JP2000050869A - グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター - Google Patents
グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】グルコノバクター属細菌の遺伝子組換え操作に
有用な新規なプラスミド及び該プラスミドを利用したシ
ャトルベクターを提供する。 【解決手段】 大きさが約５．６ｋｂであるグルコノバ
クター オキシダンスＩＦＯ３１７１株由来の内在性プ
ラスミド又はその一部とエシェリヒア属細菌で自律複製
可能なプラスミド又はその一部を連結し、グルコノバク
ター属細菌及びエシェリヒア属細菌で自律複製可能なシ
ャトルベクターを構築する。。
有用な新規なプラスミド及び該プラスミドを利用したシ
ャトルベクターを提供する。 【解決手段】 大きさが約５．６ｋｂであるグルコノバ
クター オキシダンスＩＦＯ３１７１株由来の内在性プ
ラスミド又はその一部とエシェリヒア属細菌で自律複製
可能なプラスミド又はその一部を連結し、グルコノバク
ター属細菌及びエシェリヒア属細菌で自律複製可能なシ
ャトルベクターを構築する。。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大きさが約5.6ｋ
ｂであるグルコノバクター オキシダンスIFO3171株由
来の内在性プラスミドpAG5、及び該プラスミドとエシェ
リヒア属細菌由来のプラスミドから構築されるシャトル
ベクターに関するものである。本シャトルベクターは、
グルコノバクター属細菌における遺伝子組換え操作に有
用である。
ｂであるグルコノバクター オキシダンスIFO3171株由
来の内在性プラスミドpAG5、及び該プラスミドとエシェ
リヒア属細菌由来のプラスミドから構築されるシャトル
ベクターに関するものである。本シャトルベクターは、
グルコノバクター属細菌における遺伝子組換え操作に有
用である。
【０００２】
【従来の技術】グルコノバクター属細菌は、Ｄ−アラビ
トールからＤ−キシルロースやキシリトールを生産する
等、産業上有用な微生物である。この菌からさらに優良
な菌株の育種を行うためには、遺伝子組換え技術を用い
るのが一つの有効な手段である。グルコノバクター属細
菌を用いて遺伝子組換えを行うためには、目的菌の宿主
−ベクター系を開発することがまず必要となる。また一
方で、グルコノバクター属細菌の遺伝子組換え操作を行
う際に、グルコノバクター属細菌のみならず他の宿主細
胞、例えば大腸菌（エシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)）内でも複製可能なプラスミドベクター（以下、
「シャトルベクター」という。）を得ることができれば
大変便利である。
トールからＤ−キシルロースやキシリトールを生産する
等、産業上有用な微生物である。この菌からさらに優良
な菌株の育種を行うためには、遺伝子組換え技術を用い
るのが一つの有効な手段である。グルコノバクター属細
菌を用いて遺伝子組換えを行うためには、目的菌の宿主
−ベクター系を開発することがまず必要となる。また一
方で、グルコノバクター属細菌の遺伝子組換え操作を行
う際に、グルコノバクター属細菌のみならず他の宿主細
胞、例えば大腸菌（エシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)）内でも複製可能なプラスミドベクター（以下、
「シャトルベクター」という。）を得ることができれば
大変便利である。
【０００３】これまでに、グルコノバクター属細菌由来
のプラスミドあるいはそれを用いたベクターとしては、
発酵工学第61巻15-18頁（１９８３年）、特開昭59-1628
83号公報、欧州特許出願公開EP 0381027号、WO 95/2322
0号国際公開パンフレット等に報告されている。特に、
発酵工学第61巻15-18頁（１９８３年）には、グルコノ
バクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）IFO
3171株が大きな（約26メガダルトン）一種類のプラスミ
ドを有していると報告している。
のプラスミドあるいはそれを用いたベクターとしては、
発酵工学第61巻15-18頁（１９８３年）、特開昭59-1628
83号公報、欧州特許出願公開EP 0381027号、WO 95/2322
0号国際公開パンフレット等に報告されている。特に、
発酵工学第61巻15-18頁（１９８３年）には、グルコノ
バクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）IFO
3171株が大きな（約26メガダルトン）一種類のプラスミ
ドを有していると報告している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、グルコノバ
クター属細菌の遺伝子組換え操作に有用な新規なプラス
ミド及び該プラスミドを利用したシャトルベクターを提
供することを課題とする。
クター属細菌の遺伝子組換え操作に有用な新規なプラス
ミド及び該プラスミドを利用したシャトルベクターを提
供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、グルコノバク
ター オキシダンスIFO3171株が新規の内在性プラスミ
ドを保有していることを見出し、本発明を完成するに至
ったものである。
を解決するために鋭意検討を行った結果、グルコノバク
ター オキシダンスIFO3171株が新規の内在性プラスミ
ドを保有していることを見出し、本発明を完成するに至
ったものである。
【０００６】すなわち本発明は、（１）大きさが約５．
６ｋｂであるグルコノバクター オキシダンスＩＦＯ３
１７１株由来の内在性プラスミド、またはその誘導体で
