CN1246156A - 新型细菌菌株和其在2-酮-l-古洛糖酸发酵生产工艺中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过发酵转化L-山梨糖和/或D-山梨糖醇来生产2-酮-L-古洛糖酸的工艺。本发明还涉及可用于该工艺的新的细菌菌株。
Description
发明领域
本发明涉及通过L-山梨糖和/或D-山梨糖醇的发酵转化来生产2-酮-L-古洛糖酸的工艺。本发明还涉及可用于该工艺的新的细菌菌株。
发明背景
2-酮-L-古洛糖酸(“2-KLG”)是一种必需的营养物质L-抗坏血酸(维生素C)制备过程中的一种重要中间产物。在过去已经用Reichstein法(Helvetica Chimica Acta17:311(1934))以工业规模合成了2-KLG。但是,这种方法在商业应用中有许多缺点,包括使用大量溶剂并涉及许多复杂的反应步骤。
因此,作为Reichstein法的一种替代方法,已经开发了许多利用一种或多种微生物的方法以通过发酵生产2-KLG。例如美国专利2421,611公开了一种方法,该方法包括将D-葡萄糖通过微生物氧化形成5-酮-D-葡糖酸,然后通过化学或微生物还原法还原成L-艾杜糖酸,再经微生物氧化形成2-KLG。例如日本专利公开号39-14493,53-25033,56-15877和59-35290公开了相似的工艺,所述工艺包括将D-葡萄糖经微生物氧化形成2,5-二酮-D-葡糖酸,然后通过微生物或化学还原形成2-KLG。
但是,这些方法也有许多会降低其在2-KLG商业生产中的有用性的缺点。例如,在这些方法中的化学还原步骤(即将5-酮-D-葡糖酸还原成L-艾杜糖酸以及将2,5-二酮-D-葡糖酸还原成2-KLG)同时伴有还原反应的立体化学的问题(因此,分别产生副产物D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸),由此降低了2-KLG的产率。或者,当用一种或多种微生物完成该还原反应时,需要过量的糖以便为所述还原反应提供能源,这也会降低2-KLG的产率。
为了解决这些问题,使用另一途径来发酵生产2-KLG,该途径仅需将L-山梨糖经山梨糖酮(sorbosone)中间产物氧化成2-KLG。已经开发出了许多利用该途径的方法,所述方法使用来自下列各属的微生物:葡糖杆菌属,如氧化葡糖杆菌(美国专利4935359;4960695;5312741和5541108),假葡糖杆菌属(Pseudogluconobacter)如Pseudogluconobactersaccharoketogenes(美国专利4877735;欧洲专利221707),假单胞菌如Pseudomonas sorbosoxidans(美国专利4933289和4892823),以及来自这些和其他属如醋杆菌属,芽孢杆菌属、沙雷氏菌属,分枝杆菌属和链霉菌属的微生物混合物(美国专利3912592;3907639和3234105)。
但是,这些工艺有某些缺点,限制了它们在2-KLG商业生产中的应用。例如,上述利用氧化葡糖杆菌的工艺也需要存在其他“辅助”微生物菌株,如巨大芽孢杆菌,或者商业忌讳量的酵母或来自酵母的生长组分以便生产足够高水平的2-KLG用于商业目的。类似地,使用假葡糖杆菌的工艺需要用补充了昂贵和不常见的稀土元素盐的培养基或者需要存在辅助菌株如巨大芽孢杆菌,和/或需要存在酵母以便达到符合商业要求的2-KLG浓度并有效利用山梨糖底物。应用Pseudomonas sorbosoxidans的其他工艺在培养基中也含有商业忌讳量的酵母或酵母提取物。
因此,本领域需要能够有效生产2-KLG,但没有现有技术中所存在的问题的微生物菌株。
发明综述
因此,本发明的一个目的是提供能够有效生产2-KLG的微生物菌株。本发明的其他目的、特征和优点将在下文优选的实施方案中详细说明,而且其中部分目的、特征和优点根据说明书可明显看出,或者通过本发明的实施可以领会到。通过本发明的说明书和权利要求书中具体指出的方法,本发明的这些目的和优点是可以实现和达到的。
由本发明的方法可以实现这些和其他目的,在第一个实施方案中,本发明涉及从L-山梨糖生产2-KLG的工艺,该工艺包括下列步骤:在培养基中单独培养或与一种或多种辅助菌株混合培养NRRL B-21627(ADMX6L)菌株或其突变体或变种,然后回收积累的2-KLG。本发明的另一实施方案涉及微生物菌株NRRL B-21627或其突变体,如NRRL B-21630(ADM 86-96)的培养物。
应理解上文的一般性描述和下文的详细描述都是示例性的和说明性的,是对本发明权利要求的进一步解释。
附图简述
图1是能够从L-山梨糖生产2-KLG的细菌菌株的RiboPrint图。RiboPrint图(A)是从NRRL B-21627(ADM X6L)菌株得到的;RiboPrint图(B)是从氧化葡糖杆菌菌株4025C(混合培养物保藏物DSM4027的小菌落组分菌株的再分离物,美国专利4935359)得到的;RiboPrint图(C)是从Pseudomonas sorbosoxidans菌株IFO 14502得到的;RiboPrint图(D)是从Pseudogluconobacter saccharoketogenes菌株IFO14484得到的。
本发明优选实施方案的详细描述
在第一个实施方案中,本发明涉及从L-山梨糖生产2-酮-L-古洛糖酸的发酵工艺,该工艺包括将微生物与L-山梨糖接触足够长时间,然后分离积累的2-KLG。本发明的发酵工艺优选包括在含L-山梨糖的合成或天然培养基中将微生物培养足够长时间,然后从培养基和/或微生物细胞中分离积累的2-KLG。
