WO2009101762A1 - 安定型トランスグルタミナーゼ及びその製造法 - Google Patents

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Masamichi Okada
Yoshiaki Kurono
Hitoshi Amano
Shotaro Yamaguchi
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Amano Enzyme Inc.
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    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Definitions

  • the present invention relates to transglutaminase. Specifically, the present invention relates to a stable transglutaminase excellent in oxidation stability and temperature stability.
  • Transglutaminase is an enzyme that catalyzes the acyl transfer reaction of the ⁇ -carboxylamido group of a glutamine residue in a peptide chain.
  • ⁇ -amino group of a lysine residue in a protein acts as an acyl acceptor
  • An ⁇ - ( ⁇ -Gln) -Lys crosslink is formed within or between molecules.
  • transglutaminase see Patent Document 1 using a microbial enzyme derived from the genus Streptomyces is used for meat binding, sausage, tofu. , Used in the manufacture of bread and noodles.
  • Transglutaminase is a thiol enzyme that uses cysteine, which is converted into a mature form via a pro form during fermentation, as an active central residue, so it is not stable and suppresses inactivation during the manufacturing process or during product storage. It was necessary to add a stabilizer.
  • As a method for improving the stability during storage of transglutaminase it has been proposed to add organic acids, inorganic acids, polyphenols, thiols, sugar alcohols, etc. (Patent Document 1).
  • a method for improving stability by adding protein (such as wheat protein or soybean protein) or a partial hydrolyzate of protein has been developed (Patent Document 2).
  • the technique which stabilizes using trehalose was also developed (patent document 3). JP-A-4-207194 Japanese Patent No. 3655103 JP 2004-305010 A
  • an object of the present invention is to provide a transglutaminase excellent in stability, a production method thereof, and a use thereof.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems. As a result, the presence of a transglutaminase intermediate was observed in the culture solution of the transglutaminase producing bacterium, and it was successfully recovered. As a result of further investigation, it was revealed that the recovered intermediate was obtained by binding the prosequence peptide to mature transglutaminase (mature TGase). On the other hand, as a result of evaluating the stability of the intermediate, it was found that all of pH stability, temperature stability, oxidation stability, and storage stability surpass that of mature TGase. The present invention has been completed based on the above findings, and is as follows.
  • [10] One or more stability selected from the group consisting of pH stability, temperature stability, oxidative stability, and storage stability, compared to mature transglutaminase to which no transglutaminase prosequence peptide is bound The stable transglutaminase according to any one of [1] to [9], which is high.
  • An enzyme preparation comprising the stable transglutaminase according to any one of [1] to [10].
  • [12] culturing a microorganism capable of producing transglutaminase under conditions for producing transglutaminase; Separating and recovering mature transglutaminase bound to the prosequence peptide from the culture medium;
  • a process for producing a stable transglutaminase comprising: [13] The method for producing a stable transglutaminase according to [12], wherein the microorganism is a Streptomyces microorganism. [14] The method for producing a stable transglutaminase according to [12], wherein the microorganism is Streptomyces mobaraensis.
  • the horizontal axis represents pH, and the vertical axis represents residual activity (%).
  • the horizontal axis is the treatment time (minutes), and the vertical axis is the residual activity (%).
  • the horizontal axis is the hydrogen peroxide concentration (%), and the vertical axis is the residual activity (%).
  • the horizontal axis is the storage period (months), and the vertical axis is the residual activity (%).
  • the horizontal axis is the treatment time (minutes), and the vertical axis is the residual activity (%).
  • the horizontal axis is the hydrogen peroxide concentration (%), and the vertical axis is the residual activity (%).
  • the horizontal axis is the treatment time (minutes), and the vertical axis is the residual activity (%).
  • the stable transglutaminase (stable TGase) of the present invention has a structure in which a transglutaminase pro-sequence peptide is bound to a mature TGase. That is, the essential constituent elements are a transglutaminase pro-sequence peptide and mature TGase, and these elements are combined. Due to this feature, the stable TGase of the present invention exhibits higher stability than the mature TGase.
  • the term “stability” is used as a comprehensive expression of pH stability, temperature stability, oxidation stability, and storage stability.
  • the stable TGase of the present invention is superior to the mature TGase with respect to one or more stability selected from the group consisting of pH stability, temperature stability, oxidation stability and storage stability.
  • the stable TGase of the preferred embodiment is superior to the mature TGase in terms of pH stability, temperature stability, oxidation stability, and storage stability.
  • transglutaminase which is a secreted protein
  • transglutaminase which is a secreted protein
  • prepro-type transglutaminase in which a signal sequence (pre-sequence) and a pro-sequence are linked
  • the signal sequence is cleaved and converted to pro-type transglutaminase.
  • the sequence is cleaved to become mature transglutaminase (mature TGase).
  • mature transglutaminase mature transglutaminase
  • the stable TGase of the present invention is typically obtained as an intermediate produced in the above process, but has a structure in which a prosequence peptide is bound to mature TGase and is more stable than mature TGase.
  • the manufacturing method acquisition method
  • a product obtained by separately preparing a prosequence peptide and a mature TGase and combining them corresponds to the stable TGase of the present invention as long as an improvement in stability is observed.
  • prosequence peptide refers to a part or all of a peptide constituting a prosequence (ie, a sequence existing between a presequence and a mature protein sequence). Three examples of prosequence peptides are shown below.
  • pro-sequence peptide 1 PNG consisting of the sequence of DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAA (SEQ ID NO: 1)
  • pro-sequence peptide Peptide consisting of the sequence of DNGAGEETKYAETYRTLTVD VINANALNESAPAAS (SEQ ID NO: 2)
  • pro-sequence peptide 3 LNADGET Peptide consisting of sequence
  • the origin (origin) of the prosequence peptide is not particularly limited.
  • the prosequence peptide is derived from a microorganism.
  • the “microorganism-derived prosequence peptide” includes, in addition to the prosequence peptide of transglutaminase produced by microorganisms such as Streptomyces (see, for example, JP-A No. 64-27471), the prosequence peptide (that is, the microorganism A peptide having the same amino acid sequence as the transglutaminase pro-sequence produced by the plant is partially or full-length.
  • amino acid sequence of the full length pro-sequence of transglutaminase produced by a microorganism are shown in SEQ ID NO: 4 (Streptomyces mobaraensis) and SEQ ID NO: 5 (Streptomyces cinnamoneus).