あってグルコノバクター属細菌で自律複製可能なプラス
ミド。（２）配列番号１に示す塩基配列を有する（１）
記載のプラスミド、（３）前記（１）又は（２）に記載
のプラスミド又はその一部とエシェリヒア属細菌で自律
複製可能なプラスミド又はその一部から構築され、グル
コノバクター属細菌及びエシェリヒア属細菌で自律複製
可能なシャトルベクター、（４）エシェリヒア属細菌で
自律複製可能なプラスミドがｐＵＣ１８である（３）に
記載のシャトルベクター、および（５）ｐＳＧ８または
ｐＳＧ６のいずれかである（４）に記載のシャトルベク
ター、である。
６ｋｂであるグルコノバクター オキシダンスＩＦＯ３
１７１株由来の内在性プラスミド、またはその誘導体で
あってグルコノバクター属細菌で自律複製可能なプラス
ミド。（２）配列番号１に示す塩基配列を有する（１）
記載のプラスミド、（３）前記（１）又は（２）に記載
のプラスミド又はその一部とエシェリヒア属細菌で自律
複製可能なプラスミド又はその一部から構築され、グル
コノバクター属細菌及びエシェリヒア属細菌で自律複製
可能なシャトルベクター、（４）エシェリヒア属細菌で
自律複製可能なプラスミドがｐＵＣ１８である（３）に
記載のシャトルベクター、および（５）ｐＳＧ８または
ｐＳＧ６のいずれかである（４）に記載のシャトルベク
ター、である。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の新規プラスミドは、グルコノバクター オキシ
ダンスＩＦＯ３１７１株から調製することができる。Ｉ
ＦＯ３１７１株は、（財）発酵研究所（〒532-8686日本
国大阪市淀川区十三本町2-17-85）から何人も取得する
ことができる。
本発明の新規プラスミドは、グルコノバクター オキシ
ダンスＩＦＯ３１７１株から調製することができる。Ｉ
ＦＯ３１７１株は、（財）発酵研究所（〒532-8686日本
国大阪市淀川区十三本町2-17-85）から何人も取得する
ことができる。
【０００８】ＩＦＯ３１７１株をＹＰＧ培地等の培地で
培養し、得られた菌体から通常のプラスミドＤＮＡの調
製法、例えばアルカリリシス法（Nucl. Acids Res. 7,
1513(1979)）によって細胞質のＤＮＡ画分を調製すれ
ば、本発明のプラスミドが得られる。さらに、前記ＤＮ
Ａ画分を、ＥｔＢｒ−ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心法、ア
ガロースゲル電気泳動等によって精製してもよい。
培養し、得られた菌体から通常のプラスミドＤＮＡの調
製法、例えばアルカリリシス法（Nucl. Acids Res. 7,
1513(1979)）によって細胞質のＤＮＡ画分を調製すれ
ば、本発明のプラスミドが得られる。さらに、前記ＤＮ
Ａ画分を、ＥｔＢｒ−ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心法、ア
ガロースゲル電気泳動等によって精製してもよい。
【０００９】上記のようにして後記実施例で得られた本
発明のプラスミドは、大きさが約５．６ｋｂであり、pA
G5と命名された。pAG5は、その大きさから、発酵工学第
61巻15-18頁（１９８３年）に報告されているグルコノ
バクター オキシダンスIFO3171株由来のプラスミド
（約26メガダルトン）とは明らかに異なる新規なプラス
ミドである。pAG5の制限酵素地図を図１に、塩基配列を
配列表の配列番号１に示す。尚、配列番号１に示した塩
基配列は、pAG5の制限酵素HindIII認識部位を５’末端
として示したものである。
発明のプラスミドは、大きさが約５．６ｋｂであり、pA
G5と命名された。pAG5は、その大きさから、発酵工学第
61巻15-18頁（１９８３年）に報告されているグルコノ
バクター オキシダンスIFO3171株由来のプラスミド
（約26メガダルトン）とは明らかに異なる新規なプラス
ミドである。pAG5の制限酵素地図を図１に、塩基配列を
配列表の配列番号１に示す。尚、配列番号１に示した塩
基配列は、pAG5の制限酵素HindIII認識部位を５’末端
として示したものである。
【００１０】本発明のプラスミドには、配列番号１に示
す塩基配列を有するものの他、その誘導体であってグル
コノバクター属細菌で自律複製可能なプラスミドも含ま
れる。前記誘導体としては、pAG5からその複製に関わる
領域以外の部分が除かれたものであってもよいし、pAG5
又はその一部に他のＤＮＡ配列が挿入されたものであっ
てもよい。
す塩基配列を有するものの他、その誘導体であってグル
コノバクター属細菌で自律複製可能なプラスミドも含ま
れる。前記誘導体としては、pAG5からその複製に関わる
領域以外の部分が除かれたものであってもよいし、pAG5
又はその一部に他のＤＮＡ配列が挿入されたものであっ
てもよい。
【００１１】pAG5とグルコノバクター属細菌以外の細菌
で自律複製可能なプラスミドを連結することにより、こ
れらの細菌で自律複製可能なシャトルベクターが得られ
る。グルコノバクター属細菌以外の細菌としては、エシ
ェリヒア属細菌等が、具体的にはエシェリヒア コリが
挙げられる。
で自律複製可能なプラスミドを連結することにより、こ
れらの細菌で自律複製可能なシャトルベクターが得られ
る。グルコノバクター属細菌以外の細菌としては、エシ
ェリヒア属細菌等が、具体的にはエシェリヒア コリが
挙げられる。
【００１２】シャトルベクターの構築に用いるpAG5は、
全体を用いてもよく、その一部であってもよい。一部を
用いる場合は、pAG5の複製に関わる領域が含まれている
必要があるが、複製に不要な領域は除いてもよい。複製
に必要な領域は、pAG5を制限酵素で切断して得られる断
片を、エシェリヒア コリで自律複製可能なプラスミド
に連結し、得られる組換えプラスミドでグルコノバクタ
ー オキシダンスを形質転換し、形質転換株中に前記組
換えプラスミドが保持されることを確認することによっ
