JPWO2019107288A1 - 改変型トランスグルタミナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1]配列番号1のアミノ酸配列において、以下の(1)〜(134)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている)を有し、前記アミノ酸置換に対応した特性変化が認められる改変型トランスグルタミナーゼ:
(1)変異点がV6、置換後のアミノ酸がQ、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(2)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、H、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(3)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(4)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(5)変異点がY34、置換後のアミノ酸がA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(6)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V又はW、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(7)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(8)変異点がW59、置換後のアミノ酸がR、N、Y、A、S、I、V、D、G又はP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(9)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(10)変異点がY62、置換後のアミノ酸がC、R、G、K又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(11)変異点がV65、置換後のアミノ酸がN、L、M、F、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(12)変異点がV67、置換後のアミノ酸がL、N、A、C、M、Q又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(13)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L、A、S、M、F、N、Q又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(14)変異点がW69、置換後のアミノ酸がH、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(15)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がW、D、G又はK、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(16)変異点がY75、置換後のアミノ酸がR、Q、T又はG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(17)変異点がT77、置換後のアミノ酸がM、H、E、C又はG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(18)変異点がF85、置換後のアミノ酸がM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(19)変異点がF90、置換後のアミノ酸がC、M、H、L又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(20)変異点がF108、置換後のアミノ酸がR、L、T、A、I、K、N又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(21)変異点がF117、置換後のアミノ酸がM又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(22)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、M、N、K又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(23)変異点がF202、置換後のアミノ酸がL又はW、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(24)変異点がW203、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(25)変異点がF254、置換後のアミノ酸がY又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(26)変異点がT273、置換後のアミノ酸がI、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(27)変異点がN276、置換後のアミノ酸がC、E、K、L、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(28)変異点がY278、置換後のアミノ酸がM、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(29)変異点がS284、置換後のアミノ酸がW、Y、M、F又はNアミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(30)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、W、L、A、C、K、N、Q、R、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(31)変異点がS299、置換後のアミノ酸がI、Y、V、K、M、Q、A、F、G又はE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(32)変異点がS303、置換後のアミノ酸がN、G、C、V、P又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(33)変異点がY310、置換後のアミノ酸がC、M又はI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(34)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、P、E、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(35)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(36)変異点がY34、置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(37)変異点がV67、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(38)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(39)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(40)変異点がT77、置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(41)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC又はQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(42)変異点がT273、置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(43)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL、H、K、P又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(44)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(45)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(46)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、Q、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(47)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(48)変異点がR26、置換後のアミノ酸がM、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P又はV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(49)変異点がE28、置換後のアミノ酸がL、M、K、C、V、R、W、G、N、F、Y又はH、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(50)変異点がY42、置換後のアミノ酸がL、N又はF、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(51)変異点がE58、置換後のアミノ酸がQ、A、I、V、L、T、M、K、Y、W、F又はR、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(52)変異点がV67、置換後のアミノ酸がT、S又はA、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(53)変異点がT68、置換後のアミノ酸がL、I、V又はM、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(54)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(55)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(56)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(57)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(58)変異点がS284、置換後のアミノ酸がR又はH、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(59)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、S、F、L、C、N、V又はM、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(60)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM、K又はV、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(61)変異点がF251、置換後のアミノ酸がY、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(62)変異点がV6とY75、変異点V6の置換後のアミノ酸がE、変異点Y75の置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(63)変異点がD3とT77、変異点D3の置換後のアミノ酸がP、変異点T77の置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(64)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(65)変異点がD3、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上;
(66)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上;
(67)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(68)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(69)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(70)変異点がR26、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下、抗酸化性向上及び反応性向上;
(71)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、R、K、M、N、F、G、L又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(72)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、G、N、R又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(73)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(74)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、L又はQ、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(75)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(76)変異点がV67、置換後のアミノ酸がA又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(77)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(78)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(79)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上;
(80)変異点がT77、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(81)変異点がT77、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(82)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上;
(83)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(84)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上;
