CN115029290B - 抑制非必需高丰度蛋白表达以提高tg酶发酵水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，是通过在茂源链霉菌IPIO中，利用CRISPRi技术弱化茂源链霉菌IPIO中非必需高丰度蛋白编码基因的转录水平，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株。本发明通过降低高丰度蛋白编码基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和SMDS_6427的转录水平，抑制了这些蛋白的合成，减轻TG酶合成过程中的氨基酸前体竞争压力，以此来提高谷氨酰胺转氨酶的发酵水平。本发明所得的工程菌株的谷氨酰胺转氨酶发酵产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株分别提高37％、35％、46％和32％。通过本发明可显著提高谷氨酰胺转氨酶的发酵产量，同时大幅度降低发酵成本。

Description

抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种利用CRISPRi技术降低SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989 和SMDS_6427的转录水平，抑制上述4种高丰度非必需蛋白的表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质，被广泛应用于食品行业蛋白制品食用添加剂、交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物、提高羊毛纺织品的强度等，市场需求量逐年上升，然而目前该酶产量仍然较低，亟待进一步提升。本发明发现，在茂源链霉菌生产TG酶的过程中，胞内胞外存在其他一些高丰度蛋白质，通过分别抑制其中非必需高丰度蛋白的表达，能够减轻TG酶合成过程中氨基酸前体的竞争压力，进而提高了TG酶的产量。进一步的，本发明通过蛋白质组学发现 SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和SMDS_6427蛋白丰度较高且基因功能非必需，利用CRISPRi技术降低上述基因的转录水平，抑制其非必需高丰度蛋白的表达可以减轻 TG酶合成过程中对氨基酸前体的竞争压力，增加TG酶合成过程中的氨基酸供应，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种抑制高丰度非必需蛋白SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和 SMDS_6427表达的方法；通过在茂源链霉菌IPIO中利用CRISPRi技术降低SMDS_5177、 SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平，抑制SMDS_5177、SMDS_758、 SMDS_5989和SMDS_6427表达，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种TG酶高产菌株，所述菌株的非必需高丰度蛋白编码基因转录被抑制。
作为本发明的一个实施方案，所述菌株的谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白、短杆菌肽合酶C亚基蛋白、苦霉素合酶模块3和4蛋白或促自溶诱导蛋白表达被抑制。具体是在茂源链霉菌中(通过CRISPRi技术)分别抑制了高丰度非必需蛋白编码基因 SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平。分别抑制了蛋白的表达，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。
作为本发明的一个实施方案，所述茂源链霉菌为茂源链霉菌IPIO。
第二方面，本发明提供一种用于降低蛋白编码基因转录水平的整合型质粒载体，所述载体分别降低了非必需高丰度蛋白编码基因SMDS_5177(谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因)、SMDS_758(短杆菌肽合酶C亚基蛋白编码基因)、SMDS_5989 (苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因)、SMDS_6427(促自溶诱导蛋白编码基因)的转录水平，含有靶向以上4个基因启动子区域的sgRNA，通过降低基因转录水平抑制蛋白表达。
作为本发明的一个实施方案，所述非必需高丰度蛋白编码基因源于茂源链霉菌IPIO。
作为本发明的一个实施方案，所述谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因及gRNA为序列如SEQ ID NO.1-NO.2所示的SMDS_5177及gRNA SMDS_5177；所述短杆菌肽合酶C亚基蛋白编码基因及gRNA为序列SEQ ID NO.3-NO.4所示的SMDS_758及 gRNA SMDS_758；所述苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因及gRNA为序列如SEQ ID NO.5-NO.6所示的SMDS_5989及gRNA SMDS_5989；所述促自溶诱导蛋白编码基因及gRNA 为序列如SEQ ID NO.7-NO.8所示的SMDS_6427及gRNA SMDS_6427。
作为本发明的一个实施方案，所述抑制表达为CRISPRi干扰基因转录水平。
第三方面，本发明涉及一种用于降低蛋白编码基因转录水平的整合型质粒载体的构建方法，其技术要点是，质粒的构建方法包括以下步骤：
在CRISPy-web网站上特异性设计靶向SMDS_5177的gRNA，通过PCR扩增得到252 bp的含sgRNA SMDS_5177基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒 pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2103；
或，在CRISPy-web网站上特异性设计靶向SMDS_758的gRNA，通过PCR扩增得到252bp的含sgRNA SMDS_758基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2106；
或，在CRISPy-web网站上特异性设计靶向SMDS_5989的gRNA，通过PCR扩增得到252bp的含sgRNA SMDS_5989基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2108；
或，在CRISPy-web网站上特异性设计靶向SMDS_6427的gRNA，通过PCR扩增得到252bp的含sgRNA SMDS_6427基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2109。
作为本发明的一个实施方案，所述扩增分别采用的引物为序列如SEQ ID NO.9/10所示的引物SMDS_5177gRNAp-F/gRNA-R，SEQ ID NO.11/10所示的引物 SMDS_758gRNAp-F/gRNA-R，SEQ ID NO.12/10所示的引物SMDS_5989gRNAp-F/gRNA-R，SEQ ID NO.13/10所示的引物SMDS_6427gRNAp-F/gRNA-R。
第四方面，本发明涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，将前述的整合型质粒载体，或前述的方法构建得到的整合型质粒载体通过接合转移分别导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行重组获得所述菌株。
作为本发明的一个实施方案，所述重组为位点特异性重组。
作为本发明的一个实施方案，重组之后还包括通过抗性和PCR验证筛选得到重组突变株的步骤。
第五方面，本发明涉及一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过降低非必需高丰度蛋白编码基因的转录水平，抑制相应蛋白表达以提高茂源链霉菌IPIO发酵生产谷氨酰胺转氨酶的产量。具体是分别通过CRISPRi技术降低茂源链霉菌中非必需高丰度蛋白编码基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平。以抑制相应蛋白质表达、减轻TG酶合成过程中氨基酸前体的竞争压力，增加TG酶合成过程中的氨基酸供应，最终提高茂源链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的产量。
作为本发明的一个实施方案，所述非必需高丰度蛋白编码基因源于茂源链霉菌IPIO。
作为本发明的一个实施方案，谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因及 sgRNA为序列如SEQ ID NO.1-NO.2所示的SMDS_5177及gRNA SMDS_5177；短杆菌肽合酶 C亚基蛋白编码基因及sgRNA为序列SEQ ID NO.3-NO.4所示的SMDS_758及gRNA SMDS_758；苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因及sgRNA为序列如SEQ ID NO.5-NO.6所示的SMDS_5989及gRNASMDS_5989；促自溶诱导蛋白编码基因及sgRNA为序列如SEQ ID NO.7-NO.8所示的SMDS_6427及gRNA SMDS_6427。
