KR20060006888A

KR20060006888A - ２－０－α－Ｄ－글루코피라노실－Ｌ―아스코르빈산의제조방법

Info

Publication number: KR20060006888A
Application number: KR1020057002169A
Authority: KR
Inventors: 카즈히사 무카이; 케이지 츠사키; 미치오 쿠보타; 시게하루 후쿠다; 토시오 미야케
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2006-01-20
Also published as: JP4043312B2; KR101013195B1; EP1553186A1; TW200404812A; US8759030B2; EP1553186A4; WO2004013344A1; TWI329673B; US20060216792A1; JP2004065098A

Abstract

본 발명의 과제는, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하지 않거나 또는 이들의 생성이 검출할 수 없을 정도로 적은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 반응방법을 제공함과 동시에, 본 반응방법을 사용한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법을 제공하는 것이며, L-아스코르빈산과 α-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 α-이소말토실글루코 당질생성효소 또는 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제(EC 2.4.1.19)를 작용시켜, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.

2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, L-아스코르빈산

Description

２－０－α－Ｄ－글루코피라노실－Ｌ―아스코르빈산의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING 2-O-α-D-GLUCOPYRANOSYL-L-ASCORBIC ACID}

본 발명은, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법에 관한 것으로서 더 상세하게는, α-이소말토실글루코당질생성효소를 사용하여, 또는 α-이소말토실글루코당질생성효소와 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제를 병용하여 당전이반응을 시켜 얻어지는 당전이물을 함유하는 용액으로부터의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법에 관한 것이다.

2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은, 일본국 특개평 3-135992호 공보, 일본국 특개평 3-139288호 공보 등에 개시되어 있는 바와같이, 화학식1로 표시되는 화학구조를 가지고 있으며, 직접 환원성을 보이지 않고, 안정성이 뛰어나며 또한 생체내에서 용이하게 가수분해되어 L-아스코르빈산 본래의 생리활성을 발휘하는 L-아스코르빈산의 당유도체이다.

그 공업적 제조방법으로서는, 일본국 특개평3-183492호 공보에 개시되어 있는 바와 같이, 예를 들면, L-아스코르빈산과 α-글루코실당화합물을 함유하는 용액에 당전이효소 또는 당전이효소와 글루코아밀라제(EC 3.2.1.3)를 작용시켜 얻어지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 함께 이것 이외의 협잡물(夾雜物)을 함유하는 용액을 원료용액으로 하여, 강산성양이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하는 것에 의하여, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유액을 제조하는 방법, 또한, 이것을 농축하여 과포화로 하고 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 당전이효소 또는 당전이효소와 글루코아밀라제를 작용시켜 얻어지는 L-아스코르빈산 당유도체는, 예를 들면, 당전이효소가 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제(EC 2.4.1.19) (이하, 본 명세서에서는 CGTase로 약기한다.)의 경우에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 이외에, 부생성물로서 그 결합이성체인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산(화학식2) 및 6-O-α-D-글루코피라노 실-L-아스코르빈산(화학식3)이 생성하고, 또, 당전이효소가 α-글루코시다제의 경우에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 이외에, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이 생성하는 것이 알려져 있다. 강산성양이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피를 실시할 때, 원료용액에 포함되는 L-아스코르빈산이나 글루코스는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 분자량이 다르기 때문에 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 분리가 비교적 용이하지만, 한편, 부생성물로서 생성한 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 분자량이 동일하기 때문에 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 분리가 곤란하며, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분의 순도향상을 방해하며, 또한 과포화용액으로부터의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 석출도 저해한다.

또한, 이들 결합이성체인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은, 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 분리제거한 모액(母液)중에 잔존하고, 이 모액으로부터의 재결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 석출을 저해하고, 2번결정, 3번결정의 회수량도 현저하게 저하시킨다.

5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제거방법으로서는, 일본국 특개평 5-117290호 공보에 개시되어 있는 바와 같이, 이들 결합이성체가 직접 환원성을 갖기 때문에 산화되기 쉽다는 특성을 이용하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 함께 이들 결합이성체를 함유하는 용액을 산화처리하여, 직접 환원성을 보이는 결합이성체만을 산화시키고, 이어서 강산성양이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피를 실시하는 것에 의하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 L-아스코르빈산 당유도체의 산화물(이하, 간단히 L-아스코르빈산 당유도체산화물로 약칭한다.)을 분리하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기와 같이하여, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 함께 이들 직접 환원성을 보이는 결합이성체를 함유하는 용액을 산화처리하는데에는 가능한한, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산에 작용하지 않고, 직접 환원성을 보이는 결합이성체를 우선적으로 산화하는 조건이 필요하며, 예를 들면, 통기(通氣)교반 등의 호기적(好氣的) 조건으로 노출시키는 방법이 채용되고, 이 때, pH를 약산성 내지 알칼리성으로 하거나, 동(銅)염, 철염 등의 금속염, 수증기탄, 염화아연탄 등의 활성탄 등 산화촉진제를 공존시키거나, 과산화수소, 과망간산칼륨 등의 산화제를 첨가하는 등 조작이 번잡하고, 또, 산화반응이 불충분하면 직접 환원성을 보이는 결합이성체가 잔존하고, 산화반응이 과도하면, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산에까지 작용이 미치게 되어, 결과로서 얻어지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물의 수율이 저하하는 것으로 되기 때문에, 산화반응의 공정에는 그 적정한 반응진행을 유지하기 위한 정확한 제어가 필요하며, 이에 소요되는 경제적 노력은 다대한 것이다.

본 발명은, 상기와 같은 종래의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법의 결점을 해소하기 위하여 이루어진 것으로서, 결합이성체를 분리할 필요가 없이 효율적으로 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 제조할 수 있는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조에 있어서, 그 초발공정인 L-아스코르빈산과 α-글루코실당화합물을 함유하는 용액에 당전이효소 또는 당전이효소와 글루코아밀라제를 작용시키는 공정으로 얻어지는 2-O-α-D- 글루코피라노실-L-아스코르빈산을 함유하는 용액중에 협잡물인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하지 않거나 또는 검출되지 않을 정도로 생성량을 적게할 수 있다면, 이들 직접 환원성을 보이는 L-아스코르빈산 당유도체를 산화처리하는 등의 제거공정을 필요로 하지 않고, 고순도의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물을 공업적 규모로 고수율로 제조할 수 있지 않을까라하고 생각하여, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하지 않거나 또는 이들 생성이 검출할 수 없을 정도로 적은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성반응의 확립을 목표로 하여 연구를 거듭하였다.

그 결과, 뜻밖에도, L-아스코르빈산과 α-글루코실당화합물을 함유하는 용액에 당전이효소로서, 이미 발명한 국제공개번호 WO02/10361호 명세서에 개시한 α-이소말토실글루코당질 생성효소를 작용시키는 것에 의하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 현저한 양이 생성하고, 게다가, 협잡물인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하지 않거나 또는 이들 생성이 검출할 수 없을 정도로 적다는 것을 발견하였다.

또한, 당전이반응을 할 때, 상기 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 CGTase를 병용하여 당전이반응을 일으키거나 또는 이들 효소의 병용에 의한 당전이반응을 일으키고, 이어서 글루코아밀라제를 작용시키는 것에 의하여 얻어지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량은, 당전이효소로서 α-이소말토실글루코당질생성효소를 단독으로 사용하는 경우보다도 증가하고, 또한 그 때의 5-O-α -D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 등의 결합이성체는, 당전이효소로서 α-이소말토실글루코당질생성효소를 단독으로 사용하는 경우와 마찬가지로 생성하지 않거나 또는 이들의 생성이 검출할 수 없을 정도로 적다는 것도 판명되었다.

