JPWO2019044531A1 - 改変型リパーゼ及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]配列番号1のアミノ酸配列において、T130C-S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y及びS300Pからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有する、配列番号1のアミノ酸配列からなるリパーゼに比較して高温での反応性及び/又は安定性が向上した改変型リパーゼ。
[2]改変型リパーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がT130C-S153C又はS283Yであり、高温での反応性が向上している、[1]に記載の改変型リパーゼ。
[3]改変型リパーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がA249P、S283Y又はS300Pであり、高温での安定性が向上している、[1]に記載の改変型リパーゼ。
[4]配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列であり(但し、同一性の基準が配列番号2のアミノ酸配列の場合は130位システイン及び153位システイン以外の位置、同一性の基準が配列番号3のアミノ酸配列の場合は249位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号4のアミノ酸配列の場合は259位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号5のアミノ酸配列の場合は282位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号6のアミノ酸配列の場合は283位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号7のアミノ酸配列の場合は300位プロリン以外の位置、においてアミノ酸配列の相違は生じている)、配列番号1のアミノ酸配列からなるリパーゼに比較して高温での反応性及び/又は安定性が向上したリパーゼ。
[5][1]〜[4]のいずれか一項に記載の改変型リパーゼをコードする遺伝子。
[6]配列番号8〜19のいずれかの塩基配列を含む、[5]に記載の遺伝子。
[7][5]又は[6]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
[8][7]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[9]宿主が、エシェリヒア・コリ、カンジダ・シリンドラッセ、アスペルギルス・オリゼ、バチルス・サチルス又はピキア・パストリスである、[8]に記載の微生物。
[10][1]〜[4]のいずれか一項に記載の改変型リパーゼを含む酵素剤。
[11][1]〜[4]のいずれか一項に記載の酵素又は[10]に記載の酵素剤を油脂に作用させ、酵素反応を行うことを特徴とする、油脂の分解法。
[12]酵素反応が30℃〜70℃で行われる、[11]に記載の分解法。
[13]以下のステップ(I)〜(III)を含む、改変型リパーゼの調製法:
(I)配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
(用語)
用語「改変型リパーゼ」とは、基準となるリパーゼ(以下、「基準リパーゼ」と呼ぶ)を改変ないし変異して得られる酵素である。基準リパーゼは、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列を有する、カンジダ・シリンドラッセ(Candida cylindracea)由来のリパーゼである。用語「カンジダ・シリンドラッセ(Candida cylindracea)由来のリパーゼ」と用語「カンジダ・ルゴーサ(Candida rugosa)由来のリパーゼ」とは交換可能に使用される。
メチオニン:M、セリン:S、アラニン:A、トレオニン:T、バリン:V、チロシン:Y、ロイシン:L、アスパラギン:N、イソロイシン:I、グルタミン:Q、プロリン:P、アスパラギン酸:D、フェニルアラニン:F、グルタミン酸:E、トリプトファン:W、リジン:K、システイン:C、アルギニン:R、グリシン:G、ヒスチジン:H
本発明の第1の局面は改変型リパーゼ(改変型酵素)に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列において、T130C-S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y及びS300Pからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。当該特徴により、配列番号1のアミノ酸配列からなるリパーゼに比較して高温での反応性又は高温での安定性、或いはこれらの両者が向上している。尚、配列番号1のアミノ酸配列は、カンジダ・シリンドラッセ由来のリパーゼ(本願明細書中で「LIP1」と呼ぶ)の成熟体(即ち、シグナルペプチドを含まない)の配列である。
相対活性=(60℃での酵素活性/30℃での酵素活性)×100(%)
活性残存率=(熱処理後の酵素活性/熱処理前の酵素活性)×100(%)
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
本発明の第2の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
配列番号8:変異体1(T130C-S153C)
配列番号9:変異体2(A249P)
配列番号10:変異体3(F259Y)
配列番号11:変異体4(S282P)
配列番号12:変異体5(S283Y)
配列番号13:変異体6(S300P)
配列番号14(配列番号8の配列においてコドンの置換をしたもの)