作为本发明的一个实施方案，在茂源链霉菌IPIO降低高丰度非必需蛋白编码基因的转录水平获得高丰度非必需蛋白弱化表达突变株，发酵获得谷氨酰胺转氨酶。作为一个具体示例，在茂源链霉菌IPIO中分别降低了非必需高丰度蛋白编码基因SMDS_5177、 SMDS_758、SMDS_5989与SMDS_6427的转录水平，获得抑制表达突变株WBH03、 WBH06、WBH08和WBH09，发酵获得谷氨酰胺转氨酶。本发明通过在茂源链霉菌IPIO 中利用CRISPRi技术分别降低非必需高丰度蛋白编码基因转录水平，抑制相应蛋白表达，减轻TG酶合成过程中对氨基酸前体的竞争压力，进而提高谷氨酰胺转氨酶产量。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵包括以下步骤：将活化后的突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵28-32h。收集发酵液并进行酶活检测的步骤。
作为一个具体示例，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200rpm的条件下发酵30h。
作为本发明的一个实施方案，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.3w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.3w/v％。作为一个具体示例，所述种子培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨 2.5w/v％，MgSO4·7H2O 0.2w/v％，K2HPO4·3H2O 0.2w/v％。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.3w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.3w/v％，发酵促进剂0.1-0.4w/v％。作为一个具体示例，所述发酵培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·7H2O 0.2w/v％，K2HPO4·3H2O 0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％。
本发明所涉及的质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1已经在SCI数据库文献《Zhao Y,Li L, Zheng G,Jiang W,Deng Z,Wang Z,Lu Y.CRISPR/dCas9-Mediated Multiplex GeneRepression in Streptomyces.Biotechnol J.2018Sep；13(9):e1800121.》中记载。
本发明所涉及的菌株茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO)由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为M 2020196，保藏日期为2020.6.10。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明发现，茂源链霉菌IPIO在发酵过程中胞内和胞外存在其他高丰度蛋白质，这可能是限制TG酶产量提升的一个因素；通过分别抑制其中非必需高丰度蛋白的表达，减轻了TG酶合成过程中氨基酸前体的竞争压力，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量；
2)本发明进一步在茂源链霉菌IPIO中，利用整合型载体pSET-dCas9-actII4-NT-S1，在IPIO中利用CRISPRi技术分别降低来源于茂源链霉菌IPIO的谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因SMDS_5177、短杆菌肽合酶C亚基蛋白编码基因SMDS_758、苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因SMDS_5989、促自溶诱导蛋白编码基因SMDS_6427 的转录水平，抑制相应蛋白表达，实验室摇瓶水平下较对照菌株(空白载体整合菌株)酶活分别提高37％、35％、46％和32％；通过本发明可显著提高TG酶的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为SMDS_5177基因弱化质粒构建示意图；
图2为SMDS_758基因弱化质粒构建示意图；
图3为SMDS_5989基因弱化质粒构建示意图；
图4为SMDS_6427基因弱化质粒构建示意图；
图5为非必需高丰度蛋白抑制表达突变株与对照菌株TG酶发酵产量示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
实施例1
本实施例为制备非必需高丰度蛋白编码基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989 与SMDS_6427敲低突变株WBH03、WBH06、WBH08和WBH09的具体过程。具体包括以下步骤：
第一步：构建质粒pLQ2103：以整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1作为模板，使用在两端引入Gibson重复序列的引物SMDS_5177gRNAp-F/gRNA-R，通过PCR扩增得到含gRNASMDS_5177的PCR片段(252bp)。在质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1的SpeI/EcoRI 位点插入扩增片段，得到质粒pLQ2103，如图1。
第二步：构建质粒pLQ2106：以整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1作为模板，使用在两端引入Gibson重复序列的引物SMDS_758gRNAp-F/gRNA-R，通过PCR扩增得到含gRNASMDS_758的PCR片段(252bp)。在质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1的SpeI/EcoRI 位点插入扩增片段，得到质粒pLQ2106，如图2。
第三步：构建质粒pLQ2108：以整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1作为模板，使用在两端引入Gibson重复序列的引物SMDS_5989gRNAp-F/gRNA-R，通过PCR扩增得到含gRNASMDS_5989的PCR片段(252bp)。在质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1的SpeI/EcoRI 位点插入扩增片段，得到质粒pLQ2108，如图3。
第四步：构建质粒pLQ2109：以整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1作为模板，使用在两端引入Gibson重复序列的引物SMDS_6427gRNAp-F/gRNA-R，通过PCR扩增得到含gRNASMDS_6427的PCR片段(252bp)。在质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1的SpeI/EcoRI 位点插入扩增片段，得到质粒pLQ2109，如图4。
*第一至四步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：
EcoRI识别位点： SpeI识别位点：
5'...G^AATTC...3' 5'...A^CTAGT...3'
3'...CTTAA^G...5' 3'...TGATC^A...5
*第一至四步所用到的引物序列为：
*第一至四步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：
PCR反应体系：DNA模板30ng，引物20pmol，50％DMSO 5μL，dNTP 10nmol，缓冲液25μL，TaqDNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至50μL；
PCR条件：95℃5min；95℃15s；55℃15s；72℃25s；循环32次；72℃10min。
第五步：将第一至四步构建得到的质粒载体pLQ2103、pLQ2106、pLQ2108、pLQ2109分别通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，并通过抗性及 PCR验证筛选正确的接合子，从而得到SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427 基因表达弱化突变株。具体包括以下步骤：