在本发明工艺中所用的微生物菌株优选是细菌菌株NRRL B-21627(ADM X6L)或其突变体或变种,通过在纯(即不含一种或多种其他微生物菌株)的培养物中发酵,所述菌株能够从L-山梨糖生产至少约40g/l2-KLG。
根据布达佩斯条约,已于1996年10月1日将NRRL B-21627(ADMX6L)菌株保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL),1815 North UniversityStreet,Peoria,Illinois 61604,USA,保藏号为NRRL B-21627。NRRL B-21627(ADM X6L)菌株的特征包括:
(1)细胞形态学-革兰氏阴性;在较老的培养物中可以是革兰氏可变株;多态的;短杆或球杆菌;细胞单个和成对出现;细胞可形成短链或丝状;不形成孢子;
(2)菌落形态学-点状,凸的,完整的、光滑的、奶油状和透明的;在一些培养基上的老菌落是米色或淡棕色;
(3)游动性:在从液体培养物或2%琼脂平板培养物制备的湿封固物(mount)中未观察到游动性;通过将新鲜培养物刺入已用0.3%-0.4%琼脂部分固化的BUGMTM培养基(可购自Biolog,Inc.,目录号70001)中可观察到游动性;在用于观察游动性的条件下,细胞产生鞭毛;
(4)温度范围:在4℃、37℃或41℃未观察到生长,但在25℃和30℃观察到有良好的生长;
(5)pH范围:在pH4.5未观察到生长;在pH6.2观察到生长;在pH7.2观察到良好生长;
(6)生理学特征:
(a)过氧化氢酶:阳性;
(b)氧化酶:阳性;
(c)明胶酶:阴性;
(d)需氧的:在无氧条件下无生长;
(e)从果糖可形成棕色素;
(f)从乙醇可形成酸;
(g)从甘油不产生二羟丙酮;
(h)在pH为4.0-5.0下,在静置的葡萄糖或甘露糖醇液体培养基中不形成菌膜或菌环;和
(i)对链霉素敏感;和
(7)培养特征:
(a)在3%NaCl中的生长:阳性;
(b)蛋白胨-酵母提取物-甘露糖醇琼脂:生长;
(c)海洋琼脂:生长缓慢;
(d)BUGMTM和BUGM-GTM:生长;和
(e)脑心浸液琼脂:生长。
(8)RiboPrint分析:
RiboPrint分析包括将放射性标记的反义RNA与所研究的遗传物质杂交,然后用凝胶电泳检测标记的双链杂交物。用该方法得到的图样不仅可用于区分不同种之间的生物体,还可用于区分同种内的不同菌株。图1中给出了NRRL B-21627(ADM X6L)菌株和已知能够由L-山梨糖生产2-KLG的许多可比菌株的RiboPrint图。
除天然NRRL B-21627(ADM X6L)菌株外,在本发明工艺中也可使用其突变体和变种,只要这些突变体和变种在单培养物中也能够从L-山梨糖生产至少40g/L 2-KLG。
制备本发明微生物菌株的突变体和变种的适宜方法的示范性实例包括但不限于:用紫外光或X射线照射诱变,或用化学诱变剂如亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)、甲磺酸甲酯、氮芥等处理进行诱变;基因整合技术,如由插入元件或转座子介导的技术,或者通过转化线性或环状DNA分子进行的同源重组;以及由噬菌体如P1介导的转导。这些方法是本领域熟知的,并在例如下列文献中作了描述:J.H.Miller,分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics),冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1972);J.H.Miller,细菌遗传学的简要课程(A Short Course inBacterial Genitics),冷泉港实验室出版社,冷泉港实验室,纽约(1972);M.Singer and P.Berg,基因&基因组(Gene &Genomes),University Science Books,Mill Valley,California(1991);J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,分子克隆:实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1989);P.B.Kaufman等,生物学和医学的分子和细胞方法手册(Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology and Medicine),CRC出版社,Boca Raton,Florida(1995);植物分子生物学和生物技术方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology),B.R.Glick and J.E.Thompson编,CRC出版社,Boca Raton,Florida(1993);和P.F.Smith-Keary,大肠杆菌的分子遗传学(Molecular Genetics of Escherichia coli),Guilford出版社,纽约,NY(1989)。