配列番号15(配列番号9の配列においてコドンの置換をしたもの)
配列番号16(配列番号10の配列においてコドンの置換をしたもの)
配列番号17(配列番号11の配列においてコドンの置換をしたもの)
配列番号18(配列番号12の配列においてコドンの置換をしたもの)
配列番号19(配列番号13の配列においてコドンの置換をしたもの)
本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本発明の改変型酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
本発明の更なる局面は改変型酵素及び酵素剤の用途に関し、本発明の改変型酵素又は酵素剤を用いた各種反応(加水分解、合成、転移)が提供される。具体的には、含油脂廃水やグリーストラップにおける油脂の分解、食品加工(例えば、乳フレーバーの製造、油脂の分解、FPA・DHAの製造、製パン、卵白処理)、有機合成反応(例えば、ラセミ体の光学分割、対称性化合物の非対称化、水酸基の位置選択的なアシル化)などに本発明の改変型酵素又は酵素剤を利用可能である。本発明の改変型酵素は高温での反応性・安定性に優れる。この特性は、特に常温で固化する油脂(飽和脂肪酸を含む油脂、動物性油脂など)に対する反応性を高め、上記の如き用途において有利に作用する。以下、用途の具体例として、高温下でのリパーゼの反応が望まれる、廃水中などの油脂の分解法を説明する。廃水中やグリースストラップ内に存在する油脂には、融点/凝固点が高く、常温下(20℃±10℃)での加水分解処理が困難な油脂(例えば、ラードやヘッドなどの動物性油脂)が含まれることが多い。本発明の油脂分解法は、このような油脂を効率的に分解することに有用である。従って、本発明の油脂分解法は、好ましい態様として、融点/凝固点が高い油脂を含有するもの(油脂含有物)を分解対象とする。当該油脂含有物の例は、飲食店や病院、ホテル等の排水、家庭排水、食品加工工場や油脂加工工場等から排出される産業廃水、厨房等に設置されるグリーストラップ内の排水や蓄積物である。尚、「グリーストラップ」とは、排水中の油を分離し、収集するための装置であり、典型的には3槽から構成される。第1槽はバスケットを備え、食材片や残飯などを捕捉する。第2槽では油水が分離される。油と分離した排水は第3槽に送られ、沈降性のゴミなどが除去される。飲食店や病院、ホテル等の業務用厨房にはグリーストラップの設置が義務づけられている。
本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する(ステップ(I))。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号2〜7のアミノ酸配列はいずれも、カンジダ・シリンドラッセ由来リパーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、カンジダ・シリンドラッセ由来リパーゼをコードする遺伝子に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸(遺伝子)を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例えば、Quick change(ストラタジーン社)等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(ストラタジーン社)などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
カンジダ・シリンドラッセ由来リパーゼ(配列番号1)の高温反応性又は高温安定性の向上を目指し、ジスルフィド結合の形成、ループの固定化(Pro導入)、水素結合の強化、及び疎水性の強化の観点から変異点(置換するアミノ酸残基)を選択し、22種類の変異体(改変型リパーゼ)を設計した。設計した各変異体を以下の方法で作製し、その特性を評価した。尚、配列番号1のアミノ酸配列はカンジダ・シリンドラッセ由来リパーゼの成熟体(シグナルペプチドを含まない)であるが、シグナルペプチドも含むアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列を配列番号22と配列番号23にそれぞれ示す。
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)宿主発現系(Invitrogen, Pichia Expression Kit)を使用した。プラスミドはpPIC3.5Kを使用し、テンプレートであるカンジダ・シリンドラッセ由来LIP1遺伝子には出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)に最適化されたコドン配列を使用した。Inverse PCR法による変異導入を行い(タカラバイオ Primestar mutagenesis kit)、選択した変異点にアミノ酸置換が生じた各種変異体をコードする遺伝子(配列番号14〜19)を調製した。変異体LIP1遺伝子を含むプラスミドをE. coli DH5αに形質転換した。続いて、変異体LIP1遺伝子を含むプラスミドを形質転換したE. coliより抽出した。
