JP4043312B2 - 2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法に関し、更に詳細には、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて、又は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとを併用して糖転移反応せしめ、得られる糖転移物を含有する溶液からの2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は、特開平3−135992号公報、特開平3−139288号公報などに開示されているように、化学式1で示される化学構造を有しており、直接還元性を示さず、安定性に優れ、しかも生体内で容易に加水分解され、L−アスコルビン酸本来の生理活性を発揮するL−アスコルビン酸の糖誘導体である。
【0003】
【化1】
化学式1:
【0004】
その工業的製造方法としては、特開平3−183492号公報に開示されているように、例えば、L−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3)とを作用させて得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とともにそれ以外の夾雑物を含有する溶液を原料溶液として、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行ない、この溶出液の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取することにより、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有液を製造する方法、更に、これを濃縮して過飽和とし、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を製造する方法が開示されている。
【0005】
しかしながら、糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させて得られるL−アスコルビン酸糖誘導体は、例えば、糖転移酵素がシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)(以下、本明細書では、CGTaseと略することもある。)の場合には、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸以外に、副生成物として、その結合異性体である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸(化学式2)及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸(化学式3)が生成し、また、糖転移酵素がα−グルコシダーゼの場合には、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸以外に、6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が生成することが知られている。強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーの際、原料溶液に含まれるL−アスコルビン酸やグルコースは2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸と分子量が異なるために2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸と分離が比較的に容易であるが、一方、副生成物として生成した5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸と分子量が同一であるために2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸と分離が困難であり、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分の純度向上を妨げ、更に、過飽和溶液からの結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の析出をも阻害する。
【0006】
【化2】
化学式2:
【0007】
【化3】
化学式3:
【0008】
更に、これら結合異性体である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を分離除去した母液中に残存し、この母液からの更なる結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の析出を阻害し、2番晶、3番晶の回収量を著しく低下させる。
【0009】
5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の除去方法としては、特開平5−117290号公報に開示されているように、これら結合異性体が直接還元性を有するため酸化されやすいという特性を利用して、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とともにこれら結合異性体とを含有する溶液を酸化処理して、直接還元性を示す結合異性体だけを酸化せしめ、次いで、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なうことにより、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とL−アスコルビン酸糖誘導体の酸化物(以下、単にL−アスコルビン酸糖誘導体酸化物と略称する。)とを分離し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物を製造する方法が開示されている。
【0010】
しかしながら、上記のようにして、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とともにこれら直接還元性を示す結合異性体を含有する溶液を酸化処理するには、できるだけ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸に作用することなく、直接還元性を示す結合異性体を優先的に酸化する条件が必要で、例えば、通気攪拌などの好気的条件にさらす方法が採用され、この際、pHを弱酸性乃至アルカリ性にしたり、銅塩、鉄塩などの金属塩、水蒸気炭、塩化亜鉛炭などの活性炭など酸化促進剤を共存させたり、過酸化水素、過マンガン酸カリウムなどの酸化剤を添加するなど操作が煩雑で、また、酸化反応が不十分であれば、直接還元性を示す結合異性体が残存し、酸化反応が過度であれば、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸にまで作用が及び、結果として得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物の収率が低下することとなるため、酸化反応の工程にはその適正な反応進行を維持するための正確な制御が必要で、それに掛かる経済的労力には多大なものがあった。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法の欠点を解消するために為されたもので、結合異性体を分離する必要がなく、効率良く2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を製造することができる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法を提供するものである。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造において、その初発工程であるL−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させる工程で得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を含有する溶液中に夾雑物である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成しないか、若しくは検出されないほど生成量を少なくすることができれば、これら直接還元性を示すL−アスコルビン酸糖誘導体を酸化処理するなどの除去工程を必要とすることなく、高純度の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物を工業的規模で高収率に製造できるのではないかと考え、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ない2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成反応の確立を目指して、研究を続けてきた。
【0013】
その結果、意外にも、L−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素として、先に発明した国際公開番号WO02/10361号明細書で開示したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させることによって、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が著量生成し、しかも、夾雑物である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことを見いだした。
【0014】
更に、糖転移反応する際、該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとを併用し糖転移反応を起こさせ、次いで、グルコアミラーゼを作用させることによって、得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量は、糖転移酵素としてα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を単独で使用する場合よりも増加し、しかも、その時の5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸等の結合異性体は、糖転移酵素としてα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を単独で使用する場合と同様に生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことも判明した。