然后,就改善的2-KLG生产潜力或与其在从L-山梨糖生产2-KLG的实用性有关的其他理想特性,对从本发明生物体NRRL B-21627(ADMX6L)用已知方法衍生的突变菌株进行筛选。在改善菌株之诱变和筛选方法的特别优选的实施方案中,依据已诱变细胞对部分衍生的或降解的2-KLG(如通过高压锅消毒或与热接触而产生的2-KLG衍生物)的生长抑制浓度的耐受性来进行筛选。在另一实施方案中,可用其他化学修饰2-KLG的方法产生选择性试剂,所述方法包括但不限于:氨基取代以产生2-氨基-L-古洛糖酸或2-氨基-L-艾杜糖酸;在C6位置进行氧化以产生5-酮-葡糖二酸;可产生各种2-KLG的巯基或脱氧衍生物或各种2-KLG的不饱和衍生物的修饰;或通过本领域技术人员熟知的其他方法。
已根据布达佩斯条约,于1996年10月15日将NRRL B-21627(ADMX6L)菌株的一个特别优选的突变体(ADM 86-96)保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL),1815 North University Street,Peoria,IIIinois 61604,保藏号为NRRL B-21630。
根据本发明,将本发明微生物菌株或者其突变体或变种与L-山梨糖接触足够长时间,然后分离积累的2-KLG。优选地,在含L-山梨糖的天然或合成培养基中将所述微生物菌株培养一段时间以生产2-KLG,然后分离积累的2-KLG。或者,可以将衍生于所述微生物菌株之细胞的制品与L-山梨糖接触足够长时间,然后可分离积累的2-KLG。
文中所用“衍生于细胞的制品”指来自本发明菌株或其突变体或变种之培养液的细胞的任何或所有提取物,丙酮干燥的细胞、支持物如聚丙烯酰胺凝胶、κ角叉藻糖上的固定化细胞等,以及类似的制品。
所述方法的说明性实例包括将在适宜含水缓冲液(如2-(N-甲基吗啉)乙磺酸(pH6.5;0.5M))中的L-山梨糖和CaCO3加至摇瓶中微生物菌株的水性提取液内。该反应优选在20-40℃,pH5.0-8.0范围内进行约1至100小时。L-山梨糖的浓度应为0.1-10%w/v,更优选约0.3-6%(w/v),衍生于NRRL B-21627(ADM X6L)或其突变体或变种如NRRL B-21630(ADM86-96)细胞的制品的量应为约1-30mg/ml。在靠经验确定的达到最大2-KLG产率所需的温度和pH条件下振摇足够长时间后,可以经常规方法分离积累的2-KLG。
本文所用的培养基可以是固体或液体,合成(即人工)或天然的,其含有培养本发明微生物菌株所需的足够营养。优选所用的培养基是液体培养基,最佳为合成的液体培养基。
在本发明工艺的各种实施方案中,起始物质L-山梨糖可在加入本发明微生物菌株前即已存在培养基中;或者可在加入所述菌株后加入,这可以在培养过程开始时立即全部加入或者在培养过程中连续或分批加入;或通过D-山梨糖醇的发酵转化来就地产生。所用的L-山梨糖量由本领域技术人员靠经验确定,但至少足以使所述微生物菌株产生至少约40g/L2-KLG。优选地,L-山梨糖占培养基的3-30%(w/v),更优选占5-20%。
在本发明的优选实施方案中,用适宜的微生物或微生物混合物,通过发酵转化D-山梨糖醇来就地产生起始物质L-山梨糖。可以使用在存在NRRL B-21627(ADM X6L)或其突变体或变种的情况下能将D-山梨糖醇转化成L-山梨糖而不会反面影响其将L-山梨糖转化成2-KLG的能力的任何微生物或微生物混合物。优选地,所用的微生物是氧化葡糖杆菌的一个菌株,更优选是氧化葡糖杆菌ATCC 621菌株或氧化葡糖杆菌IFO3293菌株。根据本发明的优选实施方案,起始物质D-山梨糖醇可在加入一种或多种所述微生物前就已存在于培养基中,或者可在加入一种或多种所述微生物后加入到培养基中,其可在培养过程开始时立即全部加入或者在培养过程中连续或分批加入。
除L-山梨糖和/或D-山梨糖醇之外,天然或合成培养基还含有氮源、适宜的无机盐,适当时还可含有适宜培养该微生物菌株的各种痕量营养物质和生长因子等,还可以含有至少一种补充碳源。最好对所用的这些添加成分的量进行选择以便使2-KLG产量达到最大。根据本领域已知的各种方法和技术,本领域技术人员凭经验可确定这种用量。在本发明特别优选的实施方案中,培养基中含有约10%(w/v)L-山梨糖,约3%(干固体重/体积)玉米浸液和约0.2%(w/v)MgSO4·7H2O,用NH4OH、Ca(OH)2或CaCO3控制pH。用于制备接种物的培养基可根据需要含有其他组分,如蛋白胨或N-Z胺、补充性碳源和/或各种维生素。
适宜的补充性碳源的说明性实例包括但不限于:其他碳水化合物,如葡萄糖、果糖、甘露糖醇、淀粉或淀粉水解产物,纤维素水解产物和糖浆;有机酸,如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和富马酸;和醇如甘油。
适宜氮源的说明性实例包括但不限于:氨,包括氨气和氨水;无机或有机酸的铵盐,如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵;脲;硝酸盐或亚硝酸盐,和其他含氮物质,包括纯或粗制品氨基酸,肉提取物,蛋白胨、鱼粉、鱼水解产物,玉米浸液,酪蛋白水解产物,大豆饼水解产物,酵母提取物,干酵母,乙醇-酵母馏出液、大豆粉、棉子粉等。
适宜无机盐的说明性实例包括但不限于:钾、钙、钠、镁、锰、铁、钴、锌、铜和其他痕量元素以及磷酸的盐。