  • the origin (origin) of mature TGase which is one of the components of stable TGase of the present invention, is not particularly limited.
  • mature TGase produced by microorganisms such as Streptomyces (see, for example, JP-A No. 64-27471), mature TGase produced by a mammal (see, for example, JP-B-1-50382), Recombinant (recombinant) mature TGase (eg, Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 5-199883 and 2004-97099) obtained by using recombinant DNA technology can be used.
  • the mature TGase is derived from a microorganism.
  • the “mature TGase derived from microorganisms” includes natural mature TGase produced by microorganisms such as Streptomyces (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-27471), as well as transglutaminase genes produced by microorganisms. Recombinant mature TGase obtained by culturing a transformant introduced with. Examples of amino acid sequences of mature TGase derived from microorganisms are shown in SEQ ID NO: 6 (Streptomyces mobaraensis) and SEQ ID NO: 7 (Streptomyces cinnamoneus).
  • the microorganism from which the prosequence peptide and / or mature TGase is derived is preferably a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • Streptomyces mobaraensis Streptomyces mobaraensis (Streptomyces) mobaraensis) (formerly Streptobercilium mobaraens) No. 140226 strain (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-73628), Streptomyces lavendulae (Streptomyces) lavendulae) no. 466 (see Japanese Patent No. 2849773, Patent Document 1), Streptomyces sp. sp. ) No.
  • recombinant DNA technology that is, when a genetically modified bacterium is used
  • the origin of the prosequence peptide and the origin of the mature TGase are the same.
  • a stable TGase in such a form is typically obtained as an intermediate by culturing a transglutaminase-producing bacterium (a bacterium that originally has a production ability or a recombinant bacterium into which a transglutaminase gene has been introduced). It is done.
  • a transglutaminase-producing bacterium a bacterium that originally has a production ability or a recombinant bacterium into which a transglutaminase gene has been introduced.
  • a microorganism belonging to the genus Streptomyces for example, Streptomyces mobaraensis No. 140226) having the ability to produce transglutaminase is prepared and cultured under conditions for producing transglutaminase.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as it is possible to produce transglutaminase. Specific examples of the culture conditions are shown in Examples described later. A person skilled in the art can appropriately change the culture conditions as necessary.
  • Medium includes carbon sources such as starch, sucrose, lactose, glycerol, glucose, nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate Commonly used medium raw materials such as trace metal salts such as magnesium sulfate, manganese sulfate, and calcium carbonate can be used. Moreover, in order to suppress foaming, addition of an antifoamer can also be performed as needed.
  • the culture temperature is generally 25 ° C to 35 ° C. Further, culture may be performed using various fermentation vessels, and aeration and agitation are usually performed for 2 to 6 days.
  • the culture time may generally become longer.
  • the medium pH is also controlled as necessary.
  • the removal of cells and the like from the fermentation mixture after completion of the culture is performed by filtration or centrifugation.
  • the filtration is preferably pressure filtration with diatomaceous earth added, and is preferably carried out at room temperature or lower.
  • the obtained filtrate that is, the crude transglutaminase enzyme solution is cooled as necessary.
  • transglutaminase is known to be produced as a precursor, and a fermentation mixture or peptidase is used for a certain period of time for conversion to stable TGase. These enzymes may be added for treatment.
  • transglutaminase since transglutaminase is known to exist in part as an oxidized form having no enzyme activity, it is desirable to add cysteine, glutathione, or a substance containing them to convert to an active form.
  • these activation operations are not limited to the stage of the purification process, but are preferably performed at an early stage of purification.
  • the crude enzyme solution is concentrated.
  • the concentration method is not particularly limited, it is preferable to use ultrafiltration capable of simultaneous concentration and purification. Concentration can usually be performed up to about 10 to 100 times. However, the degree of concentration is not particularly limited as long as the next step is concentrated to a possible concentration.
  • an ultrafiltration membrane such as ACP-13000 manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd. having an average pore diameter of 13,000 or less.
  • ACP-13000 manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd. having an average pore diameter of 13,000 or less.
  • Precipitation may occur during desalting and concentration, but it can be dissolved by adding an appropriate buffer or salt solution.
  • the temperature at the time of concentration is not particularly limited, but is preferably 10 ° C to 30 ° C. Concentration can be carried out more efficiently as the temperature is higher, but there is a risk of deactivation.
  • the concentrated solution contains target stable TGase (mature TGase with a prosequence peptide bound) and mature TGase. Therefore, the target stable TGase is recovered from the concentrate.
  • the concentrated solution is partially purified by pretreatment using ethanol, polyethylene glycol or the like.
  • the precipitate recovered by this pretreatment is dissolved in an appropriate buffer and then subjected to dialysis.
  • salt such as ammonium sulfate or sodium chloride is added for salting out. This precipitates mature TGase.
  • the stable TGase in the supernatant is separated and purified using salting out, column chromatography, centrifugation, or the like. Desalination, concentration, etc. are performed as necessary.
  • Enzyme preparations can be constructed using stable TGase.
  • the shape of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited and is, for example, powder, granule, liquid, capsule or the like.
  • the enzyme preparation of the present invention contains stable TGase as an essential active ingredient. Other components are optional.
  • the components that can be contained in the enzyme preparation of the present invention include food excipients, various proteins, various protein degradation products, various extracts, various salts, various antioxidants, cysteine, glutathione, sodium glutamate, sodium inosinate, Examples thereof include sodium guanylate, calcined shell calcium, and silicon dioxide.
  • excipients for food include dextrin, branched dextrin, cyclodextrin, glucose, lactose, sucrose, trehalose, maltitol, mannitol, sorbitol, polysaccharide, starch (potato starch and corn starch), indigestible dextrin, These are gums, emulsifiers (sucrose fatty acid ester, lecithin, etc.), pectin and fats and oils.
  • proteins are soy protein, wheat protein, corn protein, milk protein, animal-derived protein and the like.
  • extracts are meat extract, plant extract, yeast extract and the like.
  • salts are chloride, phosphate, polyphosphate, pyrophosphate, citrate, lactate, carbonate and the like.
  • antioxidant are L-ascorbate, sodium bisulfite and the like.
  • the crude enzyme solution was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane (ACP1010 manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) to obtain a 200 mL concentrated solution.