将质粒pLQ2103、pLQ2106、pLQ2108、pLQ2109分别转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中。将对应ET12567(pUZ8002)接种于含有Apr(终浓度50μg/mL)、Kan(终浓度50μg/mL) 和Chl(终浓度25μg/mL)三种抗生素的LB中，37℃培养20h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时将茂源链霉菌IPIO的新鲜孢子(固体培养基上活化约7-10d)收集于TES溶液中，50℃热激10min，用LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的供体菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为108： 109)均匀后涂布于含有20mM镁离子的ISP4MYM固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。14-16h后取出平板，分别将安普霉素(终浓度50μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50 μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在ISP4MYM固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5d后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素(终浓度50μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素的ISP4MYM固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到SMDS_5177、 SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427基因表达弱化突变株，分别记为WBH03、WBH06、 WBH08和WBH09。
*第五步所用到的引物序列为：
引物名称 碱基序列
dcas9-YZ-F AAGGGTACCGGATCCTTGACA SEQ ID NO.14
dcas9-YZ-R AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAA SEQ ID NO.15
*第五步中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：
PCR体系：DNA模板10～100ng，引物10pmol，50％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液 10μL，加纯水补齐至20μL；
PCR条件：95℃10min；95℃30s；58℃30s；72℃30s；循环30次；72℃10min。
实施例2
本实施例为利用四株非必需高丰度蛋白基因弱化突变株WBH03、WBH06、WBH08 和WBH09发酵产生TG酶的过程。具体步骤如下：分别将突变株WBH03、WBH06、 WBH08和WBH09涂布于固体ISP4MYM培养基上活化，30℃培养7-10d后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200rpm条件下发酵30h，收集发酵液进行酶活检测。
表1种子培养基及发酵培养基的成分构成
实施例3
本实施例为利用比色法检测TG酶的酶活的方法。具体为：取200μL稀释10-20倍的发酵液上清于试管中，其中一管加入200μL水作为对照，加入2mL 37℃预热好的A 液，37℃反应10min后，加入2mL B液终止反应。用石英比色皿在分光光度计525nm 处测定发酵液的吸光度。最终将OD525nm带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TG酶的酶活。
其中，溶液配制方法如下：
A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸(N-α-CBZ-GLN-GLY)于烧杯中，加350mL 水，调节pH为6.0，加水定容至400mL。
B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，3％FeCl3溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。
图5为非必需高丰度蛋白基因弱化突变株与对照菌株TG酶发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下突变株WBH03、WBH06、WBH08和WBH09的产量对比野生型菌株分别提高37％、35％、46％和32％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
泰兴市东圣生物科技有限公司
<120> 抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法
<130> KAG48495
<141> 2022-03-15
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 447
<212> DNA
<213> Streptomyces mobaraensis IPIO
<400> 1
atgcggtaca tcactggggg gatcgccctg ggatcagcgt tgatcctggg cagcctggtg 60
ggggccgggg ccaccgctag cgcgacgccc gcgcccgcac ccgccgccca gcagagcctg 120
tacgcaccct cggcactggt actcaccgtc ggccagggcg acaaggcagc ctccgccggc 180
atccagcgcg cggtgaccct cacctgcatg cccaagccga gcggtaccca cccggacgcc 240
cgtggggcct gcgaccaact gcgcgccgcg aacggcaact tcgaggagat caccaaggtc 300
aagtccggca cggcctgcac caaggagtgg aacccgttcg tcgtgacggc ggagggcgtc 360
tgggaaggcc agcgcgtcaa gtacgagcac accttcgcca acccgtgcga gatgaaggcg 420
ggcaagggca ccgtcttcga gttctga 447
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cccacgaaca agggagtgtt 20
<210> 3
<211> 5019
<212> DNA
<213> Streptomyces mobaraensis IPIO
<400> 3
tcagacacgg tggcgggaac cttcctcgcg ggggcggggg ccgccctggg cgggtggggt 60
ggggcgggtg agggcggacc cgccgggggc cggcactgcg gggccggatg ctccggggcc 120
ggaccctccg ggggcggacg gccggagcgc ggacgctccg ggggcagccc ctcccgagac 180
gggcactcca gggccggacg tcccgggcgc agcctctcca ggaacaggcc cctcaggggc 240
agacgccccg ggcgcggatg cttcggacgc aagccctccg acggcaggcc ctccgacggc 300
atcccctcca ggcgcggacg ctccgagggt ggaggccgtg gacgcagacg ccccggacac 360
ggacgccccg gacgcaagcc ctccgccagc cggcccccca ggcacggacc ccccgcgacc 420
ggcccctccc gcggcggcgc ccggcccacc ggccccggcc cgccccgcgc acgcgctcac 480
cgcctccagg gcccggaacc acaggtcggc cagttctccc accgactcct ccggcagcag 540
cgccgccggc caggaccagc ggacgtgcag ttcgggcccg tccgcccgtt ggagcgcgta 600
ggcgttgacg tccaggacgt agccggccgg catcgccggg tcggcggcgg cgctgaagtc 660
ggcggcctcc tcggcgaggg tgaactcgcc gtcggccgtc tcgccggtgg cgaaccggcc 720
caggtagttg aactcgatct gcggctgcgg cagtccggcc agcgccgggc ccgcctccgg 780
gtcgaggtgg cgcagcagcc cgtggccgat gccgtggtcg gggacggtac ggagccggtc 840
gcggacggag cggacgaggc cggcgagggg cgggccgccg gccagggcgg cggcggtgtc 900
ggccgggccg gggtcgaggc ggacggggtg gacggcggtg aaccagccga ccgtgcggga 960
gaggtcggca cccgggacga gctggtcctc gcggccgtgg gcttcgaggg cgacgaggac 1020