(85)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(86)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM又はF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(87)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL又はK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上;
(88)変異点がS284、置換後のアミノ酸がH又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(89)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、L、C、N、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(90)変異点がS299、置換後のアミノ酸がV、K、M又はA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(91)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上;
(92)変異点がR5、置換後のアミノ酸がQ、P、C、M、I、V、Y、F、S、N、T又はG、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(93)変異点がY34、置換後のアミノ酸がH又はM、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(94)変異点がW59、置換後のアミノ酸がK又はE、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(95)変異点がS61、置換後のアミノ酸がT、V、Y、D、I、L、N、E、M、F、W、Q、P、H又はK、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(96)変異点がY62、置換後のアミノ酸がD又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(97)変異点がG63、置換後のアミノ酸がD、Q、Y、R、K、H、P、M、N、C、F、L、W、T、V又はS、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(98)変異点がV65、置換後のアミノ酸がC、T又はK、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(99)変異点がG66、置換後のアミノ酸がW又はK、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(100)変異点がT68、置換後のアミノ酸がP又はH、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(101)変異点がW69、置換後のアミノ酸がY、D又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(102)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がR又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(103)変異点がF85、置換後のアミノ酸がY、W、L、I、Q、C、T、A、V、S、R、H又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(104)変異点がF108、置換後のアミノ酸がQ、C、E、S又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(105)変異点がF117、置換後のアミノ酸がC、I、W、V、A、G、T又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(106)変異点がY198、置換後のアミノ酸がF、H、L、S、M又はI、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(107)変異点がS199、置換後のアミノ酸がQ又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(108)変異点がK200、置換後のアミノ酸がY、M、I、R、L又はV、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(109)変異点がH201、置換後のアミノ酸がK、R、M、L又はQ、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(110)変異点がF202、置換後のアミノ酸がY、M、H、V又はC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(111)変異点がW203、置換後のアミノ酸がY、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(112)変異点がF223、置換後のアミノ酸がY、M、L、W、V、H、G又はA、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(113)変異点がR238、置換後のアミノ酸がA、D、V、G、H又はS、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(114)変異点がF251、置換後のアミノ酸がH、N、C、M、R、S、A、T、L、P、G、V又はQ、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(115)変異点がV252、置換後のアミノ酸がM、L、T又はC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(116)変異点がN253、置換後のアミノ酸がT、V、K、C又はR、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(117)変異点がY256、置換後のアミノ酸がL、V又はI、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(118)変異点がG257、置換後のアミノ酸がA又はC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(119)変異点がW258、置換後のアミノ酸がY、F又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(120)変異点がT273、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(121)変異点がG275、置換後のアミノ酸がA、C、S、V、K、I、F、H、R、L、P、Q、Y、N、M又はT、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(122)変異点がN276、置換後のアミノ酸がG、M、Q又はH、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(123)変異点がH277、置換後のアミノ酸がN、S、Q、C、E、K、D、I、R、M、P、L、W、V、Y、G、F又はT、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(124)変異点がY278、置換後のアミノ酸がP又はD、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(125)変異点がH279、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(126)変異点がS284、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(127)変異点がM288、置換後のアミノ酸がV、Q又はT、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(128)変異点がV290、置換後のアミノ酸がT、C、L、M、A、S又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(129)変異点がY291、置換後のアミノ酸がH、T、E又はG、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(130)変異点がW298、置換後のアミノ酸がF、Y、I、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(131)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(132)変異点がY302、置換後のアミノ酸がL、H、M、V、C、T、P、S又はW、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(133)変異点がS303、置換後のアミノ酸がI、Q、D、H又はE、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(134)変異点がF305、置換後のアミノ酸がW、H又はY、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化。
[2]前記同一性が82%以上である、[1]に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
[3]前記同一性が85%以上である、[1]に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
[4]前記同一性が90%以上である、[1]に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
[5]配列番号2〜10のいずれかのアミノ酸配列からなる、[1]に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
[6][1]〜[5]のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
[7]配列番号18〜26のいずれかの塩基配列を含む、[6]に記載の遺伝子。
[8][6]又は[7]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
[9][8]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[10][1]〜[5]のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼを含む酵素剤。
[11]以下のステップ(I)〜(III)を含む、改変型トランスグルタミナーゼの調製法:
(I)[1]〜[5]のいずれか一項の改変型トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
[12]前記アミノ酸配列が配列番号2〜10のいずれかのアミノ酸配列である、[11]に記載の調製法。
[13]前記核酸が、配列番号18〜26のいずれかの塩基配列を含む、[12]に記載の調製法。
(用語)
用語「改変型トランスグルタミナーゼ」とは、基準となるトランスグルタミナーゼ(以下、「基準トランスグルタミナーゼ」と呼ぶ)を改変ないし変異して得られる酵素である。基準トランスグルタミナーゼは、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列を有する、ストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)由来のトランスグルタミナーゼである。
メチオニン:M、セリン:S、アラニン:A、トレオニン:T、バリン:V、チロシン:Y、ロイシン:L、アスパラギン:N、イソロイシン:I、グルタミン:Q、プロリン:P、アスパラギン酸:D、フェニルアラニン:F、グルタミン酸:E、トリプトファン:W、リジン:K、システイン:C、アルギニン:R、グリシン:G、ヒスチジン:H
本発明の第1の局面は改変型トランスグルタミナーゼ(以下、「改変型酵素」と呼ぶ)に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列において、一又は二以上の特定のアミノ酸置換(変異)を含むアミノ酸配列を有する。当該特徴により、配列番号1のアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼに対して、温度安定性低下、耐熱性向上、抗酸化性向上、反応性向上、脱アミド酵素化(トランスグルタミナーゼ活性に対する脱アミド活性の比率の向上)或いはこれらの中の二つ以上の特性変化が認められる。温度安定性が低下した改変型酵素は酵素の熱失活工程における食品の変性防止という実用上の利点があり、例えばヨーグルトやチーズの製造等の用途での利用価値が高い。一方、耐熱性が向上した改変型酵素は、高温下においても高い活性を発揮し、例えばペプチド化合物の合成等の用途での使用に特に適する。また、抗酸化性が向上した改変型酵素は、高い保存安定性を有する等の利点があり、酵素の製造、保存、使用の際の失活を防ぐ効果が期待できる。反応性が向上した改変型酵素については、高い反応効率を望める、酵素使用量を低減できる等の利点があり、用途を問わずその利用価値が高い。脱アミド酵素化は基質特異性を改変するものであり、特に、用途の拡大(例えばタンパク質の可溶化、乳化、起泡性の向上等の用途への利用)ないし創出に繋がる。トランスグルタミナーゼはペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシルアミド基と1級アミンとの間のアシル転移反応を触媒する酵素であるが、1級アミンが存在しないと水がアシル受容体として作用し、グルタミン残基をグルタミン酸残基に変換する脱アミド反応を触媒することになる。脱アミド酵素化された改変型酵素は高い脱アミド化触媒能を示し、脱アミド化に利用される酵素としてより好ましいものとなる。尚、配列番号1のアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼの配列である。
活性残存率(%)=(熱処理後の酵素活性)/(熱処理前の酵素活性) ×100
活性残存率(%)=(過酸化水素処理後の酵素活性)/(処理前の酵素活性) ×100
<温度安定性低下に有効なアミノ酸置換>
(1)変異点がV6、置換後のアミノ酸がQ、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W又はY
(2)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、H、Y、D、G、N、P又はS
(3)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P又はY
(4)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y又はL
(5)変異点がY34、置換後のアミノ酸がA
(6)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V又はW
(7)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G又はH
(8)変異点がW59、置換後のアミノ酸がR、N、Y、A、S、I、V、D、G又はP
(9)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W又はY
(10)変異点がY62、置換後のアミノ酸がC、R、G、K又はS
(11)変異点がV65、置換後のアミノ酸がN、L、M、F、W又はY