  • McIlvine buffer solution (pH 6.0) was added to and mixed with the concentrated solution so that the final concentration was 1/10, and fractionated with 50% cold ethanol.
  • the collected precipitate was dissolved in 1/10 concentration McIlvine buffer (pH 6.0) containing 0.1 M sodium chloride, and then subjected to dialysis. Subsequently, sodium chloride was added to the dialysate until a saturated concentration was reached, and the mixture was allowed to stand at low temperature for 3 days, and then the supernatant was collected.
  • the precipitate was a crystal of mature TGase (M-TGase), and purified M-TGase was obtained by recrystallization from a saturated saline solution.
  • the specific activity (u / Abs 280 nm) of the purified M-TGase enzyme was 19.1.
  • the amino acid sequence of M-TGase is shown in SEQ ID NO: 6.
  • ammonium sulfate was added to the collected supernatant to a saturated concentration, and the precipitate was collected.
  • the recovered precipitate was dissolved in 20 mM phosphate buffer (KPB; pH 7.2) and dialyzed against the same buffer.
  • ammonium sulfate was added to the dialysate so as to have a concentration of 1.7 M, and the mixture was subjected to Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow equilibrated with 20 mM phosphate buffer (KPB; pH 7.2) containing 1.7 M ammonium sulfate.
  • transglutaminase activity was measured by the method described in JP-A No. 64-27471. Specifically, benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine and hydroxylamine are used as a substrate in the reaction in the absence of Ca 2+ to form an iron complex in the presence of trichloroacetic acid, and the absorption at 525 nm is measured. The amount of hydroxamic acid is obtained from a calibration curve, and the transglutaminase activity is calculated. Details of the measurement method will be described below. First, the following reagents A and B are prepared.
  • Reagent A 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.0), 0.1 M hydroxylamine, 0.01 M reduced glutathione, 0.03 M benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine
  • Reagent B 3 N hydrochloric acid, 12% trichloro acid, of 5% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O ( dissolved in O.1N-HCl) 1: 1: 1 mixed solution
  • the absorbance at 525 nm is measured.
  • the absorbance of an enzyme solution that has been reacted in the same manner using an enzyme solution that has been heat-inactivated in advance is measured to determine the difference in absorbance from the enzyme solution.
  • a calibration curve is prepared using L-glutamic acid- ⁇ -monohydroxamic acid instead of the enzyme solution, and the amount of hydroxamic acid produced is determined from the absorbance difference.
  • One unit is the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of hydroxamic acid per minute. Unless otherwise stated, transglutaminase activity was also measured by the measurement method in the following tests.
  • the collected solution was centrifuged using Amicon Ultra (Ultracel-5K) at 4 ° C.
  • the obtained concentrated liquid (sample) was subjected to N-terminal amino acid analysis and mass spectrometry.
  • the results of N-terminal amino acid analysis revealed that the N-terminus of the peptide was DNGAGEETKS.
  • mass spectrometry five peaks of m / z (1) 3623.938, (2) 3640.903, (3) 3710.780, (4) 3727.845, (5) 3813.735 were observed. It was done. (1) and (3) are considered to be deamidated products of (2) and (4), respectively.
  • P-TGase stability test 1 The pH stability of P-TGase and M-TGase was compared. Each enzyme dilution was prepared using a citrate-hydrochloric acid buffer solution at pH 2-4 and a Britton-Robinson buffer solution at pH 4-11, treated at 50 ° C. for 1 hour, and then measured for transglutaminase activity. As a result, P-TGase had a residual activity of 93% even at pH 4, whereas the residual activity of M-TGase under the same conditions was 2% (FIG. 1). Thus, P-TGase showed high stability in the acidic region.
  • P-TGase stability test 2 In order to evaluate the stability against oxidation in solution (resistance to oxidation deactivation), an inhibition test (versus hydrogen peroxide) was performed. Hydrogen peroxide water (reagent, 30% (w / v)) is appropriately diluted with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.0), added to the enzyme solution, treated at 37 ° C. for 30 minutes, and then transglutaminase. Activity was measured. The residual activity at a treatment concentration of 0.03% (w / v) was 3% for M-TGase and 54% for P-TGase (FIG. 3). Thus, P-TGase showed high oxidation stability in the solution.
  • P-TGase stability test 3 The stability in the powder state was evaluated. P-TGase and M-TGase were each powdered by lyophilization. Dextrin was mixed with the M-TGase powder so that the transglutaminase activity per weight was the same as that of the P-TGase powder. The storage temperature was 44 ° C. The residual activity after 2 months was 79% for M-TGase, whereas it was 85% for P-TGase (FIG. 4). Thus, P-TGase showed high stability even in the powder state.
  • the crude enzyme solution was concentrated with an ultrafiltration membrane (ACP1010 manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) to obtain 300 mL of concentrated solution.
  • the concentrate was salted out with 80% saturated ammonium sulfate, and the precipitate was collected.
  • the collected precipitate was dissolved in 20 mM phosphate buffer (KPB; pH 7.2) and dialyzed against the same buffer. Insoluble matter was removed from the dialyzed sample, and the supernatant was subjected to Blue-Sepharose 6 Fast Flow equilibrated with 20 mM phosphate buffer (KPB; pH 7.2).
  • the washed fraction in the same buffer was collected and dialyzed against 20 mM phosphate buffer (KPB; pH 6.8) containing 1.7 M ammonium sulfate.
  • the dialyzed sample was subjected to Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow equilibrated with 20 mM phosphate buffer (KPB; pH 6.8) containing 1.7 M ammonium sulfate.
  • elution was performed with a linear gradient of ammonium sulfate concentration of 1.7 M to 0 M.
  • P-TGase was eluted at an eluate ammonium sulfate concentration of about 1.0 M.
  • M-TGase was eluted in the eluate ammonium sulfate concentration around 0.8M.
  • Stability test 1 of P-TGase (Streptomyces lavendulae No. 466) The temperature stability of P-TGase and M-TGase was also compared. Each enzyme dilution was prepared with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.0), heat-treated at each temperature, and then transglutaminase activity was measured. As a result, the residual activity after treatment at 50 ° C. for 20 minutes was 12% for M-TGase and 29% for P-TGase (FIG. 5). Thus, Streptomyces ravendulae no. P-TGase derived from 466 strain showed higher thermal stability than M-TGase derived from the same strain.