ggcgcgccgc gcggggtcgg ttccggcgcg ttcgcgccag acggtgaggg ccagcgacag 1080
agcggcgagg aggacgtcgt tgacggacgc gccgagggcg gcgggagtgt cggtgagcag 1140
ccgccccgcg cggtccggcg gcagggtgcg gtcgacgtgg cgcaggctgc ccttggtgtc 1200
gcggcgcggg tcgggggcga ggccgggcag caggggttcg gcgccggcgg ccatggcggt 1260
ccagagcggg agttcggcgc gccggccgcc ggcggccgcc tgctcggcga gggcgcgggc 1320
ccagtgccgg aaggaggtgc ggacgggttc gagggcgggc ggctcgccgg ccgccgccgc 1380
gcggcaggcg gcggcgaggt cgggcagcag gacgcgccag gagacgccgt cgacgacgag 1440
gtggtggccg aggacgagga gccgggcgtc ggccgggtcg tcggtgtcca gccggacggc 1500
gaggaagacg acgccggcgg cggggtcgag ccggtccagg gcggcttcgt acgcggcggc 1560
gaggagccgg tgcgcggcct cggcggacag cccggtcgcg tccacccgcc ggacggcgtc 1620
ggccgcgagg accgagccgg gcgggcgggt ctccagtacg cccgtggcct cgtcgaagcg 1680
ggcgcggagc atgtcgtgcc ggtcgaggag ggcctggacg gcggtgagga ggtggtcgtg 1740
gccgaggccg gcggggagac gcagcaggtt tccctgcgcg tagcggccga tgggaccgcc 1800
ggtgccggtg agccagtgca tgatcggggt gagggggagg accccgatgc cgtcgtcgtc 1860
gccggccggg gcgtcctcgg cggcggtcgc ggcggcgagg gcggcgacgc tcggcgcggt 1920
gaagacgtcc ttgggcgaga tggccaggcc ggcggcgcgg gcgcggccgg tgagctggat 1980
ggagacgatg ctgtcgccgc cgagggcgaa gaagtcgtcg tcgggaccca cctcgtccac 2040
gccgaggagt tcggcgatca gcgcgcagag cagcttctcg cgcggggtgc ccggcggccg 2100
ggatccggag ccggcggcgg ccgggacggg gagggcggcc cggtcgagct tcccgtgggc 2160
ggtgagcggg agttcgggga cgacggcgac gccggccggg accatgtggg cgggcagggt 2220
ggcggcgagg aagtcccgca gctcccccgg cgcgggctcg gcgccggcgg cgggcacggc 2280
gtagccgtac agccgtttga cgcccgggcg gtcctcgcgg acgaccacca ccgcccgttc 2340
gacgtccgga tgggcggcga gggcgctctc ggtctcgccg ggctccaccc ggaagccgcg 2400
gatcttgacc tggtcgtccg tccggccggt gaagtcgagc tgcccgtcgg cggtccagcg 2460
gaccacgtcg ccggtgcggt acatccgggt gccgggcggc ccgaaggggt cggcgacgaa 2520
gcggccggcc gtcacgccgg gccgccgcag gtagccgcgg gcgaggccgt tgccggccag 2580
gtacaactcg ccgtccacgc ccgccggtac ggggttgagg taggtgtcga ggacgtaggc 2640
gcgggtgttg ccgatgggcc ggccgatgac gggccgctcg ctgtcgcggg tgtcggcgac 2700
gacggtgtcc acggtgcact cggtgggccc gtagaagttg tacgtacggg tgtcgggcag 2760
cgcgcgtagc cgctgccaca tggcgtcggg cacggcctcg ccgcccacgc cgagcccggt 2820
gagccgggcg ggccggccgt cccgcccgcc ggcggccaac tggccgtaga acgagggcga 2880
cacctcgatg aagtcgatcg ctcgctcctc cagccaggcc aggtgcaggg cggggtcgcg 2940
gcgcgtgtcc tcgtccagga tctcgatcgt gtgcccgtcg aagagggcga cgagcggctg 3000
ccaggaggcg tcgaaggaga acgaccagcc gtgcccgacg cgcagccgcc gcccggccgc 3060
ctcggcggcg ggcccgtaca cctgccgccg gtgactggcc agcaggctca ccacgttgcg 3120
gtgcacggtg acgacgccct tgggggcgcc ggtggaaccg gaggtgtaaa tgacgtaggc 3180
ggggtggccg gggagcagcg ggcgcggcag gtcggcgtcg gtgacggggt cgccggggag 3240
gtcggccagc gcttcccgga aagccgggtc gtcgacggcc agggcgggca gtccgccggg 3300
gacgccggcc ggcggttcgc cgacggtgag cagcagccgc ggccgggcgt cggtcagcat 3360
gtgcgcgacc cgcgcggccg ggtactcggg gtcgacgggc acgtaggcgg cgcccgcctt 3420
ctggacggcg agcagggcgg tgacgatgtc gaggccgcgc ggcatcgcga gggcgacgag 3480
gtcctcgggg ccgacgccct cggcgacgag ccggcgggcg aggcggttgg cgcgggcgtc 3540
gagctcggcg aaggtcagcg tctcgccggc gaagacgacg gcgggcgcgt cgggccgggc 3600
ggccacctgg ccggcgaaca ggccggggag ggtggcgtcc ggtacgtcca cggcgggccc 3660
gcgcccgtcg gcgaggaggc gcgcgcgttc gtcgtccgcg aggacgtcca ggcggcccac 3720
cgggcggtcg ggtgcgtcga ggaaggcggt gacgagccgt tcgaagcggc cggccagggt 3780
atgggcggcg gcgcggtcga ggacgtcggg ctggtactcg aaggagacgg tcagccggcc 3840
gtggaggagc agcgggacga gggtcaccgg gtagtgggtg gcgtcccggt tggcgatgcc 3900
gctgacttcg aggccgccgg cggtgcgggc gttctccagg ctctcggtga cgtcgggggc 3960
gttctcgaag acgacgaggg tgtcgaagag ttcgccggtg ccggcggcgc gctggatgtc 4020
ggcgaggccg aggtcgtggt ggggcagcag ggcggcctgc tcggcctgga gccgggcgag 4080
gaggccggtg agcggctcgt cgggccgcag ggtgacgcgg accggaacgg tgttgatgaa 4140
caggccgatc atcgtctcga ccccgggcag gccggcgggg cggccggaga cggacgcgcc 4200
gaacaccacg tcgcggctgc ccgtgagtct gccgagcagg atgccccaga ggccctgcac 4260
cacggtgttg agggtgagcc ctctgctccg ggccagggcg ccgaggcggg cggtggtggc 4320
ctcgtccagg gtgagcggga cgacgtcggg ggtgcgggcc gcccgggcgc ggccggggcc 4380
gtagaggtgg gtggggccgg ggaggccggc gagggcggtg cgccaggcgg cctcggcggg 4440
ggccttgtcc agcgtggcga gccgggcgag gtggtcgcgg tagcggcggg gggcgagcag 4500
ggccgcgggg tcgccgccgt gggcgtggag ctcgacgagt tcgcggacga gcagcggcac 4560