て決定することができる。そのような領域を有するpAG5
の部分断片の一例としては、pAG5をHindIII及びEcoRIで
切断して得られる２つの断片のうち、長い方の断片が挙
げられる。
全体を用いてもよく、その一部であってもよい。一部を
用いる場合は、pAG5の複製に関わる領域が含まれている
必要があるが、複製に不要な領域は除いてもよい。複製
に必要な領域は、pAG5を制限酵素で切断して得られる断
片を、エシェリヒア コリで自律複製可能なプラスミド
に連結し、得られる組換えプラスミドでグルコノバクタ
ー オキシダンスを形質転換し、形質転換株中に前記組
換えプラスミドが保持されることを確認することによっ
て決定することができる。そのような領域を有するpAG5
の部分断片の一例としては、pAG5をHindIII及びEcoRIで
切断して得られる２つの断片のうち、長い方の断片が挙
げられる。
【００１３】エシェリヒア コリで自律複製可能なプラ
スミドとしては特に制限されず、エシェリヒア コリを
用いた遺伝子組換え操作に通常用いられているプラスミ
ドベクターが挙げられる。具体的には、pUC18、pUC19、
pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF101
0、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。
これらのプラスミドも、全体を用いてもよく、その一部
を用いてもよい。一部を用いる場合は、プラスミドの複
製に関わる領域が含まれている必要があるが、不要な領
域は除いてもよい。通常用いられているエシェリヒア
コリ用のベクターでは、複製に必要な領域又は不要な領
域はよく知られているものが多い。
スミドとしては特に制限されず、エシェリヒア コリを
用いた遺伝子組換え操作に通常用いられているプラスミ
ドベクターが挙げられる。具体的には、pUC18、pUC19、
pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF101
0、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。
これらのプラスミドも、全体を用いてもよく、その一部
を用いてもよい。一部を用いる場合は、プラスミドの複
製に関わる領域が含まれている必要があるが、不要な領
域は除いてもよい。通常用いられているエシェリヒア
コリ用のベクターでは、複製に必要な領域又は不要な領
域はよく知られているものが多い。
【００１４】尚、本発明のシャトルベクターは、薬剤耐
性遺伝子などのマーカー遺伝子を保持することが好まし
い。薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝
子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。
これらの薬剤耐性遺伝子は、通常用いられているエシェ
リヒア コリ用のベクターに含まれており、複製に必要
な領域とともにそのままシャトルベクターの構築に用い
ることができる。例えばpUC18は、アンピシリン耐性遺
伝子を有している。
性遺伝子などのマーカー遺伝子を保持することが好まし
い。薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝
子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。
これらの薬剤耐性遺伝子は、通常用いられているエシェ
リヒア コリ用のベクターに含まれており、複製に必要
な領域とともにそのままシャトルベクターの構築に用い
ることができる。例えばpUC18は、アンピシリン耐性遺
伝子を有している。
【００１５】また、本発明のシャトルベクターは、クロ
ーニング部位、好ましくはマルチクローニング部位を有
していることが望ましい。上記のようなエシェリヒア
コリ用のプラスミドベクターはマルチクローニング部位
を有しているものが多く、これをそのまま本発明のシャ
トルベクターに用いることができる。
ーニング部位、好ましくはマルチクローニング部位を有
していることが望ましい。上記のようなエシェリヒア
コリ用のプラスミドベクターはマルチクローニング部位
を有しているものが多く、これをそのまま本発明のシャ
トルベクターに用いることができる。
【００１６】本発明のシャトルベクターの一例として、
pSG8およびpSG6が挙げられる。pSG8は、制限酵素HindII
Iで切断したpAG5と、同じくHindIIIで切断したpUC18を
連結することにより得られる。またpSG6は、pAG5をHind
IIIおよびEcoRIで切断して得られる断片のうち長い方の
断片と、pUC18をHindIIIおよびEcoRIで切断して得られ
る断片のうち長い方の断片とを連結することによって得
られる。これらのシャトルベクターは、エシェリヒア属
細菌及びグルコノバクター属細菌で自律複製可能であ
る。したがって、エシェリヒア属細菌を用いてシャトル
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入等の操作を行うことがで
き、得られる組換えベクターでグルコノバクター属細菌
を形質転換することによって、目的遺伝子の導入等を行
うことができる。尚、pSG8はSacI、BamHI、XbaI、Sal
I、PstI部位が、pSG6はEcoRI、HindIII部位が、それぞ
れクローニング部位として使用することができる。
pSG8およびpSG6が挙げられる。pSG8は、制限酵素HindII
Iで切断したpAG5と、同じくHindIIIで切断したpUC18を
連結することにより得られる。またpSG6は、pAG5をHind
IIIおよびEcoRIで切断して得られる断片のうち長い方の
断片と、pUC18をHindIIIおよびEcoRIで切断して得られ