(12)変異点がV67、置換後のアミノ酸がL、N、A、C、M、Q又はS
(13)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L、A、S、M、F、N、Q又はY
(14)変異点がW69、置換後のアミノ酸がH、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T又はV
(15)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がW、D、G又はK
(16)変異点がY75、置換後のアミノ酸がR、Q、T又はG
(17)変異点がT77、置換後のアミノ酸がM、H、E、C又はG
(18)変異点がF85、置換後のアミノ酸がM
(19)変異点がF90、置換後のアミノ酸がC、M、H、L又はV
(20)変異点がF108、置換後のアミノ酸がR、L、T、A、I、K、N又はV
(21)変異点がF117、置換後のアミノ酸がM又はL
(22)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、M、N、K又はV
(23)変異点がF202、置換後のアミノ酸がL又はW
(24)変異点がW203、置換後のアミノ酸がF
(25)変異点がF254、置換後のアミノ酸がY又はM
(26)変異点がT273、置換後のアミノ酸がI、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W又はH
(27)変異点がN276、置換後のアミノ酸がC、E、K、L、S、T又はV
(28)変異点がY278、置換後のアミノ酸がM、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T又はV
(29)変異点がS284、置換後のアミノ酸がW、Y、M、F又はN
(30)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、W、L、A、C、K、N、Q、R、S又はV
(31)変異点がS299、置換後のアミノ酸がI、Y、V、K、M、Q、A、F、G又はE
(32)変異点がS303、置換後のアミノ酸がN、G、C、V、P又はY
(33)変異点がY310、置換後のアミノ酸がC、M又はI
V6S、V6C、V6K、V6L、V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y
R26M、R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S
E28N、E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y
V30P、V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L
Y34A
Y42A、Y42C、Y42D、Y42E、Y42G、Y42I、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42T、Y42V、Y42W
E58G、E58H
W59S、W59I、W59V、W59D、W59G、W59P
L60M、L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y
Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S
V65N、V65L、V65M、V65F、V65W、V65Y
V67L、V67N、V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S
T68M、T68F、T68N、T68Q、T68Y
W69M、W69I、W69C、W69E、W69F、W69G、W69K、W69L、W69N、W69Q、W69R、W69S、W69T、W69V
Y75T、Y75G
F85M
F90V
F108T、F108A、F108I、F108K、F108N、F108V
F117L
S199K、S199V
F202W
T273L、T273R、T273G、T273A、T273E、T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H
N276C、N276E、N276K、N276L、N276T、N276V、N276S
Y278L、Y278H、Y278I、Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V
Y291W、Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V
S299E
Y310I
V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y
R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S
E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y
V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L
Y34A
Y42A、Y42C、Y42D、Y42E、Y42G、Y42I、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42T、Y42V、Y42W
W59I、W59V、W59D、W59G、W59P
L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y
Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S
V65M、V65F、V65W、V65Y
V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S
T68F、T68N、T68Q、T68Y
W69M、W69I、W69C、W69E、W69F、W69G、W69K、W69L、W69N、W69Q、W69R、W69S、W69T、W69V
Y75T、Y75G
F108A、F108I、F108K、F108N、F108V
F117L
F202W
T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H
N276C、N276E、N276K、N276L、N276S、N276T、N276V
Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V
Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V
S299E
V6H、V6G、V6N、V6W
R26H、R26Y、R26N、R26S
E28F、E28G、E28L、E28Y
V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L
Y42C、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42W
W59I、W59V、W59G
L60V、L60C、L60F
Y62C、Y62R
V67C、V67M
W69M、W69I、W69C、W69F、W69L、W69T、W69V
Y75T
T273F、T273Y、T273H
Y278W
Y291L、Y291K、Y291R
(34)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、P、E、S又はY
(35)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV
(36)変異点がY34、置換後のアミノ酸がW
(37)変異点がV67、置換後のアミノ酸がH
(38)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI
(39)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がF
(40)変異点がT77、置換後のアミノ酸がQ
(41)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC又はQ
(42)変異点がT273、置換後のアミノ酸がQ
(43)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL、H、K、P又はR
(44)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN
(45)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK
D3P、D3E、D3S、D3Y
R26V
Y34W
V67H
T77Q
S199C、S199Q
T273Q
S284H、S284K、S284P、S284R
S303K
D3E、D3S、D3Y
R26V
Y34W
V67H
S199Q
T273Q
S284H、S284K、S284P、S284R
D3E、D3S、D3Y
R26V
Y34W
T273Q
S284H、S284K、S284P、S284R
(46)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、Q、S又はY
(47)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP
(48)変異点がR26、置換後のアミノ酸がM、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P又はV
(49)変異点がE28、置換後のアミノ酸がL、M、K、C、V、R、W、G、N、F、Y又はH
(50)変異点がY42、置換後のアミノ酸がL、N又はF
(51)変異点がE58、置換後のアミノ酸がQ、A、I、V、L、T、M、K、Y、W、F又はR
(52)変異点がV67、置換後のアミノ酸がT、S又はA
(53)変異点がT68、置換後のアミノ酸がL、I、V又はM
(54)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV
(55)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD
(56)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC
(57)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE
(58)変異点がS284、置換後のアミノ酸がR又はH
(59)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、S、F、L、C、N、V又はM
D3S、D3Y
V6P
R26W、R26C、R26Q、R26G、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26D、R26I、R26S、R26P、R26V
E28L、E28M、E28K、E28C、E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H
E58A、E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R
V67S、V67A
T68I、T68V、T68M
T273E
S284R、S284H
Y291C、Y291N、Y291V、Y291M
V6P
R26C、R26Q、R26G、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26D、R26I、R26S、R26P、R26V
E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H
Y42F
E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R
T68I、T68V、T68M
S284H
R26C、R26Q、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26I、R26S、R26V
E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y
Y42F
E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R
S284H
(60)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM、K又はV
(61)変異点がF251、置換後のアミノ酸がY
(62)変異点がV6とY75、変異点V6の置換後のアミノ酸がE、変異点Y75の置換後のアミノ酸がF
(63)変異点がD3とT77、変異点D3の置換後のアミノ酸がP、変異点T77の置換後のアミノ酸がQ
S284V
F251Y
V6EとY75Fの二重変異
D3PとT77Qの二重変異
V6EとY75Fの二重変異
D3PとT77Qの二重変異
(64)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(65)変異点がD3、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上
(66)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上
(67)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(68)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(69)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(70)変異点がR26、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下、抗酸化性向上及び反応性向上
(71)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、R、K、M、N、F、G、L又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(72)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、G、N、R又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(73)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(74)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、L又はQ、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(75)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(76)変異点がV67、置換後のアミノ酸がA又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(77)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(78)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(79)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上
(80)変異点がT77、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(81)変異点がT77、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(82)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上