【0015】
上記のような糖転移反応によって得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を含有する糖転移反応生成物は、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーでは分離が困難であった5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸等の結合異性体を含有していないか、若しくは含有していてもその量が極めて少ないため、該クロマトグラフィーによって目的とする2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が容易に、且つ高収率で分離・精製でき、高純度の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物を工業的規模で高収率に製造できるものである。
【0016】
また、このようにして得られる高純度の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物の過飽和溶液は、結晶の析出が容易で収率も高く、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の工業的製造方法としてきわめて有利であることが判明した。
【0017】
本明細書でいう生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないとは、反応液固形物当り0.1w/w%(以下、本明細書では、特にことわらない限り、%はw/w%を意味する。)未満の生成量を意味する。また、本明細書でいう直接還元性を示すとは、L−アスコルビン酸の場合と同様に、そのままで、2,6−ジクロルフェノールインドフェノールを還元脱色することを意味する。
【0018】
また、本明細書でいうL−アスコルビン酸とは、L−アスコルビン酸のみならず、L−アスコルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などのL−アスコルビン酸塩、または、それらの混合物を意味する。
【0019】
また、同様に、本明細書でいう2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、α−グリコシル−L−アスコルビン酸などについても、特に不都合が生じない限り、遊離の酸のみならず、それらの塩をも意味する。
【0020】
以下、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素による糖転移反応方法、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとの併用による糖転移方法について、より具体的に説明する。
【0021】
本発明で用いるα−グルコシル糖化合物は、α−グルコースを有する化合物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとの併用によって、L−アスコルビン酸から2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸又は/及び2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸を生成できるものであればよく、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、グリコーゲンなどが適宜選択できる。
【0022】
反応時のL−アスコルビン酸の濃度は、通常、1%以上、望ましくは、約2乃至30%(w/v)であればよく、α−グルコシル糖化合物は、L−アスコルビン酸1重量部に対して、通常、約0.5乃至30重量部の範囲が好適である。
【0023】
本発明に用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、例えば、国際公開番号WO02/10361号明細書に記載の如く、非還元性末端の結合様式としてα−1,4グルコシド結合を有するグルコース重合度が2以上の糖質に対して、該糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元性末端の結合様式としてα−1,6グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−1,4グルコシド結合を有するグルコース重合度が3以上の糖質を生成する酵素活性を有しており、具体例としては、下記の理化学的性質を有する酵素がある。尚、前記非還元性末端の結合様式としてα−1,4グルコシド結合を有するグルコース重合度が2以上の糖質としては、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンから選ばれる1種又は2種以上の糖質を例示できる。
(1) 作用
非還元性末端の結合様式としてα−1,4グルコシド結合を有するグルコース重合度が2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元性末端の結合様式としてα−1,6グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−1,4グルコシド結合を有するグルコース重合度が3以上の糖質を生成する。
(2) 分子量
SDS−ゲル電気泳動法により、約74,000乃至160,000ダルトンの範囲内で分子量を有する。
(3)等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、pI約3.8乃至7.8の範囲内に等電点を有する。
(4) 至適温度
pH6.0、60分間反応で、約40乃至50℃の範囲内で至適温度を有する。
pH6.0、60分間反応で、1mMCa2+存在下、約45乃至55℃の範囲内に至適温度を有する。
pH8.4、60分間反応で、約60℃に至適温度を有する。または、
pH8.4、60分間反応で1mMCa2+存在下、約65℃に至適温度を有する。
(5) 至適pH
35℃、60分間反応で、pH約6.0乃至8.4の範囲内に至適pHを有する。
(6) 温度安定性
pH6.0、60分間保持する条件で、約45℃以下に温度安定域を有する。
pH6.0、60分間保持する条件で、1mMCa2+存在下、約50℃以下に温度安定域を有する。
pH8.0、60分間保持する条件で、約55℃以下に温度安定域を有する。または、
pH8.0、60分間保持する条件で、1mMCa2+存在下、約60℃以下に温度安定域を有する。
(7) pH安定性
4℃、24時間保持する条件で、pH約4.5乃至10.0の範囲内に安定pH域を有する。
(8) N末端アミノ酸配列
チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシン(配列表における配列番号1)、ヒスチジン−バリン−セリン−アラニン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−ロイシン(配列表における配列番号2)、または、アラニン−プロリン−ロイシン−グリシン−バリン−グルタミン−アルギニン−アラニン−グルタミン−フェニルアラニン−グルタミン−セリン−グリシン(配列表における配列番号3)を有する場合がある。
【0024】
本発明に用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、糖転移反応の供与体として、非還元性末端の結合様式がα−1,4グルコシド結合であるグルコース重合度が2以上の糖質を用いると、L−アスコルビン酸に糖転移し2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、及び、更にこの2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸のグルコピラノシル基にα−グルコピラノシル基が1個または2個以上転移した2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸を生成する。
【0025】
本発明に用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素としては、例えば、アルスロバクター属及びバチルス属などに属する細菌由来の酵素があり、例えば、アルスロバクター・グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)A19株(FERM BP−7590)、バチルス・グロビスポルス(Bacillus globisporus)C9株(FERM BP−7143)、バチルス・グロビスポルス(Bacillus globisporus)C11株(FERM BP−7144)、バチルス・グロビスポルス(Bacillus globisporus)N75株(FERM BP−7590)などを挙げることができる。勿論、NTGなどの化学変異誘発剤または紫外線や照射線などを用いた人為的変異を施したり、突然変異株を分離して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素高生産株などを取得し、その変異株由来の酵素も有利に利用できる。
【0026】
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のポリペプチドをコードする遺伝子DNAを化学合成したり、本来、該遺伝子DNAを保有する細胞からクローニングしたりして該遺伝子DNAを得た後、該遺伝子DNAをそのまま、若しくは1個または2個以上のDNAを他のDNAに置換したり、1個または2個以上のDNAを欠失または付加、挿入して、同種または異種の細胞に導入し発現させた、所謂、セルフクローニング体及び組換え体の由来の酵素であってもよい。
【0027】
