JP2004305010A - 安定化トランスグルタミナーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】安全性が高く、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する安定化したトランスグルタミナーゼ（精製結晶化されたものを含む）を提供すること。
【解決手段】安定化トランスグルタミナーゼは、微生物が生産するトランスグルタミナーゼに、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物などの１種以上を安定化剤として添加してなる。
【選択図】なし
【解決手段】安定化トランスグルタミナーゼは、微生物が生産するトランスグルタミナーゼに、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物などの１種以上を安定化剤として添加してなる。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、製造工程中や製品保存中の酵素の活性の失活が抑制される安定化トランスグルタミナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼ（以下、ＴＧａｓｅと記載することがある）は、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシルアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素で、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε−（γ−Ｇｌｎ）−Ｌｙｓ架橋結合を形成させる。従って、ＴＧａｓｅの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来の微生物酵素を用いたＴＧａｓｅ（特許文献１参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。
【０００３】
ＴＧａｓｅは、発酵過程でプロ体を経て成熟型に変換されるシスティンを活性中心残基とするチオール酵素であることから、発酵ブロス中では一部不活性型で存在するものがあり、培養終了後、適切な工程で還元剤を加える等により活性化する必要があった。また、同じ理由により安定性が悪く、製造工程中あるいは製品保存中での失活を抑えるため、安定化剤の添加が必要であった。そのため、ＴＧａｓｅに安定化剤を添加した組成物（特許文献２及び特許文献３参照）が提案されている。
【０００４】
一方、ＴＧａｓｅは、製造工程の煩雑さ、収率の低さ、コスト面等の理由から工業的規模で簡便に精製結晶化することが難しく、現在、工業的に製造されているＴＧａｓｅは、発酵混合物から菌体等を除いた粗酵素液を限外濾過膜により脱塩濃縮後、アルコール分画沈殿等により部分精製されたものである。従って、比活性の低下等の理由で安定化剤の種類や添加量に限界があり、乾燥時における失活などによる収率の低下の問題があった。また、結晶酵素であれば液状や高濃度懸濁液などの製剤化が可能であるが、部分精製では粉末以外、例えば、液状にするとプロテアーゼ等の夾雑酵素による失活の虞があり、沈殿剤等を添加して懸濁状又はペースト状にすると比活性が低いことから使用量が多くなり、安定化剤や沈殿剤の影響が大きくなるという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８４９７７３号明細書
【特許文献２】特開平４−２０７１９４号公報
【特許文献３】ＷＯ９６／１１２６４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の安定化剤の中には、各種法規制の対象となるものや、安全性に影響を及ぼす可能性のあるものもあり、使用目的等に応じた使い分けやより安全な安定化剤を用いる必要があったため、製造が煩雑となるばかりか製造コストが高くなることがあった。また、安定化剤の種類によっては十分な安定化効果が得られないことがあった。
上記特許文献１及び２に記載のものを含め従来の安定化されたＴＧａｓｅは、いずれも部分精製されたものであり、精製結晶化されたＴＧａｓｅの安定化に関してはこれまでに提案がない。従来の部分精製されたＴＧａｓｅの安定化と精製結晶化されたＴＧａｓｅの安定化とで差違のある可能性もあり、精製結晶化されたＴＧａｓｅを安定化できれば、上記の部分精製のＴＧａｓｅを安定化する場合の諸問題を解決できることからもＴＧａｓｅの精製結晶化と精製結晶化されたＴＧａｓｅの安定化に関する提案は有意義である。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、安全性が高く、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する安定化したトランスグルタミナーゼ（精製結晶化されたものを含む）を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために種々検討を重ね本発明を完成した。
すなわち、本発明は、微生物が生産するトランスグルタミナーゼであって、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物、システィンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタチオンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物からなる群から選ばれた１種以上が安定化剤として添加されてなる安定化トランスグルタミナーゼを要旨とする。
【０００９】
上記の発明によれば、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する安定化したトランスグルタミナーゼを得ることができる。
【００１０】
上記発明におけるＴＧａｓｅは、固体状に処理されたものでも液体状に処理されたものでも良いが、固体状に処理されたものが好ましく、ここに固体状に処理されたＴＧａｓｅとは、粉末状などに処理されるものをいう。
【００１１】
また、本発明は、微生物が生産する液体状に処理されたトランスグルタミナーゼであって、グルタミンペプチド、ペプチーノ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、亜硫酸水素ナトリウム、システィン、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液からなる群から選ばれた１種以上が安定化剤として添加されてなる安定化トランスグルタミナーゼを要旨とする。
【００１２】
上記の発明によれば、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する液体状に処理されたＴＧａｓｅを得ることができる。ここに、液体状に処理されたＴＧａｓｅとは、液状、懸濁状、ペースト状などに処理されるもので、ＴＧａｓｅを精製結晶化することで溶解性が高まり容易に得ることができる。
【００１３】
上記のいずれの安定化トランスグルタミナーゼも、マッキルバイン緩衝液のｐＨは６．５が好ましい。また、ＴＧａｓｅはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属が生産するものであれば、精製結晶化されたものでも、部分精製されたものでも良い。
【００１４】
【発明の実施の形態】