상기와 같은 당전이반응에 의하여 얻어지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 함유하는 당전이반응생성물은, 강산성양이온교환수지를 사용하는 컬럼클로마토그래피에서는 분리가 곤란하였던 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 등의 결합이성체를 함유하고 있지 않거나, 또는 함유하고 있어도 그 양이 극히 적기 때문에, 상기 클로마토그래피에 의하여 목적으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이 용이하게, 또한 고수율로 분리·정제할 수가 있으며, 고순도의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물을 공업적 규모에서 고수율로 제조할 수가 있는 것이다.

또, 이렇게 하여 얻어지는 고순도의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물의 과포화 용액은 결정의 석출이 용이하고 수율도 높으며, 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 공업적 제조방법으로서 극히 유리하다는 것이 판명되었다.

본 명세서에서 말하는 생성하지 않거나 또는 이들의 생성이 검출할 수 없을 정도로 적다는 것은, 반응액 고형물당 0.1w/w% (이하, 본 명세서에서는 특별히 한정하지 않는 한, %는 w/w%을 의미한다.)미만의 생성물을 의미한다. 또, 본 명세서에서 말하는 직접 환원성을 보인다는 것은, L-아스코르빈산의 경우와 마찬가지로, 그대로 2,6-디크롤페놀인도페놀을 환원탈색하는 것을 의미한다.

또, 본 명세서에서 말하는 L-아스코르빈산이란, L-아스코르빈산 뿐만 아니라, L-아스코르빈산의 알칼리금속염 또는 알칼리토류금속염 등의 L-아스코르빈산염, 또는 이들의 혼합물을 의미한다.

또, 마찬가지로 본 명서서에 말하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, α-글리코실-L-아스코르빈산 등에 대해서도 특별한 문제가 발생하지 않는한, 유리(遊離)의 산 뿐만 아니라, 이들의 염도 의미한다.

이하, 본 발명의 α-이소말토실글루코당질 생성효소에 의한 당전이 반응방법, 또는 α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase와의 병용에 의한 당전이방법에 대해서 보다 구체적으로 설명한다.

도 1은, 아드로박터·글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성효소의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.

도 2는, 아드로박터·글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성효소의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.

본 발명에서 사용하는 α-글루코실당화합물은 α-글루코스를 갖는 화합물이 며, α-이소말토실글루코당질 생성효소 단독, 또는 α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase와의 병용에 의하여 L-아스코르빈산으로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 또는/및 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성할 수 있는 것이라면 좋으며, 예를 들면, 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토옥타오스 등의 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성(溶性) 전분, 액화(液化) 전분, 호화(糊化) 전분, 글리코겐 등을 적당히 선택할 수 있다.

반응시의 L-아스코르빈산의 농도는 통상, 1%이상, 바람직하게는 약2 내지 30%(w/v)라면 좋으며, α-글루코실당화합물은 L-아스코르빈산 1중량부에 대하여 통상, 약 0.5 내지 30중량부의 범위가 적당하다.

본 발명에 사용하는 α-이소말토실글루코당질 생성효소는, 예를 들면, 국제공개번호 WO02/10361호 명세서에 기재된 바와같이, 비환원성 말단의 결합양식으로서 α-1,4글루코실 결합을 갖는 글루코스 중합도가 2이상의 당질에 대하여, 상기 당질로부터 환원력을 실질적으로 증가하는 일 없이, α-글루코실 전이하는 것에 의하여, 비환원성 말단의 결합양식으로서 α-1,6글루코실 결합을 가지며, 이 비환원말단 이외의 결합양식으로서 α-1,4글루코실 결합을 갖는 글루코스 중합도가 3이상의 당질을 생성하는 효소활성을 가지고 있으며, 구체적인 예로서는, 하기의 이화학적 성질을 갖는 효소가 있다. 또한, 상기 비환원성 말단의 결합양식으로서 α-1,4글루코실 결합을 갖는 글루코스 중합도가 2이상의 당질로서는, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스티린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성 전분, 액화 전분, 호화 전 분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 예시할 수 있다.

(1) 작용

비환원성 말단의 결합양식으로서 α-1,4글루코실 결합을 갖는 글루코스 중합도가 2이상의 당질로부터 환원력을 실질적으로 증가하는 일 없이, α-글루코실 전이하는 것에 의하여 비환원성 말단의 결합양식으로서 α-1,6글루코실 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합양식으로서 α-1,4글루코실 결합을 갖는 글루코스중합도가 3이상의 당질을 생성한다.

(2) 분자량

SDS-겔 전기영동법에 의하여, 약 74,000 내지 160,000돌턴(dolton)의 범위내에서 분자량을 갖는다.

(3) 등전점(等電點)

안포라인함유 전기영동법에 의하여 pI 약 3.8 내지 7.8의 범위내에 등전점을 갖는다.

(4) 최적 온도(optimum temperature)

pH 6.0, 60분간 반응으로 약 40 내지 50℃의 범위내에서 최적온도를 갖는다.

pH 6.0, 60분간 반응으로 1mMCa²⁺ 존재하, 약 45 내지 55℃의 범위내에 최적온도를 갖는다.

pH 8.4, 60분간 반응으로 약 60℃에 최적온도를 갖는다. 또는 pH 8.4, 60분간 반응으로 1mMCa²⁺ 존재하, 약 65℃에 최적온도를 갖는다.

(5) 최적 pH

35℃, 60분간 반응으로 pH 약 6.0 내지 8.4의 범위내에 최적pH를 갖는다.

(6) 온도 안정성

pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 약 45℃ 이하에 온도안정영역을 갖는다.

pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mMCa²⁺ 존재하, 약 50℃ 이하에 온도안정영역을 갖는다.

pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 약 55℃ 이하에 온도안정영역을 갖는다. 또는 pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mMCa²⁺ 존재하, 약 60℃ 이하에 온도안정영역을 갖는다.

(7) pH안정성

4℃, 24시간 유지하는 조건에서, pH 약 4.5 내지 10.0의 범위내에 안정pH영역을 갖는다.

(8) N말단 아미노산 배열

티로신-발린(valine)-세린-세린-로이신(leucine)-글리신(glycine)-아스파라긴-로이신-이소로이신(배열표에 있어서의 배열번호 1), 히스티딘-발린-세린-아라닌(alanine)-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-로이신(배열표에 있어서의 배열번호2), 또는, 아라닌-프로린(proline)-로이신-글리신-발린-글루타민-아르기닌-아라닌-글루타민-페닐아라닌-글루타민-세린-글리신(배열표에 있어서의 배열번호3)을 갖는 경우가 있다.

본 발명에서 사용하는 α-이소말토실글루코당질 생성효소는 당전이반응의 공여체로서, 비환원성 말단의 결합양식이 α-1,4글루코실 결합인 글루코스중합도가 2이상의 당질을 사용하면 L-아스코르빈산에 당전이하고 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 다시 이 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 글루코피라노실기에 α-글루코피라노실잔기가 1개 또는 2개 이상 전이한 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성한다.

본 발명에 사용하는 α-이소말토실글루코당질 생성효소로서는, 예를 들면, 아드로박터속 및 바실루스(Bacillus)속 등에 속하는 세균유래의 효소가 있으며, 예를 들면, 아드로박터·글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) A19주(FERM BP-7590), 바실루스·글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9주 (FERM BP-7143), 바실루스·글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11주(FERM BP-7144), 바실루스·글로비스포루스(Bacillus globisporus) N75주 (FERM BP-7590) 등을 들 수가 있다.

물론, NTG 등의 화학변이 유발제 또는 자외선이나 조사선 등을 사용한 인위적 변이를 실시하거나, 돌연변이주를 분리하여, α-이소말토실글루코당질생성효소 고생산주 등을 취득하고 그 변이주 유래의 효소도 유리하게 이용할 수 있다.