る断片のうち長い方の断片とを連結することによって得
られる。これらのシャトルベクターは、エシェリヒア属
細菌及びグルコノバクター属細菌で自律複製可能であ
る。したがって、エシェリヒア属細菌を用いてシャトル
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入等の操作を行うことがで
き、得られる組換えベクターでグルコノバクター属細菌
を形質転換することによって、目的遺伝子の導入等を行
うことができる。尚、pSG8はSacI、BamHI、XbaI、Sal
I、PstI部位が、pSG6はEcoRI、HindIII部位が、それぞ
れクローニング部位として使用することができる。
【００１７】本発明のシャトルベクターを用いてグルコ
ノバクター属細菌を形質転換するには、通常の形質転換
法、例えば電気パルス法等を用いることができる。グル
コノバクター属細菌としては、グルコノバクター オキ
シダンスが好ましいものとして挙げられる。
ノバクター属細菌を形質転換するには、通常の形質転換
法、例えば電気パルス法等を用いることができる。グル
コノバクター属細菌としては、グルコノバクター オキ
シダンスが好ましいものとして挙げられる。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により、本発明を更に具体的に
説明する。
説明する。
【００１９】（１）プラスミドの分離精製 グルコノバクター オキシダンスIFO3171株をＹＰＧ培
地（酵母エキス0.5％、バクトペプトン0.3％、グルコー
ス3％、pH6.5）で培養し、遠心分離によって菌体を集め
た。この菌体より通常のアルカリリシス法（Nucl. Acid
s Res. 7, 1513(1979)）によって細胞質のＤＮＡ画分を
抽出し、アガロースゲル電気泳動にって分離精製した。
その結果、約5kbの新規なプラスミドが見い出され、pAG
5と命名した。
地（酵母エキス0.5％、バクトペプトン0.3％、グルコー
ス3％、pH6.5）で培養し、遠心分離によって菌体を集め
た。この菌体より通常のアルカリリシス法（Nucl. Acid
s Res. 7, 1513(1979)）によって細胞質のＤＮＡ画分を
抽出し、アガロースゲル電気泳動にって分離精製した。
その結果、約5kbの新規なプラスミドが見い出され、pAG
5と命名した。
【００２０】pAG5をいくつかの制限酵素で処理すること
により作成した制限酵素地図を図１に示す。
により作成した制限酵素地図を図１に示す。
【００２１】（２）塩基配列の決定 ダイデオキシ・ターミネーション（dideoxy terminatio
n）法によって、pAG5の塩基配列を決定した。シーケン
ス反応は、 Dye Terminator Cycle SequencingKit（ABI
社製）を用いて説明書に従って行った。また、電気泳動
は、DNA Sequencer 373（ABI社製）を用いて行った。決
定された塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。
n）法によって、pAG5の塩基配列を決定した。シーケン
ス反応は、 Dye Terminator Cycle SequencingKit（ABI
社製）を用いて説明書に従って行った。また、電気泳動
は、DNA Sequencer 373（ABI社製）を用いて行った。決
定された塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。
【００２２】（３）シャトルベクターの構築 pAG5を制限酵素HindIIIで切断した。この切断物と、エ
シェリヒア コリのベクタープラスミドpUC18（アンピ
シリン耐性遺伝子を含む）のHindIII切断物を混合し、
ＤＮＡリガーゼで連結した。これを用いてエシェリヒア
コリJM109株をコンピテントセル法により形質転換し
た。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中からpAG5と
pUC18のキメラプラスミド（約8.3kb）を持つ株を選択
し、該キメラプラスミドをpSG8と命名した。
シェリヒア コリのベクタープラスミドpUC18（アンピ
シリン耐性遺伝子を含む）のHindIII切断物を混合し、
ＤＮＡリガーゼで連結した。これを用いてエシェリヒア
コリJM109株をコンピテントセル法により形質転換し
た。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中からpAG5と
pUC18のキメラプラスミド（約8.3kb）を持つ株を選択
し、該キメラプラスミドをpSG8と命名した。
【００２３】さらに、pAG5を制限酵素HindIIIとEcoRIで
切断した。この切断物と、エシェリヒア コリのベクタ
ープラスミドpUC18のHindIIIとEcoRI切断物を混合し、
ＤＮＡリガーゼで連結した。これを用いてエシェリヒア
コリJM109株をコンピテントセル法により形質転換し
た。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、pAG5
の一部とpUC18のキメラプラスミド（約6.4kb）を持つ株
を選択し、該プラスミドをpSG6と命名した。pSG8、pSG6
の構築の概要を図２に示す。
切断した。この切断物と、エシェリヒア コリのベクタ
ープラスミドpUC18のHindIIIとEcoRI切断物を混合し、
ＤＮＡリガーゼで連結した。これを用いてエシェリヒア
コリJM109株をコンピテントセル法により形質転換し
た。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、pAG5
の一部とpUC18のキメラプラスミド（約6.4kb）を持つ株
を選択し、該プラスミドをpSG6と命名した。pSG8、pSG6