トランスグルタミナーゼは、微生物が生産するものであれば特に限定されないが、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が生産するものが好ましい。ストレプトミセス属に属する微生物としては、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）（旧ストレプトベルチシリウム・モバラエンス）Ｓ−８１１２株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１０），２６１３−２６１７，１９８９、ＦＥＲＭ Ｐ−９３６４）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照、ＦＥＲＭ Ｐ−１１６５７）、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）Ｎｏ．８３（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照、ＦＥＲＭ Ｐ−１１６５６）等を挙げることができる。また、紫外線照射やＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の常法を用いて生産性を高めたり、プロテアーゼやアミラーゼなどの夾雑蛋白の生成を減らしたり、抗生物質などの生理活性物質を抑制又は欠如させたような変異株を使用することもでき、更には、遺伝子組換え菌等の使用もできる。また、ＴＧａｓｅの精製結晶化は、市販のＴＧａｓｅを用いて行うこともできる。
【００１５】
ＴＧａｓｅ生産菌の発酵に使用する培地としては、デンプン、蔗糖、乳糖、グリセロール、グルコース等の炭素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等の微量金属塩など一般的に用いられる培地原料を使用できる。また、発泡を抑えるために消泡剤の添加も必要に応じて行うことができる。培養は、２５℃〜３５℃の範囲が一般的であり、各種発酵容器により実施され、通常３日間〜６日間の通気撹拌が行われる。菌株や発酵培地培養条件によってはこの限りでなく、例えば、培地原料をフイーヂングしたり、高濃度の培地原料を含む場合は、一般的に培養時間が更に長くなることもある。また、培地ｐＨの制御も必要に応じて行われる。
【００１６】
培養終了後における発酵混合物からの菌体等の除去は、濾過あるいは遠心分離により行われる。濾過は、けい藻土を加えた加圧濾過が好ましく、また、室温以下で実施することが好ましい。得られた濾液、すなわちＴＧａｓｅ粗酵素液は、必要に応じて冷却が行われる。なお、Ｅｕｒ，．Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５７０−５７６（１９９８）に記載されているように、ＴＧａｓｅは前駆体として生産されることが知られており、成熟体への変換のため発酵混合物を一定時間そのまま、あるいは他のプロセッシングに使用可能なトリプシン等の酵素を添加して保温しても良い。また、ＴＧａｓｅは、酵素活性を持たない酸化型としても一部存在することが知られているため、システィンやグルタチオン、あるいはそれらを含む物質を添加して活性型に変換することも望ましい。但し、これらの活性化操作は、精製工程の段階に限定して行われるものではないが、好ましくは、精製の早い段階で行うのが好ましい。
【００１７】
粗酵素液は、必要に応じて濃縮を行うことができる。濃縮方法は、特に限定されないが、濃縮と精製が同時に可能な限外濾過膜の利用が好ましい。濃縮は、１０倍〜１００倍程度まで行うことができるが、次の工程である塩析結晶化における沈殿の生成、回収に可能な濃度に達していれば特に問題がなく、作業性や回収率等を考慮すれば高い方が好ましい。なお、限外濾過膜は、ＴＧａｓｅの分子量約３８，０００を考慮すれば、それ以下の例えば分子量１３，０００の平均孔径を有する旭化成工業製ＡＣＰ−１３０００等の使用が好ましいと言えるが、必ずしもこれに限定されることはなく、分子量５０，０００の孔径を有する膜を使用してもほとんど酵素が漏れることがないので、必要に応じて膜の選択を行うことで精製度を高めることも可能である。脱塩濃縮において沈殿を生じることもあるが、適切な緩衝液あるいは塩類溶液等を加えることにより溶解させ、回収率を高めることが可能である。また、濃縮時の温度は、特に限定されるものではないが、１０℃〜３０℃が好ましい。温度が高い程濃縮は効率的に実施できるが、失活も考えられる。
【００１８】
濃縮液は、予め活性炭による脱色を行ったり、その他の吸着剤やイオン交換樹脂を用いて処理することができる。また、濃縮液は、他の沈殿剤、例えば、エタノール、ポリエチレングリコール等を使用して前処理を行い部分精製しても良い。更に、分画沈殿を塩析結晶化の前に行っても良い。また、十分脱塩後、精製水等による希釈を行って沈殿を生成させ、ＴＧａｓｅを沈殿画分から回収するなどの方法も実施することができる。
【００１９】
ＴＧａｓｅの精製結晶化は、均一にまで精製し濃縮した酵素溶液に硫安や塩化ナトリウム等の塩類を加える塩析により行うことができるが、必ずしも均一にまで精製し濃縮したものである必要はない。すなわち、塩化ナトリウムでは飽和に達するまで加えても夾雑蛋白の沈殿が少ないので部分精製された酵素溶液であっても結晶化には好適である。なお、特に、酵素濃度が低い場合には、回収率を高めるために沈殿性が高い硫安等を併用することも有効である。
【００２０】
精製結晶化は、予め結晶種を添加しても良いが、添加しなくても可能である。
塩化ナトリウム等の塩類は、一時に飽和させるのではなく徐々に添加するのが好ましい。通常、酵素の結晶化は、僅かに不定形の沈殿を生成する準飽和状態から時間をかけて塩濃度を高めたり、何らかの刺激を酵素液に与えて行われるが、塩化ナトリウムは既述のように他の夾雑蛋白の沈殿が少ないことから結晶化が容易に行えるものと思われる。また、塩化ナトリウムを用いて得られる結晶懸濁液の安定性は、結晶状態であることと塩濃度が高いことにより非常に優れており、長期保存も可能である。従って、必要があれば結晶懸濁液そのまま、あるいは適切な安定化剤を加えた製品とすることも可能となった。
【００２１】
結晶の回収は、濾過や遠心分離など一般的な方法により実施できる。いずれの場合も結晶母液に含まれる夾雑蛋白を十分に除くため洗浄を行うことが好ましい。また、得られた結晶は、水あるいは塩類溶液等を用いて溶解した後、再度塩類を用いて結晶化を行ういわゆる再結晶化操作を行うことで、更に不純物の除去が可能である。
【００２２】
得られた結晶は、水あるいは塩類溶液等を用いて溶解した後、塩析に使用した塩類を除くため、限外濾過膜その他の方法を用いて脱塩濃縮を行い、凍結乾燥などの方法により粉末化する。乾燥方法は、他に噴霧乾燥、減圧乾燥、フイルム乾燥、あるいはアルコール等の有機溶媒により沈殿させた後、真空乾燥すること等で可能である。脱塩濃縮は、乾燥効率を考慮すればできる限り濃度を高めることが好ましいが、濃度を高めることによりＴＧａｓｅが沈殿として析出することもあるので、この場合、低濃度の塩類溶液を添加して溶解性を高める。
【００２３】
精製結晶化されたＴＧａｓｅの保存中の安定化は、安定化剤を添加して行うことができる。精製結晶化されたＴＧａｓｅは、従来の粉末など固体状に処理するのみならず、容易に液体状に処理して製品化できるが、安定化剤は固体状で有効でも液体状で有効でない場合やその逆の場合もあり得るので、それぞれについて安定化剤を検討する必要がある。安定化剤は、ＴＧａｓｅに保存安定化効果が期待できる物質を添加し、所定期間保存後のＴＧａｓｅの回収率と残存活性により評価される。
【００２４】
ＴＧａｓｅの安定化剤としては、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物、システィンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタチオンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物からなる群から選ばれた１種以上を挙げることができる。これらの安定化剤は、固体状に処理されたＴＧａｓｅの安定化に好適である。ここで、マッキルバイン緩衝液は、クエン酸ナトリウムとリン酸二ナトリウムとの組み合わせからなる緩衝液で、酵素の粉末重量当たり前者が１％以上、後者が３％以上、好ましくは前者が３％以上、後者１０％以上の割合で添加することが好ましい。また、マッキルバイン緩衝液のｐＨは、クエン酸ナトリウムとリン酸二ナトリウムの割合を変更することにより調整できる。
【００２５】
また、液体状に処理されたＴＧａｓｅの安定化剤は、グルタミンペプチド、ペプチーノ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、亜硫酸水素ナトリウム、システィン、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液からなる群から選ばれた１種以上を挙げることができる。