本発明に用いるCGTaseは、例えば、バチルス(Bacillus)属、クレブシーラ(Klebsiella)属、サーモアナエロバクター(Thermoanaerobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、サーモコッカス(Thermococcus)属などに属する細菌由来の酵素が適宜選択される。また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の場合と同様に、CGTaseのポリペプチドをコードする遺伝子DNAを化学合成したり、本来、該遺伝子DNAを保有する細胞からクローニングしたりして該遺伝子DNAを得た後、該遺伝子DNAをそのまま、若しくは1個または2個以上のDNAを他のDNAに置換したり、1個または2個以上のDNAを欠失または付加、挿入して、同種または異種の細胞に導入し発現させた、所謂、セルフクローニング体及び組換え体の由来の酵素であってもよい。
【0028】
これら糖転移酵素は、必ずしも精製して使用する必要はなく、通常は、粗酵素で本発明の目的を達成することができる。必要ならば、公知の各種方法で精製して使用してもよい。
【0029】
また、使用酵素量と反応時間とは、密接な関係があり、通常は、経済性の点から約3乃至80時間で反応を終了するように酵素量が選ばれる。
【0030】
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとを併用して使用する場合、CGTaseの使用量が過剰であると、CGTaseの糖転移反応による副生成物である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量が著しく増加し、本発明の効果が発揮できなくなる。したがって、本発明に用いるCGTaseの量は、望ましくは、基質のα−グルコシル糖化合物1グラム当り約0.01乃至50単位の範囲から選択される。なお、ここでいうCGTaseの酵素活性を示す単位は、20mMの酢酸緩衝液(pH5.5)及び2mMの塩化カルシウムを含む0.3%(w/v)の澱粉溶液にCGTaseを添加し、40℃、10分間反応することで測定し、その酵素活性1単位は、15mgの溶液状澱粉のヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量とする。
【0031】
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとを別々の担体に固定化し、または、両酵素を同一の担体に固定化し、得られる固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し、または連続式で反応に利用することも有利に実施できる。
【0032】
本発明の糖転移方法は、通常、前述のL−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとを加え、該両酵素が充分作用する条件、望ましくは、pH約3乃至10、温度30乃至70℃の範囲から選ばれる反応条件にして行う。
【0033】
また、反応中にL−アスコルビン酸が酸化分解を受け易いので、できるだけ嫌気または還元状態で遮光下に維持するのが望ましく、必要ならば、チオ尿素、硫化水素などを共存させて反応させることも有利に実施できる。
【0034】
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとを併用して、L−アスコルビン酸に糖転移させると、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が生成するとともに、α−D−グルコピラノシル残基が更に1個又は2個以上付加した2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸も混在して生成する。
【0035】
以上述べたように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとの併用による糖転移反応を採用すると、L−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とから、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が生成するとともに、α−D−グルコピラノシル残基が更に1個又は2個以上付加した2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸も混在して生成するものの、工業的カラムクロマトグラフィーなどで分離困難な夾雑物である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸などL−アスコルビン酸の5位水酸基への糖転移物や6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸などL−アスコルビン酸の6位水酸基への糖転移物の副生成は無いか検出できないほど少ない。
【0036】
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとの併用による糖転移反応によって得られる生成物にグルコアミラーゼを作用させると、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸より高分子の2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸のグリコシル部分のα−1,4結合又はα−1,6結合を加水分解し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を蓄積生成させることができる。
【0037】
グルコアミラーゼの作用条件は、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸より高分子の2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸を加水分解し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を蓄積生成させることができる条件であればよく、反応pH、反応温度、作用量、作用時間など適当な条件で実施すればよい。また、担体結合法、架橋法、又は包括法などで固定化されたグルコアミラーゼを用いて連続式に、またはバッチ式にグルコアミラーゼ反応することも、反応後に膜分離などして、反応液とグルコアミラーゼとを別々に回収し、グルコアミラーゼを再利用することも有利に実施できる。
【0038】
通常、反応溶液は加熱するなどして酵素を失活させた後、またはそのまま、活性炭で脱色し、濾過して不溶物を除き、必要であれば濃縮する。得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸含有溶液は、目的とする2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とともに、夾雑物として未反応のL−アスコルビン酸、D−グルコースなど中性糖質を含有している。グルコースなどの中性糖質を、公知の方法、例えば、電気透析法、アニオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー法などで分離、除去、又は低減させてもよい。このようにして得られる2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸含有溶液を原料として、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を得る。
【0039】
強酸性カチオン樹脂は、公知の、例えば、スルホン酸基を結合したスチレン−ジビニルベンゼン架橋共重合体樹脂のNa+型、K+型などのアルカリ金属塩型、または、Ca++型、Mg++型などのアルカリ土類金属塩型、またはH+型などが適宜使用され、市販品としては、例えば、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックス 50W×8』、ローム&ハース社製造の商品名『アンバーライトCG−6000』、東京有機化学工業株式会社製造の商品名『XT−1022E』、三菱化学株式会社製造の商品名『ダイヤイオン SK104』などがある。
【0040】
原料溶液として、例えば、目的とする2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とともに、L−アスコルビン酸、D−グルコースなどの夾雑物を含有する溶液を用いる場合には、強酸性カチオン交換樹脂を充填したカラムに原料溶液を流し、次いで、水で溶出し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸・L−アスコルビン酸・D−グルコース高含有画分、L−アスコルビン酸・D−グルコース高含有画分などの順に複数の画分に分画して、この2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取することにより、容易に2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物が製造される。
【0041】
また、原料溶液をカラムに流して分画するに際し、既に得られている2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸・L−アスコルビン酸・D−グルコース高含有画分などの2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸含有画分を原料溶液の前後に、または、原料溶液とともに流すことにより、分画に要する水の使用量を減少させ、原料溶液から2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物を高濃度、高収率で採取することも有利に実施できる。本発明で使用される分画方式は固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれであってもよい。
【0042】
