WO2021177181A1 - 改変型トランスグルタミナーゼ - Google Patents

改変型トランスグルタミナーゼ Download PDF

Info

Publication number
WO2021177181A1
WO2021177181A1 PCT/JP2021/007453 JP2021007453W WO2021177181A1 WO 2021177181 A1 WO2021177181 A1 WO 2021177181A1 JP 2021007453 W JP2021007453 W JP 2021007453W WO 2021177181 A1 WO2021177181 A1 WO 2021177181A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
substitution
seq
sequence
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/007453
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和典 吉田
Original Assignee
天野エンザイム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 天野エンザイム株式会社 filed Critical 天野エンザイム株式会社
Priority to JP2022505186A priority Critical patent/JPWO2021177181A1/ja
Priority to EP21765318.7A priority patent/EP4116424A1/en
Priority to US17/908,761 priority patent/US20230125821A1/en
Priority to CN202180018320.8A priority patent/CN115210379A/zh
Publication of WO2021177181A1 publication Critical patent/WO2021177181A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to transglutaminase. More specifically, the present invention relates to a modified transglutaminase whose properties have been changed or improved, its use, and the like.
  • Transglutaminase is an enzyme that catalyzes the acyl transfer reaction of the ⁇ -carboxyamide group of the glutamine residue in the peptide chain, and when the ⁇ -amino group of the lysine residue in the protein acts as an acyl acceptor, it is a protein molecule.
  • ⁇ - ( ⁇ -Gln) -Lys cross-linking is formed within or between the molecules of. Therefore, since the protein or peptide can be modified by utilizing the action of transglutaminase, transglutaminase derived from the genus Streptomyces (see, for example, Patent Document 1) can be used for meat binding, sausage, tofu, bread, etc. It is used in the production of noodles.
  • transglutaminase is being studied not only in the food field but also in the textile field, medical field, cosmetics field, and the like.
  • attempts have been made to improve the properties of transglutaminase (heat resistance, specific activity, substrate specificity, stability, etc.) (for example, Patent Documents 2 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 4). See).
  • transglutaminase As described above, improvements to transglutaminase have been attempted for the purpose of improving heat resistance and specific activity, but due to its high usefulness and further expansion of applications, transglutaminase has been used. The need for improvement remains high. Therefore, it is an object of the present invention to find a new mutation effective for improving transglutaminase and to provide a highly useful modified transglutaminase (mutant) and its use.
  • the present inventors attempted to improve transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis by amino acid substitution (converting a specific amino acid residue into another amino acid). After trial and error, we succeeded in identifying multiple mutations (combination of amino acid residues and amino acids after substitution) that are effective for changes in their properties (improved high-temperature reactivity, decreased pH stability in weakly acidic regions). bottom.
  • streptomainase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is high. If a useful mutation found in a transglutaminase derived from Seth mobaraensis is applied to another transglutaminase having a high structural similarity to the transglutaminase, the same effect is likely to be achieved. And those skilled in the art can recognize that such an application is effective.
  • the mutation points are Y34 and F305, the amino acid after the substitution at the mutation point Y34 is W, the amino acid after the substitution at the mutation point F305 is W, and the characteristic change due to the amino acid substitution improves the high temperature reactivity;
  • the mutation point is M288, the amino acid after substitution is L, F or Y, and the characteristic change due to amino acid substitution is a decrease in pH stability in the weakly acidic range;
  • Mutant point is D3, amino acid after substitution is W or K, characteristic change due to amino acid substitution improves high temperature reactivity;
  • the mutation points are D3 and F305, the amino acids after the substitution at the mutation point D3 are G, K, N, P or W, the amino acids after the substitution at the mutation point F305 are W, and the characteristic change due to the amino acid substitution improves the high temperature reactivity.
  • the mutation points are V65 and F305, the amino acid after the substitution at the mutation point V65 is I, the amino acid after the substitution at the mutation point F305 is W, and the characteristic change due to the amino acid substitution improves the high temperature reactivity; (6)
  • the mutation points are S303 and F305, the amino acid after the substitution at the mutation point S303 is R or K, the amino acid after the substitution at the mutation point F305 is W, and the characteristic change due to the amino acid substitution improves the high temperature reactivity;
  • the mutation point is R5, the amino acid after substitution is H, and the characteristic change due to amino acid substitution is a decrease in pH stability in the weakly acidic range;
  • the mutation point is V6, the amino acid after substitution is D, and the characteristic change due to amino acid substitution is a decrease in pH stability in the weakly acidic range; (9)
  • the mutation point is W59, the amino acid after substitution is T, and the characteristic change due to amino acid substitution is a decrease in pH stability in the weakly acidic range; (10)
  • the mutation point
  • [9] A microorganism carrying the recombinant DNA according to [8].