【００２６】
また、上記の安定化剤は、精製結晶化されたＴＧａｓｅ、あるいは部分精製されたＴＧａｓｅに用いることができる。
【００２７】
調製された固体状又は液体状の酵素は、更に使用目的により糖類、その他の物質の添加により賦形しても良い。特に、粉末の場合、タンパク質そのものの添加も液体状と異なり容易であるため、肉の接着においてカゼインナトリウムを高濃度に添加することができる。また、粉末状の場合には、包装容器内に酸素を吸収する脱酸素剤等を封入することも可能である。一方、液体状の場合、溶存酸素消去のため、脱気や窒素ガス封入も可能である。
【００２８】
上記の各安定化剤の添加量は、比活性が７〜２０ｕ／Ａｂ２８０ｎｍ（１７〜５０ｕ／ｍｇ）程度のＴＧａｓｅ１重量部に対して５〜１００重量部、好ましくは２０〜１００重量部である。下限あるいは上限を外れると十分な安定化効果や回収率が得られないからである。
【００２９】
【実施例】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
〔参考例１〕（ＴＧａｓｅの精製結晶化１）
取得容易な市販のＴＧａｓｅ（味の素社製ＡｃｔｉｖａＴＧ、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２株の夾雑蛋白の少ない変異株が生産するＴＧａｓｅの粗酵素の濃縮液をアルコール分画沈殿により粉末化した部分精製酵素、特開昭６４−２７４７１号公報参照）５ｇを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．０、５０ｍｌに溶解した後、不溶物を遠心分離により除いた。上清液に塩化ナトリウムを徐々に加え、少し濁りが生じた後、微量の結晶種を加えて低温に一夜保存した。生じた結晶懸濁液に更に塩化ナトリウムを飽和になるまで加えて数日間低温にて保存した。得られた結晶の回収率は６３％で、比活性は結晶化前が７．１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍであったのに対し１３．６ｕ／Ａｂ２８０ｎｍであった。
【００３１】
ＴＧａｓｅの活性の測定は、特開昭６４−２７４７１号公報に記載の方法により行った。すなわち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質としてＣａ２＋非存在下で反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸共存下で鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求め算出する。以下、具体的に示す。
試薬Ａ：０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１Ｍヒドロキシルアミン、０．０１Ｍ還元型グルタチオン、０．０３Ｍベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシン
試薬Ｂ：３Ｎ塩酸、１２％トリクロロ酢酸、５％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（Ｏ．１Ｎ−ＨＣｌに溶解）
これらの溶液の１：１：１の混合液を試薬Ｂとした。
酵素液の０．０５ｍｌに試薬Ａを０．５ｍｌを加えて混合し、３７℃で１０分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止とＦｅ錯体の形成を行った後、５２５ｎｍの吸光度を測定する。対照として予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液のかわりにＬ−グルタミン酸−γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とした。
ＴＧａｓｅの活性の測定は、以下の各参考例及び各実施例においても同様である。
【００３２】
〔参考例２〕（ＴＧａｓｅの精製結晶化２）
ＴＧａｓｅ生産菌のストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２株とストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６をそれぞれ可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸２カリウム０．２％、アデカノール０．０５％からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、これにショ糖を含まない同培地に胞子懸濁液を接種後２日間３０℃にて振とう培養した前培養液１ｍｌを接種して、４日間同様に振とう培養した。培養終了後、遠心分離によりそれぞれ粗酵素液４５０ｍｌと９３０ｍｌを得た。なお、％は重量％である。
【００３３】
上記の粗酵素液を限外濾過膜（旭化成工業社製ＡＣＰ１０１０）を用いて脱塩濃縮し、最終的に１９４ｍｌと２５５ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液を予め５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で透析し、同緩衝液で平衡化した約４０ｍｌのブルーセファロースＣｌ−６Ｂカラムを通して酵素を吸着した後、塩化ナトリウム０．５Ｍを含む同緩衝液で溶出した。硫安飽和として酵素蛋白を沈殿として回収し、約１０ｍｌの０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解した。その後、塩化ナトリウムを徐々に添加して生成する沈殿を除去することを繰り返すことによりＴＧａｓｅの精製結晶化を行うことができた（粗結晶）。回収率は酵素濃度が低いために悪く約１０％であったが、粗酵素液の比活性がそれぞれ０．１１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍ、０．０６ｕ／Ａｂ２８０ｎｍに対して粗結晶の比活性はそれぞれ１３．１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍと６．９ｕ／Ａｂ２８０ｎｍであった。
【００３４】
〔参考例３〕（ＴＧａｓｅの精製結晶化３）
市販品トランスグルタミナーゼＴＧＢ（中国、Ｙｉｍｉｎｇ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）１０ｇを０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０ ５０ｍｌに溶解懸濁後、不溶物を遠心分離により除き、硫安飽和による塩析を行って沈殿を集めた。沈殿を０．０５Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０に溶解透析後、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラムに通して酵素を吸着させた後、食塩０．５Ｍを含む同緩衝液で溶出を行った。このようにして、製品中に含まれる賦形剤等の除去を行った後、食塩飽和による塩析結晶化を行った。酵素濃度が低いため、十分な沈殿の生成に至らなかったため、少量の硫安を追加することにより結晶化を行うことができた。回収率は低いが、製品溶解液における比活性が２．２ｕ／Ａｂ２８０ｎｍに対し、比活性１０．１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍの粗結晶が得られた。
【００３５】
〔実施例１〕（固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討１）
上記参考例１〜３でそれぞれＴＧａｓｅの精製結晶化を行うことができた。これらのＴＧａｓｅは、いずれも精製結晶化されており酵素的に同等であるため、いずれを使用して安定化剤の検討を行っても良いが、以下の検討では実施例４を除き参考例１、即ち市販の製品から得られた精製結晶化ＴＧａｓｅを使用した。