适宜痕量营养物质、生长因子等的说明性实例包括但不限于:辅酶A、泛酸、生物素、硫胺、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、其他维生素,氨基酸如半胱氨酸,硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸、烟酰胺等,它们可以是纯的或部分纯化的化合物或作为天然物质存在。通过本领域技术人员已知的任何深层发酵技术如空气升液器、传统的喷射搅拌装置或振荡培养,可完成本发明微生物菌株的培养。
所用的培养条件,包括温度、pH、通气速率、搅拌速率、培养时间等可由本领域技术人员依经验确定以使2-KLG的产量最大。具体培养条件的选择取决于各种因素,如所用的本发明的具体微生物菌株,培养基组成和类型,培养技术以及类似的考虑因素。在本发明特别优选的实施方案中,当使用NRRL B-21627(ADM X6L)或其突变体或变种如NRRL B-21630(ADM 86-96)时,培养温度为22-35℃,优选约30℃,pH为5.0-8.0,优选5.5-7.5,最佳为约6.0-6.8。当然,所用的培养条件可按需要在培养过程中的不同时间点用已知方法加以调整以使2-KLG的产量最大。
培养足够长时间如10-150小时后,用任何已知的方法分离在细胞和/或培养液中积累的2-KLG。与培养所用条件相适应的任何方法均可使用;用于回收2-KLG的适宜方法的说明性实例参见美国专利5474924;5312741;4960695;4935359;4877735;4933289;4892823;3043749;3912592;3907639和3234105。
根据一种这样的方法,首先用已知方法如离心或过滤从培养液中除去微生物,然后将所得溶液真空浓缩。再通过过滤回收2-KLG晶体,需要时通过再结晶纯化。同样,可用已知方法如离子交换树脂、溶剂提取、沉淀、盐析等回收2-KLG。
当以游离酸形式回收2-KLG时,可按需要通过常规方法,用钠、钾、钙、铵或相似阳离子将其转化成盐。或者,将2-KLG以盐形式回收时,可用常规方法将其转化成游离形式或不同的盐。
在本发明的其他实施方案中,将本发明微生物与一种或多种辅助菌株混合培养。本文所用“辅助菌株”指在本发明工艺中可增加2-KLG产量的微生物菌株。适宜的辅助菌株可由本领域技术人员依经验确定。适宜辅助菌株的说明性实例包括但不限于下列属的成员:金杆菌属(优选液化金杆菌或天牛金杆菌)、棒杆菌属(优选产氨棒杆菌或谷氨酸棒杆菌),芽孢杆菌属、短杆菌属(优选扩展短杆菌或黄色短杆菌)、假单胞菌属,变形菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属和黄杆菌属。优选辅助菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC 21544。
优选在适宜的条件下将辅助菌株在适宜的培养基中培养足够长时间直至得到足够的种群培养物。然后可将该辅助菌株接种物单独接种或与其他本发明微生物菌株一起(即混合接种物)接种到用于生产2-KLG的培养基中。优选地,辅助菌株量与NRRL B-21627(ADM X6L)菌株量的比例为10∶1至1∶10000。
本发明的另一实施方案涉及可用于2-KLG发酵生产工艺中的上述新微生物菌株。
下列实施例仅仅是说明性的,并不用于限制由所附权利要求书所限定的本发明范围。对本领域技术人员来说,显然可以对本发明方法进行各种修饰和改变而不偏离本发明精神和范围。因此,本发明覆盖了本发明的修饰和改变,只要这种修饰和改变在本发明权利要求和其等同内容的范围内。
本文涉及的所有专利和文献均引入本文作为参考。实施例
实施例1:分离菌株NRRL B-21627(ADM X6L)
A.土壤样品的来源、富集和筛选
在摇瓶中对环境样品进行微生物富集。对所得的混合培养物进行筛选以鉴定出至少含一种能够从L-山梨糖生产2-KLG的微生物菌株的培养物。从美国各地收集湿土壤、沙子、沉积物、水果、浆果、腐殖土和其他环境样品。将各样品立即贮存在冷而通风且潮湿的容器中。将1克土壤或样品加至250mL带档板摇瓶内的30mL培养基A(表1)中开始富集,然后在30℃,以230rpm振荡培养49小时。
为了筛选发酵富集物,将0.5-0.75mL各富集物转移至含30mL新鲜培养基B(表1)的250mL带档板摇瓶内。将这些烧瓶在30℃,230rpm振荡培养68小时,此后,用各混合培养发酵产物的一部分分析2-KLG含量,然后将其低温保藏。为了进行保藏,将每一培养物各2.0mL与1.0mL无菌的于水中的40%甘油混合,然后贮存在-70℃。
在250mm厚的Whatman LK5 Silica Gel 150板(目录号4855-820)上,用薄层色谱法筛选产生各烧瓶的2-KLG产量。将5μL离心培养液点在所述平板上,然后在溶剂(157mL正丙醇;39mL去离子水;4mL 1%磷酸;0.4mL冰醋酸)中展开5-6小时。将平板风干,然后用溶解于25mL甲醇和25mL 6N氢氧化钠的0.125g四唑蓝氯化物喷洒,此后,在60℃烘烤5分钟。在制成的平板上,可肉眼看到山梨糖和2-KLG为紫色点,然后通过与各含10g/L 2-KLG和L-山梨糖的标准物比较而进行鉴定。
用HPLC定量分析2-KLG的产量。以1∶10稀释于移动相中而制得样品,然后通过0.45μm多孔膜过滤。移动相含用Milli-Q水稀释成4.0L的1.1mL ACS级硫酸。将诸样品各100μl上样至2个连续排列的2mm×300mm×7.8mm Aminex HPX-87H柱(BioRad)上以便总柱长度为600mm.前面为装有相同树脂的保护柱。在55℃将所述柱以0.6mL/分的流速过柱。用Waters Model No410差示折光计检测L-山梨糖和2-KLG,然后通过与含2-KLG和L-山梨糖的标准物进行比较来鉴定。