  • Method for preparing modified transglutaminase which comprises the following steps (I) to (III): (I) A step of preparing a nucleic acid encoding the amino acid sequence of the modified transglutaminase according to any one of [1] to [5]; (II) The step of expressing the nucleic acid and (III) the step of recovering the expression product.
  • the preparation method according to [11] wherein the amino acid sequence is any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 22.
  • the preparation method according to [12], wherein the nucleic acid comprises the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 23 to 43.
  • modified transglutaminase is an enzyme obtained by modifying or mutating a reference transglutaminase (hereinafter referred to as “reference transglutaminase”).
  • reference transglutaminase is typically a transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis is a transglutaminase whose origin is Streptomyces mobaraensis, and the genetic information of the transglutaminase produced by Streptomyces mobaraensis or the transglutaminase. It contains transglutaminase and the like expressed by other microorganisms using it.
  • amino acid substitution is performed as a modification or mutation. Therefore, when the modified transglutaminase and the reference transglutaminase are compared, some amino acid residues are different.
  • a modified transglutaminase is also referred to as a modified enzyme or a mutant.
  • each amino acid is represented by one character as follows.
  • the position of the mutation point is specified by the number assigned from the N-terminal to the C-terminal with the N-terminal amino acid residue of the mature transglutaminase as the first.
  • an amino acid residue to be substituted with an amino acid that is, a "mutation point” is expressed by a combination of one letter indicating the type of amino acid and a number indicating the position of the amino acid.
  • the mutation due to amino acid substitution is expressed by adding one character indicating the type of amino acid after substitution to the right of the indication of the mutation point. Therefore, for example, if the aspartic acid at the 3-position is a mutation point, it is expressed as "D3", and if the aspartic acid at the 3-position is replaced with glycine, it is expressed as "D3G".
  • the "weakly acidic range” refers to a region of pH 4 or more and pH 5 or less
  • the “neutral range” refers to a region of pH 5 or more and less than pH 8.
  • modified transglutaminase The first aspect of the present invention relates to modified transglutaminase (hereinafter referred to as “modified enzyme”).
  • modified enzyme of the present invention typically has an amino acid sequence containing one or more specific amino acid substitutions (mutations) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Due to this characteristic, a characteristic change of "improved high temperature reactivity" or “decreased pH stability in a weakly acidic region” is observed with respect to transglutaminase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the modified enzyme having improved high-temperature reactivity exhibits high activity even at high temperatures, and is advantageous for application to foods and food raw materials produced under high-temperature conditions (for example, 60 ° C.
  • a modified enzyme having a reduced pH stability in a weakly acidic region can be inactivated as the pH of a food or the like to which it is applied decreases. Therefore, for example, in the production of lactic acid fermented foods (specific example, yogurt). High utility value. More specifically, when a modified enzyme having a reduced pH stability in a weakly acidic region is used in the production of a lactic acid fermented food, lactic acid fermentation may be performed after the modified enzyme is allowed to act on the fermentation raw material. Often, the lactic acid fermentation may proceed at the same time as the modified enzyme is allowed to act on the fermentation raw material.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a sequence of transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis.
  • amino acid substitution means that the mutation point (that is, the position of the amino acid residue at which a specific amino acid substitution occurs) is the amino acid after the substitution. Therefore, when the amino acid sequence containing the amino acid substitution (mutated amino acid sequence) is compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 not containing the amino acid substitution (reference amino acid sequence), a difference in amino acid residues is observed at the position of the amino acid substitution. It will be.
  • the high temperature reactivity can be evaluated, for example, based on the activity calculated by the activity measurement method (however, the reaction temperature is changed from 37 ° C. to 60 ° C.) shown in Examples described later.
  • the modified enzyme with improved high temperature reactivity has a higher activity at 60 ° C than the reference transglutaminase.
  • the activity of the modified enzyme at 60 ° C. is, for example, 180% or more, preferably 200% or more, more preferably 250% or more, and particularly preferably 270% or more of the activity of the reference transglutaminase.
  • the decrease in pH stability in the weakly acidic region can be evaluated based on, for example, the residual activity when treated at pH 4.0 to 5.0 at 30 ° C. for 60 minutes (details of measurement and evaluation of residual activity are shown in Examples described later). ).
  • the modified enzyme in which the pH stability in the weakly acidic range is lowered the decrease in activity with the decrease in pH becomes remarkable in the weakly acidic range (specifically, in the range of pH4.0 to pH5.0). Therefore, a sharp decrease in the residual activity rate is observed as compared with the reference transglutaminase.