このようにして得られる本発明の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物、望ましくは、純度70%以上の高含有物は、溶液状であっても、また濃縮してシラップ状であっても、安定であり、その取り扱いは容易である。通常、更に濃縮して、過飽和溶液とし、結晶化して、さらに安定化した結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を製造する。本発明で使用する晶出用2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物は、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の析出を阻害する直接還元性を示す結合異性体を、初発の糖転移反応段階で実質的に含有していないので、その結晶の析出は、きわめて容易であり、結晶収率も高い。晶出方法は、通常、20乃至60℃の過飽和2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸溶液を助晶缶にとり、これに種結晶を望ましくは、0.1乃至2%共存せしめて、ゆっくり攪拌しつつ徐冷し、晶出を促してマスキットにすればよい。
【0043】
このように、本発明の結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は、過飽和2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸溶液に結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を種晶として加えることにより容易に晶出させることができる。
【0044】
晶出したマスキットから結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸粉末を製造する方法としては、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸粉末を採取できる方法を適宜選択すればよく、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などが挙げられる。
【0045】
このようにして得られる結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は、その純度、晶出率によって多少変動するものの、実質的に非吸湿性または、難吸湿性であり、その結晶粉末は流動性であり、固着の懸念もなく、その優れた特長は、次の通りである。
(1)直接還元性を示さず、きわめて安定である。
L−アスコルビン酸とは違って、メイラード反応を起こしにくい。従って、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生理活性物質などが共存しても無用の反応を起こさず、むしろ、これらの物質を安定化する。
(2)加水分解を受けてL−アスコルビン酸を生成し、L−アスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示す。
(3)体内の酵素により、L−アスコルビン酸とD−グルコースとに容易に加水分解され、L−アスコルビン酸本来の生理活性を示す。
また、ビタミンE、ビタミンPなどとの併用により、その生理活性を増強することができる。
(4)L−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを経口摂取することにより、生体内で生成され、代謝される物質であることから、その安全性は極めて高い。
(5)実質的に、非吸湿性、難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビタミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューインガム、即席ジュース、即席調味料などの飲食物のビタミンC強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などとして有利に利用できる。
(6)実質的に非吸湿性または難吸湿性であり、固結しないことからその粉末は流動性であり、その取り扱いは容易で非晶質の場合と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的経費が大幅に削減できる。
【0046】
次に実験により本発明のL−アスコルビン酸への糖転移方法をさらに具体的に説明する。
【0047】
【実験1】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産〉
澱粉部分分解物『パインデックス#4』4.0%(w/v)、酵母抽出物『アサヒミースト』1.8%(w/v)、リン酸二カリウム0.1%(w/v)、リン酸一ナトリウム・12水塩0.06%(w/v)、硫酸マグネシウム・7水塩0.05%(w/v)、及び水からなる液体培地を、500ml容三角フラスコに100mlずつ入れ、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミスA19株(FERM BP−7590)を接種し、27℃、230rpmで48時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量30Lのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約20L入れて、加熱滅菌、冷却して温度27℃とした後、種培養液1%(v/v)を接種し、温度27℃、pH6.0乃至9.0に保ちつつ、48時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約1.1単位/mlであった。この培養物を遠心分離(10,000rpm、30分間)して回収した上清約18Lの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約1.06単位/ml(総活性約19,100単位)であった。
【0048】
尚、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定は、次のようにして測定する。
マルトトリオースを濃度2w/v%となるよう100mMグリシン−NaOH緩衝液(pH8.4)に溶解させ基質液とし、その基質液0.5mlに酵素液0.5ml加えて、40℃で60分間酵素反応し、その反応液を10分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース含量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性1単位は、上記の条件下で1分間に1μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。尚、HPLCは、『Shodex KS−801カラム』(昭和電工株式会社製造)を用い、カラム温度60℃、溶離液として水を用いて流速0.5ml/minの条件で行い、検出は示差屈折計『RI−8012』(東ソー株式会社製造)を用いて行なった。
【0049】
【実験2】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製〉
実験1の方法で得た培養上清約18Lを80%飽和硫安液で塩析して4℃、24時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離(10,000rpm、30分間)して回収し10mMトリス・塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約850mlを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約8,210単位含んでいた。この粗酵素液を『DEAE−トヨパール(Toyopearl)650S』ゲル(東ソー株式会社製造)を用いたイオン交換クロマトグラフィー(ゲル量380ml)に供した。酵素活性成分は、『DEAE−トヨパール(Toyopearl)650S』ゲルには吸着し、NaCl濃度0Mから1Mのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、NaClのリニアグラジエントでその濃度が約0.2M付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分を回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を回収した。
【0050】
得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を1M硫安を含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル(Sephacryl) HR S−200』ゲル(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造)を用いたアフィニティークロマトグラフィー(ゲル量500ml)に供した。酵素活性成分は、『セファクリル(Sephacryl HR S−200』ゲルに吸着し、硫安1Mから0Mに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジエント濃度が約0.2M付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表1に示す。
【0051】
【表1】
【0052】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を7.5%(w/v)濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。
【0053】
【実験3】
<α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の諸性質>
【0054】
【実験3−1】
<分子量>
実験2の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ゲル濃度7.5w/v%)に供し、同時に泳動した分子量マーカー(日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製造)と比較して当該酵素の分子量を測定した。当該酵素の分子量は約94,000±20,000ダルトンであった。
【0055】
【実験3−2】
<等電点>