또, α-이소말토실글루코당질 생성효소의 폴레펩티드를 코드하는 유전자DNA를 화학합성하거나, 본래, 이 유전자DNA를 보유하는 세포로부터 클로닝하거나 하여상기 유전자DNA를 얻은 후, 상기 유전자DNA를 그대로 혹은 1개 또는 2개 이상의 DNA를 다른 DNA로 치환하거나, 1개 또는 2개 이상의 DNA를 결실(缺失) 또는 부가(附加), 삽입하여 동종 또는 이종의 세포에 도입하고 발현시킨, 이른바, 셀프클로닝 체 및 재조합체 유래의 효소라도 좋다.

본 발명에 사용하는 CGTase는, 예를 들면, 바실루스(Bacillus)속, 클레브실라(Klebsiella)속, 터모아나에로박터(Thermoanaerobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 터모콕카스(Thermococcus)속 등에 속하는 세균유래의 효소가 적의하게 선택된다. 또, α-이소말토실글루코당질 생성효소의 경우와 마찬가지로, CGTase의 폴리펩티드를 코드하는 유전자DNA를 화학합성하거나, 본래, 상기 유전자DNA를 보유하는 세포로부터 클로닝하거나하여 상기 유전자DNA를 얻은 후, 상기 유전자DNA를 그대로, 또는 1개 또는 2개 이상의 DNA를 다른 DNA에 치환하거나, 1개 또는 2개 이상의 DNA를 결실 또는 부가, 삽입하여 동종 또는 이종의 세포에 도입하여 발현시킨, 이른바, 셀프클로닝체 및 재조합체 유래의 효소라도 좋다.

이들 당전이효소는, 반드시 정제하여 사용할 필요는 없고, 통상은, 조(粗)효소로 본 발명의 목적을 달성할 수가 있다. 필요하다면, 공지의 각종방법으로 정제하여 사용하여도 좋다.

또, 사용효소량과 반응시간은 밀접한 관계가 있으며, 통상은, 경제적 측면에서 약 3 내지 80시간으로 반응을 종료하도록 효소량이 선택된다.

또, α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase를 병용하여 사용하는 경우, CGTase의 사용량이 과잉이면, CGTase의 당전이반응에 의한 부생성물인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량이 현저하게 증가하고, 본 발명의 효과를 발휘할 수 없게 된다.

따라서, 본 발명에 사용하는 CGTase의 양은 바람직하게는 기질의 α-글루코 실당화합물 1그램당 약 0.01 내지 50단위의 범위에서 선택된다. 또한, 여기서 말하는 CGTase의 효소활성을 나타내는 단위는 20mM의 초산완충액(pH 5.5) 및 2mM의 염화칼슘을 포함하는 0.3%(w/v)의 전분용액에 CGTase를 첨가하고, 40℃, 10분간 반응하는 것으로 측정하고, 그 효소활성 1단위는 15mg의 용액상(狀) 전분의 요오드 소정색(呈色)을 완전히 소실시키는 효소량으로 한다.

또, α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase를 각각의 담체에 고정화하고, 또는 양효소를 동일한 담체에 고정화하여 얻어지는 고정화된 당전이효소를 배치(batch)식으로 반복하고, 또는 연속식으로 반응에 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명의 당전이방법은, 통상, 앞에서 기술한 L-아스코르빈산과 α-글루코실당 화합물을 함유하는 용액에 α-이소말토실글루코당질 생성효소 또는 α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase를 첨가하고, 상기 양효소가 충분히 작용하는 조건, 바람직하게는 pH 약 3 내지 10, 온도 30 내지 70℃의 범위에서 선택되는 반응조건으로 하여 실시한다.

또, 반응중에 L-아스코르빈산이 산화분해를 받기 쉽기 때문에, 될수 있는대로 혐기(嫌氣) 또는 환원상태에서 차광 하에서 유지하는 것이 바람직하고, 필요하다면 티오뇨소, 황화수소 등을 공존시켜 반응시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명의 α-이소말토실글루코당질 생성효소 단독, 또는 α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase를 변용하여 L-아스코르빈산에 당전이시키면, 2-O-α-D- 글루코피라노실-L-아스코르빈산이 생성함과 동시에, α-D-글루코피라노실 잔기가 다시 1개 또는 2개 이상 부가한 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산도 혼합되어 생성한다.

이상 상술한 바와같이, α-이소말토실글루코당질 생성효소 단독, 또는 α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase의 병용에 의한 당전이반응을 채용하면, L-아스코르빈산과 α-글루코실당 화합물로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이 생성함과 동시에, α-D-글루코피라노실 잔기가 다시 1개 또는 2개 이상 부가한 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산도 혼합되어 생성하기는 하지만, 공업적 컬럼크로마토그래피 등으로 분리하기가 곤란한 협잡물인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 등 L-아스코르빈산의 5위 수산기에로의 당전이물이나 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 등 L-아스코르빈산의 6위 수산기에로의 당전이물의 부생성은 없거나, 검출할 수 없을 정도로 적다.

본 발명의 α-이소말토실글루코당질 생성효소 단독, 또는 α-이소말토실글루코당질 생성효소와 CGTase의 병용에 의한 당전이반응에 의하여 얻어지는 생성물에 글루코아밀라제를 작용시키면, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산보다 고분자의 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산의 글리코실 부분의 α-1,4 결합 또는 α-1,6 결합을 가수분해하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 축적 생성시킬수가 있다.

글루코아밀라제의 작용조건은, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산보다 고분자의 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산을 가수분해하고, 2-O-α-D-글루코피라노 실-L-아스코르빈산을 축적 생성시킬수 있는 조건이라면 좋으며, 반응pH, 반응온도, 작용량, 작용시간 등 적당한 조건으로 실시하면 좋다. 또, 담체결합법, 가교법, 또는 포괄법 등으로 고정화된 글루코아밀라제를 사용하여 연속식으로, 또는 배치식으로 글루코아밀라제 반응하는 것도, 반응후에 막분리하는 등 하여, 반응액과 글루코아밀라제를 각각 회수하고, 글루코아밀라제를 재이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

일반적으로, 반응용액은 가열하거나 하여 효소를 실활(失活)시킨 후, 또는 그대로 활성탄으로 탈색하고, 여과하여 불용액을 제거하며 필요하다면 농축한다.

얻어지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 함유 용액은 목적으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 함께, 협잡물로서 미반응의 L-아스코르빈산, D-글루코스 등 중성당질을 함유하고 있다. 글루코스 등의 중성당질을 공지의 방법, 예를 들면, 전기투석법, 음이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피법 등으로 분리, 제거, 또는 저감시켜도 좋다. 이렇게 하여 얻어지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 함유 용액을 원료로 하여, 강산성 양이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 얻는다.

강산성 양이온수지는 공지의, 예를 들면, 술폰산기를 결합한 스틸렌-디비닐벤젠 가교공중합체수지의 Na⁺형, K⁺형 등의 알칼리금속염형, 또는 Ca⁺⁺형, Mg⁺⁺형 등의 알칼리토류금속염형, 또는 H⁺형 등이 적의하게 사용되며, 시판품으로서는, 예를 들면, 다우케미컬사 제조의 상품명 『다우엑스 50W×8』, 롬&하스사 제조의 상품명『안바라이트 CG-6000』, 도쿄유기화학공업주식회사 제조의 상품명 『XT-1022E』, 미츠비시화학주식회사 제조의 상품명 『다이아이온 SK104』등이 있다.

원료용액으로서, 예를 들면, 목적으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 함께 L-아스코르빈산, D-글루코스 등의 협잡물을 함유하는 용액을 사용하는 경우에는 강산성 양이온교환수지를 충전한 컬럼에 원료용액을 흐르게하고, 이어서 물로 용출하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산·L-아스코르빈산·D-글루코스 고함유획분, L-아스코르빈산·D-글루코스 고함유획분 등의 순으로 복수의 획분으로 분획하고, 이 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하는 것에 의하여 용이하게 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물이 제조된다.