  • Stability test 2 of P-TGase (Streptomyces lavendulae No. 466) In order to evaluate the stability against oxidation in solution (resistance to oxidation deactivation), an inhibition test (versus hydrogen peroxide) was performed. Hydrogen peroxide water (reagent, 30% (w / v)) is appropriately diluted with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.0), added to the enzyme solution, treated at 37 ° C. for 15 minutes, and then transglutaminase. Activity was measured. The residual activity at a treatment concentration of 0.006% (w / v) was 35% for M-TGase and 62% for P-TGase (FIG. 6). Thus, Streptomyces ravendulae no. P-TGase derived from 466 strain showed high oxidative stability in solution.
  • pro-type transglutaminase Contains 2% soluble starch, 5% sucrose, 2% polypeptone, 0.2% yeast extract, 0.1% magnesium sulfate, 0.2% dipotassium phosphate, 0.05% adecanol Using a culture medium, Streptomyces mobaraensis No. which is a transglutaminase-producing bacterium.
  • the 140226 strain Japanese Patent Laid-Open No. 2005-73628, was cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days to obtain 1500 mL of a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution was concentrated with an ultrafiltration membrane (ACP1010 manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) to obtain 150 mL of concentrated solution.
  • the concentrated solution was purified by a method based on literature information (Eur. J. Biochem. 257, 570-576 (1998)) to obtain pro-type transglutaminase.
  • P-TGase conversion from pro-type transglutaminase by protease treatment
  • Dispase II manufactured by Roche was added to the dialyzed sample so that the final concentration of the treatment solution was 0.08 u / mL, followed by treatment at 30 ° C. for 60 minutes to prepare P-TGase.
  • the reaction was stopped by diluting to a working concentration of “11.” below with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA.
  • M-TGase used in the following “11.” was also treated with dispase II in the same manner as P-TGase.
  • P-TGase (protease-treated product) stability test The temperature stability of P-TGase and M-TGase was also compared. Each enzyme dilution was prepared with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.0), heat-treated at each temperature, and then transglutaminase activity was measured. As a result, the residual activity after treatment at 50 ° C. for 60 minutes was 41% for M-TGase and 76% for P-TGase (FIG. 7). Thus, P-TGase obtained by protease treatment also showed higher thermal stability than M-TGase. From this, it was considered that the above-mentioned “10.” P-TGase obtained by protease treatment was the same substance as the above-mentioned “1.” P-TGase.
  • the stable transglutaminase of the present invention is superior to mature transglutaminase in terms of pH stability and temperature stability.
  • Examples of uses of the stable transglutaminase of the present invention are production of meat binding, sausage, tofu, bread and noodles.

Abstract

　安定性に優れたトランスグルタミナーゼ及びその製造法を提供することを課題とする。トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼに結合した構造からなる、安定型トランスグルタミナーゼが提供される。また、トランスグルタミナーゼ産生能を有する微生物を、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養するステップ、培養液より、プロ配列ペプチドが結合した成熟型トランスグルタミナーゼを分離・回収するステップ、を含む、安定型トランスグルタミナーゼの製造法が提供される。

Description

安定型トランスグルタミナーゼ及びその製造法
　本発明はトランスグルタミナーゼに関する。詳しくは、酸化安定性や温度安定性などに優れた安定型トランスグルタミナーゼに関する。
　トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ－カルボキシルアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素で、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε－アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε－（γ－Ｇｌｎ）－Ｌｙｓ架橋結合を形成させる。従って、トランスグルタミナーゼの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来の微生物酵素を用いたトランスグルタミナーゼ（特許文献１参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。
　トランスグルタミナーゼは、発酵過程でプロ体を経て成熟型に変換されるシスティンを活性中心残基とするチオール酵素であることから安定性が悪く、製造工程中あるいは製品保存中での失活を抑えるため、安定化剤の添加が必要であった。
　トランスグルタミナーゼの保存中の安定性を改善するための方法として、有機酸、無機酸、ポリフェノール、チオール、糖アルコールなどを添加することが提案された（特許文献１）。また、タンパク質（小麦タンパク質や大豆タンパク質など）やタンパク質の部分加水分解物を添加して安定性を高める方法も開発された（特許文献２）。さらには、トレハロースを利用して安定化する技術も開発された（特許文献３）。
特開平４－２０７１９４号公報 特許第３６５１００３号公報 特開２００４－３０５０１０号公報
　これまでに各種の安定化技術が提案されたものの、依然としてトランスグルタミナーゼを安定化することに対するニーズは高い。前述の通り、トランスグルタミナーゼは食品分野で広く利用されている。従って、不測の事態を回避するためには、可能な限り余分な成分を添加しないことが望まれる。