参考例１で得られた精製結晶化酵素の一部を０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液に溶解後、限外濾過膜により脱塩濃縮を行った。脱塩濃縮液２ｍｌに対し、表１に示すＴＧａｓｅの保存安定化効果を期待できそうな各種物質２００ｍｇを添加溶解後、予備凍結し、凍結乾燥機により乾燥させ、固体状に処理したＴＧａｓｅの回収率と残存活性を調べた。結果は、表１に示す通りであった。なお、保存安定性については、上記で得た凍結乾燥品０．３〜０．８ｇを１５ｍｌ容ファルコンプラスチックチューブにそのまま封入し、４４℃で各時間保存後の残存活性により評価した。また、回収率は、乾燥に用いた脱塩濃縮液２ｍｌの総活性に対して乾燥後の総活性を測定することにより算出した。以下の各実施例においても同様である。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から明らかなように、トレハロースととうもろこしタンパクの分解物であるペプチーノの混合物を添加した精製結晶化ＴＧａｓｅでは、ほぼ完全に活性が維持された。また、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ７．０付近のマッキルバイン緩衝液成分の混合物も活性が高く維持された。
【００３８】
〔実施例２〕（固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討２）
実施例１と同様に固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅを用いて、クエン酸とリン酸２ナトリウムからなる各ｐＨのマッキルバイン緩衝液の添加量を中心に、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとの組み合わせからなるＴＧａｓｅの回収率と４４℃、１ヶ月間保存後の残存活性について検討した。結果は、表２に示した。なお、酵素及び各種物質の添加量は表２に示す通りである。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２から明らかなように、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとマッキルバイン緩衝液の混合物は、マッキルバイン緩衝液のｐＨの６．５のものが回収率と残存活性で最も高い結果を示した。なお、後記の液体状に処理された酵素についてのマッキルバイン緩衝液でのｐＨ安定性がｐＨ６．０〜７．０で高いことから、この固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅのｐＨ安定性もこの領域で最も高いことが考えられる。また、ｐＨ６．５以外のマッキルバイン緩衝液を加えたものも、添加量を増やすことにより回収率と残存活性を高めることが可能と考えられる。
【００４１】
〔実施例３〕（固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討３）
各種物質の添加効果について更に確認するために、実施例１と同様に固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅを用いて調べた。即ち、表３に記載の各種物質を添加して回収率と４４℃、１ヶ月間保存後の残存活性を測定した。表３に示すように、ｐＨ６．５のマッキルバイン緩衝液とシスティンあるいはグルタチオンの混合物が添加されたＴＧａｓｅは、従来知られているシスティン、グルタチオンの単独添加の場合より回収率と残存活性において顕著に高い結果を示した。なお、回収率で特に高い値を示しているシスティン、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウムは、酵素の乾燥中に一部活性化され、逆に、他のもので回収率が低いのは、精製工程で活性化が不十分であったことによるものと考えられる。
【００４２】
【表３】
【００４３】
〔実施例４〕（粗酵素ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討）
実施例１〜３では、精製結晶化された酵素に対する安定化効果を調べたが、本実施例では結晶化されない粗酵素での同様な効果を調べた。参考例１に記載の市販のＴＧａｓｅを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．０に懸濁後、不溶物を遠心分離により除いた上清液に硫安を飽和となるまで加えて塩析した。生じた沈殿を遠心分離により集めて限外濾過膜により脱塩濃縮して粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて表４に示す各種物質の保存安定性効果を調べた。
【００４４】
【表４】
【００４５】
表４より、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、あるいはグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物が高い回収率と残存活性を示した。なお、これらの効果が認められた安定化剤は、特に結果は示していないが、精製結晶化ＴＧａｓｅについても保存安定化効果が確認された。
【００４６】
〔実施例５〕（液体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討）
参考例１で得られた精製結晶化されたＴＧａｓｅを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解し、通常の活性測定に使用される２倍濃縮となるまで希釈した後、表５、表６に記載の各種物質の溶液と等量混合し、液体状のまま５０℃１時間の加熱処理を行って残存活性の測定を行い各種物質の保存安定化効果を検討した。
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
表５と表６に示すように、グルタミンペプチド、ペプチーノ等の蛋白分解物、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、Ｌ−システィン、亜硫酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液が精製結晶化により液体状に処理されたＴＧａｓｅの保存安定化に効果があった。
特許文献２や特許文献３に記載される部分精製された粉末状のＴＧａｓｅの安定化剤とある程度の相関性はあるが、これらで安定化効果が認められた糖や糖アルコール、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどは精製結晶化により液体状に処理されたＴＧａｓｅでは効果が認められず、完全には相関するものではなかった。また、結果は示さないが、これら物質について適宜組み合わせることにより相加あるいは相乗的な効果がみられた。特に、特徴的な効果としてグルタミンペプチドではｐＨ５．０〜６．５付近で、また、マッキルバイン緩衝液（ｐＨ６〜７．０）で高い安定化効果を示すことが見出された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、以下の効果を奏する。安全性がありかつ安定化効果に優れた安定化剤を添加することによりＴＧａｓｅが安定化し、製造中や製品保存中に酵素活性が失活し難く、長期に亘る酵素活性の高いＴＧａｓｅの保管が可能となる。
また、精製結晶化されたＴＧａｓｅの製造中や製品保存中の安定化を図ることができるので、粉末など固体状に処理される精製結晶化されたＴＧａｓｅのみならず、液状、懸濁状、ペースト状など液体状に処理される酵素活性の高い精製結晶化ＴＧａｓｅの保管が可能となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、製造工程中や製品保存中の酵素の活性の失活が抑制される安定化トランスグルタミナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼ（以下、ＴＧａｓｅと記載することがある）は、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシルアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素で、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε−（γ−Ｇｌｎ）−Ｌｙｓ架橋結合を形成させる。従って、ＴＧａｓｅの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来の微生物酵素を用いたＴＧａｓｅ（特許文献１参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。
