廉价，用量较少，其使用成本低于转化率提高后多产出的2-KGA成本，故有望在实际工业发酵过程中进一步提高2-KGA收率，降低成本。

Claims (8)

1. 增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-L-古龙酸能力的方法，其特征在于，在酮古龙酸菌（小菌）与巨大芽孢杆菌（大菌）混菌发酵过程中加入二碳单位或六碳单位碳源中的一种或几种。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二碳单位包括乙醇、乙醛及乙酸（盐），所述的六碳单位包括D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖。

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的种液培养基为：1-3% L-山梨糖，0.3-1% 玉米浆，0.1-0.5% 葡萄糖，0.05-0.3% 尿素，0.1-0.3% 碳酸钙，pH 6.7-7.0，121℃灭菌20 min。

4. 根据权利要求1-3任何一项所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：8-12% L-山梨糖、0.3-3% 玉米浆、0.05-0.2% 磷酸二氢钾,0.05-0.5% 尿素，0.005-0.02% 硫酸镁，0.1-0.5% 碳酸钙，pH6.7-7.0，其中碳源（L-山梨糖）和氮源分开灭菌，灭菌条件为121℃，20min。

5. 根据权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于，所述的二碳或六碳单位的加入量分别为0.02%-2%（m/v）。

6. 根据权利要求1-5任何一项所述的方法，其特征在于，所述的二碳或六碳单位在培养基配制的时候添加，或在发酵开始后以补料方式加入。

7. 根据权利要求1-6任何一项所述的方法，其特征在于，加入种液培养基中的二碳或六碳单位为：0.15% D-甘露醇，0.05% D-甘露糖，0.15% 乙醇及0.1% 乙酸钠。

8. 根据权利要求1-6任何一项所述的方法，其特征在于，加入发酵培养基中的二碳或六碳单位为：0.15% D-山梨醇，0.1% D-甘露醇，0.1% D-甘露糖，0.05% 乙醛及0.1% 乙酸钠。