또, 원료용액을 컬럼에 흐르게하여 분획할 때에, 이미 얻어져 있는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산·L-아스코르빈산·D-글루코스 고함유획분 등의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 함유획분을 원료용액의 전후에, 또는, 원료용액과 함께 흐르게 하는 것에 의하여 분획에 요하는 물의 사용량을 감소시키고, 원료용액으로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물을 고눙도, 고수율로 채취하는 것도 유리하게 실시할 수가 있다. 본 발명에서 사용되는 분획방식은 고정상(固定床) 방식, 이동상 방식, 의사(擬似)이동상 방식, 어느것이라도 좋다.

이렇게 하여 얻어지는 본 발명의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물, 바람직하게는 순도 70%이상의 고함유물은 용액상태라도, 또, 농축하여 시럽상태라도 안정적이며, 그 취급은 용이하다. 통상, 다시 농축하여, 과포화용액으로 하고, 결정화하여 다시 안정화된 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 제조한다. 본 발명에서 사용하는 정출(晶出)용 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물은, 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 석출을 저해하는 직접 환원성을 보이는 결합이성체를, 초발의 당전이반응 단계에서 실질적으로 함유하고 있지 않기 때문에, 그 결정의 석출은 극히 용이하며, 결정수율도 높다. 정출방법은, 통상, 20 내지 60℃의 과포화 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 용액을 조정(助晶)캔에 넣고, 이것에 종(種)결정을 바람직하게는 0.1 내지 2% 공존시켜, 천천히 교반하면서 서냉하여, 정출을 촉진시켜 마스키트(MASKIT)로하면 좋다.

이와같이, 본 발명의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 과포화 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 용액에 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 종정(種晶)으로서 첨가하는 것에 의하여 용이하게 정출시킬 수 있다.

정출한 마스키트로부터 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 분말을 제조하는 방법으로서는, 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 분말을 채취할 수 있는 방법을 적당히 선택하면 좋고, 예를 들면, 분밀(分蜜)방법, 블록분쇄방법, 유동조립(流動造粒)방법, 분무건조방법 등을 들 수가 있다.

이렇게 하여 얻어지는 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 그 순도와, 정출율에 의하여 다소 변동하기는 하지만, 실질적으로 비흡습성 또는 난흡습성이며, 그 결정분말은 유동성이며, 고착하는 염려도 없다. 그 뛰어난 특성은 다음과 같다.

(1) 직접 환원성을 보이지 않으며, 극히 안정적이다.

L-아스코르빈산과는 다르게, 메일라드 반응(Maillard Reaction)을 일으키기 어렵다. 따라서, 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질, 당질, 생리활성물질 등이 공존하여도 필요없는 반응을 일으키지 않으며, 오히려 이들 물질을 안정화시킨다.

(2) 가수분해를 받아 L-아스코르빈산을 생성하고, L-아스코르빈산과 동일한 환원작용, 항산화작용을 나타낸다.

(3) 체내의 효소에 의하여 L-아스코르빈산과 D-글루코스에 용이하게 가수분해되고, L-아스코르빈산 본래의 생리활성을 나타낸다.

또, 비타민E, 비타민P 등과의 병용에 의하여, 그 생리활성을 증강시킬 수가 있다.

(4) L-아스코르빈산과 α-글루코실당화합물을 경구 섭취하는 것에 의하여 생체내에서 생성되며, 대사되는 물질이기 때문에 그 안정성은 극히 높다.

(5) 실질적으로 비흡습성, 난흡습성임에도 불구하고, 물에 대하여 큰 용해속도, 용해도를 가지고 있으며, 분말, 과립, 정제 등의 비타민제, 샌드크림, 쵸콜릿, 츄잉검, 즉석 쥬스, 즉석 조미료 등의 음식물의 비타민C강화제, 맛내기개선제, 산미(酸味)제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

(6) 실질적으로 비흡습성 또는 난흡습성이며, 고결(固結)하지 않기 때문에 그 분말은 유동성이며, 그 취급은 용이하며 비정질의 경우와 비교하여 그 포장, 수송, 저장에 요하는 물적, 인적 경비를 대폭적으로 삭감할 수 있다.

다음에 실험에 의해 본 발명의 L-아스코르빈산에로의 당전이방법을 더욱 구체적으로 설명한다.

(실험 1) <α-이소말토실글루코 당질생성효소의 생산>

전분 부분분해물 『파인덱스 #4』 4.0%(w/v), 효모추출물『아사히미스트』1.8%(w/v), 인산2칼륨 0.1%(w/v), 인산1나트륨·12수염 0.06%(w/v), 황산마그네슘·7수염 0.05%(w/v) 및 물로 이루어진 액체배지를 500ml용 삼각플라스코에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 아드로박터·글로비포르미스 A19주(FERM BP-7590)를 접종하고, 27℃, 230rpm으로 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 배양조에 종배양의 경우와 동일한 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1%(v/v)를 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 9.0으로 유지하면서, 48시간 통기교반 배양하였다.

배양 후, 배양물 중의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성은 약 1.1 단위/ml 이었다. 이 배양물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성은 약 1.06 단위/ml (총활성 약 19,100단위)이었다.

또한, α-이소말토실글루코 당질생성효소의 활성측정은 다음과 같이하여 측 정한다. 말토트리오스를 농도 2w/v%가 되도록 100mM 글리신-NaOH완충액(pH 8.4)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml 첨가하고, 40℃에서 60분간 효소반응시켜, 그 반응액을 10분간 자비(煮沸)하여 반응을 정지시킨 후, 그 반응액중의 말토스 함량을 고속 액체크로마토그래피(HPLC)법으로 정량(定量)하는 것에 의하여 실시하였다.

α-이소말토실글루코 당질생성효소의 활성 1단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 말토스를 생성하는 효소량으로 정의하였다. 또한, 상기 HPLC는 『Shodex KS-801컬럼』(쇼와전공주식회사 제조)을 사용하고, 컬럼온도 60℃, 용리액으로서 물의 유속 0.5ml/min수(水)의 조건에서 실시하고, 검출은 시차굴절계(視差屈折計) 『RI-8012』(토소주식회사 제조)를 사용하여 실시하였다.

(실험 2) <α-이소말토실글루코 당질생성효소의 정제>

상기 실험1의 방법으로 얻은 배양상청 약 18L를 80% 포화 유안(황산암모늄)액으로 염석하여 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수하고 10mM 트리스·염산완충액(pH7.5)에 용해시킨 후, 동완충액에 대하여 투석하여 조효소액 약 850ml을 얻었다. 이 조효소액은 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 약 8,210단위 함유하고 있었다. 이 조효소액을 『DEAE-토요펄(Toyopearl) 650S』겔(토소주식회사 제조)을 사용한 이온교환크로마토그래피(겔의 양 380ml)에 공급하였다. 효소활성성분은 『DEAE-토요펄(Toyopearl) 650S』겔에는 흡착하고, NaCl농도 0M에서 1M의 리니어그라디엔트로 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성성분은, NaCl의 리니어그라디엔트에서 그 농도가 약 0.2M 부근에서 용출하였다. 그래서, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성획분을 회수하고, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 부분정제효소표본품을 회수하였다.

얻어진 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 부분정제효소표본품을 1M 유안을 함유하는 10mM 인산완충액(pH7.0)에 대하여 투석하고, 이 투석액을 원심분리하여 불용액을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』겔 (아마샴·펄마시아·바이오테크사 제조)을 사용한 아피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)(겔양 500ml)에 공급하였다. 효소활성성분은, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』겔에 흡착하고, 유안 1M에서 0M으로 농도저하하는 리니아그라디엔트로 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성은, 유안의 리니어그라디엔트 농도가 약 0.2M 부근의 획분에서 검출되었다. 그래서, 본 효소활성획분을 회수하고, 정제효소표본품으로 하였다. 이 정제의 각 단계에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 효소표본품의 효소활성량, 비(比)활성, 수율을 표 1에 나타낸다.