cgaccagccg tcgaggagga tgtggtggct gtgcaggacg agccggtgga ggcggtcggc 4620
gagccggatc agccggaagc gcatcagcgg cggttcggtg aggtcgaagc ggcgggcgcg 4680
gtcctcgcgg aggacggctt cgagggcgtc ctcccgttct ccggccggca cgtggccgag 4740
atcggtctcc tcccagaccg gctcgacggc cttggggatc acctggaccg gccgccggac 4800
gccctcgttc cagaaggcgg cgcgcaggtt ggggtggcgg tgcagcagcg ccccggcgga 4860
gcggcgcagc acggcgcggt ccagcggtcc gcgcagttcc aggatgagct gcatggtgta 4920
gacgtcgtgg gcgctctcgt cgaagagcgc ttggaagagc agcccctcct gcaagggcgc 4980
gagcggcagt acgtcctcga tgcccggccg cttcgtcat 5019
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcccctgatt ccgttccctg 20
<210> 5
<211> 10272
<212> DNA
<213> Streptomyces mobaraensis IPIO
<400> 5
atggcctgcc gcctgcccgg tgacgtccgg tcccccgagg acctgtggcg gctcgtcgcc 60
accggcaccg acgccatcac cccgttcccc gaggaccgcg gctgggacgt cgacgccctc 120
tacgacccgg accccgacac ccccggccgc acctatgtcc gggagggcgg cttcgtccac 180
gacgccggcc gcttcgacgc cgacttcttc ggcatcagcc cccgcgaggc cacggccatg 240
cacccgcagc agcggctgct gctggagacc gcctgggagg cgttcgaacg ggccggcatc 300
gacccgtcgt ccgtccgcgg cacgcgcacc ggcgtgttcg ccggcgtgat gcagatggac 360
tacgcgtccc ggctgcgcaa ggcccccgag gacctcgagg gctatctgat gaccggcggg 420
cagggcagcg tcgtctccgg ccgcatcgcc tacaccctcg gcctcgaagg ccccgccgtc 480
accgtcgaca ccgcctgttc ctcgtccctg gtggcagccc acctcgcctg ccagtccctc 540
cggcgccagg agtgcaccct cgccctggcc ggcggcgtca ccgtcatggc cgacaccctc 600
ggcttcgtcg agttcagccg gcagcgcgcg ctgtccccgg acggccgctg ccgctcgttc 660
gccgccggcg cggaaggcac cggctgggcc gagggcgccg gcgtcctgct cctcgaacgg 720
ctctccgacg cccgccgcaa cggccaccgg atcctcgccg tcctgcgcgg ctccgccgtc 780
aaccaggacg gcggcagcag cggcttttcc gcccccaacg gccccgccca gcagcgcgtc 840
atccgcgacg ccctcgccgg cgcccggctg acccccgccg acgtggacgc cgtggaggca 900
cacggcaccg ggacgaagct cggcgacccg atcgaggccc aggcgctcct cgccacctac 960
ggcaagggac gtgcggcgga ccggccgctg tggctcggct cgctcaagtc caacctcggc 1020
cacacccagg ctgccgcggg cgtcgccggc gtcatcaaga tggtgatggc gctgcgcaac 1080
ggcgtcctcc cgcgcaccct ccacgtcgac gcgcccaccc cgcacgtcga ctgggaggcc 1140
ggcggcgtcg ccctgctcac cgaggagcgg ccctggcccg aggccgcccg gccgcgccgg 1200
gccgccgtct cctccttcgg catcagcggc accaacgccc acgtcatcat cgaacaggcc 1260
cccgccgacg gcgccgacga gcccaccggc gccggcgcgg tggccgacgg ctccggcgtc 1320
ctgccctggc tgctctccgc ccgtacgccc gaggccctgc gcgagcaggc ggcccggctg 1380
cgcacggagg tcaccggcca cgccgagtgg cccgccggcg aggtcggctg gtccctcgcc 1440
accgggcgcg cggccctcga acagcgggcc gtcgtcatcg gcggcgaccg cgaggaactc 1500
ctcaccggcc tcaccgccct caccaccggc gacgccgccc ccaccctggt gaccggggcg 1560
accggcggcg gttccctcgg ccggcccgtc ttcgtcttcc ccggccaggg ctcgcagtgg 1620
ctcggcatgg ccgtcgaact cctcggctcc agcgaggtgt tcgccgggcg gatggccgac 1680
tgcgagcggg cgctggcacc gttcgtggac tggtccctgg tggacgtgct gcgcggcgcg 1740
gaaggcgccc ccgggctcga ccgggtggac gtcgtgcagc cggcgctgtg ggccgtgatg 1800
gtgtcgctcg ccgaactgtg gcggtccgtg ggcgtggaac ccgccgccgt cgtggggcac 1860
tcgcagggcg agatcgccgc cgcgtgcgtg gcgggcgggc tcacgctgga ggacggcgcc 1920
cgggtggtgg cgctgcggtc gcgggcgctg ctggagatcg ccggcgaggg tgggatgatg 1980
tccgtcgccc tgcccgccgc cgagacggag acgctggtcg cggcctggga cggccgcata 2040
tccgtcgccg ccctcaacgg cccccggtcc acggtggtct gcggggacgc gagcgcgctg 2100
gacgagctca tggcccactg cgaggccgat gagatccggg cccggcgcgt gcccgtcgac 2160
tacgcgtcgc actcggcgca cgtcgagcgc atccgcgagc ggatccgggg cgaactggcg 2220
gacgtccggc cgcactcggg ctcggtgccg ttccactcca ccctcaccgg cgaggtgttc 2280
gacacggccg gtcttgacgc ggactactgg taccgcaacc tgcgcggcac cgtccgcttc 2340
cagtcggtga tcgaggggct gctggccgcc gggcaccggg cgttcgtcga gtgcagcgcc 2400
catccggtgc tgaccgtcgg ggtcgaggag accgcgcagg aggcggacgt cccggccgtc 2460
gtcgtcggct cgctgcgccg cgacgagggc gactggcggc gcttcctgac ctccatggcc 2520
gaggcgtaca cccagggcct cgccgtcgac tggccctcgc tcttctcggg cggcgcccgc 2580
cgcctcgtcg acctgcccac ctacgcgttc cagcaccgcc gttactggct ggaggagacc 2640
gcgccggagg aggccgggcc cgccgacgga ccggaggccg gcttctggag cgccgtcgag 2700
gacggggacg ccgacgccct cgccgccgcc ctgcgggtgg aggacgacga acagcgcacc 2760
tccgtggcct ccctcctccc ggtcctgtcc tcctggcggc ggcggagccg cgagcgcgac 2820
gccgtggacg gctggcgcta ccggatcggc tggaaacccg tcggcgccgt gggcgccgga 2880
ccctccggca cctggctcgt cgtcctgccc gaggggcacg cggacgaccc gtggccggcg 2940