  • the residual activity rate of the modified enzyme in which the pH stability in the weakly acidic region is reduced becomes 0% by the pH 4.0 treatment, and preferably 0% by the pH 4.5 treatment.
  • Modified enzymes with reduced pH stability in the weakly acidic range are more useful than reference transglutaminase in terms of altered properties, but should be active, for example, to allow a reduction in the amount used (enzyme amount).
  • the activity of the modified enzyme having reduced pH stability in the weakly acidic region at pH 6 is preferably 30% or more, more preferably 50% or more, and more preferably 80% or more of the activity of the reference transglutaminase. It is more preferable that the above is 100% or more (that is, the activity is equal to or higher than that of the reference transglutaminase).
  • amino acid substitutions (mutant points and amino acids after substitution) that bring about each of the above characteristic changes are listed below.
  • ⁇ Amino acid substitution effective for improving high temperature reactivity> (1) Mutant points Y34 and F305, amino acid after substitution at mutant point Y34 is W, amino acid after substitution at mutant point F305 is W (3) The mutation point is D3, and the amino acid after substitution is W or K. (4) Mutant points are D3 and F305, amino acids after substitution at mutant point D3 are G, K, N, P or W, and amino acids after substitution at mutant point F305 are W.
  • the mutation point is M288, and the amino acid after substitution is L, F or Y. (7) The mutation point is R5, and the amino acid after substitution is H. (8) The mutation point is V6, and the amino acid after substitution is D. (9) The mutation point is W59, and the amino acid after substitution is T. (10) The mutation point is S61, and the amino acid after substitution is G or R. (11) The mutation point is V290, and the amino acid after substitution is I.
  • amino acid substitutions are more preferable amino acid substitutions because the degree of decrease in pH stability in the weakly acidic region is large.
  • S61G, S61R, M288F, M288L and V290I are highly useful in that they show high activity in the neutral range (pH 6) in addition to lowering the pH stability in the weakly acidic range.
  • transglutaminase consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 22 (in order, D3G mutant, D3K mutant, D3W mutant, D3G / F305W mutant, D3K / F305W).
  • the mutated protein may have the same function as the pre-mutated protein. That is, the mutation in the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the function of the protein may be maintained before and after the mutation.
  • the amino acid sequences of the two proteins are highly identical, it is highly probable that they both exhibit the same characteristics.
  • the amino acid sequence of the modified enzyme that is, the amino acid sequence containing the amino acid substitution of any one of (1) to (11) above in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (the amino acid sequence).
  • a specific example of the above is an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 22), which is not completely identical (that is, 100% identical), but has an amino acid sequence showing high identity and shows a desired change in characteristics.
  • the enzyme is substantially the same as the modified enzyme (substantially the same transglutaminase).
  • the identity here is 70% or more, 80% or more, 82% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 98%, or 99% or more. The higher the identity, the better. Therefore, in the most preferred embodiment, the identity is 99% or more.
  • the difference in amino acid sequence shall occur at a position other than the above-mentioned amino acid substitution position. Therefore, for example, when the criterion of identity is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the position other than the 3-position G, and when the criterion of identity is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the position other than the 3-position K, the criterion of identity.
  • the identity criterion is the position other than the 3-position N and the 305-position W, and the identity criterion is SEQ ID NO: 8.
  • the identity criterion is the position other than the 3-position W and the 305-position W
  • the identity criterion is SEQ ID NO: 10.
  • the criterion of identity is SEQ ID NO: 12.
  • the identity standard is a position other than 303 R and 305 W, and the identity standard is SEQ ID NO: 14.
  • the difference in the amino acid sequence occurs at a position other than the position Y at position 288, and in the case where the criterion of identity is the amino acid sequence at position 22 in the position other than the position I at position 290.
  • the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (70% or more, 80% or more, 82% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 98%, or 99%).
  • the 3-position amino acid G is.
  • the 3-position amino acid is K
  • the 3-position amino acid is W
  • the 3-position amino acid is G
  • the 305-position amino acid is W
  • the amino acid sequence showing the above-mentioned identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 the 3-position amino acid.
  • the amino acid W at position 305 is N
  • the amino acid sequence at position 3 is N
  • the amino acid W at position 305 is N in the amino acid sequence showing the same identity as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the above.
  • the 3-position amino acid is P and the 305-position amino acid is W
  • the 3-position amino acid is W and the 305-position amino acid is W.
  • the 34th amino acid is W
  • the 305th amino acid is W
  • the amino acid sequence showing the above identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 the 65th amino acid.