【０００３】
ＴＧａｓｅは、発酵過程でプロ体を経て成熟型に変換されるシスティンを活性中心残基とするチオール酵素であることから、発酵ブロス中では一部不活性型で存在するものがあり、培養終了後、適切な工程で還元剤を加える等により活性化する必要があった。また、同じ理由により安定性が悪く、製造工程中あるいは製品保存中での失活を抑えるため、安定化剤の添加が必要であった。そのため、ＴＧａｓｅに安定化剤を添加した組成物（特許文献２及び特許文献３参照）が提案されている。
【０００４】
一方、ＴＧａｓｅは、製造工程の煩雑さ、収率の低さ、コスト面等の理由から工業的規模で簡便に精製結晶化することが難しく、現在、工業的に製造されているＴＧａｓｅは、発酵混合物から菌体等を除いた粗酵素液を限外濾過膜により脱塩濃縮後、アルコール分画沈殿等により部分精製されたものである。従って、比活性の低下等の理由で安定化剤の種類や添加量に限界があり、乾燥時における失活などによる収率の低下の問題があった。また、結晶酵素であれば液状や高濃度懸濁液などの製剤化が可能であるが、部分精製では粉末以外、例えば、液状にするとプロテアーゼ等の夾雑酵素による失活の虞があり、沈殿剤等を添加して懸濁状又はペースト状にすると比活性が低いことから使用量が多くなり、安定化剤や沈殿剤の影響が大きくなるという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８４９７７３号明細書
【特許文献２】特開平４−２０７１９４号公報
【特許文献３】ＷＯ９６／１１２６４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の安定化剤の中には、各種法規制の対象となるものや、安全性に影響を及ぼす可能性のあるものもあり、使用目的等に応じた使い分けやより安全な安定化剤を用いる必要があったため、製造が煩雑となるばかりか製造コストが高くなることがあった。また、安定化剤の種類によっては十分な安定化効果が得られないことがあった。
上記特許文献１及び２に記載のものを含め従来の安定化されたＴＧａｓｅは、いずれも部分精製されたものであり、精製結晶化されたＴＧａｓｅの安定化に関してはこれまでに提案がない。従来の部分精製されたＴＧａｓｅの安定化と精製結晶化されたＴＧａｓｅの安定化とで差違のある可能性もあり、精製結晶化されたＴＧａｓｅを安定化できれば、上記の部分精製のＴＧａｓｅを安定化する場合の諸問題を解決できることからもＴＧａｓｅの精製結晶化と精製結晶化されたＴＧａｓｅの安定化に関する提案は有意義である。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、安全性が高く、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する安定化したトランスグルタミナーゼ（精製結晶化されたものを含む）を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために種々検討を重ね本発明を完成した。
すなわち、本発明は、微生物が生産するトランスグルタミナーゼであって、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物、システィンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタチオンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物からなる群から選ばれた１種以上が安定化剤として添加されてなる安定化トランスグルタミナーゼを要旨とする。
【０００９】
上記の発明によれば、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する安定化したトランスグルタミナーゼを得ることができる。
【００１０】
上記発明におけるＴＧａｓｅは、固体状に処理されたものでも液体状に処理されたものでも良いが、固体状に処理されたものが好ましく、ここに固体状に処理されたＴＧａｓｅとは、粉末状などに処理されるものをいう。
【００１１】
また、本発明は、微生物が生産する液体状に処理されたトランスグルタミナーゼであって、グルタミンペプチド、ペプチーノ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、亜硫酸水素ナトリウム、システィン、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液からなる群から選ばれた１種以上が安定化剤として添加されてなる安定化トランスグルタミナーゼを要旨とする。
【００１２】
上記の発明によれば、製造工程中や製品保存中の酵素活性の失活を抑制する液体状に処理されたＴＧａｓｅを得ることができる。ここに、液体状に処理されたＴＧａｓｅとは、液状、懸濁状、ペースト状などに処理されるもので、ＴＧａｓｅを精製結晶化することで溶解性が高まり容易に得ることができる。
【００１３】
上記のいずれの安定化トランスグルタミナーゼも、マッキルバイン緩衝液のｐＨは６．５が好ましい。また、ＴＧａｓｅはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属が生産するものであれば、精製結晶化されたものでも、部分精製されたものでも良い。
【００１４】
【発明の実施の形態】
トランスグルタミナーゼは、微生物が生産するものであれば特に限定されないが、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が生産するものが好ましい。ストレプトミセス属に属する微生物としては、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）（旧ストレプトベルチシリウム・モバラエンス）Ｓ−８１１２株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１０），２６１３−２６１７，１９８９、ＦＥＲＭ Ｐ−９３６４）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照、ＦＥＲＭ Ｐ−１１６５７）、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）Ｎｏ．８３（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照、ＦＥＲＭ Ｐ−１１６５６）等を挙げることができる。また、紫外線照射やＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の常法を用いて生産性を高めたり、プロテアーゼやアミラーゼなどの夾雑蛋白の生成を減らしたり、抗生物質などの生理活性物質を抑制又は欠如させたような変異株を使用することもでき、更には、遺伝子組換え菌等の使用もできる。また、ＴＧａｓｅの精製結晶化は、市販のＴＧａｓｅを用いて行うこともできる。
【００１５】
ＴＧａｓｅ生産菌の発酵に使用する培地としては、デンプン、蔗糖、乳糖、グリセロール、グルコース等の炭素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等の微量金属塩など一般的に用いられる培地原料を使用できる。また、発泡を抑えるために消泡剤の添加も必要に応じて行うことができる。培養は、２５℃〜３５℃の範囲が一般的であり、各種発酵容器により実施され、通常３日間〜６日間の通気撹拌が行われる。菌株や発酵培地培養条件によってはこの限りでなく、例えば、培地原料をフイーヂングしたり、高濃度の培地原料を含む場合は、一般的に培養時間が更に長くなることもある。また、培地ｐＨの制御も必要に応じて行われる。