gcggtcgtgg acgccctgac ggcccgcggc gtctccgtcg tcaccgtctc gccgcccgcg 3000
gcggacgccg gccggcactc cctcgccgac tccctccgca ccgccctggc cggcgcggaa 3060
ccggcgggcg tgctgtcctt cctcgccctg gacacccggc cgtgggccgg ccgccccgac 3120
acgggcaccg gcgtcttcct gacgctcggc ctggtccagg ccctgggcga cgcgggcgtg 3180
accgcgcccc tgtggtgcgc cacgcgcggc gcggtcgcca ccggcccctc cgacccgccg 3240
gccgatcccg tccaggccca ggtctggggc ctcggccggg tcgtcgcggt ggagcacccg 3300
gaacgctggg gcggtctgct ggacctgccg ggcggcgtgg acccggacga gcggacgctc 3360
gaccggttct gcggggcgct ggcgggcggc gcgggggtgg gccgtcgtac gggcgcaccc 3420
gcctcagggg acgctggatc ggtggccggt ggcaccgggt cggccgtcgc gaccgccgag 3480
tcggccgccg gaaccgccgg accggctccc gaggaggccg tacccgccgc cggaatcgcc 3540
cgtccgcaca ccggccccgc cgcggacgcc gaggaccagc tcgccgtccg tcccgccggg 3600
ctgttcgccc ggcggatgct ctccgcgccg ctgggcgacg cccggccggc ccgggactgg 3660
aagccgcgcg gcaccgtcct ggtgaccggc ggcacgggcg tcctcggccg gcggctcgcc 3720
cagtggctgg ccgcctccgg ggccgagcac ctcgtcctcg tcagccgtcg tggggccgaa 3780
gccccggggg cgcgcgaact ccgcgacgag atcacggcgt tgggcgccga cgtcaccctc 3840
gccgcctgcg acctcgccga ccgggacgcc gtcgccgccc tgctcgccgg gctcgcggag 3900
gacggccgta cggtccgaac cgtgctgcac acggccgcgc acatcgagct ggaccgcgtc 3960
gacaccacca cgtacgacgc cctggccgac gccgtcgccg ccaagatggc cggcgcccgg 4020
cacctggccg acctcctcga cccggccgag ctcgacgcct tcgtcatgtt ctcgtcgatc 4080
gccagcgtct ggggcagcgg tgagcacgcc gcgtacgccg ccgccaacgc cgccctcgac 4140
gcgttcgccg agcacggcag ggcccgcggc ctcccgctga ccaccgtggc ctggggcgtc 4200
tgggaggacg ccgtgcgcac ctgggaggac cacggcctgg acgtggccga ccggcgccgg 4260
cgcgtccgcg aacagggcct gcccctgatg cgcaccgaac tcgccctcgc cgcgctccag 4320
caggtcctcg accaccgcga caccttcatc gcggtcgccg acatcgactg ggaccgcttc 4380
gtccccctct tcacctcggc ccgccccagc gccctgctgc gcgacctgcc gcaggcccgc 4440
ccggccaagg acgacgggaa ggcccccgcc gcgcccgccg gcgagggcgc cgaactccgc 4500
gcccgtctcg ccgcgttgcc cccggccgac cgccggcgcg ccctcctcga tctcgtccgg 4560
acgcacgccg tggccgtcct cggccactcc gcgcccgacg ccatcggcgc cgaacgcgcc 4620
ttcaaggagc tcgggttcga gtcgctgacg gccgtcgggc tgcgcaaccg gctggcctcc 4680
gccaccggac tgcggctccc cgccaccctc gtcttcgact acccgacccc cctcgccctc 4740
gccggccacc tcgccggcct gatcctcggc gacaccccgg cccccgccgc gcccgcggcc 4800
ccggtccccg ccctcccggc ggccgacgac gacccgatcg cgatcgtcgg catggcctgc 4860
cggttccccg gcggcgtcga gacccccgag gacctctggc ggctcgtcgc caccggcggc 4920
gacgccgtgt ccggcttccc cgccgaccgc ggctggcgcc tcgacgacct ctacgacccc 4980
gaccccgacc ggctcggcac cagctacgtc cgcgagggcg gcttcgtcca cggcgccgac 5040
cgcttcgacg ccggcttctt cggcatcagc ccccgcgagg ccctcgccat ggacccgcag 5100
cagcggctgc tgctggagac cgcctgggag gcgttcgagc gggcaggtat cggccgcgag 5160
gccctgcgct ccagcgccac cggctcgttc atcggcgcca tgaccaacgg ctacgggccg 5220
cgcccccagg acgcgccgcg cgagatcggc gactacgtgg tgacgggcag cgtcaccagc 5280
gtcgtctccg gccgcctcgc ctacgcgttc ggcctggagg gcccggcggt caccgtcgag 5340
acggcctgct cgtcgtccct cgtcgccctg cacctcgcct gccaggccct ccgtgccggc 5400
gactgctcca tggcgctcgc cggcggcagc gtcgtcatgc ccaccccgga cgcgttcgtc 5460
ggcttcagcc ggctccgcgg gctggcgagg gacggccgct gcaaggcgtt ctccgacgac 5520
gccgacggct tcggcctctc cgagggagca ggcgtcgtcc tgctcgaacg cctctccgag 5580
gcccgccgca acggccaccg ggtgctcgcc gtcgtccgcg gctccgccgt caaccaggac 5640
ggcgcctcca acgggctcgc cgcccccaac ggcccctccc agcagcgtgt catccgcgaa 5700
gccctggcga acgcccgggt ggcggcggcc gacgtcgaca cggtcgaggc acacggcacg 5760
ggcaccaagc tcggcgaccc gatcgaggcc caggcgctcc tcgccaccta cggccaggac 5820
cggcccgccg accggccgct ctggctcggc acggtgaagt ccaacatcgg ccacacccag 5880
gccgccgccg gcgtcgcggg cgtcatcaag accgtgctgg cactgcggca cggcgtcctc 5940
ccgcagaccc tgcacgtcag ccggctgtcc cgccacatcg actggtcggc gggcggcgtc 6000
gaggtgctga ccgagcaccg cgcctggccg gacacgcacg gccggccgcg ccgcgccggc 6060
gtctcggcct tcggcatcag cggcaccaac gcccacgtca tcctggaaca ggcgccggag 6120
gacgagtccg ccgccgctcc cgagagcagc tgcacggacg tcctgccctg ggcggtctcc 6180
gcccgctccc cgcaggccct gcgggcccag gccgcccggc tcgccgaggc cgtcggggac 6240
gcagacccgg gccgggtggg gtggacgctg gcgtcggggc gctcggcgtt cgagcaccgg 6300
gcggtgatca tcggggacgg tctcggtgaa ctgcgcgagg gcctgcgggc gttggcggac 6360
ggtgagatcg cctccggtgt ggtgagcggg gtggcctcgg gcgaggccga cggtccggtg 6420
ttcgtgttcc cggggcaggg gtcgcagtgg gccggcatgg ccgtcgaact gctcgacgcc 6480