実験2の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、2w/v%アンフォライン(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造)含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、電気泳動後の蛋白バンド及びゲルのpHを測定して当該酵素ポリペプチドの等電点を求めた。その結果、当該酵素の等電点はpI約4.3±0.5であった。
【0056】
【実験3−3】
<作用温度及びpH>
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性に及ぼす温度とpHの影響について、各種温度、pH条件下、実験1に記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定法に準じて調べた。その結果、至適温度は、pH8.4、60分間反応で、約60℃(Ca2+非存在)又は約65℃(1mMCa2+存在)で、その至適pHは、35℃、60分間反応で約8.4であった。
【0057】
【実験3−4】
<安定性>
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性は、当該酵素含有溶液(20mMグリシン−NaOH緩衝液、pH8.0)をCa2+非存在下または1mMCa2+存在下で各温度に60分間保持し、水冷した後、残存するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定することにより求めた。又、pH安定性は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を各pHの50mM緩衝液中で4℃、24時間保持した後、pHを8.0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。その結果、温度安定性は約55℃まで(Ca2+非存在)又は約60℃まで(1mMCa2+存在)で、pH安定性は約5.0乃至9.0であった。
【0058】
【実験3−5】
<N末端アミノ酸配列>
実験2の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素について、そのN末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル473A』(アプライドバイオシステムズ社製造)を用いて分析したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は配列表に於ける配列番号3に示すアミノ酸配列を有することが判明した。
【0059】
以上、アルスロバクター・グロビホルミスA19株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製方法及びその性質を示したが、本発明においては、他の菌株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素であっても用いることができる。
【0060】
【実験4】
〈L−アスコルビン酸への糖転移試験〉
以下に示す各種糖質が、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いる糖転移反応における糖供与体となり、L−アスコルビン酸へ糖転移するかどうかを試験した。すなわち、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシド、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、プルラン、デキストランを含む溶液を調製した。それぞれ溶液にL−アスコルビン酸を加えて、糖質濃度及びL−アスコルビン酸濃度を2w/v%に調整した。これらの溶液に、実験2の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖質固形物1グラム当たりそれぞれ3単位ずつ加え、基質濃度を1.6w/v%になるように調整し、これらを40℃、pH6.0で20時間作用させた。酵素反応後の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成を調べるため、シリカゲル薄層クロマトグラフィー(以下、TLCと略す。)を行なった。展開溶媒としてn−ブタノール、ピリジン、水混液(容量比6:4:1)、薄層プレートとしてメルク社製造『キーゼルゲル60F254』(アルミプレート、20×20cm)を用い1回展開した後、紫外線を薄層プレートに照射してアスコルビン酸及び2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸検出し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成の有無を確認した。結果を表2に示す。
【0061】
【表2】
【0062】
表2の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した各種糖質の内、グルコース重合度が3以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質を糖供与体として、L−アスコルビン酸に糖転移し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成することが判明した。又、グルコース重合度が2の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも作用し2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成することが判明した。
【0063】
【実験5】
〈L−アスコルビン酸への糖転移生成物〉
L−アスコルビン酸を濃度5w/v%、マルトペンタオースを濃度5w/v%、及び1mMの塩化カルシウムを含む水溶液をpH5.0に調整し、これに実験2の方法で調製した精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトペンタオース1g当たり10単位になるように加えて50℃で24時間反応させ、その反応液を10分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液の一部分を採り、それにグルコアミラーゼ(生化学工業株式会社製造)をマルトペンタオース1g当たり40単位加え、40℃で16時間作用させた後、10分間煮沸して反応を停止させた。これら反応液中のL−アスコルビン酸への糖転移生成物及び残存するL−アスコルビン酸を、以下の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法で分離し測定した。『Wakopak WB−T−330カラム』(和光純薬工業株式会社製造)を用い、カラム温度25℃、溶離液として70ppm硝酸水溶液の流速0.5ml/minの条件で行い、検出は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸への糖転移物を分光光度計『UV−8020』(東ソー株式会社製造)を用いて波長238nm吸収で測定するとともに、アスコルビン酸及びアスコルビン酸への糖転移物を含めた全組成を示差屈折計『RI−8020』(東ソー株式会社製造)を用いて測定することで行ない、アスコルビン酸及びアスコルビン酸への糖転移物の反応液固形物当りの生成量(以下、本明細書では、特に断らない限り、生成量は反応液固形物当りの生成量を意味する。)を求めた。それらの結果を表3に示す。
【0064】
【表3】
【0065】
表3の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるL−アスコルビン酸への糖転移生成物として、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が約18.7%生成するとともに、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とは異なる転移生成物が約0.4%生成することがわかった。また、この反応液にグルコアミラーゼを作用させると、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とは異なる転移生成物は消失し、その消失とともに2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸量が増加し、L−アスコルビン酸への糖転移生成物として、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸のみが生成することが判明した。グルコアミラーゼの作用特性を考慮すると、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸とは異なる転移生成物は、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸にα−D−グルコピラノシル残基が更に1個又は2個以上付加した2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸であり、グルコアミラーゼ作用の結果、この2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸の1個又は2個以上付加したα−D−グルコピラノシル残基が加水分解され、2−O−α−グリコシル−L−アスコルビン酸が2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸に変換されたと判断される。
【0066】
【実験6】
〈2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成の作用温度及びpH〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成活性に及ぼす温度とpHの影響について、各種温度、pH条件下で調べた。2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成活性測定は、次のようにして測定した。