효 소	효소량 (단위/g)	생 성 량 (%)
효 소	효소량 (단위/g)	2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산
아드로박터속유래 α-이소말토실글루코 당질생성효소	5	22.5	0.0	0.0
	10	24.0	0.0	0.0
	20	24.3	0.0	0.0
시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제 (CGTase:대조)	300	25.5	0.8	0.3

정제한 α-이소말토실글루코 당질생성효소표본품을 7.5%(w/v)농도 폴리아크릴아미드를 포함하는 겔전기영동에 의한 효소표본품의 순도를 검정한 결과, 단백밴드는 단일이며 고순도의 효소표본품이었다.

(실험 3) <α-이소말토실글루코 당질생성효소의 여러 성질>

실험 3-1 <분자량>

실험 2의 방법으로 정제하여 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성효소표본품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동법 (겔농도 7.5w/v%)에 공급하고, 동시에 영동한 분자량 마커(니혼바이오·래드·라버러토리스 주식회사 제조)와 비교하여 당해 효소의 분자량을 측정하였다. 당해 효소의 분자량은 약 94,000 ±20,000 돌턴이었다.

실험 3-2 <등전점>

실험2의 방법으로 정제하여 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성효소표본품을 2w/v% 안포라인(아마샴·펄마시아·바이오테크사 제조) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔전기영동법에 공급하고, 전기영동후의 단백밴드 및 겔의 pH를 측정하여 당해 효소폴리펩티드의 등전점을 구하였다. 그 결과, 당해 효소의 등전점은 pI 약 4.3±0.5였다.

실험 3-3 <작용온도 및 pH>

α-이소말토실글루코 당질생성효소활성에 미치는 온도와 pH의 영향에 대하여 각종 온도, pH조건하, 실험1에 기재한 α-이소말토실글루코 당질생성효소의 활성측정법에 준하여 조사하였다. 그 결과, 최적온도는 pH 8.4, 60분간 반응으로 약 60℃(Ca²⁺ 비존재) 또는 약 65℃(1mM Ca²⁺ 존재)이며, 그 최적pH는 35℃, 60분간 반응으로 약 8.4였다.

실험 3-4 <안정성>

α-이소말토실글루코 당질생성효소의 온도안정성은, 당해 효소함유용액(20mM 글리신-NaOH완충액, pH 8.0)을 Ca²⁺ 비존재하 또는 1mM Ca²⁺ 존재하에서 각 온도에 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 측정하는 것에 의하여 구하였다. 또, pH안정성은, α-이소말토실글루코 당질생성효소를 각 pH의 50mM완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH8.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정하는 것에 의하여 구하였다. 그 결과, 온도안정성은 약 55℃까지(Ca²⁺ 비존재) 또는 약 60℃까지 (1mM Ca²⁺ 존재)이며, pH안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.

실험 3-5 <N말단아미노산 배열>

실험2의 방법으로 정제하여 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성효소에 대하여 그 N말단아미노산 배열을 『프로테인 시퀀서 모델473A』(어프라이드 바이오시스템스사 제조)을 사용하여 분석한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소는 배열표에 있어서의 배열번호3에 보이는 아미노산 배열을 갖는 것이 판명되었다.

이상, 아드로박터·글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성효소의 제조방법 및 그 성질을 설명하였으나, 본 발명에 있어서는 다른 균주유래의 α-이소말토실글루코 당질생성효소라도 사용할 수가 있다.

(실험 4) <L-아스코르빈산에로의 당전이시험>

이하에 나타내는 각종 당질이, α-이소말토실글루코 당질생성효소를 사용하는 당전이반응에 있어서의 당공여체로 되며, L-아스코르빈산으로 당전이하는지 여부를 시험하였다. 즉, 글루코스, 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토스, 이소말토트리오스, 이소파노스, 트레하로스, 코지비오스, 니게로스, 네오트레하로스, 세로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토스, 스크로스, 엘로스, 세라기노스, 말토실글루코시드, 이소말토실글루코시드, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, τ-시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 풀란, 덱스트란을 포함하는 용액을 조제하였다. 각각의 용액에 L-아스크로빈산을 첨가하여, 당질농도 및 L-아스코르빈산 농도를 2w/v%로 조정하였다. 이들 용액에 실험2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글 루코 당질생성효소표본품을 당질고형물 1g당 각각 3단위씩 첨가하여, 기질농도를 1.6w/v%가 되도록 조정하고, 이들을 40℃, pH 6.0에서 20시간 작용시켰다. 효소반응후의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성을 조사하기 위하여 실리카겔박층크로마토그래피(이하, TLC라고 약기한다.)를 실시하였다. 전개용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물혼합액(용량비 6:4:1), 박층플레이트로서 메르크사제조 『키젤겔 60F254』(알루늄플레이트, 20×20cm)을 사용하여 1회 전개한 후, 자외선을 박층플레이트에 조사하여 아스코르빈산 및 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 검출하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성의 유무를 확인하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.

α-이소말토실글루코 당질생성효소 (단위/g)	시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제(CGTase) (단위/g)	생 성 량 (%)
α-이소말토실글루코 당질생성효소 (단위/g)	시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제(CGTase) (단위/g)	2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산
10	0	25.1	0.0	0.0
10	1	29.3	0.0	0.0
10	2	30.1	0.0	0.0
10	5	30.8	0.1	0.0
10	10	30.9	0.1	0.0
10	100	30.6	0.8	0.3
0	1	4.3	0.0	0.0
0	2	5.4	0.0	0.0
0	5	7.8	0.2	0.0
0	10	10.4	0.3	0.1
0	100	29.5	0.9	0.3

표 2의 결과로부터 명확히 알수 있듯이, α-이소말토실글루코 당질생성효소는 시험한 각종 당질 내, 글루코스중합도가 3이상으로, 비환원말단에 말토스구조를 갖는 당질을 당공여체로하여, L-아스코르빈산에 당전이하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하는 것이 판명되었다. 또, 글루코스중합도가 2인 당질에서는, 말토스, 코지비오스, 니게로스, 네토레하로스, 말토리이톨, 엘로스에도 작용하여, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하는 것이 판명되었다.

(실험 5) <L-아스코르빈산에로의 당전이생성물>

L-아스코르빈산을 농도 5w/v%, 말토펜타오스를 농도 5w/v%, 및 1mM의 염화칼슘을 포함하는 수용액을 pH 5.0으로 조정하고, 이에 실험2의 방법으로 조제한 정제 α-이소말토실글루코 당질생성효소를 말토펜타오스 1g당 10단위가 되도록 첨가하여 50℃에서 24시간 반응시키고, 그 반응액을 10분간 자비하여 반응을 정지시킨 후, 그 반응액의 일부분을 채취하고, 이것에 글루코아밀라제(생화학공업주식회사 제조)를 말토펜타오스 1g당 40단위 첨가하고, 40℃에서 16시간 작용시킨 후, 10분간 자비하여 반응을 정지시켰다.

이들 반응액중의 L-아스코르빈산에로의 당전이생성물 및 잔존하는 L-아스코르빈산을 이하의 고속 액체크로마토그래피(HPLC)법으로 분리하여 측정하였다. 『Wakopak WB-T-330컬럼』(와코준야쿠공업주식회사 제조)을 사용하여, 컬럼온도 25℃, 용리액으로서 70ppm 질산수용액의 유속 0.5ml/min의 조건하에서 실시하고, 검출은 아스코르빈산 및 아스코르빈산에로의 당전이물을 분광광도계『UV-8020』(토소주식회사 제조)를 사용하여 파장 238nm흡수로 측정함과 동시에, 아스코르빈산 및 아스코르빈산에로의 당전이물을 포함한 모든조성을 시차굴절계 『RI-8020』『토소주식회사 제조』를 사용하여 측정하는 것으로 실시하고, 아스코르빈산 및 아스코르 빈산에로의 당전이물의 반응액고형물당의 생성량(이하, 본 명세서에서는 특별히 한정하지 않는한 생성량은 반응액고형물당의 생성량을 의미한다.)을 구하였다. 이들 결과를 표3에 나타낸다.