　以上の背景の下、本発明は、安定性に優れたトランスグルタミナーゼ、その製造法、並びにその用途を提供することを課題とする。
　本発明者らは以上の課題に鑑み鋭意検討した。その結果、トランスグルタミナーゼ生産菌の培養液中にトランスグルタミナーゼ中間体の存在を認め、これを回収することに成功した。検討を更に進めたところ、回収された中間体は、プロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼ（成熟型ＴＧａｓｅ）に結合したものであることが明らかとなった。一方、中間体の安定性を評価した結果、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性のいずれについても成熟型ＴＧａｓｅを凌ぐことが判明した。
　本発明は以上の知見に基づき完成されたものであり、次の通りである。
　［１］トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼに結合した構造からなる、安定型トランスグルタミナーゼ。
　［２］成熟型トランスグルタミナーゼが微生物由来である、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［３］微生物がストレプトミセス属微生物である、［２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［４］微生物がストレプトミセス・モバラエンシスである、［２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［５］成熟型トランスグルタミナーゼが、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［６］プロ配列ペプチドが微生物由来である、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［７］微生物がストレプトミセス属微生物である、［６］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［８］微生物がストレプトミセス・モバラエンシスである、［６］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［９］プロ配列ペプチドが、以下の（１）～（３）のいずれかの配列を有する、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ：
　（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）；
　（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）；
　（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）。
　［１０］トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが結合していない成熟型トランスグルタミナーゼと比較して、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性からなる群より選択される一以上の安定性が高い、［１］～［９］のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
　［１１］［１］～［１０］のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼを含有する酵素製剤。
　［１２］トランスグルタミナーゼ産生能を有する微生物を、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養するステップ、
　培養液より、プロ配列ペプチドが結合した成熟型トランスグルタミナーゼを分離・回収するステップ、
　を含む、安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
　［１３］微生物が、ストレプトミセス属微生物である、［１２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
　［１４］微生物が、ストレプトミセス・モバラエンシスである、［１２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）のｐＨ安定性の比較。横軸はｐＨ、縦軸は残存活性（％）。 安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の温度安定性の比較。横軸は処理時間（分）、縦軸は残存活性（％）。 安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の酸化安定性の比較。横軸は過酸化水素濃度（％）、縦軸は残存活性（％）。 安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の保存安定性の比較。横軸は保存期間（月）、縦軸は残存活性（％）。 安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の温度安定性の比較。横軸は処理時間（分）、縦軸は残存活性（％）。 安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の酸化安定性の比較。横軸は過酸化水素濃度（％）、縦軸は残存活性（％）。 安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の温度安定性の比較。横軸は処理時間（分）、縦軸は残存活性（％）。
（安定型ＴＧａｓｅ）
　本発明の安定型トランスグルタミナーゼ（安定型ＴＧａｓｅ）は、トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが成熟型ＴＧａｓｅに結合した構造を有する。即ち、必須の構成要素はトランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドと成熟型ＴＧａｓｅであり、これらの要素が結合していることが特徴となる。この特徴によって、本発明の安定型ＴＧａｓｅは、成熟型ＴＧａｓｅよりも高い安定性を示す。本明細書において用語「安定性」は、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性、保存安定性を包括する表現として使用される。従って、本発明の安定型ＴＧａｓｅは、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性からなる群より選択される一以上の安定性について成熟型ＴＧａｓｅよりも優れることになる。好ましい態様の安定型ＴＧａｓｅは、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性、及び保存安定性の全てについて成熟型ＴＧａｓｅよりも優れる。
　ところで、分泌型タンパク質であるトランスグルタミナーゼはシグナル配列（プレ配列）及びプロ配列が連結されたプレプロ型トランスグルタミナーゼとして翻訳された後、シグナル配列が切断されてプロ型トランスグルタミナーゼに変換され、続いてプロ配列が切断され、成熟型トランスグルタミナーゼ（成熟型ＴＧａｓｅ）になる。後述の実施例に示す通り、本発明者らは、この一連の過程の中で、切断されたプロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼに結合した構造の中間体が存在することを見出すとともに、それが安定性に優れることを明らかにした。本発明の安定型ＴＧａｓｅは、典型的には、上記の過程で生成される中間体として得られるが、プロ配列ペプチドが成熟型ＴＧａｓｅに結合した構造を有し、成熟型ＴＧａｓｅよりも安定性が向上している限りにおいてその製造法（取得法）は特に限定されない。従って、プロ配列ペプチドと成熟型ＴＧａｓｅを別々に用意し、両者を結合させて得られるものも、安定性の向上が認められる限り、本発明の安定型ＴＧａｓｅに該当する。
　本明細書において「プロ配列ペプチド」とは、プロ配列（即ち、プレ配列と成熟型タンパク質配列の間に存在する配列）を構成するペプチドの一部又は全部のことをいう。プロ配列ペプチドの例として３種のペプチドを以下に示す。
　プロ配列ペプチドの例１：ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）の配列からなるペプチド
　プロ配列ペプチドの例２：ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）の配列からなるペプチド
　プロ配列ペプチドの例３：ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）の配列からなるペプチド
　プロ配列ペプチドの由来（起源）は特に限定されない。好ましくは、プロ配列ペプチドは微生物由来である。「微生物由来のプロ配列ペプチド」には、ストレプトミセス属などの微生物が産生するトランスグルタミナーゼ（例えば特開昭６４－２７４７１号公報を参照）のプロ配列ペプチドの他、当該プロ配列ペプチド（即ち、微生物が産生するトランスグルタミナーゼのプロ配列の一部又は全長）と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。微生物が産生するトランスグルタミナーゼのプロ配列全長のアミノ酸配列の例を配列番号４（ストレプトミセス・モバラエンシス）、配列番号５（ストレプトミセス・シナモネウス）に示す。