(83)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(84)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上
(85)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(86)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM又はF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(87)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL又はK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上
(88)変異点がS284、置換後のアミノ酸がH又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(89)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、L、C、N、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(90)変異点がS299、置換後のアミノ酸がV、K、M又はA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(91)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上
V6P
R26K、R26Q、R26M、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S
E28V、E28R、E28K、E28M、E28N、E28F、E28G、E28L、E28Y
Y42F、Y42L、Y42M
E58Y、E58M、E58A、E58F、E58I、E58V、E58R、E58K、E58L、E58Q
V67A、V67S
T68C、T68L、T68M
T77C
T273E
Y291I、Y291L、Y291C、Y291N、Y291S、Y291V
(92)変異点がR5、置換後のアミノ酸がQ、P、C、M、I、V、Y、F、S、N、T又はG
(93)変異点がY34、置換後のアミノ酸がH又はM
(94)変異点がW59、置換後のアミノ酸がK又はE
(95)変異点がS61、置換後のアミノ酸がT、V、Y、D、I、L、N、E、M、F、W、Q、P、H又はK
(96)変異点がY62、置換後のアミノ酸がD又はP
(97)変異点がG63、置換後のアミノ酸がD、Q、Y、R、K、H、P、M、N、C、F、L、W、T、V又はS
(98)変異点がV65、置換後のアミノ酸がC、T又はK
(99)変異点がG66、置換後のアミノ酸がW又はK
(100)変異点がT68、置換後のアミノ酸がP又はH
(101)変異点がW69、置換後のアミノ酸がY、D又はP
(102)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がR又はP
(103)変異点がF85、置換後のアミノ酸がY、W、L、I、Q、C、T、A、V、S、R、H又はN
(104)変異点がF108、置換後のアミノ酸がQ、C、E、S又はN
(105)変異点がF117、置換後のアミノ酸がC、I、W、V、A、G、T又はN
(106)変異点がY198、置換後のアミノ酸がF、H、L、S、M又はI
(107)変異点がS199、置換後のアミノ酸がQ又はP
(108)変異点がK200、置換後のアミノ酸がY、M、I、R、L又はV
(109)変異点がH201、置換後のアミノ酸がK、R、M、L又はQ
(110)変異点がF202、置換後のアミノ酸がY、M、H、V又はC
(111)変異点がW203、置換後のアミノ酸がY
(112)変異点がF223、置換後のアミノ酸がY、M、L、W、V、H、G又はA
(113)変異点がR238、置換後のアミノ酸がA、D、V、G、H又はS
(114)変異点がF251、置換後のアミノ酸がH、N、C、M、R、S、A、T、L、P、G、V又はQ
(115)変異点がV252、置換後のアミノ酸がM、L、T又はC
(116)変異点がN253、置換後のアミノ酸がT、V、K、C又はR
(117)変異点がY256、置換後のアミノ酸がL、V又はI
(118)変異点がG257、置換後のアミノ酸がA又はC
(119)変異点がW258、置換後のアミノ酸がY、F又はN
(120)変異点がT273、置換後のアミノ酸がN
(121)変異点がG275、置換後のアミノ酸がA、C、S、V、K、I、F、H、R、L、P、Q、Y、N、M又はT
(122)変異点がN276、置換後のアミノ酸がG、M、Q又はH
(123)変異点がH277、置換後のアミノ酸がN、S、Q、C、E、K、D、I、R、M、P、L、W、V、Y、G、F又はT
(124)変異点がY278、置換後のアミノ酸がP又はD
(125)変異点がH279、置換後のアミノ酸がN
(126)変異点がS284、置換後のアミノ酸がC
(127)変異点がM288、置換後のアミノ酸がV、Q又はT
(128)変異点がV290、置換後のアミノ酸がT、C、L、M、A、S又はN
(129)変異点がY291、置換後のアミノ酸がH、T、E又はG
(130)変異点がW298、置換後のアミノ酸がF、Y、I、L又はM
(131)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN又はP
(132)変異点がY302、置換後のアミノ酸がL、H、M、V、C、T、P、S又はW
(133)変異点がS303、置換後のアミノ酸がI、Q、D、H又はE
(134)変異点がF305、置換後のアミノ酸がW、H又はY
R5Q、R5P、R5C、R5M、R5I、R5V、R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G
Y34H、Y34M
W59K、W59E
S61T、S61V、S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K
Y62D、Y62P
G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S
V65C、V65T、V65K
G66W、G66K
T68P、T68H
W69Y、W69D、W69P
Q74R、Q74P
F85Y、F85W、F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N
F108Q、F108C、F108E、F108S、F108N
F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N
Y198F、Y198H、Y198L、Y198S、Y198M、Y198I
S199Q、S199P
K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V
H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q
F202Y、F202M、F202H、F202V、F202C
W203Y
F223Y、F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A
R238A、R238D、R238V、R238G、R238H、R238S
F251H、F251N、F251C、F251M、F251R、F251S、F251A、F251T、F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q
V252M、V252L、V252T、V252C
N253T、N253V、N253K、N253C、N253R
Y256L、Y256V、Y256I
G257A、G257C
W258Y、W258F、W258N
T273N
G275A、G275C、G275S、G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T
N276G、N276M、N276Q、N276H
H277N、H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T
Y278P、Y278D
H279N
S284C
M288V、M288Q、M288T
V290T、V290C、V290L、V290M、V290A、V290S、V290N
Y291H、Y291T、Y291E、Y291G
W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M
S299N、S299P
Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W
S303I、S303Q、S303D、S303H、S303E
F305W、F305H、F305Y
R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G
Y34M
S61T、S61V、S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K
Y62P
G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S
V65C、V65T、V65K
G66K
T68P、T68H
W69D、W69P
F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N
F108C、F108E、F108S、F108N
F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N
Y198L、Y198S、Y198M、Y198I
S199Q、S199P
K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V
H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q
F202M、F202H、F202V、F202C
W203Y
F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A
R238H、R238S
F251N、F251C、F251M、F251R、F251S、F251A、F251T、F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q
V252L、V252T、V252C
N253T、N253V、N253K、N253C、N253R
Y256L、Y256V、Y256I
G257A、G257C
W258Y、W258F、W258N
T273N
G275C、G275S、G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T
N276G、N276M、N276Q、N276H
H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T
Y278P、Y278D
M288Q、M288T
V290M、V290A、V290S、V290N
Y291T、Y291E、Y291G
W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M
S299P
Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W
F305H、F305Y
S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K
Y62P
G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S
V65T、V65K
G66K
T68P、T68H
W69D、W69P
F85H、F85N
F117G、F117T、F117N
Y198S、Y198M、Y198I
S199P
K200M、K200I、K200R、K200L、K200V
H201M、H201L、H201Q
F202V、F202C
W203Y
F223W、F223V、F223H、F223G、F223A
F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q
N253T、N253V、N253K、N253C、N253R
Y256L、Y256V、Y256I
G257C
W258N
G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T
N276G、N276M、N276Q、N276H
H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T
Y278P、Y278D
M288T
V290S、V290N
Y291G
W298Y、W298I、W298L、W298M
F305Y
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
本発明の第2の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
配列番号18:R26N変異体
配列番号19:R26Y変異体
配列番号20:R26S変異体
配列番号21:E28N変異体
配列番号22:E28G変異体
配列番号23:E28F変異体
配列番号24:E28Y変異体
配列番号25:E58R変異体
配列番号26:E58L変異体
本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本発明の改変型酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、各種タンパク質、各種タンパク質の分解物、各種エキス類、各種塩類、各種酸化防止剤、システイン、グルタチオン、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、貝殻焼成カルシウム、二酸化ケイ素などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。タンパク質の例は、大豆タンパク質、小麦タンパク質、トウモロコシタンパク質、乳タンパク質、動物由来タンパク質などである。エキス類の例は肉エキス、植物エキス、酵母エキスなどである。塩類の例は、塩化塩、リン酸塩、ポリリン酸塩、ピロリン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、炭酸塩などである。酸化防止剤の例は、L-アスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウムなどである。本発明の酵素製剤の形状は特に限定されず、例えば粉末状、顆粒状、液体状、カプセル状等である。
本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明の改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、本発明の改変型酵素のアミノ酸配列(例えば配列番号2〜10のいずれか)をコードする核酸を用意する(ステップ(I))。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「本発明の改変型酵素のアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、本発明の改変型酵素のアミノ酸配列は基準トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、基準トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子に対して必要な変異を加えることによっても、「本発明の改変型酵素のアミノ酸配列をコードする核酸」を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例えば、Quick change(ストラタジーン社)等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(ストラタジーン社)などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