글루코아밀라제반응의 유무	생 성 량 (%)
글루코아밀라제반응의 유무	2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산*	L-아스코르빈산
무	18.7	0.4	40.3
유	19.1	0.0	40.3

*2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산에 α-D-글루코피라노실잔기가 다시 1개 또는 2개 이상 부가한 것을 의미한다.

표 3의 결과에서 명확히 알수 있듯이, α-이소말토실글루코 당질생성효소에 의한 L-아스코르빈산에로의 당전이생성물로서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이 약 18.7% 생성함과 동시에, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과는 다른 전이생성물이 약 0.4% 생성하는 것을 알았다. 또, 이 반응액에 글루코아밀라제를 작용시키면, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 다른 전이생성물은 소실하고, 그 소실과 함께 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산량이 증가하고, L-아스코르빈산에로의 당전이생성물로서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산만이 생성되는 것이 판명되었다. 글루코아밀라제의 작용특성을 고려하면, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산과 다른 전이생성물은, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산에 α-D-글루코피라노실잔기가 다시 1개 또는 2개 이상 부가한 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산이며, 글루코아밀라제 작용의 결과, 이 2-O-α-글리코 실-L-아스코르빈산의 1개 또는 2개 이상 부가한 α-D-글루코피라노실잔기가 가수분해되어, 2-O-α-글리코실-L-아스코르빈산이 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산으로 변환되었다고 판단된다.

(실험 6) <2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산생성의 작용온도 및 pH>

α-이소말토실글루코 당질생성효소의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성활성에 미치는 온도와 pH의 영향에 대하여 각종 온도, pH조건하에서 조사하였다. 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성활성측정은, 다음과 같이 하여 측정하였다.

(1) 온도의 영향에 대해서는 L-아스코르빈산을 농도 0.5w/v%, 말토펜타오스를 농도 0.5w/v%, 및 염화칼슘을 농도 1mM이 되도록 100mM 초산완충액(pH 5.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 2ml에 효소액 0.2ml 첨가하여, 30 내지 65℃에서 30분간 효소반응시키고, 그 반응액을 10분간 자비하여 반응을 정지시켰다. 그 반응액중에 생성한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산량은 실험5에 기재한 HPLC법에 의하여 분리하여 측정하는 것에 의하여 실시하였다.

(2) pH의 영향에 대해서는 L-아스코르빈산을 농도 0.5w/v%, 말토펜타오스를 농도 0.5w/v%, 및 염화칼슘을 농도 1mM이 되도록 100mM의 각종 완충액에 용해시켜 기질액으로 하였다.

완충액의 종류는 pH 4.1 내지 6.4의 범위에서는 초산완충액을 사용하고, pH 6.7 내지 7.5의 범위에서는 인산완충액을 사용하고, pH 7.6 내지 8.5의 범위에서는 트리스·염산완충액을 사용하였다. 그 기질액 2ml에 효소액 0.2ml를 첨가하여, 40 ℃에서 30분간 효소반응시키고, 그 반응액을 10분간 자비하여 반응을 정지시킨 후, 그 반응액중에 생성한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산량을 HPLC법으로 정량하는 것에 의하여 실시하였다. 이들 결과를 도1(온도의 영향) 및 도2(pH의 영향)에 나타냈다.

도 1에서 명확히 알 수 있듯이, α-이소말토실글루코 당질생성효소의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성활성의 최적온도는 pH 5.0, 30분간 반응에서 약 55 내지 60℃였다.

또, 도2에서 명확히 알 수 있듯이, 그 최적 pH는 40℃, 30분간 반응에서 약 5.5였다.

(실험 7) <2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성>

L-아스코르빈산을 5%, 전분 부분분해물(상품명 『파인덱스 #1』마츠타니화학주식회사 제조)을 5% 및 1mM의 염화칼슘을 포함하는 수용액을 pH 5.0으로 조정하고, 이것에 실험2의 방법으로 조제한 정제 α-이소말토실글루코 당질생성효소를 전분 부분분해물 1g당 5 내지 20단위가 되도록 첨가하여 50℃에서 48시간 반응시켰다. 이들 반응액을 약 100℃에서 10분간 가열하고, 효소를 실활시킨 후, 40℃로 냉각하고, 글루코아밀라제(생화학공업주식회사 제조)를 전분 부분분해물 1g당 40단위 첨가하고, 40℃에서 16시간 작용시켰다. 이들 반응액을 실험5에 기재한 HPLC법에 제공하고, 표준품으로서 시판의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조), 특허 제 3134235호 명세서에 기재된 방법으로 조제한 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스 코르빈산을 사용하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 및 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 분리하고, 각각의 생성량을 측정하여 기질고형물당의 생성율을 구하였다. 대조로서 α-이소말토실글루코 당질생성효소를 대신하여 바실루스·스테아로서모필스 유래의 CGTase(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조)를 전분 부분분해물 1g당 300단위 사용한 것 이외는 동일한 조작을 실시하고, 마찬가지로 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 및 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량을 조사하였다. 이들의 결과를 표4에 나타낸다.

효 소	효소량 (단위/g)	생 성 량 (%)
효 소	효소량 (단위/g)	2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산
아드로박터속유래 α-이소말토실글루코 당질생성효소	5	22.5	0.0	0.0
	10	24.0	0.0	0.0
	20	24.3	0.0	0.0
시클로말토덱스트린·트랜스글루카나제 (CGTase:대조)	300	25.5	0.8	0.3

표 4의 결과에서 명확히 알수 있듯이, α-이소말토실글루코 당질생성효소는 아스코르빈산에로의 전이물로서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산만이 생성되고, 그 밖의 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 생성되지 않았다. 한편, 대조의 CGTase는 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 거의 동일한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 생성량 이었지만, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량은 각각 0.8%, 0.3%였다.

이상의 결과로부터 CGTase의 아스코르빈산에로의 당전이는 아스코르빈산의 2위 수산기뿐만 아니라, 5위 및 6위 수산기에도 전이하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성함과 동시에, 부생성물로서 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하는 것에 대하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성효소의 아스코르빈산에로의 당전이는, 아스코르빈산의 2위 수산기에만 반응하고, 특이적으로 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성한다는 것이 판명되었다.

(실험 8) <CGTase와의 병용시험>

L-아스코르빈산을 9%, 전분 부분분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마츠타니화학주식회사 제조)을 21% 및 1mM의 염화칼슘을 포함하는 수용액을 pH 5.0으로 조정하고, 이것에 실험2의 방법으로 조제한 정제 α-이소말토실글루코 당질생성효소를 전분 부분분해물 1g당 10단위, CGTase(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조)를 1 내지 100단위가 되도록 첨가하여 50℃에서 24시간 반응시켰다. 이들 반응액을 약 100℃에서 10분간 가열하고, 효소를 실활시킨 후, 40℃로 냉각하고, 글루코아밀라제(생화학공업주식회사 제조)를 전분 부분분해물 1g당 40단위 첨가하고, 40℃에서 16시간 작용시켰다. 이들 반응액을 실험5에 기재한 HPLC법에 제공하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 및 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량을 측정하고, 기질고형물 당의 생성량을 구하였다. 아울러 정제 α-이소말토실글루코 당질생성효소단독 및 대조로서 CGTase 단독으로 전이반응을 실시하고 동일하게 조작하였다. 이들 결과를 표 5에 나타낸다.