の構築の概要を図２に示す。
【００２４】なお、pSG8を保持するエシェリヒア コリ
JM109株は、プライベートナンバーAJ13485が付与され、
平成１０年７月２１日に通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所の特許微生物寄託センター（郵便番号30
5-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託
され、受託番号FERM P-16903がが付されている。
JM109株は、プライベートナンバーAJ13485が付与され、
平成１０年７月２１日に通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所の特許微生物寄託センター（郵便番号30
5-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託
され、受託番号FERM P-16903がが付されている。
【００２５】（４）各キメラプラスミドを用いたグルコ
ノバクター オキシダンスATCC621株の形質転換 グルコノバクター オキシダンスATCC621株をＹＰＧ培
地で培養した。遠心分離により集めた菌体を10％シュク
ロース溶液で洗浄した後、再度１０％シュクロース溶液
に懸濁し、上記のキメラプラスミドpSG8又はpSG6と混合
して（100μg/ml）、電気パルス法により形質転換を行
った。形質転換は、島津細胞融合装置ＳＳＨ−１０（島
津製作所製）を用いて、1400Vの電気パルスを７回印加
することにより行った。pSG8、pSG6のいずれのプラスミ
ドを用いた場合もアンピシリン耐性株が得られた。これ
らの株よりアルカリリシス法でプラスミドを分離し、ア
ガロースゲル電気泳動で解析したところ、導入したプラ
スミドが形質転換株中に保持されていたことが確認され
た。
ノバクター オキシダンスATCC621株の形質転換 グルコノバクター オキシダンスATCC621株をＹＰＧ培
地で培養した。遠心分離により集めた菌体を10％シュク
ロース溶液で洗浄した後、再度１０％シュクロース溶液
に懸濁し、上記のキメラプラスミドpSG8又はpSG6と混合
して（100μg/ml）、電気パルス法により形質転換を行
った。形質転換は、島津細胞融合装置ＳＳＨ−１０（島
津製作所製）を用いて、1400Vの電気パルスを７回印加
することにより行った。pSG8、pSG6のいずれのプラスミ
ドを用いた場合もアンピシリン耐性株が得られた。これ
らの株よりアルカリリシス法でプラスミドを分離し、ア
ガロースゲル電気泳動で解析したところ、導入したプラ
スミドが形質転換株中に保持されていたことが確認され
た。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、グルコノバクター属細菌
由来の新規プラスミド及び該プラスミドを用いたシャト
ルベクターが提供される。該シャトルベクターは、グル
コノバクター属細菌及びエシェリヒア コリの細胞内で
自律複製できるため、ベクターＤＮＡの組換え操作及び
グルコノバクター属細菌への遺伝子導入に有用である。
由来の新規プラスミド及び該プラスミドを用いたシャト
ルベクターが提供される。該シャトルベクターは、グル
コノバクター属細菌及びエシェリヒア コリの細胞内で
自律複製できるため、ベクターＤＮＡの組換え操作及び
グルコノバクター属細菌への遺伝子導入に有用である。
【００２７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター <130> P-5866 <141>1998-08-12 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００２８】 <210> 1 <211> 5648 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <400> 1 aagctttgca cagatccttg gtctacacgg ctcgtggaac ctcaaaggcc gcactgtagc 60 cagccaagtg aaagggaggc tcgtctaatg gggacgtttt atgaagagct ggcaaagctc 120 caacatgccc gtttcatcgg aaaaacactg gatgaggtag taaggatcga aaagatttct 180 gctaaccatc caaccaccat cgcaaggcag gccacaaagg cagaagaaca gcaaaccgtc 240 gctgatctgg acaaggcgat ggccgcgcac gttcactcaa aaatgcatcc gggtgaaaac 300 gagaagcagg catttatccg cctcgtaaac gagcatgatc ctgatgtgtc agcactctac 360 agcagacgaa aagcagctat cgcattagcc gacaaaacaa cgggtcgata atggcgcaag 420 cgtacacgcc caagggatca agaagagcct ttcagacatt catgacgctc aacaagctga 480 aatcgtcaaa gcgtctatga ccggagagac cataagcgaa aacgaaccat ggttcgagcc 540 atacaaagct catccagaaa tctacttagc tattcgaaca gcacggataa tgaggcaaaa 600 cgggatggat ggagaatgac tgtgaaaatc cgcactcaag aggacgtggc aaagcagctc 660 atccagattt acagcgatgc acgagaaggc agaattacac ccaaggccgc cgatcggctc 720 tcacgggttc