33种混合培养物发酵物生产1.8-9.3g/L的2-KLG。来自土壤样品#216B的混合培养物发酵物(此后从中分离出NRRL B-21627菌株(实施例1 B))产生6.3g/L 2-KLG。
B.单一培养物的分离与检测
从上述富集物中以单一培养物形式或者以与其他微生物的混合培养物形式分离出能够从L-山梨糖生产2-KLG的纯微生物培养物。依据其出众的2-KLG产量,从实施例1A中选出11种混合培养物富集物。将这些培养物融解并用培养基A以10倍稀释度连续稀释,此后,将每一稀释物各0.1mL铺在培养基A琼脂平板表面。将平板在30℃培养24小时,然后放大8-40倍进行检测。必需注意最小的、生长最慢的菌落以便从稀释平板上回收生产2-KLG的菌株。每种菌落类型和大小均选出数个代表,然后在新鲜培养基A平板上次培养,此后,将稀释平板放回至30℃培养24小时。从稀释平板上选出其他生长缓慢的菌落,在第二培养期后进行次培养。在培养基A平板或PYM平板(10g/L蛋白胨;10g/L酵母提取物;0.5g/L甘油;30g/L甘露糖醇;20g/L琼脂)上将各菌株划线纯化1-3轮。在含20%甘油的PYM液体培养基中于-70℃低温保存所述纯菌株。从11种富集混合物中回收得到共118个纯菌株。
在摇瓶中检测所述118个新菌株将L-山梨糖转化成2-KLG的潜力。为了说明2-KLG的生产可能需要两种或多种微生物的组合活性,用与源自相同富集物的所有其他菌株的配对混合物,以及纯培养物,检测每种新的分离物。为了制备接种物,将每个菌株在PYM琼脂上培养24小时,此后将一大环细胞悬浮在含50mM磷酸钠,0.4%氯化钠和0.05%甘露糖醇的无菌缓冲液(pH7.2)中。对于每个纯菌株或配对菌株试验,均用每种相关菌株的0.2mL细胞悬浮液接种含30mL培养基C(表1)的250mL带档板烧瓶。在30℃,以230rpm将这些烧瓶振荡培养24小时,此后,将1.0mL转移至30mL发酵培养基D(表1)中。在30℃,以230rpm将发酵烧瓶振荡培养3天,然后用TLC和HPLC分析培养液中的2-KLG和山梨糖含量。为了检测来自土壤样品#216B的菌株,需要105个烧瓶。其中18个生产2-KLG,生产量为1.9-19.3g/L,这18个中的14个接种了分离物ADM X6L(表2)。ADM X6L(NRRL B-21627)在纯培养物中能够生产14.9g/L 2-KLG的事实说明该菌株是2-KLG生产菌株。
表1:实施例1中所用的培养基
成分(g/L) | A | B | C | D |
L-山梨糖 | 20.0 | 50.0 | 20.0 | 50.0 |
D-葡萄糖 | 2.0 | 0.0 | 1.0 | 0.0 |
玉米浆液干固体 | 10.0 | 10.0 | 15.0 | 15.0 |
FeSO4·7H2O | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
酵母氮碱 | 1.7 | 1 7 | 1.7 | 1.7 |
CaCO3 | 6.0 | 20.0 | 6.0 | 20.0 |
放线菌酮 | 0.005 | 0.005 | 0.0 | 0.0 |
*将葡萄糖、玉米浆液、硫酸铁和碳酸钙调至pH7.9,然后高压锅消毒20分钟。其余组分调至pH6.3,然后过滤除菌。制成的培养基的pH为7.1-7.4。酵母氮碱是Difco产品#0335-15-9。
表2:菌株ADM X6L在纯培养物或与来自土壤样品
#216-B的其他菌株的混合培养物中生产2-KLG的产量
216-B菌株组合 | 2-KLG(g/L) | L-山梨糖(g/L) | 转化率% |
ADMX6L | 14.9 | 34.6 | 96.7 |
ADM X6L+1 | 3.1 | 2.3 | 6.5 |
ADM X6L+3 | 1.9 | 1.3 | 3.9 |
ADM X6L+4 | 11.6 | 33.2 | 69.0 |
ADM X6L+7 | 16.3 | 27.3 | 71.8 |
ADM X6L+10 | 19.2 | 26.2 | 80.7 |
ADM X6L+11a | 13.6 | 33.1 | 80.5 |
ADM X6L+11b | 18.5 | 27.6 | 82.6 |
ADM X6L+15 | 9.5 | 32.3 | 53.7 |
ADM X6L+16 | 8.2 | 31.0 | 43.1 |
ADM X6L+17 | 19.0 | 26.1 | 79.5 |
ADM X6L+18a | 19.3 | 24.8 | 76.6 |
ADM X6L+18b | 2.4 | 0.0 | 4.8 |
ADM X6L+19 | 14.1 | 29.0 | 67.1 |
*转化率百分比指已被消耗而形成2-KLG的L-山梨糖的重量百分比。
实施例2:在摇瓶中用NRRL B-21627从L-山梨糖生产2-KLG
30℃下,在BUGMTM固体琼脂培养基上培养NRRL B-21627菌株,然后用无菌牙签将菌落转移至含20mL培养基E(表3)的250mL带档板摇瓶中。在30℃,以240rpm将种子培养物培养24小时。然后将2mL该种子液接种到250mL带档板摇瓶中的20mL生产培养基(培养基F、培养基G或培养基H;表3)中。在30℃,240rpm将培养物培养72小时。随后取出培养液并进行HPLC分析。2-KLG的产量结果列于表4。