変異体LIP1遺伝子を含むプラスミドをピキア・パストリスGS115に形質転換した(Invitrogen, Pichia Expression Kit)。得られたピキア・パストリス形質転換体を培養し、培養上清を回収した。培養はKitに記載の方法にて実施可能である。例えば、ピキア・パストリス形質転換体をBMGY培地(2.0% Peptone, 1.0% Yeast extract, 100mM Potassium phosphate pH 6.0, 1.34% Yeast Nitrogen Base (without Amino Acids), 0.4μg/mL Biotin, 1.0% Glycerol)に植菌し、試験管で30℃、2日間振とう培養を行い、培養液を50mL BMMY培地(2.0% Peptone, 1.0% Yeast extract, 100mM Potassium phosphate pH 6.0, 1.34% Yeast Nitrogen Base (without Amino Acids), 0.4μg/mL Biotin, 0.5% Methanol)の入ったバッフル付フラスコに植えつぎ30℃、200rpmで1日間培養を行い、集菌後、50mL BMMY培地に懸濁しバッフル付フラスコにて同条件で培養を行い、約12時間おきにメタノールを終濃度0.5%となるように添加し、酵素発現誘導を4日間行った。回収した培養上清(粗酵素液)を用い、各変異体の特性(高温反応性と高温安定性)を評価し、野生型と比較して特性の向上が認められた変異体8種を選択した。
選択した変異体の培養上清を脱塩・濃縮し、20mM マッキルバイン緩衝液(pH3.8)に置換した。置換後の溶液を、同緩衝液で平衡化したSP-sepharose(GE healthcare)カラムにアプライした。0から0.5 mol/L NaClのリニアグラジエントで溶出し、リパーゼ活性を示すフラクションを回収し、精製酵素を獲得した。
各精製酵素について、30℃での酵素活性と60℃での酵素活性をリパーゼキットS(DSバイオファーマメディカル)で測定し、高温反応性が向上しているか確認した。高温反応性は、以下の計算式で算出される相対活性(30℃での酵素活性に対する60℃での酵素活性の比率)で評価した。
相対活性=(60℃での酵素活性/30℃での酵素活性)×100(%)
280nmの吸光度(A280)が等しくなるように各精製酵素をリン酸緩衝液(pH6.0)で希釈し、50℃で30分加熱を行った後、氷上で冷却した。続いて遠心処理し、各サンプルの遠心上清の酵素活性をリパーゼキットS(DSバイオファーマメディカル)で測定した。この測定結果(熱処理後の酵素活性)と熱処理前の酵素活性から活性残存率を以下の通り算出し、高温安定性を評価した。
活性残存率=(熱処理後の酵素活性/熱処理前の酵素活性)×100(%)
変異体1(T130C-S153C):配列番号2
変異体2(A249P):配列番号3
変異体3(F259Y):配列番号4
変異体4(S282P):配列番号5
変異体5(S283Y:配列番号6
変異体6(S300P):配列番号7
Claims (13)
- 配列番号1のアミノ酸配列において、T130C-S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y及びS300Pからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有する、配列番号1のアミノ酸配列からなるリパーゼに比較して高温での反応性及び/又は安定性が向上した改変型リパーゼ。
- 改変型リパーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がT130C-S153C又はS283Yであり、高温での反応性が向上している、請求項1に記載の改変型リパーゼ。
- 改変型リパーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がA249P、S283Y又はS300Pであり、高温での安定性が向上している、請求項1に記載の改変型リパーゼ。
- 配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列であり(但し、同一性の基準が配列番号2のアミノ酸配列の場合は130位システイン及び153位システイン以外の位置、同一性の基準が配列番号3のアミノ酸配列の場合は249位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号4のアミノ酸配列の場合は259位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号5のアミノ酸配列の場合は282位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号6のアミノ酸配列の場合は283位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号7のアミノ酸配列の場合は300位プロリン以外の位置、においてアミノ酸配列の相違は生じている)、配列番号1のアミノ酸配列からなるリパーゼに比較して高温での反応性及び/又は安定性が向上したリパーゼ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変型リパーゼをコードする遺伝子。
- 配列番号8〜19のいずれかの塩基配列を含む、請求項5に記載の遺伝子。
- 請求項5又は6に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項7に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 宿主が、エシェリヒア・コリ、カンジダ・シリンドラッセ、アスペルギルス・オリゼ、バチルス・サチルス又はピキア・パストリスである、請求項8に記載の微生物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変型リパーゼを含む酵素剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の酵素又は請求項10に記載の酵素剤を油脂に作用させ、酵素反応を行うことを特徴とする、油脂の分解法。
- 酵素反応が30℃〜70℃で行われる、請求項11に記載の分解法。
- 以下のステップ(I)〜(III)を含む、改変型リパーゼの調製法:
(I)配列番号2〜7のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
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