有用性の高い改変型のトランスグルタミナーゼの取得を目指し、蛋白質工学を用い、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼ(野生型酵素。配列番号1)の酵素機能の改良(温度安定性の低減、耐熱性の向上、抗酸化性の向上、反応性の向上、脱アミド酵素化)を試みた。まず、アミノ酸置換による変異を導入することにし、CASTing library(例えばAngew Chem Int Ed Engl. 2006 Feb 13;45(8):1236-41.を参照)及びアラニンスキャニング(Ala scanning)(例えばJ Mol Biol. 1995 Feb 17;246(2):317-30.を参照)を利用して変異点の候補を選出した。次に、以下の方法で各変異点に変異を導入し、変異酵素を調製した。
1−1.変異の導入
(1)変異導入用のPCRプライマーを設計する。
(2)各変異点用のプライマーセットを用い、トランスグルタミナーゼ遺伝子(配列番号17)が組み込まれたプラスミドpET20bを鋳型としてPCR(98℃で1分の反応の後、98℃で10秒、60℃で15秒、68℃で2分の反応を15サイクル行い、68℃で5分反応させた後、4℃で放置)。
(3)PCR反応液(25μL/チューブ)にDpnI(1.5μL/チューブ)を添加して処理(37℃、3時間以上)する。
(4)T4キナーゼを用い、ライゲーション処理(16℃、一晩)する。
(5)ライゲーション反応液(11μL/チューブ)でE.coli BL21(DE3)を形質転換し、アンピシリン含有LB培地で培養(37℃、一晩)する。
(1)変異が導入された株(変異株)をアンピシリン含有TB培地に植菌し、33℃、48時間培養する。培養開始から24時間の時点でIPTG(最終濃度0.1mM)を添加する。
(2)培養液を遠心分離(3,000 g × 10分)した後、上澄みを除去して菌体を回収する。
(3)溶菌剤を添加して菌体を溶菌させる。
(4)溶菌液を遠心分離(3,000 g × 10分)した後、上澄みを回収して酵素抽出液とする。
(1)酵素抽出液と2mg/mLプロテアーゼ(ディスパーゼ)溶液を等量混合し、反応(30℃、2時間以上)させる。
(2)混合液を遠心分離(3,000 g × 10分)した後、上澄みを回収して成熟体化酵素とする。
調製した各変異酵素の特性を評価する際には以下の活性測定法を用いた。
<活性測定法>
成熟体化酵素を200mM Tris-HCl pH6.0で適当な濃度に希釈する(サンプル溶液)。サンプル溶液10μLに基質溶液(R-1) 100μLを添加し混合した後、37℃で10分間反応させる。発色溶液(R-2) 100μLを加えて反応を停止させるともにFe錯体を形成させた後、525nmの吸光度を測定する。対照として、予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、サンプル溶液との吸光度差を求める。別途、酵素液の代わりにL−グルタミン酸−γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求める。1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位(1U)とする。
(基質溶液(R-1))
2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1.3-プロパンジオール 2.42g、塩酸ヒドロキシアンモニウム 0.70g、還元型グルタチオン 0.31g、Z-Gln-Gly (ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミニルグリシン) 1.01gを蒸留水に溶解し総量100 mLとする(pH 6.0)。
(基質溶液(R-2))
3M 塩酸溶液 30 mL、12% トリクロロ酢酸溶液 30 mL、5% 塩化鉄(III)溶液 30 mLを混合する。
成熟体化酵素を200mM Tris-HCl pH6.0で2倍希釈し、所定の温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)にて30分間処理する。処理後に活性測定し、処理前の活性と比較することで、活性の残存率を算出する。
活性残存率(%)=(熱処理後の酵素活性)/(熱処理前の酵素活性)×100
対野生型(%)=(変異酵素の活性残存率)/(野生型酵素の活性残存率)×100
(1)変異点がV6、置換後のアミノ酸がQ、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W又はY
(2)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、H、Y、D、G、N、P又はS
(3)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P又はY
(4)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y又はL
(5)変異点がY34、置換後のアミノ酸がA
(6)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V又はW
(7)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G又はH
(8)変異点がW59、置換後のアミノ酸がR、N、Y、A、S、I、V、D、G又はP
(9)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W又はY
(10)変異点がY62、置換後のアミノ酸がC、R、G、K又はS
(11)変異点がV65、置換後のアミノ酸がN、L、M、F、W又はY
(12)変異点がV67、置換後のアミノ酸がL、N、A、C、M、Q又はS
(13)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L、A、S、M、F、N、Q又はY
(14)変異点がW69、置換後のアミノ酸がH、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T又はV
(15)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がW、D、G又はK
(16)変異点がY75、置換後のアミノ酸がR、Q、T又はG
(17)変異点がT77、置換後のアミノ酸がM、H、E、C又はG
(18)変異点がF85、置換後のアミノ酸がM
(19)変異点がF90、置換後のアミノ酸がC、M、H、L又はV
(20)変異点がF108、置換後のアミノ酸がR、L、T、A、I、K、N又はV
(21)変異点がF117、置換後のアミノ酸がM又はL
(22)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、M、N、K又はV
(23)変異点がF202、置換後のアミノ酸がL又はW
(24)変異点がW203、置換後のアミノ酸がF
(25)変異点がF254、置換後のアミノ酸がY又はM
(26)変異点がT273、置換後のアミノ酸がI、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W又はH
(27)変異点がN276、置換後のアミノ酸がC、E、K、L、S、T又はV
(28)変異点がY278、置換後のアミノ酸がM、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T又はV
(29)変異点がS284、置換後のアミノ酸がW、Y、M、F又はN
(30)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、W、L、A、C、K、N、Q、R、S又はV
(31)変異点がS299、置換後のアミノ酸がI、Y、V、K、M、Q、A、F、G又はE
(32)変異点がS303、置換後のアミノ酸がN、G、C、V、P又はY
(33)変異点がY310、置換後のアミノ酸がC、M又はI
V6S、V6C、V6K、V6L、V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y
R26M、R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S
E28N、E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y
V30P、V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L
Y34A
Y42A、Y42C、Y42D、Y42E、Y42G、Y42I、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42T、Y42V、Y42W
E58G、E58H
W59S、W59I、W59V、W59D、W59G、W59P
L60M、L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y
Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S
V65N、V65L、V65M、V65F、V65W、V65Y
V67L、V67N、V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S
T68M、T68F、T68N、T68Q、T68Y
W69M、W69I、W69C、W69E、W69F、W69G、W69K、W69L、W69N、W69Q、W69R、W69S、W69T、W69V
Y75T、Y75G
F85M
F90V
F108T、F108A、F108I、F108K、F108N、F108V
F117L
S199K、S199V
F202W
T273L、T273R、T273G、T273A、T273E、T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H
N276C、N276E、N276K、N276L、N276T、N276V、N276S
Y278L、Y278H、Y278I、Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V
Y291W、Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V
S299E
Y310I
V6H、V6F、V6G、V6N、V6P、V6R、V6W、V6Y
R26H、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S
E28F、E28G、E28L、E28P、E28Y
V30C、V30A、V30E、V30F、V30G、V30H、V30K、V30N、V30Q、V30R、V30W、V30Y、V30L
Y34A
Y42A、Y42C、Y42D、Y42E、Y42G、Y42I、Y42L、Y42M、Y42Q、Y42S、Y42T、Y42V、Y42W
W59I、W59V、W59D、W59G、W59P
L60V、L60A、L60C、L60E、L60F、L60Q、L60S、L60T、L60W、L60Y
Y62C、Y62R、Y62G、Y62K、Y62S
V65M、V65F、V65W、V65Y
V67A、V67C、V67M、V67Q、V67S
T68F、T68N、T68Q、T68Y
W69M、W69I、W69C、W69E、W69F、W69G、W69K、W69L、W69N、W69Q、W69R、W69S、W69T、W69V
Y75T、Y75G
F108A、F108I、F108K、F108N、F108V
F117L
F202W
T273F、T273Y、T273D、T273K、T273W、T273H
N276C、N276E、N276K、N276L、N276S、N276T、N276V
Y278K、Y278R、Y278W、Y278C、Y278G、Y278N、Y278Q、Y278S、Y278T、Y278V
Y291L、Y291A、Y291C、Y291K、Y291N、Y291Q、Y291R、Y291S、Y291V
S299E
(34)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、P、E、S又はY
(35)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV
(36)変異点がY34、置換後のアミノ酸がW
(37)変異点がV67、置換後のアミノ酸がH
(38)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI
(39)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がF
(40)変異点がT77、置換後のアミノ酸がQ
(41)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC又はQ
(42)変異点がT273、置換後のアミノ酸がQ
(43)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL、H、K、P又はR
(44)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN
(45)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK
D3P、D3E、D3S、D3Y
R26V
Y34W
V67H
T77Q
S199C、S199Q
T273Q
S284H、S284K、S284P、S284R
S303K
D3E、D3S、D3Y
R26V
Y34W
V67H
S199Q
T273Q
S284H、S284K、S284P、S284R
過酸化水素(30〜35%)(Wako, 試薬特級)を200mM Tris-HCl pH6.0で希釈し、酸化剤としての過酸化水素溶液(0.03%)を調製する。成熟体酵素を過酸化水素溶液で2倍希釈した後、30℃で1時間反応させる。反応度に活性測定し、処理前の活性と比較することで、活性の残存率を算出する。
活性残存率(%)=(過酸化水素処理後の酵素活性)/(処理前の酵素活性) ×100
対野生型(%)=(変異酵素の活性残存率)/(野生型酵素の活性残存率) ×100
(46)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、Q、S又はY
(47)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP
(48)変異点がR26、置換後のアミノ酸がM、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P又はV
(49)変異点がE28、置換後のアミノ酸がL、M、K、C、V、R、W、G、N、F、Y又はH
(50)変異点がY42、置換後のアミノ酸がL、N又はF
(51)変異点がE58、置換後のアミノ酸がQ、A、I、V、L、T、M、K、Y、W、F又はR
(52)変異点がV67、置換後のアミノ酸がT、S又はA
(53)変異点がT68、置換後のアミノ酸がL、I、V又はM
(54)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV
(55)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD
(56)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC
(57)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE
(58)変異点がS284、置換後のアミノ酸がR又はH
(59)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、S、F、L、C、N、V又はM
D3S、D3Y
V6P
R26W、R26C、R26Q、R26G、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26D、R26I、R26S、R26P、R26V
E28L、E28M、E28K、E28C、E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H
E58A、E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R
V67S、V67A
T68I、T68V、T68M
T273E
S284R、S284H
Y291C、Y291N、Y291V、Y291M
V6P
R26C、R26Q、R26G、R26Y、R26E、R26T、R26N、R26D、R26I、R26S、R26P、R26V
E28V、E28R、E28W、E28G、E28N、E28F、E28Y、E28H
Y42F
E58I、E58V、E58L、E58T、E58M、E58K、E58Y、E58W、E58F、E58R
T68I、T68V、T68M
S284H
成熟体化酵素を200mM Tris-HCl pH6.0で適当な濃度に希釈し(サンプル溶液)、活性測定する。野生型に対する相対値を以下の計算式で算出し、反応性の向上に有効なアミノ酸置換を特定した。
対野生型(%)=(変異酵素の活性)/(野生型酵素の活性) ×100
(60)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM、K又はV
(61)変異点がF251、置換後のアミノ酸がY
(62)変異点がV6とY75、変異点V6の置換後のアミノ酸がE、変異点Y75の置換後のアミノ酸がF
(63)変異点がD3とT77、変異点D3の置換後のアミノ酸がP、変異点T77の置換後のアミノ酸がQ
S284V
F251Y
V6EとY75Fの二重変異
D3PとT77Qの二重変異
V6EとY75Fの二重変異
D3PとT77Qの二重変異
(64)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(65)変異点がD3、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上
(66)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上
(67)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(68)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(69)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(70)変異点がR26、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下、抗酸化性向上及び反応性向上
(71)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、S、R、K、M、N、F、G、L又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(72)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、G、N、R又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(73)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(74)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、L又はQ、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(75)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(76)変異点がV67、置換後のアミノ酸がA又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(77)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(78)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(79)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上
(80)変異点がT77、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(81)変異点がT77、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(82)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上
(83)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(84)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上
(85)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(86)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM又はF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(87)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL又はK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上
(88)変異点がS284、置換後のアミノ酸がH又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上
(89)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、L、C、N、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上
(90)変異点がS299、置換後のアミノ酸がV、K、M又はA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上
(91)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上
R26K、R26Q、R26M、R26Y、R26D、R26G、R26N、R26P、R26S
E28V、E28R、E28K、E28M、E28N、E28F、E28G、E28L、E28Y
Y42F、Y42L、Y42M
E58Y、E58M、E58A、E58F、E58I、E58V、E58R、E58K、E58L、E58Q
V67A、V67S
T68C、T68L、T68M
T77C
T273E
Y291I、Y291L、Y291C、Y291N、Y291S、Y291V
成熟体酵素の脱アミド活性とトランスグルタミナーゼ活性の各々を、野生型酵素に対する相対値として以下の計算式で算出した後、脱アミド活性(対野生型比率)/トランスグルタミナーゼ活性(対野生型比率)の値によって、基質特異性の変化(即ち、脱アミド酵素化)の程度を評価し、脱アミド酵素化に有効なアミノ酸置換を特定した。尚、脱アミド活性は以下の方法で測定し、トランスグルタミナーゼ活性については、基質溶液(R-1)を用いた上記の活性測定法で測定した。
脱アミド活性(対野生型比率)(%)=(変異酵素の脱アミド活性)/(野生型酵素の脱アミド活性)×100
トランスグルタミナーゼ活性(対野生型比率)(%)=(変異酵素のトランスグルタミナーゼ活性)/(野生型酵素のトランスグルタミナーゼ活性)×100
成熟体化酵素を200mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で適当な濃度に希釈する(サンプル溶液)。サンプル溶液20μLに基質溶液(1% Z-Gln-Gly、200mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0)を80μL添加し混合した後、37℃で24時間反応させる。アンモニアテストワコー(WAKO)を用いて、反応サンプル20μLに発色試薬A 40μL、発色試薬B 20μL、発色試薬C 40μLを添加して、37℃で10分反応させる。発色サンプル50μLと除蛋白液50μLを混合し、遠心分離した後、上澄みを回収して、630nmの吸光度を測定する。
(92)変異点がR5、置換後のアミノ酸がQ、P、C、M、I、V、Y、F、S、N、T又はG
(93)変異点がY34、置換後のアミノ酸がH又はM
(94)変異点がW59、置換後のアミノ酸がK又はE
(95)変異点がS61、置換後のアミノ酸がT、V、Y、D、I、L、N、E、M、F、W、Q、P、H又はK
(96)変異点がY62、置換後のアミノ酸がD又はP
(97)変異点がG63、置換後のアミノ酸がD、Q、Y、R、K、H、P、M、N、C、F、L、W、T、V又はS
(98)変異点がV65、置換後のアミノ酸がC、T又はK
(99)変異点がG66、置換後のアミノ酸がW又はK
(100)変異点がT68、置換後のアミノ酸がP又はH
(101)変異点がW69、置換後のアミノ酸がY、D又はP
(102)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がR又はP
(103)変異点がF85、置換後のアミノ酸がY、W、L、I、Q、C、T、A、V、S、R、H又はN
(104)変異点がF108、置換後のアミノ酸がQ、C、E、S又はN
(105)変異点がF117、置換後のアミノ酸がC、I、W、V、A、G、T又はN
(106)変異点がY198、置換後のアミノ酸がF、H、L、S、M又はI
(107)変異点がS199、置換後のアミノ酸がQ又はP
(108)変異点がK200、置換後のアミノ酸がY、M、I、R、L又はV
(109)変異点がH201、置換後のアミノ酸がK、R、M、L又はQ
(110)変異点がF202、置換後のアミノ酸がY、M、H、V又はC
(111)変異点がW203、置換後のアミノ酸がY
(112)変異点がF223、置換後のアミノ酸がY、M、L、W、V、H、G又はA
(113)変異点がR238、置換後のアミノ酸がA、D、V、G、H又はS
(114)変異点がF251、置換後のアミノ酸がH、N、C、M、R、S、A、T、L、P、G、V又はQ
(115)変異点がV252、置換後のアミノ酸がM、L、T又はC
(116)変異点がN253、置換後のアミノ酸がT、V、K、C又はR
(117)変異点がY256、置換後のアミノ酸がL、V又はI
(118)変異点がG257、置換後のアミノ酸がA又はC
(119)変異点がW258、置換後のアミノ酸がY、F又はN
(120)変異点がT273、置換後のアミノ酸がN
(121)変異点がG275、置換後のアミノ酸がA、C、S、V、K、I、F、H、R、L、P、Q、Y、N、M又はT
(122)変異点がN276、置換後のアミノ酸がG、M、Q又はH
(123)変異点がH277、置換後のアミノ酸がN、S、Q、C、E、K、D、I、R、M、P、L、W、V、Y、G、F又はT
(124)変異点がY278、置換後のアミノ酸がP又はD
(125)変異点がH279、置換後のアミノ酸がN
(126)変異点がS284、置換後のアミノ酸がC
(127)変異点がM288、置換後のアミノ酸がV、Q又はT
(128)変異点がV290、置換後のアミノ酸がT、C、L、M、A、S又はN
(129)変異点がY291、置換後のアミノ酸がH、T、E又はG
(130)変異点がW298、置換後のアミノ酸がF、Y、I、L又はM
(131)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN又はP
(132)変異点がY302、置換後のアミノ酸がL、H、M、V、C、T、P、S又はW
(133)変異点がS303、置換後のアミノ酸がI、Q、D、H又はE
(134)変異点がF305、置換後のアミノ酸がW、H又はY
R5Q、R5P、R5C、R5M、R5I、R5V、R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G
Y34H、Y34M
W59K、W59E
S61T、S61V、S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K
Y62D、Y62P
G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S
V65C、V65T、V65K
G66W、G66K
T68P、T68H
W69Y、W69D、W69P
Q74R、Q74P
F85Y、F85W、F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N
F108Q、F108C、F108E、F108S、F108N
F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N
Y198F、Y198H、Y198L、Y198S、Y198M、Y198I
S199Q、S199P
K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V
H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q
F202Y、F202M、F202H、F202V、F202C
W203Y
F223Y、F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A
R238A、R238D、R238V、R238G、R238H、R238S
F251H、F251N、F251C、F251M、F251R、F251S、F251A、F251T、F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q
V252M、V252L、V252T、V252C
N253T、N253V、N253K、N253C、N253R
Y256L、Y256V、Y256I
G257A、G257C
W258Y、W258F、W258N
T273N
G275A、G275C、G275S、G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T
N276G、N276M、N276Q、N276H
H277N、H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T
Y278P、Y278D
H279N
S284C
M288V、M288Q、M288T
V290T、V290C、V290L、V290M、V290A、V290S、V290N
Y291H、Y291T、Y291E、Y291G
W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M
S299N、S299P
Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W
S303I、S303Q、S303D、S303H、S303E
F305W、F305H、F305Y
R5Y、R5F、R5S、R5N、R5T、R5G