表3实施例12中所用的培养基
成分(量/L) | Ea | Fb | Gc | Hb |
酵母提取物 | 10.0g | 15g | 0 | 0 |
甘油 | 5.0mL | 0.5mL | 0 | 5.0mL |
MgSO4·7H2O | 0 | 2.5g | 2.5g | 2.5g |
CaCO3 | 0 | 25.0g | 25.0g | 25.0g |
L-山梨糖 | 0 | 87.5g | 95.8g | 81.3g |
玉米浆液干固体 | 0 | 0 | 20.0g | 20.0g |
细菌蛋白胨 | 10.0g | 0 | 15.0g | 0 |
D-甘露糖醇 | 0 | 0 | 14.4g | 0 |
烟酰胺(5g/L) | 0 | 0 | 9.6mL | 0 |
硫胺 | 0 | 0 | 0.028g | 0 |
泛酸 | 0 | 0 | 0.383g | 0 |
对氨基苯甲酸 | 0 | 0 | 0.192g | 0 |
D-山梨糖醇 | 20.0g | 0 | 0 | 0 |
a在高压锅消毒20分钟前,将pH调至7.0
b将L-山梨糖高压锅消毒20分钟,然后加至已将pH调至7.2并经高压锅消毒20分钟的其余组分中。
c将维生素的pH调至7.0并过滤除菌,然后加至已经高压锅消毒20分钟的L-山梨糖和D-甘露糖醇中。然后将该混合物加至已将pH调至7.2并经高压锅消毒20分钟的其余组分中。
表4在烧瓶中由NRRL B-21627生产2-KLG的产量
培养基 | 2-KLG(g/L) |
F | 18.6 |
G | 35.6 |
H | 27.1 |
实施例3:NRRL B-21627菌株与其它菌株在纯培养物中从L-山梨糖生产2-KLG的产量的比较
用数种不同培养基(表5)和方法,检测本发明微生物菌株NRRL B-21627(ADM X6L)和氧化葡糖杆菌菌株4025C(混合培养物保藏物DSM4027之小菌落成分菌株的再分离物,美国专利4935359)从L-山梨糖生产2-KLG的情况。结果(表6)表明,在各种培养基中NRRL B-21627菌株生产2-KLG的产量明显较高。另外,从培养基I/J转至培养基K/L时,两菌株所受的影响不同。
表5实施例3中所用的培养基
成分(量/L) | I | J | K | L |
N-Z SoyTM(Sheffield) | 0 | 0 | 10.0g | 0 |
ADM Arcon FTM(ADM Co.) | 0 | 0 | 0 | 10.0g |
玉米浆液干固体lids) | 20.0g | 20.0g | 20.0g | 20.0g |
细菌蛋白胨 | 10.0g | 15.0g | 0 | 0 |
L-山梨糖 | 0 | 100.0g | 0 | 70.0g |
D-山梨糖醇 | 10.0g | 0 | 5.0g | 4.8g |
D-甘露糖醇 | 10.0g | 15.0g | 10.0g | 0 |
烟酰胺 | 0 | 0.05g | 0 | 0.048g |
硫胺 | 0 | 0.3g | 0 | 0.29g |
泛酸 | 0 | 0.4g | 0 | 0.386g |
对氨基苯甲酸 | 0 | 0.2g | 0 | 0.193g |
MgSO4·7H2O | 0 | 2.5g | 0 | 2.0g |
CaCO3 | 10.0g | 25.0g | 10.0g | 25.0g |
pH(高压锅消毒前) | 6.5 | 7.2 | 6.5 | 7.2 |
表6 NRRL B-21627和4025C在纯
菌株 | 种子培养基/发酵培养基 | ||
C/Da | I/J | K/L | |
B-21627 | 16.0b | 39.7 | 33.5 |
4025C | 5.4b | 17.8 | 19.0 |
a对于培养基C/D(表1),使用实施例1B的实验方案,不同之处在于这些菌株开始是在BUGMTM琼脂而不是在PYM琼脂上培养的。对于培养基I/J和K/L(表5),使用实施例2的实验方案。
b在C/D培养基中ADM X6L的2-KLG值是9个试验的平均值;4025C的数值是6个试验的平均值。
实施例4:在摇瓶中用由NRRL B-21627和另一种微生物组成的混合培养物从L-山梨糖生产2-KLG
含20mL培养基I的250mL带档板摇瓶用NRRL B-21627的100μL冷冻培养物和相似体积的另一种菌株接种。在30℃,以240rpm将烧瓶振荡24小时。然后将2mL该培养物转移至含25mL培养基M(表9)的250mL带档板烧瓶中。在30℃,以240rpm振荡培养65小时后,用HPLC分析各烧瓶中从L-山梨糖形成2-KLG的情况。结果列于表7。
表7:含菌株NRRL B-21627(ADM X6L)
的混合培养物在烧瓶中由L-山梨糖生产2-KLG的产量
生产者培养物 | 辅助培养物* | 2-KLG g/L | 产率%** |
X6L | ---- | 28.3 | 100.0 |
X6L | ATCC 19354 | 47.7 | 89.9 |
X6L | ATCC 19391 | 42.4 | 82.5 |
X6L | ATCC 21544 | 45.6 | 100.0 |
X6L | ATCC 21529 | 41.7 | 96.1 |
X6L | NRRL B-14840 | 41.2 | 81.3 |
X6L | NRRL B43647 | 35.6 | 83.4 |