α-이소말토실글루코 당질생성효소 (단위/g)	시클로말토덱스트린·트랜스글루카나제(CGTase) (단위/g)	생 성 량 (%)
α-이소말토실글루코 당질생성효소 (단위/g)	시클로말토덱스트린·트랜스글루카나제(CGTase) (단위/g)	2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산	6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산
10	0	25.1	0.0	0.0
10	1	29.3	0.0	0.0
10	2	30.1	0.0	0.0
10	5	30.8	0.1	0.0
10	10	30.9	0.1	0.0
10	100	30.6	0.8	0.3
0	1	4.3	0.0	0.0
0	2	5.4	0.0	0.0
0	5	7.8	0.2	0.0
0	10	10.4	0.3	0.1
0	100	29.5	0.9	0.3

상기 표 5의 결과에서 명확히 알수 있듯이, α-이소말토실글루코 당질생성효소 단독의 경우는 상기 실험 7의 결과와 마찬가지로, 아스코르빈산에로의 전이물로서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산만을 약 25% 생성량으로 생성하고, 그 밖의 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성은 검출되지 않았다. α-이소말토실글루코 당질생성효소와 CGTase를 병용한 경우는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성이 증가하고, 약 29 내지 31%의 생성량으로, 병용하는 CGTase의 사용량이 1 내지 2단위/g에서는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈 산의 생성은 검출되지 않고, 병용하는 CGTase의 사용량이 5 내지 10 단위/g에서는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성이 약 0.1%의 생성량으로 검출되고, 병용하는 CGTase의 사용량이 100단위/g에서는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성이 각각 0.8% 및 0.1%의 생성량으로 검출되었다. 대조의 CGTase 단독의 경우, 그 사용량이 1 내지 2단위/g에서는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성은 검출되지 않은 것이기는 하나, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량은 약 4 내지 5%로 소량이며, 또, CGTase 단독의 사용량이 5단위/g 이상의 경우에서는 그 사용량의 증가와 함께 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성량이 약 8%에서 약 30%로 상승하지만, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및/또는 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이 생성되는 것을 알았다.

이상의 결과로부터 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및/또는 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성이 없거나 또는 검출할 수 없을 사용량의 CGTase를 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 병용하는 것에 의하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성율을 α-이소말토실글루코 당질생성효소 단독사용의 경우보다 증가시키고, 또한, α-이소말토실글루코 당질생성효소 단독사용의 경우와 마찬가지로, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및/또는 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 생성이 없거나 또는 검출할 수 없을 정도의 극미량인 것이 판명되었다.

이하, 본 발명의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유물의 제조방법에 대한 실시예를 설명한다.

실시예 1

덱스트린(DE 약 6) 9중량부를 물 28중량부에 가열용해하고, 환원하에서 유지하고, L-아스코르빈산 3중량부를 첨가하여 pH 5.0, 50℃로 유지하면서 이것에 실험2의 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 부분정제효소표본품을 덱스트린 1g 당 8단위 첨가하여 42시간 반응시켰다. 다음에 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 55℃로 조정하고, 이것에 글루코아밀라제를 덱스트린 1g당 50단위 첨가하여 16시간 반응시켰다.

상기 반응액을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 24.9% 함유하고 있으며, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및/또는 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 검출되지 않았다. 또한, 본 반응액을 가열하여 효소를 실활시키고, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 양이온교환수지 (H⁺형)의 컬럼에 걸어서 탈미네랄하고, 이어서, 음이온교환수지(OH^-형)의 컬럼에 걸어서 음이온 수지에 흡착시키고, 수세하여 D-글루코스 등을 제거한 후, 0.5규정-염산용액으로 용출, 농축하였다.

상기 농축액을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 52.5%, L-아스코르빈산을 고형물당 약 39% 함유하고 있으며, 5- O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 0.1% 미만이었다. 본 농축액을 원료용액으로하여, 강산성양이온교환수지(롬&하스사 제조, 상품명 『안바라이트 CG-6000』, H⁺형)를 충전한 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하였다.

본 획분을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 93.6% 함유하고 있으며, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 0.1% 미만이었다. 본 획분을 감압농축하여 농도 약 77%로 하고, 이것을 조정(助晶)캔에 넣고 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 서냉하여 2일간에 걸쳐서 20℃까지 내리고, 다시 바스켓형 원심분리기에 걸어 결정-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 원료의 L-아스코르빈산에 대하여 수율 약 46%로 얻었다. 또, 모액으로서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 82.3% 함유하는 용액을 원료의 L-아스코르빈산에 대하여 고형물수율 약 28%로 회수하였다.

본 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산품은 직접 환원성을 나타내지 않고, 안정성, 생리활성도 충분하고, 비타민C강화제로서 뿐만 아니라, 맛내기개선제, 산미제, 안정제, 품질개량제, 항 산화제, 생리활성제, 자외선흡수제, 의약원료, 그리고 화학품 등으로서 음식물, 항 감수성질환제, 화장품 등에 유리하게 이용 할 수 있다.

실시예 2

실시예 1의 방법으로 회수한 모액을 농축후, 실시예 2의 방법에 준하여 강산성양이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하였다. 본 획분을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 93.0% 함유하고 있으며, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 0.1% 미만이었다. 또한, 본 획분을 실시예 1의 방법에 준하여 농축, 정출, 분밀하고, 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 모액고형물당 수율 약 63%로 얻었다.

본품은, 실시예1의 경우와 마찬가지로, 음식물, 항 감수성질환제, 화장품 등에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 3

아드로박터·글로비포르미스 A19주(FERM BP-7590)을 상법에 따라서 변이제로서 니트로소그아니딘을 사용하여 변이시키고, α-이소말토실글루코 당질생성효소 고생산, 또한, α-이소말토실전이효소 비생산주를 취득하였다. 이 변이주를 실험1의 방법에 준하여 전분 부분분해물 『파인덱스#4』4.0%(w/v), 효모추출물『아사히미스트』1.8%(w/v), 인산2칼륨 0.1%(w/v), 인산1나트륨·12수염 0.06%(w/v), 황산 마그네슘·7수염 0.05%(w/v), 및 물로 이루어진 액체배지에서 72시간 통기하에서 교반 배양하였다. 배양후, 배양액중의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성은 약 14단위/ml로, α-이소말토실전이효소활성은 검출되지 않았다. 얻어진 배양액을 상법에 따라서 SF막으로 제균하여, UF막으로 농축하고, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성은 약 350단위/ml이었다.

옥수수전분을 농도 약 20%의 전분유(乳)로하고, 이것에 탄산칼륨 0.1% 첨가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사 제조)를 전분 g당 0.3% 첨가하여, 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 다시 약 53℃로 급냉시켜 DE 약 4의 액화용액을 얻고, 이 액화용액 88중량부에 L-아스코르빈산 12중량부를 첨가하여, pH 5.0, 53℃로 유지하면서, 이것에 상기의 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 농축액을 덱스트린 1g당 10단위와 CGTase(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조)를 덱스트린 1g당 1단위 첨가하여 36시간 반응시켰다.

반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 55℃로 조정하고, 이것에 글루코아밀라제를 덱스트린 1g당 50단위 첨가하고, 16시간 반응시켰다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 33.5% 함유하고 있으며, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 검출되지 않았다.

본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 양이온교환수지 (H⁺형)의 컬럼에 걸어 탈미네랄하고, 이어서, 음이온교환수지(OH^-형)의 컬럼에 걸어 음이온을 수지에 흡착시키고, 수세하여 D-글루코스 등을 제거한 후, 0.5규정-염산용액으로 용출, 농축하여, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 56.1% 함유하는 농축액을 얻었다.

본 농축액을 원료용액으로하여, 실시예 1의 방법에 준하여 강산성양이온교환수지를 사용한 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 96.4% 함유하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유 획분을 얻었다.