(1)温度の影響については、L−アスコルビン酸を濃度0.5w/v%、マルトペンタオースを濃度0.5w/v%、及び塩化カルシウムを濃度1mMとなるように100mM酢酸緩衝液(pH5.0)に溶解させ基質液とし、その基質液2mlに酵素液0.2ml加えて、30乃至65℃で30分間酵素反応し、その反応液を10分間煮沸して反応を停止させた。その反応液中に生成した2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸量は、実験5に記載のHPLC法により分離し測定することによって行った。
(2)pHの影響については、L−アスコルビン酸を濃度0.5w/v%、マルトペンタオースを濃度0.5w/v%、及び塩化カルシウムを濃度1mMとなるように100mMの各種緩衝液に溶解させ基質液とした。緩衝液の種類は、pH4.1乃至6.4の範囲では酢酸緩衝液を用い、pH6.7乃至7.5の範囲ではリン酸緩衝液を用い、pH7.6乃至8.5の範囲ではトリス・塩酸緩衝液を用いた。その基質液2mlに酵素液0.2ml加えて、40℃で30分間酵素反応し、その反応液を10分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に生成した2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸量をHPLC法で定量することによって行った。それらの結果を図1(温度の影響)及び図2(pHの影響)に示した。
【0067】
図1から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成活性の至適温度は、pH5.0、30分間反応で、約55乃至60℃であった。また、図2から明らかなように、その至適pHは、40℃、30分間反応で約5.5であった。
【0068】
【実験7】
〈2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成〉
L−アスコルビン酸を5%、澱粉部分分解物(商品名『パインデックス#1』、松谷化学株式会社製造)を5%及び1mMの塩化カルシウムを含む水溶液をpH5.0に調整し、これに実験2の方法で調製した精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉部分分解物1g当たり5乃至20単位になるように加えて50℃で48時間反応させた。これら反応液を約100℃で10分間加熱し、酵素を失活させた後、40℃に冷却し、グルコアミラーゼ(生化学工業株式会社製造)を澱粉部分分解物1g当たり40単位加え、40℃で16時間作用させた。これら反応液を実験5に記載のHPLC法に供し、標準品として、市販の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸(株式会社林原生物化学研究所製造)、特許第3134235号明細書に記載の方法で調製した5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を用いて、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、及び5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を分離し、それぞれの生成量を測定し、基質固形物当りの生成率を求めた。対照として、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の代わりに、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のCGTase(株式会社林原生物化学研究所製造)を澱粉部分分解物1g当り300単位用いた以外、同じ操作を行い、同様に、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、及び5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量を調べた。それらの結果を表4に示す。
【0069】
【表4】
【0070】
表4の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、アスコルビン酸への転移物として2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸のみを生成し、他の5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は生成されなかった。一方、対照のCGTaseは、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とほぼ同じの2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成量であったが、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量は、それぞれ、0.8%、0.3%であった。
【0071】
以上の結果から、CGTaseのアスコルビン酸への糖転移は、アスコルビン酸の2位水酸基だけでなく、5位及び6位水酸基にも転移し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成するとともに、副生成物として5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成するのに対して、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のアスコルビン酸への糖転移は、アスコルビン酸の2位水酸基のみに反応し、特異的に2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成することが判明した。
【0072】
【実験8】
〈CGTaseとの併用試験〉
L−アスコルビン酸を9%、澱粉部分分解物(商品名『パインデックス#100』、松谷化学株式会社製造)を21%及び1mMの塩化カルシウムを含む水溶液をpH5.0に調整し、これに実験2の方法で調製した精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉部分分解物1g当たり10単位、CGTase(株式会社林原生物化学研究所製造)を1乃至100単位になるように加えて50℃で24時間反応させた。これら反応液を約100℃で10分間加熱し、酵素を失活させた後、40℃に冷却し、グルコアミラーゼ(生化学工業株式会社製造)を澱粉部分分解物1g当たり40単位加え、40℃で16時間作用させた。これら反応液を実験5に記載のHPLC法に供し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、及び5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸、6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量を測定し、基質固形物当りの生成量を求めた。併せて、精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独及び対照として、CGTase単独で転移反応を行い同様に操作した。それらの結果を表5に示す。
【0073】
【表5】
【0074】
表5の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独の場合は、上記の実験7の結果と同様に、アスコルビン酸への転移物として2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸のみを約25%生成量で生成し、他の5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成は検出されなかった。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とCGTaseとを併用した場合は、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成が増加し、約29乃至31%の生成量で、併用するCGTaseの使用量が1乃至2単位/gでは5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成は検出されず、併用するCGTaseの使用量が5乃至10単位/gでは5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成が約0.1%の生成量で検出され、併用するCGTaseの使用量が100単位/gでは5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成が、それぞれ0.8%及び0.1%の生成量で検出された。対照のCGTase単独の場合、その使用量が1乃至2単位/gでは、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成は検出されないものの、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量は約4乃至5%と少量で、また、CGTase単独の使用量が5単位/g以上の場合では、その使用量の増加とともに2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成量が約8%から約30%に上昇するものの、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び/又は6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が生成することがわかった。
【0075】