  • Is I the amino acid at position 305 is W
  • amino acid K at position 303 is W
  • the amino acid at position 305 is W
  • the 303rd amino acid is R
  • the 305th amino acid is W
  • the 5th amino acid is H
  • the amino acid of SEQ ID NO: 15 in the amino acid sequence showing the above identity with the sequence, the 6-position amino acid is D
  • the 59-position amino acid is T in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the 61st amino acid is G, and in the amino acid sequence showing the sameness as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, the 61st amino acid is R, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and the above.
  • the 288th amino acid is F
  • the 288th amino acid is L
  • the amino acid at position 288 is Y
  • the amino acid sequence showing the same identity as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 is I.
  • the "slight difference in amino acid sequence” here is caused by amino acid deletion, substitution, addition, insertion, or a combination thereof. Typically, one to several amino acids (upper limit of 3, 5, 7, 10) that make up the amino acid sequence are deleted, substituted, or 1 to several (upper limit is, for example, 3). It means that the amino acid sequence is mutated (changed) by the addition, insertion, or combination of 5, 7, and 10) amino acids. "Slight differences in amino acid sequences" are preferably caused by conservative amino acid substitutions. The term “conservative amino acid substitution” as used herein means substituting an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having similar properties.
  • Amino acid residues depending on their side chain, are basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg aspartic acid, glutamate), uncharged polar side chains (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine).
  • basic side chains eg lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains eg aspartic acid, glutamate
  • uncharged polar side chains eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine.
  • Cysteine non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, It is classified into several families, such as tryptophan (histidine).
  • Conservative amino acid substitutions are preferably substitutions between amino acid residues within the same family.
  • transglutaminase SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 1 the active residue of transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis is cysteine at position 64, it seems that the acid residue is not affected when mutation is applied. It is good to set it to.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two base sequences can be determined by the following procedure, for example.
  • the two sequences are lined up for optimal comparison (eg, a gap may be introduced in the first sequence to optimize alignment with the second sequence).
  • a gap may be introduced in the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • Comparison of two sequences and determination of identity can be realized using a mathematical algorithm.
  • mathematical algorithms that can be used to compare sequences include the algorithms described in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Such an algorithm is incorporated in the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) described in Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.
  • Gapped BLAST described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25 (17): 3389-3402 is available.
  • the default parameters of the corresponding programs eg XBLAST and NBLAST
  • Examples of other mathematical algorithms available for sequence comparison are those described in Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4: 11-17.
  • the identity of the two amino acid sequences can be determined using the GAP program in the EMBOSS package, using the Blosum62 matrix, with a gap weight of 10 and a gap length weight of 2.
  • the transglutaminase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that is, the transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis is mutated (amino acid substitution according to any one of (1) to (11) above). It is a modified enzyme of the invention. Regarding the above substantially the same transglutaminase, further mutation is added to the transglutaminase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which the transglutaminase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mutated (the amino acid substitution of any of the above (1) to (11)).
  • transglutaminase consisting of an amino acid sequence highly identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, such as transglutaminase derived from the same species as Streptomyces mobaraensis strain that produces transglutaminase consisting of an amino acid sequence.
  • equivalent mutation here, in the amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the mutation point in the present invention (the mutation point in any of the amino acid substitutions (1) to (11) above) The amino acid residue corresponding to the amino acid residue will be replaced.
  • transglutaminase having an amino acid sequence highly identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 it was classified as Streptomyces mobaraensis (formerly Streptomyces mobaraensis). ), A transglutaminase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 (93% identity of the amino acid sequence), and a transglutaminase derived from Streptomyces albireticuli and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.
  • the term "equivalent” means that the proteins (enzymes) to be compared make an equivalent contribution to the exertion of their functions.
  • the amino acid sequence to be compared with the amino acid sequence of the reference transglutaminase (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) can be optimally compared while considering the partial homology of the primary structure (amino acid sequence).
  • the amino acid at the position corresponding to the specific amino acid in the reference amino acid sequence is specified as the "corresponding amino acid”. be able to.
  • Crystallize the protein is indispensable for determining the three-dimensional structure, but it also has industrial usefulness as a high-purity purification method for proteins and a high-density and stable storage method. In this case, it is preferable to crystallize a protein to which a substrate or an analog compound thereof is bound as a ligand.
  • the produced crystal is irradiated with X-rays and diffraction data is collected. In many cases, protein crystals are damaged by X-ray irradiation and their diffractivity deteriorates.
  • phase information is required to perform crystal structure analysis. If the crystal structure of a protein related to the target protein is unknown, it is impossible to determine the structure by the molecular replacement method, and the phase problem must be solved by the heavy atom homozygous substitution method.