tgcatcgtct caaacctctg ctccctctga atgacttcgt cgctgattta 780 gcccaattcg gaaactgaaa tggccagacc acggattacc gttgatgaag aagcccttga 840 gcatctgatc ggtcttggcg tctcaatcgg tctggcagcc gacattatgg aagtgagcga 900 aagcacgatt gcacggcacc tgaagcgcaa tccagaagct cacaaacgga tgacggcggc 960 gagaacacgg gctcagaaca cgactgattg cggaaatggt aaggcgtggg ctcaaaagca 1020 gcgacagact gctcctggca tctgtagaac gattggccgg gctcaaatct catgctcttg 1080 aaatcagcgg tccgaatggt ggtcctatcg ggcttcacca taacgctgac gtcagctcgg 1140 aaattatgac agaagccagc gagctactga aacaaatcca agaagcagct cgtaatcggg 1200 atggagatcc aagctctacc gaagtagaat aagtcttctc ctgtttccaa cgataggaag 1260 cgcgtcggtt catcccgacg cgttttctat ttctggacca tcaacacagc caaggcgcat 1320 caaagatgcg ggctacgccg ctcccgcgct gcgctcgccc ttggcatgac gggtccgtgc 1380 aaacccgttt gggtatctgc tcaagggcca atgagtggac gggaaggcca ttcctcacat 1440 ctgaagagta gagctgcgag aaatcccgta tgcctttctg caatacgcca cgagcgtgat 1500 ggtcaagatc cttggggaga ttgtagcagg ttttctcacg ttcatatctg tccagataga 1560 tgccctgaaa tttgagggca tcttctccaa cgccaccgca tctttgcgtt cgcatcgcgc 1620 cagtgaacga actcaaaatt gagggcgtca gtcgcttgca agcagacgcc ctagaataaa 1680 acagccaatc gatggtcgct tggttaagtt ttaggagaac gatcatgggt aaaaacccag 1740 acgatcagaa gatgccagac ccctacttct ttttgttgtt gctaatcttt gatgtggtga 1800 tggtcagtgc tgacctgatc ggactagcgc gtctctgctg ataaaaatca gaagctgaag 1860 atgacctgca cttccttaat ggaggttcag gtcatcacca agcgcggaaa ggcgatgcgg 1920 gaattcccgc atcggtcagt aagcccaccc attaagactt cattttcctt ccaaaccata 1980 aggcaagaaa tatcatagaa gcagtaacga tttgctcgat ggtactgaga taatagcctg 2040 acaaaacggc ctcctaaaat gaaggatggc cgcctcttgt cttgcatcgg ctcgaaagat 2100 gcacttacaa cccaagaacg tcatatggtt ctccccattt atgactggcg gccgattatg 2160 gacaatcggt ccaattcaag ggctcgggtg ttacagcact cgagccctta caaatgcatt 2220 tccacatcag aagcgcactc tgcaagcgaa ctcttagctt gcaaaaagca acgagctgtg 2280 aattttgaaa tttagaacaa atctctgagt acttatccac acccgaaaaa ccaattttac 2340 ccatagacaa cggtaagtac tgaagcagtt agccttttta ggaagaaaga ataccctcaa 2400 aaaataatca cgaaacttga cgctaaattg gtcaatatta gagggtcagg taccagaaaa 2460 cattcaatca ggcggtgaac gctgcataat ccgctcccag atcaaacgat aaacgtcaca 2520 ccactcaatc ccctcggtta tcgccaactt tttagtgatg cgaatgatcc aggcatgatc 2580 gaaaacagga tgattggcag cccgcttcca aacagcaacc ggaagaagcc caacaggctt 2640 ttcgtcctgc gcttcaagct ccggctcttg ctcgtctgca atgtcttcga agtccagatc 2700 taagatcccc ttcaatcggg gaccaaccac aagcagacgt tgacctgaca gggcagaaac 2760 tgcttcggcg tacttctggc cagcaagtcg gtcaccttca gcggccaacg caagcaactc 2820 aggaacattc aggcgattag ggcgcttccc ggttttcttc catccggccg ccatctcaga 2880 agccattccc caactgcgaa gatctgcgac cccataatca gacaagcctt