　本発明の安定型ＴＧａｓｅの構成要素の一つである成熟型ＴＧａｓｅの由来（起源）も特に限定されない。例えば、ストレプトミセス属などの微生物が産生する成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特開昭６４－２７４７１号公報を参照）、哺乳動物が産生する成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特公平１－５０３８２号公報を参照）、組換えＤＮＡ技術を利用して得られるリコンビナント（組換え型）成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特開平５－１９９８８３号公報、特開２００４－９７０９９号公報）等を用いることができる。好ましくは、成熟型ＴＧａｓｅは微生物由来である。「微生物由来の成熟型ＴＧａｓｅ」には、ストレプトミセス属などの微生物が産生する天然型の成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特開昭６４－２７４７１号公報を参照）の他、微生物が産生するトランスグルタミナーゼの遺伝子が導入された形質転換体を培養して得られるリコンビナント成熟型ＴＧａｓｅが含まれる。微生物由来の成熟型ＴＧａｓｅのアミノ酸配列の例を配列番号６（ストレプトミセス・モバラエンシス）、配列番号７（ストレプトミセス・シナモネウス）に示す。
　プロ配列ペプチド及び／又は成熟型ＴＧａｓｅの由来としての微生物は、好ましくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。ストレプトミセス属に属する微生物としては、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）（旧ストレプトベルチシリウム・モバラエンス）Ｎｏ．１４０２２６株（特開２００５－７３６２８号公報）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照）、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．）Ｎｏ．８３（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照）等を挙げることができる。また、紫外線照射やＮＴＧ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の常法を用いて生産性を高めたり、プロテアーゼやアミラーゼなどの夾雑蛋白の生成を減らしたり、抗生物質などの生理活性物質を抑制又は欠如させたような変異株を使用することもでき、更には、遺伝子組換え菌等の使用もできる。
　組換えＤＮＡ技術を利用すれば（即ち、遺伝子組換え菌を使用する場合）、プロ配列ペプチドの由来と成熟型ＴＧａｓｅの由来が異なる安定型ＴＧａｓｅを得ることも可能である。但し、好ましくは、プロ配列ペプチドの由来と成熟型ＴＧａｓｅの由来は同一である。このような形態の安定型ＴＧａｓｅは、典型的には、トランスグルタミナーゼ生産菌（本来的に生産能を有する菌又はトランスグルタミナーゼ遺伝子が導入された組換え菌）を培養することによって、中間体として得られる。以下、当該形態の安定型ＴＧａｓｅの製造法の一例を説明する。
（安定型ＴＧａｓｅの製造法）
　まず、トランスグルタミナーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物（例えばストレプトミセス・モバラエンシスＮｏ．１４０２２６株）を用意し、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養する。トランスグルタミナーゼを産生することが可能である限り、培養条件は特に限定されない。培養条件の具体例は、後述の実施例に示される。当業者であれば、必要に応じて培養条件を適宜変更可能である。
　培地には、デンプン、蔗糖、乳糖、グリセロール、グルコース等の炭素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等の微量金属塩など一般的に用いられる培地原料を使用できる。また、発泡を抑えるために消泡剤の添加も必要に応じて行うことができる。培養温度は２５℃～３５℃が一般的である。また、各種発酵容器を用いて培養すればよく、通常２日間～６日間の通気撹拌が行われる。使用する菌株の種類や発酵培地によっては必ずしもこの条件に従わなくても良い。例えば、培地原料をフイーヂングしたり、高濃度の培地原料を含む場合は、一般的に培養時間が更に長くなることもある。また、培地ｐＨの制御も必要に応じて行われる。
　培養終了後における発酵混合物からの菌体等の除去は、濾過あるいは遠心分離により行われる。濾過としては、けい藻土を加えた加圧濾過が好ましく、また、室温以下で実施することが好ましい。得られた濾液、すなわちトランスグルタミナーゼ粗酵素液は、必要に応じて冷却される。尚、Ｅｕｒ，．Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５７０－５７６（１９９８）に記載されているように、トランスグルタミナーゼは前駆体として生産されることが知られており、安定型ＴＧａｓｅへの変換のため発酵混合物を一定時間プロテアーゼ或いはペプチダーゼ等の酵素を添加して処理しても良い。また、トランスグルタミナーゼは、酵素活性を持たない酸化型としても一部存在することが知られているため、システィンやグルタチオン、あるいはそれらを含む物質を添加して活性型に変換することも望ましい。但し、これらの活性化操作は、精製工程の段階に限定して行われるものではないが、好ましくは、精製の早い段階で行うのが好ましい。
　必要に応じて粗酵素液は濃縮される。濃縮方法は特に限定されないが、濃縮と精製が同時に可能な限外濾過によることが好ましい。濃縮は通常１０倍～１００倍程度まで行うことができる。但し、次の工程が可能な濃度まで濃縮される限り、濃縮の程度は特に問わない。なお、限外濾過膜は、ＴＧａｓｅの分子量（約３８，０００）を考慮すれば、それ以下の例えば分子量１３，０００の平均孔径を有する旭化成工業製ＡＣＰ－１３０００等の使用が好ましい。但し、分子量５０，０００の孔径を有する膜を使用してもほとんど酵素が漏れることがないので、必要に応じて膜の選択を行うことで精製度を高めることも可能である。脱塩濃縮において沈殿を生じることもあるが、適切な緩衝液あるいは塩類溶液等を加えることにより溶解させることが可能である。また、濃縮時の温度は、特に限定されるものではないが、１０℃～３０℃が好ましい。温度が高い程濃縮は効率的に実施できるが、その反面、失活のおそれがある。
　濃縮液中には目的の安定型ＴＧａｓｅ（プロ配列ペプチドが結合した成熟型ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅが含まれる。そこで、濃縮液から目的の安定型ＴＧａｓｅを回収する。以下、安定型ＴＧａｓｅの回収法の一例を説明する。まず、夾雑タンパク質などを除去するため、エタノール、ポリエチレングリコール等を使用した前処理によって濃縮液を部分精製する。この前処理によって回収された沈澱を適当な緩衝液に溶解した後、透析に供する。透析後、硫安や塩化ナトリウム等の塩類を加えて塩析する。これによって成熟型ＴＧａｓｅが沈澱する。上清を回収した後、塩析、カラムクロマトグラフィー、遠心分離等を利用して上清中の安定型ＴＧａｓｅを分離・精製する。必要に応じて脱塩、濃縮などを行う。
（安定型ＴＧａｓｅを含有する酵素製剤）
　安定型ＴＧａｓｅを用いて酵素製剤を構成することができる。本発明の酵素製剤の形状は特に限定されず、例えば粉末状、顆粒状、液体状、カプセル状等である。本発明の酵素製剤は、必須の有効成分として安定型ＴＧａｓｅを含有する。その他の成分は任意である。本発明の酵素製剤が含有可能な成分として、食品用賦形剤、各種タンパク質、各種タンパク質の分解物、各種エキス類、各種塩類、各種酸化防止剤、システイン、グルタチオン、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、貝殻焼成カルシウム、二酸化ケイ素を例示することができる。尚、食品用賦形剤の例は、デキストリン、分岐デキストリン、サイクロデキストリン、グルコース、乳糖、蔗糖、トレハロース、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、多糖類、澱粉（馬鈴薯澱粉やコーンスターチ）、難消化性デキストリン、ガム類、乳化剤（ショ糖脂肪酸エステル、レシチンなど）、ペクチン、油脂である。タンパク質の例は、大豆タンパク質、小麦タンパク質、トウモロコシタンパク質、乳タンパク質、動物由来タンパク質などである。エキス類の例は肉エキス、植物エキス、酵母エキスなどである。塩類の例は、塩化塩、リン酸塩、ポリリン酸塩、ピロリン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、炭酸塩などである。酸化防止剤の例は、L-アスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウムなどである。
１．安定型ＴＧａｓｅの精製
　可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、アデカノール０．０５％を含む培地を用い、トランスグルタミナーゼ生産菌であるストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ．１４０２２６株（特開２００５－７３６２８号公報を参照）を３０℃で２日間振とう培養し、粗酵素液４０００ｍＬを得た。尚、特に言及しない限り、％は重量％を意味する（以下の各実施例においても同様）。