  • the heavy atom isomorphic substitution method is a method in which a metal atom having a large atomic number such as mercury or platinum is introduced into a crystal, and phase information is obtained by utilizing the contribution of the large X-ray scattering ability of the metal atom to the X-ray diffraction data. ..
  • the determined phase can be improved by smoothing the electron density of the solvent region in the crystal. Since the electron density of water molecules in the solvent region is large, the electron density is hardly observed. Therefore, by approximating the electron density in this region to 0, the true electron density can be approached, and the phase is improved. .. Further, when a plurality of molecules are contained in the asymmetric unit, the phase is further significantly improved by averaging the electron densities of these molecules.
  • the protein model is fitted to the electron density diagram calculated using the thus improved phase. This process is performed on computer graphics using a program such as QUANTA from MSI (USA). After that, structural refinement is performed using a program such as MSI's X-PLOR, and structural analysis is completed. If the crystal structure of a related protein is known for the protein of interest, it can be determined by the molecular replacement method using the atomic coordinates of the known protein. Molecular replacement and structural refinement can be performed using programs such as CNS # SOLVE ver.11.
  • the second aspect of the present invention provides nucleic acids related to the modified enzyme of the present invention. That is, it is used as a primer for amplifying or mutating a gene encoding a modified enzyme, a nucleic acid that can be used as a probe for identifying a nucleic acid that encodes a modified enzyme, or a nucleic acid that encodes a modified enzyme. Nucleic acid capable of producing is provided.
  • the gene encoding the modified enzyme is typically used to prepare the modified enzyme. According to a genetic engineering preparation method using a gene encoding a modified enzyme, it is possible to obtain a modified enzyme in a more homogeneous state. In addition, the method can be said to be a suitable method when preparing a large amount of modified enzyme.
  • the use of the gene encoding the modified enzyme is not limited to the preparation of the modified enzyme.
  • the nucleic acid can be used as an experimental tool for elucidating the mechanism of action of a modified enzyme, or as a tool for designing or producing a further variant of an enzyme.
  • the term "gene encoding a modified enzyme” refers to a nucleic acid from which the modified enzyme can be obtained when it is expressed, and has a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the modified enzyme. Not only nucleic acids, but also nucleic acids obtained by adding a sequence that does not encode an amino acid sequence to such nucleic acid. Also, codon degeneracy is taken into account.
  • SEQ ID NOs: 23 to 43 Examples of the sequence (base sequence) of the gene encoding the modified enzyme are shown in SEQ ID NOs: 23 to 43. These sequences encode the variants shown in the Examples below, as described below.
  • 5'of the above sequence (for example, any of SEQ ID NOs: 23 to 43) is usually used for structural stabilization of the modified enzyme which is an expression product.
  • a gene construct having a sequence encoding a propeptide (pro sequence) added to the terminal side will be introduced into the host.
  • a gene contract is further prepared in which a sequence encoding a pre-sequence (signal sequence) is added to the 5'end side of the sequence encoding the pro sequence.
  • the gene construct When the gene construct is used, it is expressed as a pre-pro-type transglutaminase in which the pre-sequence and the pro-sequence are linked, and then the pre-sequence is cleaved (conversion to the pro-transglutaminase) and the pro-sequence is cleaved to form the mature transglutaminase. Is obtained.
  • the original sequence that is, the sequence of the reference transglutaminase (transglutaminase before modification) may be used.
  • pre-sequence is SEQ ID NO: 51 (pre-sequence of transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis)
  • pro sequence is SEQ ID NO: 52 (pro-sequence of transglutaminase derived from streptomyces mobaraensis), pre-sequence.
  • SEQ ID NO: 53 sequence encoding the pre-sequence of transglutaminase derived from Streptomyces mobaraensis
  • prosequence No. 54 derived from Streptomyces mobaraensis
  • the nucleic acid of the present invention can be obtained by using standard genetic engineering methods, molecular biological methods, biochemical methods, chemical synthesis, etc., with reference to the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence listing. It can be prepared in an isolated state.
  • nucleic acid having the same function of the protein encoded by the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention but having a different base sequence in some parts (hereinafter referred to as “nucleic acid”). Also referred to as “homologous nucleic acid”. Further, the base sequence defining the homologous nucleic acid is also referred to as "homologous base sequence").
  • a homologous nucleic acid a modified enzyme consisting of a base sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or more bases based on the base sequence of the nucleic acid encoding the modified enzyme of the present invention.
  • Nucleic acid encoding a protein having an enzymatic activity (that is, transglutaminase activity) characteristic of the above can be mentioned. Base substitutions and deletions may occur at multiple sites.