tgtcttcaga 2940 taccggaaca accttctgcc ctgatccaac ggcgatatga ccagccttgg ccaacaggtc 3000 gatccagcga cctgtgagcg actggcccgc actaacggcc gcctttgcgc cgtcccggtg 3060 aataacaatc gcatggacat gcagatgcca gcccgtccta gcgccccaag tcacctcaaa 3120 gacccggata aagccgacca gaccgtccct gagcagccgg ttccacaagc caccacgctg 3180 catcgcggaa atagccttag tctgaaccgt ccgcatgttt gacaggcgag tgtttcggtc 3240 atgccgcata gtccatgtgg cgaatgcagc gccgtatcca ttggcatgaa ccgctttgag 3300 gaccgcacca acccgggcag acacatcaga tgcccgtaga ggcgcacagt gagggcaacg 3360 agcagagccg caatgcgtga cgccatccac ggccaaccgc gttgatccat cccgagcagc 3420 aacagggcgg agagaaatgt gggcagtatc tttgccaggc aaaccacaag cgcggatcga 3480 acatctcacg tcatgatcgt gcaagacctt cctagaagcc ttggataacc gccatttttg 3540 ctcgtctttt gcctctgggg gggtaaaccg atttcctctg ttatcaaggg gctcagattt 3600 ggtgtccgga gctttacccg acagagcatc caaaccggca aaatcctgcc ctgacgcttt 3660 cgaagtaatc cgagcattct tggaagcgct cgacgcagaa aaatgacgtg catttggccc 3720 cttgcgggat acctcatgca gattttttat ctttccacat tgaggatttt cgggctgaaa 3780 accgctattt tttaggggtt ctttaagcaa aatccccgcc aaacatggcg gtctggtgtt 3840 gaaatcgcgc ttcaattcct gatatggaaa aagcgcggat cggggtatgc gaaaacatag 3900 cctgttctaa gttctgggcc tatttcgggc tttcgccaag ttgcaaaccg agatcagccc 3960 tgatccgtgc caccagacct aacgtagctt ctcaccggta ggcaagccct cccgacaatc 4020 tctggtattc caaaccagtg aagcgcgtct ctgcatgacc ttcttctcat cgtccctaat 4080 gatgaaaatg cctttcccgt cttagggtct gcgccagctt gcaccgacca acccaaactt 4140 aggttcgttc atcacaaagg aaatcaacgt cacatctcga acgtaataga ctgcctatcc 4200 taggtatttt cctgctctct aacgatcact cgccctgatc gtgtccgaaa gagcctttgg 4260 tctgatcatt tgtctgaccg cgcttcacgt cctgcgctac acgattgacc aactggaacg 4320 cagttttctg cacatgatca ggaacagtca gaccggcaga ggccatccgc actacaagat 4380 caactgcttg agtggcgtcg gtaagactga cagggcttac ttgtctgaca gcgacctttt 4440 tacccgcgtt cctgtctgcc ttgatcttct cgcggatggc agaggcgatc cattctccaa 4500 caccaacacc agcagtcttg gcatgtgaga cagcagcttg cttcacgtct gaaggaactc 4560 cccggatgct ccaaggtgtt gcgtcagtct gatttccggt tcatgtcata ctcctatcag 4620 cttctgtagt caggaaaagc caaagtgtct gccccacaag ggatacgtct aacaaacaga 4680 cggaaatgta gacaagagcg tcaatctgaa tgactgccac agggcttatg gcggggatgc 4740 atcaaagcgc cctggcattt agatggcgca caaggagacc aaagcgcttg tgatcgagtt 4800 ggagcctcgg gaaattcccc taccaccctt aacagaagct ctgatcaggt tttgctcggg 4860 aaaaaagacg tagggacaag acaccgtcaa aaccattttg tgcgggtttt ctcatacgct 4920 ctgaagaaac aaagagaatt ttcgcatgtc tttggaaaga cgcgattaat aatccagata 4980 caaacaaata atgcaaaaat gttctaaaat ataagaacaa ttctagtctt ctgaaatttc 5040 accaaattga agttcataga tcaaaaactt tgatatctat ctaattaaac aatagaatat 5100 ggctattatc atcacacatg