以上の結果から、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び/又は6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成が無いか若しくは検出できない使用量のCGTaseを、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と併用することによって、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成率をα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独使用の場合より増加させ、且つ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独使用の場合と同様に、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び/又は6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の生成が無いか若しくは検出できないほどの極微量にできることが判明した。
【0076】
以下、本発明の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有物の製造方法についての実施例を述べる。
【0077】
【実施例1】
デキストリン(DE約6)9重量部を水28重量部に加熱溶解し、還元下に保って、L−アスコルビン酸3重量部を加え、pH5.0、50℃に維持しつつ、これに実験2の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品をデキストリン1グラム当り8単位加えて42時間反応させた。次に、反応液を加熱して酵素を失活させた後、55℃に調整し、これにグルコアミラーゼをデキストリン1g当り50単位加えて、16時間反応させた。
【0078】
反応液をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約24.9%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は検出されなかった。さらに、本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H+型)のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、アニオン交換樹脂(OH−型)のカラムにかけアニオンを樹脂に吸着させ、水洗してD−グルコースなどを除去後、0.5規定―塩酸溶液で溶出、濃縮した。
【0079】
濃縮液をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約52.5%、L−アスコルビン酸を固形物当り約39%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は0.1%未満であった。本濃縮液を原料溶液として、強酸性カチオン交換樹脂(ローム&ハース社製造、商品名『アンバーライトCG−6000』、H+型)を充填したカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取した。
【0080】
本画分をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約93.6%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は0.1%未満であった。本画分を減圧濃縮して濃度約77%とし、これを助晶缶にとり、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を種晶として2%加えて40℃とし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して2日間を要して20℃まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、結晶−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を原料のL−アスコルビン酸に対して収率約46%で得た。また、母液として、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約82.3%含有する溶液を原料のL−アスコルビン酸に対して固形物収率約28%で回収した。
【0081】
本結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミンC強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【0082】
【実施例2】
実施例1の方法で回収した母液を濃縮後、実施例2の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取した。本画分をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約93.0%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は0.1%未満であった。さらに、本画分を、実施例1の方法に準じて、濃縮、晶出、分蜜し、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を母液固形物当り収率約63%で得た。
【0083】
本品は、実施例1の場合と同様に、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【0084】
【実施例3】
アルスロバクター・グロビホルミスA19株(FERM BP−7590)を常法に従って、変異剤としてニトロソグアニジンを用いて変異させ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素高生産且つα−イソマルトシル転移酵素非生産株を取得した。この変異株を、実験1の方法に準じて、澱粉部分分解物『パインデックス#4』4.0%(w/v)、酵母抽出物『アサヒミースト』1.8%(w/v)、リン酸二カリウム0.1%(w/v)、リン酸一ナトリウム・12水塩0.06%(w/v)、硫酸マグネシウム・7水塩0.05%(w/v)、及び水からなる液体培地で72時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約14単位/mlで、α‐イソマルトシル転移酵素活性は検出されなかった。得られた培養液を、常法に従って、SF膜で除菌し、UF膜で濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する濃縮液を得た。得られた濃縮液の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約350単位/mlであった。
【0085】
とうもろこし澱粉を濃度約20%の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム0.1%加え、pH6.5に調整し、α−アミラーゼ(商品名『ターマミール60L』、ノボ社製造)を澱粉グラム当たり0.3%加え、95℃で15分間反応させ、次いで120℃に20分間オートクレーブし、更に約53℃に急冷してDE約4の液化溶液を得、この液化溶液88重量部にL−アスコルビン酸12重量部を加え、pH5.0、53℃に維持しつつ、これに上記のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する濃縮液をデキストリン1グラム当り10単位とCGTase(株式会社林原生物化学研究所製造)をデキストリン1グラム当り1単位加えて36時間反応させた。
【0086】
反応液を加熱して酵素を失活させた後、55℃に調整し、これにグルコアミラーゼをデキストリン1g当り50単位加えて、16時間反応させた。反応液をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約33.5%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は検出されなかった。
【0087】
本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H+型)のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、アニオン交換樹脂(OH−型)のカラムにかけアニオンを樹脂に吸着させ、水洗してD−グルコースなどを除去後、0.5規定―塩酸溶液で溶出、濃縮し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約56.1%含有する濃縮液を得た。
【0088】
本濃縮液を原料溶液として、実施例1の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取し、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約96.4%含有する2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を得た。
【0089】
本画分を減圧濃縮して濃度約77%とし、これを助晶缶にとり、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を種晶として1%加えて40℃とし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して2日間を要して20℃まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、1番晶結晶として2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を原料のL−アスコルビン酸に対して固形物収率約48%で得た。また、母液として、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約86.7%含有する溶液を原料のL−アスコルビン酸に対して固形物収率約26%で回収した。
【0090】
得られた母液を、活性炭で脱色濾過し、濃縮して、実施例2の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取した。
【0091】
本画分をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約96.3%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は0.1%未満であった。
【0092】