본 획분을 감압농축하여 농도 약 77%로 하고, 이것을 조정캔에 넣고 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 종정으로서 1%를 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 서냉하여 2일간에 걸쳐서 20℃까지 내리고, 다시 바스켓형 원심분리기에 걸어 1번정 결정으로서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 원료의 L-아스코르빈산에 대하여 고형물 수율 약 48%로 얻었다. 또, 모액으로서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 86.7% 함유하는 용액을 원료의 L-아스코르빈산에 대하여 고형물수율 약 26%로 회수하였다.

얻어진 모액을 활성탄으로 탈색여과하고, 농축하여 실시예 2의 방법에 준하여 강산성 양이온교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 이 용출액 의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하였다.

본 획분을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 96.3% 함유하고 있으며, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 0.1% 미만이었다.

본 획분을 실시예 1의 방법에 준하여 농축, 정출, 분밀하고, 2번정 결정으로서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 모액고형물당 수율 약 65%로 얻었다.

상기의 방법으로 얻어진 1번정 및 2번정의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 각각 건조하고, 혼합하고 분쇄하여, 순도 99% 이상의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 분말을 원료의 L-아스코르빈산에 대하여 고형물 수율 약 60%로 얻었다.

본품은 직접 환원성을 나타내지 않고, 안정성, 생리활성도 충분하고, 비타민C강화제로서 뿐만 아니라, 맛내기개선제, 산미제, 안정제, 품질개량제, 항 산화제, 생리활성제, 자외선흡수제, 의약원료, 그리고, 화학품 등으로서 음식물, 항 감수성질환제, 화장품 등에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 4

국제공개번호 WO02/10361호 명세서에 기재된 방법에 준하여 전분부분분해물

『파인덱스 #4』 4.0%(w/v), 효모추출물『아사히미스트』1.8%(w/v), 인산2칼륨 0.1%(w/v), 인산1나트륨·12수염 0.06%(w/v), 황산마그네슘·7수염 0.05%(w/v) 및 물로 이루어진 액체배지를 사용하여 바실루스·글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11주(FERM BP-7144)를 48시간 통기하에서 교반배양하고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 배양상청을 80%포화 유안(황산암모늄)액으로 염석하고, 투석한 후, 『세파비스(Sepabeads) FP-DA13』겔(미츠비시화학주식회사 제조)을 사용한 이온교환 크로마토그래피, 계속해서『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』겔 (아마샴·펄마시아·바이오테크사 제조)을 사용한 아피니티 크로마토그래피(affinity chromatography), 다시 『부틸-토요펄(Butyl-Toyopearl) 650M』겔(토소주식회사 제조)을 사용한 소수(疎水)크로마토그래피, 다시 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』겔을 사용한 아피니티 크로마토그래피를 실시하고, α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 약 2,000단위 갖는 정제효소표본품을 얻었다.

덱스트린(DE 약 6) 9중량부를 물 30중량부에 가열용해하고, 환원하에서 유지하고, L-아스코르빈산 4중량부를 첨가하여 pH 5.0, 40℃로 유지하면서, 이것에 상기의 α-이소말토실글루코 당질생성효소활성을 갖는 정제효소표본품을 덱스트린 1g당 1단위와 CGTase(주식회사 하야시바라생물화학연구소 제조)를 덱스트린 1g당 2단위 첨가하여 24시간 반응시켰다. 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 55℃로 조정하고, 이것에 글루코아밀라제를 덱스트린 1g당 50단위 첨가하여 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 가열하여 효소를 실활시켜 활성탄으로 탈색 여과하여 여과액을 얻었다.

여과액을 HPLC로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 고형물당 약 10.2% 함유하고 있으며, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산은 검출되지 않았다.

여과액을 양이온교환수지 (H⁺형)의 컬럼에 걸어 탈 미네랄하고, 이어서, 음이온교환수지(OH^-형)의 컬럼에 걸어 음이온을 수지에 흡착시키고, 수세하여 D-글루코스 등을 제거한 후, 0.5규정-염산용액으로 용출, 농축하고, 실시예 1의 방법에 준하여 강산성양이온교환수지를 사용한 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 고함유획분을 채취하여 감압농축하여 농도 약 77%로 하고, 이것을 조정캔에 넣어, 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 종정으로서 2% 첨가하여 40℃로 하고, 천천히 교반하면서 서냉하여 2일간에 걸쳐서 20℃까지 내리고, 다시 바스켓형 원심분리기에 걸어, 순도 98% 이상의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 원료의 L-아스코르빈산에 대하여 고형물 수율 약 11%로 얻었다.

본품은 직접 환원성을 보이지 않고, 안정성, 생리활성도 충분하고, 비타민C강화제로서 뿐만 아니라, 맛내기개선제, 산미제, 안정제, 품질개량제, 항 산화제, 생리활성제, 자외선흡수제, 의약원료, 화학품 등으로서 음식물, 항 감수성질환제, 화장품 등에 유리하게 이용할 수 있다.

이상, 설명한 바와같이, 본 발명은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 α-이소말토실글루코 당질생성효소를 사용하여, 또는, α-이소말토실글루코 당질생성효소와 시클로말토덱스트린·글루카 노트랜스페라제를 병용하여 L-아스코르빈산에 당전이반응시켜, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하게 하는 반응을 이용한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법에 관한 발명이다. 이와 같은 발명에 의하면 당전이물중에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 결합이성체인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이 생성되지 않거나, 또는 이들의 생성이 검출할 수 없을 정도로 적고, 당전이물로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 채취하는 공정에 있어서 이들 결합이성체의 악영향을 받는 일 없이, 유리하게 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 채취할 수가 있다.

이러한 본 발명에 의하면, 당 업계에 있어서 유용한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 공업적으로 대량, 저렴한 비용과 고수율로 제조할 수가 있다.

<110> KABUSHIKI KAISHA HAYASHIBARA SEIBUTSU KAGAKU KENKYUJO <120> PROCESS FOR PRODUCING 2-O-ALPHA-D-GLUCOPYRANOSYL-L-ASCORBIC ACID <130> PI-5K1003JP <150> JP2002-228705 <151> 2002-08-06 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Arthrobacter globiformis <400> 1 Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Arthrobacter globiformis <400> 2 His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Arthrobacter globiformis <400> 3 Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly 1 5 10

Claims

L-아스코르빈산과 α-글루코실당화합물을 함유하는 용액에 α-이소말토실글루코 당질생성효소 또는 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제(EC 2.4.1.19)를 작용시켜, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성시켜 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
제1항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질생성효소 또는 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제를 작용시킨 후, 글루코아밀라제(EC 3.2.1.3)를 작용시키는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성시킬 때에, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성하지 않거나 또는 이들의 생성이 검출할 수 없을 정도로 적은 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
제1항, 제2항, 또는 제3항에 있어서, α-글루코실당화합물이 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성 전분, 액화 전분, 호 화 전분, 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서, 생성하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산이, 반응액 고형물당 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 10w/w% 이상 함유하고, 또한, 반응액 고형물당 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 0.1w/w% 미만 함유하는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
제1항 내지 제5항에 어느 한 항에 있어서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 채취하는 공정에 있어서, 강산성양이온교환수지를 사용하고, 다시 필요에 따라서 분말화 공정 또는 결정화 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
제1항 내지 제6항에 어느 한 항에 있어서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 채취하는 공정에 있어서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 시럽상, 분말상 또는 결정상으로 채취하는 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산의 제조방법.
L-아스코르빈산과 α-글루코실당화합물을 함유하는 용액에 α-이소말토실글 루코 당질생성효소 또는 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스페라제를 작용시켜, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르빈산을 생성시키는 L-아스코르빈산에의 당전이방법.
제8항에 있어서, α-글루코실당화합물이 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성 전분, 액화 전분, 호화 전분, 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 L-아스코르빈산에의 당전이방법.