gatctgatca tgacctatgg cggcactcat gccaatgcca 5160 gtcagcgcac cgggaccgaa gcgtgatctt gccgacgcga tcactcaacg ggacacactc 5220 acaaaacggc tgaaagctct tcggaccaac attcaggcat gccgtggtgc aggccgagat 5280 atcccggcca atctggcatt cgatcttctg caaaccgagc gttctgtcga agccaaggaa 5340 aaagaactgg caggtctgga agtcatctgc cgggatcatc tcaagcaacg atccgaagaa 5400 gaactgaagc agaaagagaa ggctgagatt gctcaccggg aaaccgtagc agcgtactca 5460 actgaagtcc tgacggctgc caagcagact gatgacgctc tttcggcttt gatcacggcc 5520 ttcacctcat tgaagactgc aagccagagc ctaagcctac acaacggcat cacgatcgat 5580 ggatgggcta acaacccgga aagctggctc atggaagcca tgggcaccat gaacacatca 5640 gacggaaa 5648
【図１】 本発明のプラスミドpAG5の制限酵素地図。数
字は塩基番号を示す。
字は塩基番号を示す。
【図２】 本発明のシャトルベクターpSG8およびpSG6の
構築手順の概要を示す図。
構築手順の概要を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横関 健三 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社アミノサイエンス研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 EA04 FA15
Claims (5)
- 【請求項１】 大きさが約５．６ｋｂであるグルコノバ
クター オキシダンスＩＦＯ３１７１株由来の内在性プ
ラスミド、またはその誘導体であってグルコノバクター
属細菌で自律複製可能なプラスミド。 - 【請求項２】 配列番号１に示す塩基配列を有する請求
項１記載のプラスミド。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のプラスミド又はそ
の一部とエシェリヒア属細菌で自律複製可能なプラスミ
ド又はその一部から構築され、グルコノバクター属細菌
及びエシェリヒア属細菌で自律複製可能なシャトルベク
ター。 - 【請求項４】 エシェリヒア属細菌で自律複製可能なプ
ラスミドがｐＵＣ１８である請求項３記載のシャトルベ
クター。 - 【請求項５】 ｐＳＧ８またはｐＳＧ６のいずれかであ
る請求項４記載のシャトルベクター。
Priority Applications (7)
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|---|---|---|---|
| JP10227437A JP2000050869A (ja) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター |
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| KR1019990032774A KR20000017225A (ko) | 1998-08-11 | 1999-08-10 | 글루코노박터 세균으로부터 유도된 플라스미드 및 벡터 |
| EP99115780A EP0979875A1 (en) | 1998-08-11 | 1999-08-10 | Plasmid derived from gluconobacter bacteria and vector |
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|---|---|---|---|
| JP10227437A JP2000050869A (ja) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター |
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| EP (1) | EP0979875A1 (ja) |
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| PE (1) | PE20001129A1 (ja) |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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- 1999-08-10 KR KR1019990032774A patent/KR20000017225A/ko not_active Application Discontinuation
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- 1999-08-11 PE PE1999000809A patent/PE20001129A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-08-11 CN CN99117706A patent/CN1256308A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
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