本画分を、実施例1の方法に準じて、濃縮、晶出、分蜜し、2番晶結晶として2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を母液固形物当り収率約65%で得た。
【0093】
上記の方法で得られた1番晶及び2番晶の結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸をそれぞれ乾燥し、混合して粉砕して、純度99%以上の結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸粉末を原料のL−アスコルビン酸に対して固形物収率約60%で得た。
【0094】
本品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミンC強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【0095】
【実施例4】
国際公開番号WO02/10361号明細書に記載の方法に準じて、澱粉部分分解物『パインデックス#4』4.0%(w/v)、酵母抽出物『アサヒミースト』1.8%(w/v)、リン酸二カリウム0.1%(w/v)、リン酸一ナトリウム・12水塩0.06%(w/v)、硫酸マグネシウム・7水塩0.05%(w/v)、及び水からなる液体培地を用いて、バチルス・グロビスポルス C11株(FERM BP−7144)を48時間通気攪拌培養し、遠心分離(10,000rpm、30分間)して回収した培養上清を80%飽和硫安液で塩析し、透析した後、『セファビーズ(Sepabeads)FP−DA13』ゲル(三菱化学株式会社製造)を用いたイオン交換クロマトグラフィー、続いて、『セファクリル(Sephacryl) HR S−200』ゲル(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造を用いたアフィニティークロマトグラフィー、更に『ブチル−トヨパール(Butyl−Toyopearl)650M』ゲル(東ソー株式会社製造)を用いた疎水クロマトグラフィー、再度『セファクリル(Sephacryl) HR S−200』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約2,000単位有する精製酵素標品を得た。
【0096】
デキストリン(DE約6)6重量部を水30重量部に加熱溶解し、還元下に保って、L−アスコルビン酸4重量部を加え、pH5.0、40℃に維持しつつ、これに上記のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する精製酵素標品をデキストリン1グラム当り1単位とCGTase(株式会社林原生物化学研究所製造)をデキストリン1グラム当り2単位加えて24時間反応させた。反応液を加熱して酵素を失活させた後、55℃に調整し、これにグルコアミラーゼをデキストリン1g当り50単位加えて、16時間反応させた。この反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液を得た
【0097】
濾液をHPLCで分析したところ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を固形物当り約10.2%含有しており、5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸は検出されなかった。
【0098】
濾液をカチオン交換樹脂(H+型)のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、アニオン交換樹脂(OH−型)のカラムにかけアニオンを樹脂に吸着させ、水洗してD−グルコースなどを除去後、0.5規定―塩酸溶液で溶出、濃縮し、実施例1の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸高含有画分を採取し、減圧濃縮して濃度約77%とし、これを助晶缶にとり、結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を種晶として2%加えて40℃とし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して2日間を要して20℃まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、純度98%以上の結晶2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を原料のL−アスコルビン酸に対して固形物収率約11%で得た。
【0099】
本品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミンC強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【0100】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法に関し、より詳細には、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて、又は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとを併用して、L−アスコルビン酸に糖転移反応させ、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を生成せしめる反応を利用した2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法に関する発明である。斯かる本発明によれば、糖転移物中には、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の結合異性体である5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸が生成してないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少なく、糖転移物から2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を採取する工程において、これら結合異性体の悪影響を受けることなく有利に2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を採取することができる。斯かる本発明によれば、斯界に於いて有用な2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】アルスロバクター・グロビホルミスA19由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図2】アルスロバクター・グロビホルミスA19由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸生成活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
Claims (5)
- L−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素またはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)とを作用させ、固形物当り2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を10w/w%以上含有し、且つ、固形物当り5−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸及び6−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を0.1w/w%未満含有する2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸含有溶液液とし、この2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸含有溶液液から2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を採取することを特徴とする2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法。
- α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素又はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとを作用させた後に、グルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3)を作用させることを特徴とする請求項1記載の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法。
- α−グルコシル糖化合物が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる1種又は2種以上の糖質である請求項1又は2に記載の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法。
- 2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を採取する工程に於いて、強酸性カチオン交換樹脂を用い、更に、必要に応じて、粉末化工程又は結晶化工程を含むことを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法。
- 2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸を採取する工程に於いて、2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸をシラップ状、粉末状又は結晶状で採取することを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の2−O−α−D−グルコピラノシル−L−アスコルビン酸の製造方法。
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