【００１６】
培養終了後における発酵混合物からの菌体等の除去は、濾過あるいは遠心分離により行われる。濾過は、けい藻土を加えた加圧濾過が好ましく、また、室温以下で実施することが好ましい。得られた濾液、すなわちＴＧａｓｅ粗酵素液は、必要に応じて冷却が行われる。なお、Ｅｕｒ，．Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５７０−５７６（１９９８）に記載されているように、ＴＧａｓｅは前駆体として生産されることが知られており、成熟体への変換のため発酵混合物を一定時間そのまま、あるいは他のプロセッシングに使用可能なトリプシン等の酵素を添加して保温しても良い。また、ＴＧａｓｅは、酵素活性を持たない酸化型としても一部存在することが知られているため、システィンやグルタチオン、あるいはそれらを含む物質を添加して活性型に変換することも望ましい。但し、これらの活性化操作は、精製工程の段階に限定して行われるものではないが、好ましくは、精製の早い段階で行うのが好ましい。
【００１７】
粗酵素液は、必要に応じて濃縮を行うことができる。濃縮方法は、特に限定されないが、濃縮と精製が同時に可能な限外濾過膜の利用が好ましい。濃縮は、１０倍〜１００倍程度まで行うことができるが、次の工程である塩析結晶化における沈殿の生成、回収に可能な濃度に達していれば特に問題がなく、作業性や回収率等を考慮すれば高い方が好ましい。なお、限外濾過膜は、ＴＧａｓｅの分子量約３８，０００を考慮すれば、それ以下の例えば分子量１３，０００の平均孔径を有する旭化成工業製ＡＣＰ−１３０００等の使用が好ましいと言えるが、必ずしもこれに限定されることはなく、分子量５０，０００の孔径を有する膜を使用してもほとんど酵素が漏れることがないので、必要に応じて膜の選択を行うことで精製度を高めることも可能である。脱塩濃縮において沈殿を生じることもあるが、適切な緩衝液あるいは塩類溶液等を加えることにより溶解させ、回収率を高めることが可能である。また、濃縮時の温度は、特に限定されるものではないが、１０℃〜３０℃が好ましい。温度が高い程濃縮は効率的に実施できるが、失活も考えられる。
【００１８】
濃縮液は、予め活性炭による脱色を行ったり、その他の吸着剤やイオン交換樹脂を用いて処理することができる。また、濃縮液は、他の沈殿剤、例えば、エタノール、ポリエチレングリコール等を使用して前処理を行い部分精製しても良い。更に、分画沈殿を塩析結晶化の前に行っても良い。また、十分脱塩後、精製水等による希釈を行って沈殿を生成させ、ＴＧａｓｅを沈殿画分から回収するなどの方法も実施することができる。
【００１９】
ＴＧａｓｅの精製結晶化は、均一にまで精製し濃縮した酵素溶液に硫安や塩化ナトリウム等の塩類を加える塩析により行うことができるが、必ずしも均一にまで精製し濃縮したものである必要はない。すなわち、塩化ナトリウムでは飽和に達するまで加えても夾雑蛋白の沈殿が少ないので部分精製された酵素溶液であっても結晶化には好適である。なお、特に、酵素濃度が低い場合には、回収率を高めるために沈殿性が高い硫安等を併用することも有効である。
【００２０】
精製結晶化は、予め結晶種を添加しても良いが、添加しなくても可能である。
塩化ナトリウム等の塩類は、一時に飽和させるのではなく徐々に添加するのが好ましい。通常、酵素の結晶化は、僅かに不定形の沈殿を生成する準飽和状態から時間をかけて塩濃度を高めたり、何らかの刺激を酵素液に与えて行われるが、塩化ナトリウムは既述のように他の夾雑蛋白の沈殿が少ないことから結晶化が容易に行えるものと思われる。また、塩化ナトリウムを用いて得られる結晶懸濁液の安定性は、結晶状態であることと塩濃度が高いことにより非常に優れており、長期保存も可能である。従って、必要があれば結晶懸濁液そのまま、あるいは適切な安定化剤を加えた製品とすることも可能となった。
【００２１】
結晶の回収は、濾過や遠心分離など一般的な方法により実施できる。いずれの場合も結晶母液に含まれる夾雑蛋白を十分に除くため洗浄を行うことが好ましい。また、得られた結晶は、水あるいは塩類溶液等を用いて溶解した後、再度塩類を用いて結晶化を行ういわゆる再結晶化操作を行うことで、更に不純物の除去が可能である。
【００２２】
得られた結晶は、水あるいは塩類溶液等を用いて溶解した後、塩析に使用した塩類を除くため、限外濾過膜その他の方法を用いて脱塩濃縮を行い、凍結乾燥などの方法により粉末化する。乾燥方法は、他に噴霧乾燥、減圧乾燥、フイルム乾燥、あるいはアルコール等の有機溶媒により沈殿させた後、真空乾燥すること等で可能である。脱塩濃縮は、乾燥効率を考慮すればできる限り濃度を高めることが好ましいが、濃度を高めることによりＴＧａｓｅが沈殿として析出することもあるので、この場合、低濃度の塩類溶液を添加して溶解性を高める。
【００２３】
精製結晶化されたＴＧａｓｅの保存中の安定化は、安定化剤を添加して行うことができる。精製結晶化されたＴＧａｓｅは、従来の粉末など固体状に処理するのみならず、容易に液体状に処理して製品化できるが、安定化剤は固体状で有効でも液体状で有効でない場合やその逆の場合もあり得るので、それぞれについて安定化剤を検討する必要がある。安定化剤は、ＴＧａｓｅに保存安定化効果が期待できる物質を添加し、所定期間保存後のＴＧａｓｅの回収率と残存活性により評価される。
【００２４】
ＴＧａｓｅの安定化剤としては、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物、システィンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタチオンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物からなる群から選ばれた１種以上を挙げることができる。これらの安定化剤は、固体状に処理されたＴＧａｓｅの安定化に好適である。ここで、マッキルバイン緩衝液は、クエン酸ナトリウムとリン酸二ナトリウムとの組み合わせからなる緩衝液で、酵素の粉末重量当たり前者が１％以上、後者が３％以上、好ましくは前者が３％以上、後者１０％以上の割合で添加することが好ましい。また、マッキルバイン緩衝液のｐＨは、クエン酸ナトリウムとリン酸二ナトリウムの割合を変更することにより調整できる。
【００２５】
また、液体状に処理されたＴＧａｓｅの安定化剤は、グルタミンペプチド、ペプチーノ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、亜硫酸水素ナトリウム、システィン、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液からなる群から選ばれた１種以上を挙げることができる。
【００２６】
また、上記の安定化剤は、精製結晶化されたＴＧａｓｅ、あるいは部分精製されたＴＧａｓｅに用いることができる。
【００２７】
調製された固体状又は液体状の酵素は、更に使用目的により糖類、その他の物質の添加により賦形しても良い。特に、粉末の場合、タンパク質そのものの添加も液体状と異なり容易であるため、肉の接着においてカゼインナトリウムを高濃度に添加することができる。また、粉末状の場合には、包装容器内に酸素を吸収する脱酸素剤等を封入することも可能である。一方、液体状の場合、溶存酸素消去のため、脱気や窒素ガス封入も可能である。
【００２８】
上記の各安定化剤の添加量は、比活性が７〜２０ｕ／Ａｂ２８０ｎｍ（１７〜５０ｕ／ｍｇ）程度のＴＧａｓｅ１重量部に対して５〜１００重量部、好ましくは２０〜１００重量部である。下限あるいは上限を外れると十分な安定化効果や回収率が得られないからである。
【００２９】
【実施例】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
〔参考例１〕（ＴＧａｓｅの精製結晶化１）