　次に、限外濾過膜（旭化成社製ＡＣＰ１０１０）により粗酵素液を脱塩・濃縮し、２００ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液に最終１／１０濃度となるようにマッキルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ６．０）を添加・混合した後、冷エタノール５０％で分画した。回収した沈殿を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１／１０濃度のマッキルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した後、透析に供した。続いて、透析液に飽和濃度になるまで塩化ナトリウムを添加し、低温で３日間静置した後、上清を回収した。沈殿は成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ－ＴＧａｓｅ）の結晶であり、飽和食塩溶液による再結晶化によりＭ－ＴＧａｓｅ精製酵素が得られた。Ｍ－ＴＧａｓｅ精製酵素の比活性（ｕ／Ａｂｓ２８０ｎｍ）は１９．１であった。尚、Ｍ－ＴＧａｓｅのアミノ酸配列を配列番号６に示した。
　一方、回収した上清に飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを添加し、沈殿を回収した。回収した沈澱を２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）に溶解後、同緩衝液で透析した。次に、透析液に１．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗに供した。硫酸アンモニウム濃度１．７Ｍで洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍで溶出した。本溶出画分に目的の安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ－ＴＧａｓｅ）が溶出した。このようにして得られたＰ－ＴＧａｓｅの比活性（ｕ／Ａｂｓ２８０ｎｍ）は７．９であった。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加した場合と添加しない場合のゲルろ過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１００）の溶出パターンを比較した結果、Ｐ－ＴＧａｓｅは、成熟型ＴＧａｓｅにプロ配列ペプチドが結合した構造を有することが判明した。
　トランスグルタミナーゼの活性の測定は、特開昭６４－２７４７１号公報に記載の方法により行った。すなわち、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質としてＣａ２＋非存在下で反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸共存下で鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求めトランスグルタミナーゼ活性を算出する。以下、測定法の詳細を説明する。まず、以下の試薬Ａ及びＢを用意する。
　試薬Ａ：０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１Ｍヒドロキシルアミン、０．０１Ｍ還元型グルタチオン、０．０３Ｍベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン
　試薬Ｂ：３Ｎ塩酸、１２％トリクロロ酢酸、５％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（Ｏ．１Ｎ－ＨＣｌに溶解）の１：１：１の混合液
　酵素液０．０５ｍＬに試薬Ａを０．５ｍＬ加えて混合した後、３７℃で１０分間反応させる。試薬Ｂを加えて反応を停止させるともにＦｅ錯体を形成させた後、５２５ｎｍの吸光度を測定する。対照として、予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別途、酵素液の代わりにＬ－グルタミン酸－γ－モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求める。１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とする。特に言及しない限り、以下の各試験においても当該測定法によりトランスグルタミナーゼの活性を測定した。
２．プロ配列ペプチドの精製
　１．で得られたＰ－ＴＧａｓｅ溶液１．８ｍＬに５．０ｍｇの炭酸ナトリウムを添加・溶解した後、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を０．２ｍＬ混合し、３７℃で３０分処理した。処理液２．０ｍＬを、０．１％ＳＤＳを含む２０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．２）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１００（カラム体積１６０ｍＬ）に供した。吸光度２８０ｎｍをモニタリングし、移動相量１２３ｍＬ付近に見られるピークを回収した。回収した溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ－５Ｋ）を用い、４℃の条件下、遠心濃縮した。得られた濃縮液（サンプル）をＮ末端アミノ酸解析及び質量分析に供した。Ｎ末端アミノ酸分析の結果から、ペプチドのＮ末端がＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳであることが明らかになった。一方、質量分析の結果、ｍ／ｚ　（１）３６２３．９３８、（２）３６４０．９０３、（３）３７１０．７８０、（４）３７２７．８４５、（５）３８１３．７３５の５つのピークが観測された。（１）と（３）はそれぞれ（２）と（４）の脱アミド体と考えられる。Ｎ末端アミノ酸解析の結果と質量分析の結果より、その他の３ピークのアミノ酸配列は（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）、（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）、（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）と同定された。尚、これらの配列は、プロ配列全長（配列番号４）の一部に相当する。
３．Ｐ－ＴＧａｓｅの安定性試験１
　Ｐ－ＴＧａｓｅとＭ－ＴＧａｓｅのｐＨ安定性を比較した。ｐＨ２～４はクエン酸－塩酸緩衝液、ｐＨ４～１１はユニバーサル（Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液を用いて各酵素希釈液を調製し、５０℃、１時間処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、Ｐ－ＴＧａｓｅはｐＨ４でも９３％の残存活性を有しているのに対して、同条件でのＭ－ＴＧａｓｅの残存活性は２％であった（図１）。このように、Ｐ－ＴＧａｓｅは酸性域で高い安定性を示した。
　一方、Ｐ－ＴＧａｓｅとＭ－ＴＧａｓｅの温度安定性も比較した。０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で各酵素希釈液を調製し、各温度で熱処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、５０℃で８０分処理した場合の残存活性は、Ｍ－ＴＧａｓｅが３３％であるのに対して、Ｐ－ＴＧａｓｅは６４％であった（図２）。このように、Ｐ－ＴＧａｓｅはＭ－ＴＧａｓｅよりも高い熱安定性を示した。
４．Ｐ－ＴＧａｓｅの安定性試験２
　溶液中の酸化に対する安定性（酸化失活のしにくさ）を評価するため、阻害試験（対過酸化水素）を実施した。過酸化水素水（試薬、３０％（ｗ／ｖ））を適宜０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈して酵素溶液に添加し、３７℃で３０分処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。処理濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の場合の残存活性は、Ｍ－ＴＧａｓｅが３％であるのに対して、Ｐ－ＴＧａｓｅは５４％であった（図３）。このように、Ｐ－ＴＧａｓｅは溶液中において高い酸化安定性を示した。
５．Ｐ－ＴＧａｓｅの安定性試験３
　粉末状態での安定性を評価した。凍結乾燥によりＰ－ＴＧａｓｅとＭ－ＴＧａｓｅをそれぞれ粉末化した。Ｍ－ＴＧａｓｅ粉末にはデキストリンを混合し、Ｐ－ＴＧａｓｅ粉末と重量あたりのトランスグルタミナーゼ活性が同一となるようにした。保存温度は４４℃とした。２ヶ月後の残存活性は、Ｍ－ＴＧａｓｅが７９％であるのに対して、Ｐ－ＴＧａｓｅは８５％であった（図４）。このように、粉末状態の場合もＰ－ＴＧａｓｅは高い安定性を示した。
６．Ｐ－ＴＧａｓｅの精製（ストレプトミセス・ラベンデュラエ　Ｎｏ．４６６）
　可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、アデカノール０．０５％を含む培地を用い、トランスグルタミナーゼ生産菌であるストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６（特許第２８４９７７３号公報、特開平４－２０７１９４号公報を参照）を３０℃で３日間振とう培養し、粗酵素液１５００ｍＬを得た。