Y34M
S61T、S61V、S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K
Y62P
G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S
V65C、V65T、V65K
G66K
T68P、T68H
W69D、W69P
F85L、F85I、F85Q、F85C、F85T、F85A、F85V、F85S、F85R、F85H、F85N
F108C、F108E、F108S、F108N
F117C、F117I、F117W、F117V、F117A、F117G、F117T、F117N
Y198L、Y198S、Y198M、Y198I
S199Q、S199P
K200Y、K200M、K200I、K200R、K200L、K200V
H201K、H201R、H201M、H201L、H201Q
F202M、F202H、F202V、F202C
W203Y
F223M、F223L、F223W、F223V、F223H、F223G、F223A
R238H、R238S
F251N、F251C、F251M、F251R、F251S、F251A、F251T、F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q
V252L、V252T、V252C
N253T、N253V、N253K、N253C、N253R
Y256L、Y256V、Y256I
G257A、G257C
W258Y、W258F、W258N
T273N
G275C、G275S、G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T
N276G、N276M、N276Q、N276H
H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T
Y278P、Y278D
M288Q、M288T
V290M、V290A、V290S、V290N
Y291T、Y291E、Y291G
W298F、W298Y、W298I、W298L、W298M
S299P
Y302L、Y302H、Y302M、Y302V、Y302C、Y302T、Y302P、Y302S、Y302W
F305H、F305Y
S61Y、S61D、S61I、S61L、S61N、S61E、S61M、S61F、S61W、S61Q、S61P、S61H、S61K
Y62P
G63D、G63Q、G63Y、G63R、G63K、G63H、G63P、G63M、G63N、G63C、G63F、G63L、G63W、G63T、G63V、G63S
V65T、V65K
G66K
T68P、T68H
W69D、W69P
F85H、F85N
F117G、F117T、F117N
Y198S、Y198M、Y198I
S199P
K200M、K200I、K200R、K200L、K200V
H201M、H201L、H201Q
F202V、F202C
W203Y
F223W、F223V、F223H、F223G、F223A
F251L、F251P、F251G、F251V、F251Q
N253T、N253V、N253K、N253C、N253R
Y256L、Y256V、Y256I
G257C
W258N
G275V、G275K、G275I、G275F、G275H、G275R、G275L、G275P、G275Q、G275Y、G275N、G275M、G275T
N276G、N276M、N276Q、N276H
H277S、H277Q、H277C、H277E、H277K、H277D、H277I、H277R、H277M、H277P、H277L、H277W、H277V、H277Y、H277G、H277F、H277T
Y278P、Y278D
M288T
V290S、V290N
Y291G
W298Y、W298I、W298L、W298M
F305Y
配列番号3:人工配列の説明:R26Y変異体
配列番号4:人工配列の説明:R26S変異体
配列番号5:人工配列の説明:E28N変異体
配列番号6:人工配列の説明:E28G変異体
配列番号7:人工配列の説明:E28F変異体
配列番号8:人工配列の説明:E28Y変異体
配列番号9:人工配列の説明:E58R変異体
配列番号10:人工配列の説明:E58L変異体
配列番号18:人工配列の説明:R26N変異体
配列番号19:人工配列の説明:R26Y変異体
配列番号20:人工配列の説明:R26S変異体
配列番号21:人工配列の説明:E28N変異体
配列番号22:人工配列の説明:E28G変異体
配列番号23:人工配列の説明:E28F変異体
配列番号24:人工配列の説明:E28Y変異体
配列番号25:人工配列の説明:E58R変異体
配列番号26:人工配列の説明:E58L変異体
Claims (13)
- 配列番号1のアミノ酸配列において、以下の(1)〜(134)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている)を有し、前記アミノ酸置換に対応した特性変化が認められる改変型トランスグルタミナーゼ:
(1)変異点がV6、置換後のアミノ酸がQ、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(2)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、H、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(3)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(4)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(5)変異点がY34、置換後のアミノ酸がA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(6)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V又はW、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(7)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(8)変異点がW59、置換後のアミノ酸がR、N、Y、A、S、I、V、D、G又はP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(9)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(10)変異点がY62、置換後のアミノ酸がC、R、G、K又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(11)変異点がV65、置換後のアミノ酸がN、L、M、F、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(12)変異点がV67、置換後のアミノ酸がL、N、A、C、M、Q又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(13)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L、A、S、M、F、N、Q又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(14)変異点がW69、置換後のアミノ酸がH、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(15)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がW、D、G又はK、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(16)変異点がY75、置換後のアミノ酸がR、Q、T又はG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(17)変異点がT77、置換後のアミノ酸がM、H、E、C又はG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(18)変異点がF85、置換後のアミノ酸がM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(19)変異点がF90、置換後のアミノ酸がC、M、H、L又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(20)変異点がF108、置換後のアミノ酸がR、L、T、A、I、K、N又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(21)変異点がF117、置換後のアミノ酸がM又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(22)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、M、N、K又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(23)変異点がF202、置換後のアミノ酸がL又はW、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(24)変異点がW203、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(25)変異点がF254、置換後のアミノ酸がY又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(26)変異点がT273、置換後のアミノ酸がI、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(27)変異点がN276、置換後のアミノ酸がC、E、K、L、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(28)変異点がY278、置換後のアミノ酸がM、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(29)変異点がS284、置換後のアミノ酸がW、Y、M、F又はNアミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(30)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、W、L、A、C、K、N、Q、R、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(31)変異点がS299、置換後のアミノ酸がI、Y、V、K、M、Q、A、F、G又はE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(32)変異点がS303、置換後のアミノ酸がN、G、C、V、P又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(33)変異点がY310、置換後のアミノ酸がC、M又はI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下;
(34)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、P、E、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(35)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(36)変異点がY34、置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(37)変異点がV67、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(38)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(39)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(40)変異点がT77、置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(41)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC又はQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(42)変異点がT273、置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(43)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL、H、K、P又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(44)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(45)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上;
(46)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、Q、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(47)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(48)変異点がR26、置換後のアミノ酸がM、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P又はV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(49)変異点がE28、置換後のアミノ酸がL、M、K、C、V、R、W、G、N、F、Y又はH、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(50)変異点がY42、置換後のアミノ酸がL、N又はF、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(51)変異点がE58、置換後のアミノ酸がQ、A、I、V、L、T、M、K、Y、W、F又はR、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(52)変異点がV67、置換後のアミノ酸がT、S又はA、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(53)変異点がT68、置換後のアミノ酸がL、I、V又はM、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(54)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(55)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(56)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(57)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(58)変異点がS284、置換後のアミノ酸がR又はH、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(59)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、S、F、L、C、N、V又はM、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上;