取得容易な市販のＴＧａｓｅ（味の素社製ＡｃｔｉｖａＴＧ、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２株の夾雑蛋白の少ない変異株が生産するＴＧａｓｅの粗酵素の濃縮液をアルコール分画沈殿により粉末化した部分精製酵素、特開昭６４−２７４７１号公報参照）５ｇを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．０、５０ｍｌに溶解した後、不溶物を遠心分離により除いた。上清液に塩化ナトリウムを徐々に加え、少し濁りが生じた後、微量の結晶種を加えて低温に一夜保存した。生じた結晶懸濁液に更に塩化ナトリウムを飽和になるまで加えて数日間低温にて保存した。得られた結晶の回収率は６３％で、比活性は結晶化前が７．１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍであったのに対し１３．６ｕ／Ａｂ２８０ｎｍであった。
【００３１】
ＴＧａｓｅの活性の測定は、特開昭６４−２７４７１号公報に記載の方法により行った。すなわち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質としてＣａ２＋非存在下で反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸共存下で鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求め算出する。以下、具体的に示す。
試薬Ａ：０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１Ｍヒドロキシルアミン、０．０１Ｍ還元型グルタチオン、０．０３Ｍベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシン
試薬Ｂ：３Ｎ塩酸、１２％トリクロロ酢酸、５％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（Ｏ．１Ｎ−ＨＣｌに溶解）
これらの溶液の１：１：１の混合液を試薬Ｂとした。
酵素液の０．０５ｍｌに試薬Ａを０．５ｍｌを加えて混合し、３７℃で１０分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止とＦｅ錯体の形成を行った後、５２５ｎｍの吸光度を測定する。対照として予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液のかわりにＬ−グルタミン酸−γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とした。
ＴＧａｓｅの活性の測定は、以下の各参考例及び各実施例においても同様である。
【００３２】
〔参考例２〕（ＴＧａｓｅの精製結晶化２）
ＴＧａｓｅ生産菌のストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２株とストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６をそれぞれ可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸２カリウム０．２％、アデカノール０．０５％からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、これにショ糖を含まない同培地に胞子懸濁液を接種後２日間３０℃にて振とう培養した前培養液１ｍｌを接種して、４日間同様に振とう培養した。培養終了後、遠心分離によりそれぞれ粗酵素液４５０ｍｌと９３０ｍｌを得た。なお、％は重量％である。
【００３３】
上記の粗酵素液を限外濾過膜（旭化成工業社製ＡＣＰ１０１０）を用いて脱塩濃縮し、最終的に１９４ｍｌと２５５ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液を予め５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で透析し、同緩衝液で平衡化した約４０ｍｌのブルーセファロースＣｌ−６Ｂカラムを通して酵素を吸着した後、塩化ナトリウム０．５Ｍを含む同緩衝液で溶出した。硫安飽和として酵素蛋白を沈殿として回収し、約１０ｍｌの０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解した。その後、塩化ナトリウムを徐々に添加して生成する沈殿を除去することを繰り返すことによりＴＧａｓｅの精製結晶化を行うことができた（粗結晶）。回収率は酵素濃度が低いために悪く約１０％であったが、粗酵素液の比活性がそれぞれ０．１１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍ、０．０６ｕ／Ａｂ２８０ｎｍに対して粗結晶の比活性はそれぞれ１３．１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍと６．９ｕ／Ａｂ２８０ｎｍであった。
【００３４】
〔参考例３〕（ＴＧａｓｅの精製結晶化３）
市販品トランスグルタミナーゼＴＧＢ（中国、Ｙｉｍｉｎｇ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）１０ｇを０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０ ５０ｍｌに溶解懸濁後、不溶物を遠心分離により除き、硫安飽和による塩析を行って沈殿を集めた。沈殿を０．０５Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０に溶解透析後、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラムに通して酵素を吸着させた後、食塩０．５Ｍを含む同緩衝液で溶出を行った。このようにして、製品中に含まれる賦形剤等の除去を行った後、食塩飽和による塩析結晶化を行った。酵素濃度が低いため、十分な沈殿の生成に至らなかったため、少量の硫安を追加することにより結晶化を行うことができた。回収率は低いが、製品溶解液における比活性が２．２ｕ／Ａｂ２８０ｎｍに対し、比活性１０．１ｕ／Ａｂ２８０ｎｍの粗結晶が得られた。
【００３５】
〔実施例１〕（固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討１）
上記参考例１〜３でそれぞれＴＧａｓｅの精製結晶化を行うことができた。これらのＴＧａｓｅは、いずれも精製結晶化されており酵素的に同等であるため、いずれを使用して安定化剤の検討を行っても良いが、以下の検討では実施例４を除き参考例１、即ち市販の製品から得られた精製結晶化ＴＧａｓｅを使用した。
参考例１で得られた精製結晶化酵素の一部を０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液に溶解後、限外濾過膜により脱塩濃縮を行った。脱塩濃縮液２ｍｌに対し、表１に示すＴＧａｓｅの保存安定化効果を期待できそうな各種物質２００ｍｇを添加溶解後、予備凍結し、凍結乾燥機により乾燥させ、固体状に処理したＴＧａｓｅの回収率と残存活性を調べた。結果は、表１に示す通りであった。なお、保存安定性については、上記で得た凍結乾燥品０．３〜０．８ｇを１５ｍｌ容ファルコンプラスチックチューブにそのまま封入し、４４℃で各時間保存後の残存活性により評価した。また、回収率は、乾燥に用いた脱塩濃縮液２ｍｌの総活性に対して乾燥後の総活性を測定することにより算出した。以下の各実施例においても同様である。
【００３６】
【表１】
表１から明らかなように、トレハロースととうもろこしタンパクの分解物であるペプチーノの混合物を添加した精製結晶化ＴＧａｓｅでは、ほぼ完全に活性が維持された。また、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ７．０付近のマッキルバイン緩衝液成分の混合物も活性が高く維持された。
【００３８】
〔実施例２〕（固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討２）
実施例１と同様に固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅを用いて、クエン酸とリン酸２ナトリウムからなる各ｐＨのマッキルバイン緩衝液の添加量を中心に、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとの組み合わせからなるＴＧａｓｅの回収率と４４℃、１ヶ月間保存後の残存活性について検討した。結果は、表２に示した。なお、酵素及び各種物質の添加量は表２に示す通りである。