tccgaggagt tcgccgagcg gatcgccgag tgcgagcggg cgctgggccc gtacgtggag 6540
tggtcgctca ccgatgtgct gcggcaggcg ccgggcgccc ccgggctgga gcgcgttgac 6600
gtcgtgcagc cggtgctgtg ggcggtgatg gtgtcgctgg ccgcgctgtg gcggtcgtcg 6660
ggcgttgagc ccgtcgccgt ggtggggcat tcgcagggcg agatcgccgc cgcgtgtgtg 6720
gcgggtggtc tgtcgctgga ggacggtgcc cgcgtcgtcg cgctgcgttc ccgggcgttg 6780
ctggagatcg cgggggaggg cggcatggtg tccgtcgccc tgccggccgc cgagaccgag 6840
gcgctgctgg agtcgtggga cgggcgaata tccgtcgccg ccctcaacgg cccgcgctcg 6900
acggtggtgt ccggtgaggc cggtgcgctg gaggagttgc tggcgcactg cgagtcccag 6960
gagatccggg cgcggcgggt gccggtcgac tacgcgtcgc actcggcgca cgtcgagcgc 7020
atccgggagc ggatccaccg ggagctggcg ggcatcagcc cccgctccgg gtcggtcccc 7080
ttccactcca cgctcaccgg tgaggtcttc gacacggccg gacttgacgc ggactactgg 7140
taccgcaacc tgcgcagcac cgtccgcttc cagtcggtga tcggcgatct gctgaccgcg 7200
ggccaccgga cgttcgtcga gtgcagcgcc caccccgtcc tcaccgtcgg catcgaggag 7260
accgcgcagg aggcggacgt accggccgtg gtcgtcggct cgttgcgccg cgacgagggc 7320
ggccgacgtc gcttcctgac ctccctggcc gaggcgtacg tccagggtgt ggccgtcgac 7380
tggaccaccg tcttcccggc cggcgcccgc caccgcgtcg acctccccac ctacgccttc 7440
cagcgcgagc ggttctgggt cgacgccccg cgtcccgccg gggacgtcgg gcaggccggg 7500
ctggccgacg ccgggcatcc gctgctgggc gcgggcgtgg ccctggccgg gggcgaaggg 7560
ctgctgttca ccgggcggtt gtcgacggag agccacccgt ggctcgccga ccacgccgtc 7620
tggggcacgg ccctgctgcc cggcaccgga ctggtcgaac tcgccgtgta cgcgggtgac 7680
caggccggct gcggcgccct ggaggaactg acgctccagg cgccgctcgt cctgcccgag 7740
cgcggcgcgg tcgacgtaca ggtacggctc ggcgcgcccg acgcggacgg gcggcggccg 7800
gtcggcatcc actcccgacc cgccgcgtcc gcccgggagt tcaccggtga cggctgggtc 7860
tgccacgcca ccggcacgct cgccgccacc ccggcggcgg agccggccgt cccggccgcc 7920
ggcgcctggc cgcccgccgc ggcgatcccc gtggacctcg acgggctcta cgagcgcctg 7980
gcgggcgacg ggttcggcta cggcccggcc ttccaggggc tgcgcgcggc gtggcggacc 8040
gaggaagcgt tcctcgccga ggtccggctg gcccccgaac agcaggcgga cgccgcccgg 8100
ttcggcgtcc acccggcgct gctcgacgcc gccctccaca ccaccctcct ggacggtgtg 8160
gaccaggtgc ggctgccgtt cgcctggacg ggcgtcgagg tgcacgccac cggcgcgacg 8220
gcgctgcgcg tccggctcgc ccggaccggc ccggacacgg tgtcgctgac cacgaccgac 8280
accaccggcc gtccggtggc ctccgtcgcg tcgctcgccg tccggcccgt ccggcccgag 8340
cagctgcgga acgcggcggc gggcgtgggg gacgcgctgt tccgcctcga ctggaccgag 8400
cgcgccgaaa agggcggggc acagggcggc acctgggccg tgctgggctc ctcgcccgag 8460
gccgacgccc tcgcggccgc cttgacggac gcgggcaccc ccgtcaccgt ccacgccgac 8520
gtcgcgaccc tgctcgccga agcggctccg gctccggacg tcctgctgct cccctggacg 8580
gaagcggacg ccggtcccgt ccccgccgcg acccacaccg ccgtccaccg tgccctggcc 8640
gtcctccagg gctgcctcgc cgcccccgcc ctggagaaca cccgcgtggt gtgggtgacg 8700
cgcggcgcgg tgagcgtcgt cgacggcgag gacgtcaccg acctggcggc cgccgccgtg 8760
cacggtgcgc tgcggtccgc gcgggtggag cacccgggcc ggttcgccgc cgtggacctc 8820
gacggggacg cggcgtccgt ccgcgcgctg ccggcggtgc cgttcgccga cgagccgtgg 8880
gcggccgtgc gggcgggccg ggtgctcgtc ccccggctgt cccgcgcggt agcggcgggc 8940
ggcgcggagg tcgtcgcacc aggggacggg accgtgctga tcaccggcgg caccggcacg 9000
ctgggcggcc tgctggcccg gcacctggtg accgtccacg gcgtacggaa cctgctgctg 9060
gccggccggc gcgggccgga cgcgcccgga gccgccgaac tggtcgacga actcgccgcg 9120
ttgggcgccc gggtgaccgt tgtggcctgc gacgtcgccg accgggacgc gctggcgcgg 9180
gtcgtggccg cggccgaacc gccgctgacc ggcgtcgtcc acgcggccgg cgtcctggac 9240
gacggcgtcg tcaccgccct gacccccgac cggatgagcg cggtcctgcg gccgaaggcc 9300
gacgcggcct ggcacctgca cgagctgacg cgggacgcgg gactgtcgat gttcgtcctg 9360
ttctccggcg ccggcagcac cctcggcaac ggcgggcagg ccaactacgg tgccgccaac 9420
gccttcctgg acggcctcgc cgcccaccgg cgggcgctcg gcctgccggg cctgtcgatg 9480
gcgtggggcc attgggccga caccagcgcc atgaccggga cgatggacga cgccgacctg 9540
gccaggatgc ggcgctccgg cgtcctgccg ctgtccgccg ccgaggggct cgccctgttc 9600
gacgcggccc tcggacagga ccgggcgttc gtcctccccg cccgcctcga cctcgccgcc 9660
ctccgggccg ggaccggcac cccgccgccg ctgctgcgga cgctggcggc accggccggg 9720
cggcgggctg cggccgccca acctgccgct gtggaaaccg ggttggccga ccggctggcg 9780
gcgctgccgc ccgccgagcg cggcagcgtc ctgctcgatc tcgtccgcgc ccatgtcgcg 9840
accgtcctcg gctacggctc cccggacgag gtcgacaccg gccggggctt cctcgaagcg 9900
ggcttcgact cgctgcgcgc cgtcgaactg cgcaaccggc tcgccgccgc caccggactg 9960
cggctgccgg ccacgctcac cttcgaccac cccagcccgg acgcgctcgc ccggcacctg 10020