*菌株ATCC19354,ATCC19391,ATCC21544,ATCC21529,NRRL B-14840和NRRL B-43647分别是产氨棒杆菌,扩展短杆菌,谷氨酸棒杆菌,黄色短杆菌,天牛金杆菌和液化金杆菌。
**产率%指已消耗而转化成2-KLG的L-山梨糖的重量百分比。
实施例5:NRRL B-21627菌株之改进变种的诱变、筛选和选择
对本发明细菌菌株NRRL B-21627(ADM X6L)和其突变体进行诱变,回收2-KLG产量提高的变种。使细菌培养物在BUGMTM或PYM液体培养基中生长至对数中期,然后离心沉淀并重悬在玻璃试管内2mL过滤除菌的TM缓冲液(Tris·HCl 6.0g/L,马来酸5.8g/L,(NH4)2SO41.0g/L,Ca(NO3)2 5.0mg/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O0.25mg/L,用KOH将pH调至6.0)中。将2mL细胞悬浮液与2.5μL5.0mg/mL N’-硝基-N-亚硝基胍(NGT)混合,然后在30℃保温25分钟。将未处理的细胞悬浮液同样保温,作为估计杀死率的对照细胞。保温后,将10mL TM缓冲液加至各试管中,然后离心沉淀细胞,用TM缓冲液洗涤两遍,再重悬在4.0mL用KOH调至pH7.2的0.1MNaH2PO4(磷酸盐缓冲液)中。用磷酸盐缓冲液进一步稀释洗涤过的细胞悬浮液,将样品等分液铺在BUGMTM或CM2琼脂培养基上,然后在30℃保温(BUGMTM可从Biolog,Inc.得到,目录号70001;CM2培养基含D-山梨糖醇5.0g/L,(NH4)2SO4 2.0g/L,K2HPO4 0.1g/L,KH2PO40.9g/L,FeCl3·6H2O 5mg/L,MnSO4·4H2O 5mg/L,酪蛋白氨基酸2.0g/L,酵母提取物2.0g/L,琼脂15.0g/L,在高压锅消毒前将pH调至7.0;将下列CM2组分过滤除菌:MgSO4·7H2O 0.25g/L,硫胺·HCl30mg/L,泛酸和烟酰胺10mg/L,和对氨基苯甲酸5mg/L)。相对于未诱变的对照细胞,NTG处理细胞的杀死率为60%-80%。随机挑出存活菌株并在摇瓶中筛选出具有改善的从L-山梨糖生产2-KLG的产率的菌落。或者,将诱变的细胞悬浮液稀释并铺在生长抑制性CM2-S选择性琼脂培养基平板(CM2-S,是在高压锅消毒前向培养基的热消毒组分中加入7-8%2-KLG的CM2)上。挑出在CM2-S琼脂上生长的菌落并在摇瓶中检测其是否改善了由L-山梨糖生产2-KLG的潜力。
A.NRRL B-21627和突变体衍生物在纯培养物摇瓶发酵中由L-山梨糖生产2-KLG的产量
对于每个被检测的菌株,将0.1mL冷冻培养物接种至含20mL种子培养基K(表5)的250mL带档板烧瓶中,然后在30℃,以240rpm培养24小时。用2mL种子培养物接种在250mL带档板摇瓶中的25mL发酵培养基M(表9),然后在30℃,以240rpm将烧瓶振荡培养72小时。用HPLC检测2-KLG产物(表8)。
表8纯培养物在摇瓶中由L-山梨糖生产2-KLG的产量
菌株 | 类型 | 2-KLG(g/L) |
X6L | 野生型 | 27.5 |
77-111 | X6L的突变体 | 40.6 |
86-96* | 77-11的2-KLG抗性突变体 | 64.4 |
*在CM2-S琼脂培养基上筛选出的菌株
B.NRRL B-21627和突变体衍生物在纯培养物发酵罐中由L-山梨糖生产2-KLG的产量
对于每种菌株,用0.2mL冷冻培养物接种含35mL种子培养基N(表9)的250mL带档板烧瓶,然后在30℃以240rpm培养24小时。用35mL种子培养物接种在1.5L Applikon发酵罐中的700mL发酵培养基O(表9)。在下列控制条件下发酵72小时:32℃,1000rpm,用21%NH4OH将pH调至6.3,通气率为1500mL/分。用HPLC检测2-KLG产物(表10)。
表9:实施例4和5中所用的培养基
成分(量/L) | M | N | O |
N-Z SoyTM(Sheffield) | 10.0g | 5.0g | 10.0g |
玉米浆液干固体 | 20.0g | 10.0g | 20.0g |
L-山梨糖 | 70.0g | 0 | 70.0g |
D-山梨糖醇 | 4.2g | 5.0g | 5.0g |
烟酰胺 | 0.04g | 0 | 0.05g |
硫胺 | 0.25g | 0 | 0.3g |
泛酸 | 0.34g | 0 | 0.4g |
对氨基苯甲酸 | 0.168g | 0 | 0.2g |
MgSO4·7H2O | 2.0g | 0 | 2.0g |
CaCO3 | 25.0g | 5.0g | 25.0g |
消泡剂6000K | 0 | 0 | 0.4mL |
pH(高压锅消毒前) | 7.2 | 6.5 | 7.2 |
表10:纯培养物在发酵罐内由L-梨糖生产2-KLG的产量
菌株 | 类型 | 2-KLG(g/L) | 摩尔产率% |
X6L | 野生型 | 65 | 84 |
54-164 | X6L的突变体 | 72.2 | 84 |
64-165 | X6L的突变体 | 76.3 | 82 |
65-93 | X6L的突变体 | 76 | 94 |
66-44 | X6L的突变体 | 73.5 | 87 |
66-53 | X6L的突变体 | 74.8 | 83 |