【００３９】
【表２】
表２から明らかなように、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとマッキルバイン緩衝液の混合物は、マッキルバイン緩衝液のｐＨの６．５のものが回収率と残存活性で最も高い結果を示した。なお、後記の液体状に処理された酵素についてのマッキルバイン緩衝液でのｐＨ安定性がｐＨ６．０〜７．０で高いことから、この固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅのｐＨ安定性もこの領域で最も高いことが考えられる。また、ｐＨ６．５以外のマッキルバイン緩衝液を加えたものも、添加量を増やすことにより回収率と残存活性を高めることが可能と考えられる。
【００４１】
〔実施例３〕（固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討３）
各種物質の添加効果について更に確認するために、実施例１と同様に固体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅを用いて調べた。即ち、表３に記載の各種物質を添加して回収率と４４℃、１ヶ月間保存後の残存活性を測定した。表３に示すように、ｐＨ６．５のマッキルバイン緩衝液とシスティンあるいはグルタチオンの混合物が添加されたＴＧａｓｅは、従来知られているシスティン、グルタチオンの単独添加の場合より回収率と残存活性において顕著に高い結果を示した。なお、回収率で特に高い値を示しているシスティン、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウムは、酵素の乾燥中に一部活性化され、逆に、他のもので回収率が低いのは、精製工程で活性化が不十分であったことによるものと考えられる。
【００４２】
【表３】
〔実施例４〕（粗酵素ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討）
実施例１〜３では、精製結晶化された酵素に対する安定化効果を調べたが、本実施例では結晶化されない粗酵素での同様な効果を調べた。参考例１に記載の市販のＴＧａｓｅを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．０に懸濁後、不溶物を遠心分離により除いた上清液に硫安を飽和となるまで加えて塩析した。生じた沈殿を遠心分離により集めて限外濾過膜により脱塩濃縮して粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて表４に示す各種物質の保存安定性効果を調べた。
【００４４】
【表４】
表４より、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、あるいはグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物が高い回収率と残存活性を示した。なお、これらの効果が認められた安定化剤は、特に結果は示していないが、精製結晶化ＴＧａｓｅについても保存安定化効果が確認された。
【００４６】
〔実施例５〕（液体状に処理された精製結晶化ＴＧａｓｅに添加する安定化剤の検討）
参考例１で得られた精製結晶化されたＴＧａｓｅを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．０に溶解し、通常の活性測定に使用される２倍濃縮となるまで希釈した後、表５、表６に記載の各種物質の溶液と等量混合し、液体状のまま５０℃１時間の加熱処理を行って残存活性の測定を行い各種物質の保存安定化効果を検討した。
【００４７】
【表５】
【表６】
表５と表６に示すように、グルタミンペプチド、ペプチーノ等の蛋白分解物、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、Ｌ−システィン、亜硫酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液が精製結晶化により液体状に処理されたＴＧａｓｅの保存安定化に効果があった。
特許文献２や特許文献３に記載される部分精製された粉末状のＴＧａｓｅの安定化剤とある程度の相関性はあるが、これらで安定化効果が認められた糖や糖アルコール、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどは精製結晶化により液体状に処理されたＴＧａｓｅでは効果が認められず、完全には相関するものではなかった。また、結果は示さないが、これら物質について適宜組み合わせることにより相加あるいは相乗的な効果がみられた。特に、特徴的な効果としてグルタミンペプチドではｐＨ５．０〜６．５付近で、また、マッキルバイン緩衝液（ｐＨ６〜７．０）で高い安定化効果を示すことが見出された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、以下の効果を奏する。安全性がありかつ安定化効果に優れた安定化剤を添加することによりＴＧａｓｅが安定化し、製造中や製品保存中に酵素活性が失活し難く、長期に亘る酵素活性の高いＴＧａｓｅの保管が可能となる。
また、精製結晶化されたＴＧａｓｅの製造中や製品保存中の安定化を図ることができるので、粉末など固体状に処理される精製結晶化されたＴＧａｓｅのみならず、液状、懸濁状、ペースト状など液体状に処理される酵素活性の高い精製結晶化ＴＧａｓｅの保管が可能となる。
Claims (6)
- 微生物が生産するトランスグルタミナーゼであって、トレハロースとペプチーノの混合物、トレハロースとグルタミンペプチドの混合物、トレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムとトレハロースとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、ペプチーノとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミンペプチドとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、トレハロースとグルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタミン酸ナトリウムと亜硫酸水素ナトリウムの混合物、システィンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物、グルタチオンとｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液の混合物からなる群から選ばれた１種以上が安定化剤として添加されてなる安定化トランスグルタミナーゼ。
- トランスグルタミナーゼが固体状に処理されたものである請求項１記載の安定化トランスグルタミナーゼ。
- 微生物が生産する液体状に処理されたトランスグルタミナーゼであって、グルタミンペプチド、ペプチーノ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物、亜硫酸水素ナトリウム、システィン、炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０〜７．０の範囲内のマッキルバイン緩衝液からなる群から選ばれた１種以上が安定化剤として添加されてなる安定化トランスグルタミナーゼ。
- マッキルバイン緩衝液のｐＨが６．５である請求項１〜請求項３のいずれか記載の安定化トランスグルタミナーゼ。
- トランスグルタミナーゼが精製結晶化されたものである請求項１〜請求項４のいずれか記載の安定化トランスグルタミナーゼ。
- 微生物がストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のものである請求項１〜請求項５のいずれか記載の安定化トランスグルタミナーゼ。
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