cggtcccggc tggagacgga cgaacaggcg gcgcccgcgg ccggattcgc ggaactcgac 10080
ggcctggagg ccgccgtccg ggccctcccg gccggagacc ccggccgcgc cgggatcgcg 10140
gcccggctgc gcgacctgct gaccgagctg aagaacgacg cggaacccgc cgccggggac 10200
gacgacgcgg tgaccgcggc gaccctcgac gagctcctcg acatcgtcga cgacgaactg 10260
cgcaggtcct ga 10272
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gatgggctcg gactgcgcct 20
<210> 7
<211> 1152
<212> DNA
<213> Streptomyces mobaraensis IPIO
<400> 7
atgtctgcgc cccacaaggg agagatcgtg aagcggatgg gatgggccgt caccgcggcc 60
gtcaccacca tcgtcctggc ccagtcgtcc ctcgccgccc aggcggcgga ctccacctcc 120
gggtggcggg ccccctcgtg cgccaaggtc gccggcgacg gcgccgtcac cttcaccacc 180
gacgacggcg cgaccctcgt cccgacgacg ggcaccctga agtccgtcag ctacacccac 240
ggcctggtcg cgctggacac ccccaacacg ctcctcgcca cgcacaacga cgagctccag 300
cgctcgacgg acgccggctg cacctggacc aaggtcgcga cgctcggcag cggctccacc 360
tggctgaccg ccgccaccgg cggccgggcc ttcgcctggg agaagaacgg cggctacctg 420
gcccgcgtcg acggcaagac cgtcaccaag ctgtcctcgc ccagcgccga catcgtcggc 480
gtcggcaccg acaaggcgcg ccgcgaccac gtccgcctcg ccggcagcga tggacagctt 540
tacgactcga cggacgccgg cgccacctgg aagccggtcg gcaagctcgc cttcggcccg 600
ggcgccaacc tctacaccgt gtccttcgac cccgccgacc tcgaccacgc ggtcgccggc 660
ggcatgacga ccggcggcgc ggtcaccacc gacggcggcg ccacctggac cgccgccacc 720
ggcctgtccg ccacggccgg cggcaaggcc aacctcttcg ccgcgtccgt ctccccggcc 780
gaccgcaacg tcgtctacgc cctgggcatc gacctcgtgg aggccgcgcc gagctcgggc 840
gccgagggcc ggcacctgta ccggtccacc gacggcggcc ggacgtacac ccggatcgtc 900
gacgacaccc cggacaccga gctcaccaac agcaccctgc tggcgccgag ccccgtggac 960
gcgaacgtcc tgtacttcga gtacggcacg tacttccagg cgtacggcac cgacctgtac 1020
cgctatgacg cgcggacggg caaggtcggc aagacgcaca acgcccacga cggcatctcg 1080
gccatcgcct tcaacccggc ccggccgtcc gtgatgtacc tgggcctcga agaggtgcgg 1140
atcgaccact ga 1152
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tgttgacgat caggttctat 20
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cagctagctc agtcctaggt ataatactag tcccacgaac aagggagtgt tgttttagag 60
ctagaaatag caagtt 76
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
caggaaacag ctatgacatg attac 25
<210> 11
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cagctagctc agtcctaggt ataatactag ttcccctgat tccgttccct ggttttagag 60
ctagaaatag caagtt 76
<210> 12
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cagctagctc agtcctaggt ataatactag tgatgggctc ggactgcgcc tgttttagag 60
ctagaaatag caagtt 76
<210> 13
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cagctagctc agtcctaggt ataatactag ttgttgacga tcaggttcta tgttttagag 60
ctagaaatag caagtt 76
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
aagggtaccg gatccttgac a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agcgagtcag tgagcgagga a 21

Claims (8)

1.一种TG酶高产菌株，其特征在于，所述菌株的非必需高丰度蛋白编码基因转录被抑制，具体为在保藏编号为CCTCC NO:M 2020196的茂源链霉菌IPIO中通过CRISPRi技术降低序列如SEQ ID NO.1所示的基因SMDS_5177的转录水平。
2.一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，将整合型质粒载体通过接合转移分别导入保藏编号为CCTCC NO:M 2020196的受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，获得所述菌株；所述整合型质粒载体抑制了所述茂源链霉菌IPIO的谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因SMDS_5177的转录水平，含有靶向基因SMDS_5177启动子区域的gRNA，通过降低基因转录水平抑制蛋白表达；所述基因SMDS_5177的序列如SEQ ID NO.1所示的。
3.根据权利要求2所述的高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，所述基因SMDS_5177对应的gRNA SMDS_5177的序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，所述整合型质粒载体的构建方法包括如下步骤：
在CRISPy-web网站上设计特异性靶向SMDS_5177启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA SMDS_5177基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2103。
5.一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于，通过CRISPRi技术降低保藏编号为CCTCC NO:M 2020196的茂源链霉菌IPIO中序列如SEQ ID NO.1所示的基因SMDS_5177的转录水平。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述茂源链霉菌IPIO中降低茂源链霉菌IPIO中的高丰度非必需蛋白编码基因SMDS_5177的转录水平，获得基因表达弱化突变株，发酵获得谷氨酰胺转氨酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵包括以下步骤：将活化后的突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵28-32h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.3w/v％，K2HPO4·3H2O0.1-0.3w/v％；
所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.3w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.3w/v％，发酵促进剂0.1-0.4w/v％。
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