(60)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM、K又はV、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(61)変異点がF251、置換後のアミノ酸がY、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(62)変異点がV6とY75、変異点V6の置換後のアミノ酸がE、変異点Y75の置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(63)変異点がD3とT77、変異点D3の置換後のアミノ酸がP、変異点T77の置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が反応性向上;
(64)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(65)変異点がD3、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上;
(66)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上;
(67)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(68)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(69)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(70)変異点がR26、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下、抗酸化性向上及び反応性向上;
(71)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、R、K、M、N、F、G、L又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(72)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、G、N、R又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(73)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(74)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、L又はQ、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(75)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(76)変異点がV67、置換後のアミノ酸がA又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(77)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(78)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(79)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上;
(80)変異点がT77、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(81)変異点がT77、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(82)変異点がT77、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上及び反応性向上;
(83)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(84)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上、抗酸化性向上及び反応性向上;
(85)変異点がT273、置換後のアミノ酸がE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(86)変異点がS284、置換後のアミノ酸がM又はF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(87)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL又はK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上;
(88)変異点がS284、置換後のアミノ酸がH又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び抗酸化性向上;
(89)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、L、C、N、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び抗酸化性向上;
(90)変異点がS299、置換後のアミノ酸がV、K、M又はA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上;
(91)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上及び反応性向上;
(92)変異点がR5、置換後のアミノ酸がQ、P、C、M、I、V、Y、F、S、N、T又はG、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(93)変異点がY34、置換後のアミノ酸がH又はM、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(94)変異点がW59、置換後のアミノ酸がK又はE、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(95)変異点がS61、置換後のアミノ酸がT、V、Y、D、I、L、N、E、M、F、W、Q、P、H又はK、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(96)変異点がY62、置換後のアミノ酸がD又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(97)変異点がG63、置換後のアミノ酸がD、Q、Y、R、K、H、P、M、N、C、F、L、W、T、V又はS、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(98)変異点がV65、置換後のアミノ酸がC、T又はK、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(99)変異点がG66、置換後のアミノ酸がW又はK、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(100)変異点がT68、置換後のアミノ酸がP又はH、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(101)変異点がW69、置換後のアミノ酸がY、D又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(102)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がR又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(103)変異点がF85、置換後のアミノ酸がY、W、L、I、Q、C、T、A、V、S、R、H又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(104)変異点がF108、置換後のアミノ酸がQ、C、E、S又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(105)変異点がF117、置換後のアミノ酸がC、I、W、V、A、G、T又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(106)変異点がY198、置換後のアミノ酸がF、H、L、S、M又はI、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(107)変異点がS199、置換後のアミノ酸がQ又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(108)変異点がK200、置換後のアミノ酸がY、M、I、R、L又はV、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(109)変異点がH201、置換後のアミノ酸がK、R、M、L又はQ、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(110)変異点がF202、置換後のアミノ酸がY、M、H、V又はC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(111)変異点がW203、置換後のアミノ酸がY、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(112)変異点がF223、置換後のアミノ酸がY、M、L、W、V、H、G又はA、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(113)変異点がR238、置換後のアミノ酸がA、D、V、G、H又はS、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(114)変異点がF251、置換後のアミノ酸がH、N、C、M、R、S、A、T、L、P、G、V又はQ、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(115)変異点がV252、置換後のアミノ酸がM、L、T又はC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(116)変異点がN253、置換後のアミノ酸がT、V、K、C又はR、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(117)変異点がY256、置換後のアミノ酸がL、V又はI、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(118)変異点がG257、置換後のアミノ酸がA又はC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(119)変異点がW258、置換後のアミノ酸がY、F又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(120)変異点がT273、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(121)変異点がG275、置換後のアミノ酸がA、C、S、V、K、I、F、H、R、L、P、Q、Y、N、M又はT、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(122)変異点がN276、置換後のアミノ酸がG、M、Q又はH、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(123)変異点がH277、置換後のアミノ酸がN、S、Q、C、E、K、D、I、R、M、P、L、W、V、Y、G、F又はT、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(124)変異点がY278、置換後のアミノ酸がP又はD、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(125)変異点がH279、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(126)変異点がS284、置換後のアミノ酸がC、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(127)変異点がM288、置換後のアミノ酸がV、Q又はT、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(128)変異点がV290、置換後のアミノ酸がT、C、L、M、A、S又はN、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(129)変異点がY291、置換後のアミノ酸がH、T、E又はG、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(130)変異点がW298、置換後のアミノ酸がF、Y、I、L又はM、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(131)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN又はP、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(132)変異点がY302、置換後のアミノ酸がL、H、M、V、C、T、P、S又はW、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(133)変異点がS303、置換後のアミノ酸がI、Q、D、H又はE、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化;
(134)変異点がF305、置換後のアミノ酸がW、H又はY、アミノ酸置換による特性変化が脱アミド酵素化。 - 前記同一性が82%以上である、請求項1に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
- 前記同一性が85%以上である、請求項1に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
- 前記同一性が90%以上である、請求項1に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
- 配列番号2〜10のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
- 配列番号18〜26のいずれかの塩基配列を含む、請求項6に記載の遺伝子。
- 請求項6又は7に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項8に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼを含む酵素剤。
- 以下のステップ(I)〜(III)を含む、改変型トランスグルタミナーゼの調製法:
(I)請求項1〜5のいずれか一項の改変型トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。 - 前記アミノ酸配列が配列番号2〜10のいずれかのアミノ酸配列である、請求項11に記載の調製法。
- 前記核酸が、配列番号18〜26のいずれかの塩基配列を含む、請求項12に記載の調製法。
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