  • the term "plurality” here means, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, and more preferably 2 to 10 bases, although it varies depending on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the nucleic acid. Is.
  • the homologous nucleic acid is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, still more preferably about 90% or more, still more preferably, based on the reference base sequence. Have 95% or more, most preferably 99% or more identity.
  • the above homologous nucleic acids can be treated with restriction enzymes, treatments with exonucleases, DNA ligases, etc., molecular cloning, third edition, chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, and random suddenly. It can be obtained by introducing a mutation by a mutation introduction method (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Homological nucleic acids can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • Yet another aspect of the present invention is at least about 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, based on the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention, or a base sequence complementary thereto.
  • nucleic acids having 99% and 99.9% identical base sequences.
  • Yet another aspect of the present invention is a nucleic acid having a base sequence that hybridizes under stringent conditions to the base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a base sequence complementary to the base sequence thereof.
  • the "stringent condition” here means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • Such stringent conditions are known to those skilled in the art, such as Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). Can be set by referring to.
  • Specific stringent conditions include hybridization solution (50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g. Incubate at about 42 ° C to about 50 ° C using / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)), and then use 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS to about 65 ° C to about 70 ° C. The conditions for cleaning with can be mentioned.
  • nucleic acid having a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a part of a base sequence complementary thereto.
  • a nucleic acid fragment can be used for detecting, identifying, and / or amplify a nucleic acid or the like having a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid fragment is, for example, a contiguous nucleotide portion (eg, about 10 to about 100 bases long, preferably about 20 to about 100 bases long, more preferably about 30 to about 30 to about 30 to about 30 to about 100 bases in the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention. It is designed to include at least a portion that hybridizes to (100 bases long).
  • Nucleic acid fragments can be labeled when used as probes. For example, fluorescent substances, enzymes, and radioisotopes can be used for labeling.
  • Yet another aspect of the present invention relates to recombinant DNA containing the gene of the present invention (gene encoding a modified enzyme).
  • the recombinant DNA of the present invention is provided, for example, in the form of a vector.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell.
  • E. coli-hosted vectors include M13 phage or its variants, ⁇ phage or its variants, pBR322 or its variants (pB325, pAT153, pUC8, etc.), pET21, etc.
  • yeast-hosted vectors include pYepSec1, pMFa. , PYES2, pPIC3.5K, etc., pAc, pVL, etc. can be exemplified as vectors having insect cells as hosts, and pCDM8, pMT2PC, etc. can be exemplified as vectors hosting mammalian cells.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • the "expression vector” refers to a vector in which the nucleic acid inserted therein can be introduced into a target cell (host cell) and can be expressed in the cell.
  • the expression vector usually contains a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes the expression, and the like.
  • Expression vectors containing selectable markers can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence (and its degree) of introduction of the expression vector can be confirmed by using a selectable marker.
  • Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold). It can be carried out using a well-known method using restriction enzymes and DNA ligase, which can refer to Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • Host cells include Aspergillus (eg Aspergillus oryzae), Bacillus bacteria (eg Bacillus satillus, Bacillus licheniformis, Bacillus aminolikfaciens), Brevibacillus bacteria (eg Brevibacillus) for ease of handling.
  • -Chosinensis Escherichia coli (Escherichia coli), Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) and other microorganisms can be used, but any host cell capable of replicating recombinant DNA and expressing the gene for the modified enzyme. It is available.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Saccharomyces cerevisiae A microorganism of the genus Streptomyces (eg, Streptomyces morabaensis) can also be used as a host.
  • Escherichia coli Escherichia coli BL21 (DE3) can be mentioned when a T7 promoter is used, and Escherichia coli JM109 can be mentioned otherwise.
  • budding yeast include budding yeast SHY2, budding yeast AH22, and budding yeast INVSc1 (Invitrogen).
  • microorganism ie, a transformant
  • the microorganism of the present invention can be obtained by transfection or transformation using the vector of the present invention.
  • the calcium chloride method Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), Vol. 53, p. 159 (1970)
  • the Hanahan method Journal of Molecular Biology, Vol. 166, No. 557). Page (1983)
  • SEM Method Gene, Vol. 96, Page 23 (1990)
  • Method of Chung et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, No. 86) Volume, p.
  • Enzyme agent containing modified transglutaminase The modified enzyme of the present invention is provided, for example, in the form of an enzyme agent.
  • Enzyme agents include active ingredients (modified enzymes of the present invention), excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, various proteins, decomposition products of various proteins, etc. It may contain various extracts, various salts, various antioxidants, cysteine, glutathione, sodium glutamate, sodium inosinate, sodium guanylate, calcined shell calcium, silicon dioxide and the like.
  • starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used.
  • buffer phosphate, citrate, acetate and the like can be used.
  • Propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used as the stabilizer.
  • phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben and the like can be used.
  • ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • proteins include soy protein, wheat protein, corn protein, milk protein, animal-derived protein and the like.
  • extracts are meat extract, plant extract, yeast extract and the like.
  • salts are chlorides, phosphates, polyphosphates, pyrophosphates, citrates, lactates, carbonates and the like.
  • antioxidants are L-ascorbic acid salt, sodium bisulfite and the like.
  • the shape of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and is, for example, powdery, granular, liquid, capsule or the like.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for preparing a modified enzyme.
  • the modified enzyme of the present invention is prepared by a genetic engineering technique.
  • a nucleic acid encoding the amino acid sequence of the modified enzyme of the present invention (eg, any of SEQ ID NOs: 2 to 22) is prepared (step (I)).
  • the "nucleic acid encoding a specific amino acid sequence” is a nucleic acid from which a polypeptide having the amino acid sequence can be obtained when it is expressed, and of course, a nucleic acid having a base sequence corresponding to the amino acid sequence is available.
  • nucleic acid encoding the amino acid sequence of the modified enzyme of the present invention refers to standard genetic engineering methods, molecular biological methods, and biochemistry with reference to the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence table. It can be prepared in an isolated state by using a specific method or the like.
  • amino acid sequence of the modified enzyme of the present invention is a mutation of the amino acid sequence of the reference transglutaminase.
  • nucleic acid encoding the amino acid sequence of the modified enzyme of the present invention can also be obtained by adding the necessary mutation to the gene encoding the reference transglutaminase.
  • Many methods for position-specific nucleotide sequence substitution are known in the art (see, for example, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), and the appropriate method is selected from among them. Can be used.
  • a position-specific mutagenesis method a position-specific amino acid saturation mutation method can be adopted.
  • the position-specific amino acid saturation mutation method is a "Semi-rational, semi-random" method that estimates the position involved in the desired function based on the three-dimensional structure of the protein and introduces the amino acid saturation mutation (J. Mol.
  • Biol.331,585-592 (2003) For example, it is possible to introduce a position-specific amino acid saturation mutation using a kit such as Quick change (Stratagene) or Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res. 16, 7351-7367 (1988)).
  • a kit such as Quick change (Stratagene) or Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res. 16, 7351-7367 (1988)).
  • the DNA polymerase used for PCR Taq polymerase or the like can be used.
  • a highly accurate DNA polymerase such as KOD-PLUS- (Toyobo Co., Ltd.) or Pfu turbo (Stratagene Co., Ltd.).
  • step (II) the prepared nucleic acid is expressed (step (II)).
  • step (II) an expression vector into which the above nucleic acid is inserted is prepared, and the host cell is transformed using this.
  • the transformant is cultured under the condition that the modified enzyme which is the expression product is produced.
  • the transformant may be cultured according to a conventional method.
  • the carbon source used in the medium may be any assimilating carbon compound, and for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • the nitrogen source may be any available nitrogen compound, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline extract and the like are used.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, etc. are used as needed.
  • the culture temperature can be set within the range of 30 ° C to 40 ° C (preferably around 33 to 37 ° C).
  • the culturing time can be set in consideration of the growth characteristics of the transformant to be cultivated, the production characteristics of the modified enzyme, and the like.
  • the pH of the medium is adjusted within the range in which the transformant grows and the enzyme is produced.
  • the pH of the medium is preferably about 6.0 to 9.0 (preferably around pH 7.0).
  • the expressed product (modified enzyme) is recovered (step (III)).
  • the culture solution containing the cells after culturing can be used as it is, or can be used as an enzyme solution after concentration, removal of impurities, etc., but in general, the expressed product is once recovered from the culture solution or cells. If the expressed product is a secretory protein, it can be recovered from the culture medium, and if it is not, it can be recovered from the cells.
  • the culture solution for example, after filtering and centrifuging the culture supernatant to remove insoluble matter, concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, methanol, ethanol or acetone, etc.
  • chromatography such as salting out, dialysis, heat treatment, isoelectric point treatment, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.
  • Sephadex gel GE Healthcare Bioscience
  • the cells are collected by filtering, centrifuging, etc., and then the cells are subjected to mechanical methods such as pressure treatment, ultrasonic treatment, physical crushing treatment, or lysozyme.
  • a refined product of the modified enzyme can be obtained by separating and purifying in the same manner as described above after disrupting by an enzymatic method such as.