*摩尔产率%指已消耗而转化为2-KLG的L-山梨糖的摩尔百分比。
实施例6:由ADM86-96(NRRL B-21630)和另一种微生物组成的混合培养物在发酵罐中从D-山梨糖醇生产2-KLG的产量
在存在第二种微生物的条件下,培养菌株ADM86-96(NRRL B-21630)(NRRL B-21627的一种突变变种),所述第二种微生物能够将D-山梨糖醇转化成L-山梨糖。用ADM86-96菌株的0.2mL冷冻培养物和类似体积的作为第二种微生物的ADM29-121(IFO3293菌株的突变体)或ATCC621接种含50mL种子培养基P(表12)的500mL带档板烧瓶。在30℃,以240rpm将烧瓶振荡培养24小时。用种子培养物接种在1.5LApplikon发酵罐中的700mL发酵培养基Q(表12)。在下列条件下发酵43-70小时:30℃,以800rpm搅拌,通气率为1.8VVM,用17%NH4OH将pH维持在6.0。结果列于表11中。
表11:混合菌株培养物在发酵罐中从D-山梨糖醇生产2-KLG的产量
生产L-山梨糖的菌株 | 生产2-KLG的菌株 | 2-KLG(g/L) | 转化率%* |
ADM 29-121(IFO 3293的突变体) | 86-96 | 109 | 96 |
ATCC 621 | 86-96 | 114 | 98 |
*产生的2-KLG克数/(D-山梨糖醇克数-残余的L-山梨糖克数)
表12:实施例6中所用培养基
成分(量/L) | P | Q |
N-Z SoyTM(Sheffield) | 10.0g | 0 |
玉米浆液干固体 | 20.0g | 31.5g |
D-山梨糖醇 | 10.0g | 105.0g |
D-甘露糖醇 | 20.0g | 0 |
烟酰胺 | 0.05g | 0 |
硫胺 | 0.3g | 0 |
泛酸 | 0.4g | 0 |
对氨基苯甲酸 | 0.2g | 0 |
MgSO4·7H2O | 0 | 2.0g |
CaCO3 | 10.0g | 25.0g |
消泡剂6000K | 0 | 0.4mL |
pH(高压锅消毒前) | 6.5 | 7.2 |
Claims (21)
1.一种生产2-酮-L-古洛糖酸的工艺,其包括在含L-山梨糖的培养基中,将微生物菌株NRRL B-21627或其突变体或变种培养足够长时间以将所述L-山梨糖转化成2-酮-L-古洛糖酸;然后回收所述2-酮-L-古洛糖酸。
2.根据权利要求1的工艺,其中菌株NRRL B-21627的所述突变体或变种在纯培养物中能够从L-山梨糖产生至少约40g/L 2-酮-L-古洛糖酸。
3.根据权利要求1的工艺,其还包括将所述2-酮-L-古洛糖酸转化成抗坏血酸或其盐。
4.根据权利要求1的工艺,其中所述培养是在pH为约5.0-8.0下进行的。
5.根据权利要求1的工艺,其中所述培养在约22℃-约35℃进行的。
6.根据权利要求1的工艺,其中所述微生物是在纯培养物中培养的。
7.根据权利要求1的工艺,其中所述微生物是在与至少一种其他微生物菌株的混合培养物中培养的。
8.根据权利要求7的工艺,其中所述其他微生物菌株是选自下述属之一的成员:金杆菌属、棒杆菌属,芽孢杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属,变形菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属和黄杆菌。
9.根据权利要求8的工艺,其中所述其他微生物菌株是谷氨酸棒杆菌。
10.根据权利要求9的工艺,其中所述谷氨酸棒杆菌是ATCC 21544菌株。
11.根据权利要求1的工艺,其中所述L-山梨糖是通过D-山梨糖醇的发酵转化而产生的。
12.根据权利要求11的工艺,其中所述L-山梨糖是用氧化葡糖杆菌发酵转化D-山梨糖醇而产生的。
13.根据权利要求12的工艺,其中所述氧化葡糖杆菌是ATCC 621菌株或IFO 3293菌株或它们的突变体。
14.根据权利要求1的工艺,其中所述微生物能耐受由2-酮-L-古洛糖酸或其化学衍生物或降解产物导致的生长抑制作用。
15.根据权利要求1的工艺,其中所述微生物菌株是NRRL B-21630。
16.一种生产2-酮-L-古洛糖酸的工艺,它包括在含D-山梨糖醇的培养基中,将微生物菌株NRRL B-21627或其突变体或变种与能够将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物菌株混合培养足够长时间以将所述D-山梨糖醇转化成2-酮-L-古洛糖酸;然后回收所述2-酮-L-古洛糖酸。
17.根据权利要求16的工艺,其中所述其他微生物菌株是葡糖杆菌属或醋杆菌属的成员。
18.根据权利要求17的工艺,其中所述其他微生物菌株是氧化葡糖杆菌ATCC 621或氧化葡糖杆菌IFO 3293,或者它们的突变体或变种。
19.微生物菌株NRRL B-21627或者其突变体或变种的生物学纯培养物。
20.根据权利要求19的生物学纯培养物,其中所述突变体是NRRLB-21630菌株。
21.一种生产具有改善的从L-山梨糖生产2-KLG之能力的微生物菌株的方法,该方法包括在存在生长抑制量的2-KLG衍生物或类似物的条件下,培养能够从L-山梨糖生产2-KLG的菌株细胞;然后在存在所述2-KLG衍生物或类似物的条件下,回收能够生长的细胞。
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