　次に、限外濾過膜（旭化成社製ＡＣＰ１０１０）により粗酵素液を濃縮し、３００ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液を８０％飽和濃度硫酸アンモニウムで塩析し、沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）で溶解し、更に同緩衝液で透析した。透析サンプルから不溶物を除去し、上清を同じく２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）で平衡化したＢｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗに供した。同緩衝液での洗浄画分を回収し、１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ６．８）で透析した。透析サンプルを同じく１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ６．８）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗに供した。同緩衝液で洗浄後、硫酸アンモニウム濃度１．７Ｍ～０Ｍのリニアグラジエントで溶出したところ、溶出液硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍ付近にＰ－ＴＧａｓｅが溶出した。また溶出液硫酸アンモニウム濃度０．８Ｍ付近にＭ－ＴＧａｓｅが溶出した。
７．Ｐ－ＴＧａｓｅ（ストレプトミセス・ラベンデュラエ　Ｎｏ．４６６）の安定性試験１
　Ｐ－ＴＧａｓｅとＭ－ＴＧａｓｅの温度安定性も比較した。０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で各酵素希釈液を調製し、各温度で熱処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、５０℃で２０分処理した場合の残存活性は、Ｍ－ＴＧａｓｅが１２％であるのに対して、Ｐ－ＴＧａｓｅは２９％であった（図５）。このように、ストレプトミセス・ラベンデュラエ　Ｎｏ．４６６株由来のＰ－ＴＧａｓｅは同株由来のＭ－ＴＧａｓｅよりも高い熱安定性を示した。
８．Ｐ－ＴＧａｓｅ（ストレプトミセス・ラベンデュラエ　Ｎｏ．４６６）の安定性試験２
　溶液中の酸化に対する安定性（酸化失活のしにくさ）を評価するため、阻害試験（対過酸化水素）を実施した。過酸化水素水（試薬、３０％（ｗ／ｖ））を適宜０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈して酵素溶液に添加し、３７℃で１５分処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。処理濃度０．００６％（ｗ／ｖ）の場合の残存活性は、Ｍ－ＴＧａｓｅが３５％であるのに対して、Ｐ－ＴＧａｓｅは６２％であった（図６）。このように、ストレプトミセス・ラベンデュラエ　Ｎｏ．４６６株由来のＰ－ＴＧａｓｅは溶液中において高い酸化安定性を示した。
９．プロ型トランスグルタミナーゼの調製
　可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、アデカノール０．０５％を含む培地を用い、トランスグルタミナーゼ生産菌であるストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ．１４０２２６株（特開２００５－７３６２８）を３０℃で２日間振とう培養し、粗酵素液１５００ｍＬを得た。粗酵素液を限外濾過膜（旭化成社製ＡＣＰ１０１０）により濃縮し、１５０ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液を文献情報（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７，５７０－５７６（１９９８））に基づいた方法で精製し、プロ型トランスグルタミナーゼを得た。
１０．Ｐ－ＴＧａｓｅの調製（プロテアーゼ処理によるプロ型トランスグルタミナーゼからの変換）
　プロ型トランスグルタミナーゼ溶液を１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で透析して透析サンプル（Ａｂｓ．２８０ｎｍ＝１．８）を得た。透析サンプルにディスパーゼII（ロシェ製）を処理液終濃度０．０８ｕ／ｍＬとなるように添加後、３０℃で６０分処理してＰ－ＴＧａｓｅを調製した。反応停止は５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で下記「１１．」の使用濃度まで希釈することにより行った。一方、下記「１１．」で使用するＭ－ＴＧａｓｅもＰ－ＴＧａｓｅと同様にディスパーゼII処理したサンプルを用いた。
１１．Ｐ－ＴＧａｓｅ（プロテアーゼ処理品）の安定性試験
　Ｐ－ＴＧａｓｅとＭ－ＴＧａｓｅの温度安定性も比較した。０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で各酵素希釈液を調製し、各温度で熱処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、５０℃で６０分処理した場合の残存活性は、Ｍ－ＴＧａｓｅが４１％であるのに対して、Ｐ－ＴＧａｓｅは７６％であった（図７）。このように、プロテアーゼ処理によって得られたＰ－ＴＧａｓｅもＭ－ＴＧａｓｅよりも高い熱安定性を示した。このことから、プロテアーゼ処理によって得られた上記「１０.」のＰ－ＴＧａｓｅは上記「１.」のＰ－ＴＧａｓｅと同じ物質であると考えられた。
　本発明の安定型トランスグルタミナーゼは成熟型トランスグルタミナーゼに比較してｐＨ安定性、温度安定性などの点で優れる。本発明の安定型トランスグルタミナーゼの用途の例は、肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造である。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (14)

  1. 　トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼに結合した構造からなる、安定型トランスグルタミナーゼ。
  2. 　成熟型トランスグルタミナーゼが微生物由来である、請求項１に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  3. 　微生物がストレプトミセス属微生物である、請求項２に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  4. 　微生物がストレプトミセス・モバラエンシスである、請求項２に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  5. 　成熟型トランスグルタミナーゼが、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  6. 　プロ配列ペプチドが微生物由来である、請求項１に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  7. 　微生物がストレプトミセス属微生物である、請求項６に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  8. 　微生物がストレプトミセス・モバラエンシスである、請求項６に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  9. 　プロ配列ペプチドが、以下の（１）～（３）のいずれかの配列を有する、請求項１に記載の安定型トランスグルタミナーゼ：
    　（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）；
    　（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）；
    　（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）。
  10. 　トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが結合していない成熟型トランスグルタミナーゼと比較して、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性からなる群より選択される一以上の安定性が高い、請求項１～９のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼを含有する酵素製剤。
  12. 　トランスグルタミナーゼ産生能を有する微生物を、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養するステップ、
    　培養液より、プロ配列ペプチドが結合した成熟型トランスグルタミナーゼを分離・回収するステップ、
    　を含む、安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
  13. 　微生物が、ストレプトミセス属微生物である、請求項１２に記載の安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
  14. 　微生物が、ストレプトミセス・モバラエンシスである、請求項１２に記載の安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
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