  • the purified enzyme obtained as described above in powder form by, for example, freeze-drying, vacuum-drying, or spray-drying.
  • the purified enzyme may be previously dissolved in a phosphate buffer solution, a triethanolamine buffer solution, a Tris-hydrochloric acid buffer solution, or a GOOD buffer solution.
  • a phosphate buffer solution or a triethanolamine buffer solution can be used.
  • examples of the GOOD buffer solution include PIPES, MES, and MOPS.
  • the gene expression-expression product is recovered using an appropriate host-vector system as described above, but a cell-free synthesis system may also be used.
  • the "cell-free synthesis system refers to ribosomes derived from living cells (or obtained by genetic engineering techniques) rather than using living cells. It refers to the in vitro synthesis of the mRNA or protein encoded by a nucleic acid (DNA or mRNA) that is a template, using a transcription / translation factor or the like.
  • a cell extract obtained by purifying a cell disruption solution as needed is generally used.
  • Cell extracts generally contain various factors such as ribosomes and initiation factors required for protein synthesis, and various enzymes such as tRNA. When synthesizing proteins, various amino acids, energy sources such as ATP and GTP, and other substances necessary for protein synthesis such as creatine phosphate are added to this cell extract. Of course, at the time of protein synthesis, ribosomes, various factors, and / or various enzymes prepared separately may be supplemented as needed.
  • cell-free transcription / translation system is used interchangeably with cell-free protein synthesis system, in vitro translation system or in vitro transcription / translation system.
  • RNA is used as a template to synthesize proteins.
  • total RNA, mRNA, in vitro transcript, etc. are used as the template RNA.
  • DNA is used as a template in the other in vitro transcription / translation system.
  • the template DNA should contain a ribosome binding region and preferably contains a suitable terminator sequence.
  • in the in vitro transcription / translation system conditions are set in which factors necessary for each reaction are added so that the transcription reaction and the translation reaction proceed continuously.
  • mutant enzyme 1-1 Introduction of mutation (1) A PCR primer for mutagenesis was designed. (2) Using the primer set for each mutation point, PCR (reaction at 98 ° C for 1 minute, then 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C) using the plasmid pET20b in which the transglutaminase gene (SEQ ID NO: 50) was integrated was used as a template. The reaction was carried out for 15 seconds at 68 ° C for 2 minutes for 15 cycles, reacted at 68 ° C for 5 minutes, and then left at 4 ° C).
  • Table 1 shows the evaluation results of high temperature reactivity. High-temperature reactivity was improved in all amino acid substitutions, and it was judged to be an effective amino acid substitution. In particular, D3P / F305W substitution, D3W / F305W substitution, and Y34W / F305W showed an improvement of 250% or more in activity as compared with the wild type, and it was judged to be a particularly effective amino acid substitution.
  • the matured enzyme was diluted 2-fold with 200 mM Britton-Robinson Buffer (pH 4, 4.5, 5, 5.5, 6) at each pH and treated at 30 ° C. for 60 minutes.
  • the mature enzyme was diluted 2-fold with 200 mM Tris-HCl pH 6.0.
  • the untreated sample and the pH-treated sample were diluted 2-fold with 500 mM Tris-HCl pH 6.0, the activity was measured, and the relative activity was evaluated when the activity of the untreated sample of the wild-type enzyme was set to 100.
  • Table 2 shows the evaluation results of the decrease in pH stability in the weakly acidic range.
  • the relative activity at pH 4.0 was 0 for all amino acid substitutions, and it was judged that the amino acid substitution was effective for lowering pH stability in the weakly acidic range.
  • the relative activity at pH 4.5 was also 0, and it was judged to be a particularly effective amino acid substitution.
  • M288L substitution is also highly useful in that it shows high activity in the neutral range (pH 6). In terms of activity in the neutral range (pH 6), S61G substitution, S61R substitution, M288F substitution and V290I substitution are also highly useful.
  • the modified transglutaminase of the present invention has improved practically important properties and has high industrial value. Therefore, it is expected to be applied not only to existing applications but also to new applications.
  • SEQ ID NO: 2 Description of artificial sequence: D3G variant SEQ ID NO: 3: Description of artificial sequence: D3K variant SEQ ID NO: 4: Description of artificial sequence: D3W variant SEQ ID NO: 5: Description of artificial sequence: D3G / F305W variant SEQ ID NO: 6: Description of artificial sequence: D3K / F305W Variant SEQ ID NO: 7: Description of artificial sequence: D3N / F305W Variant SEQ ID NO: 8: Description of artificial sequence: D3P / F305W Variant SEQ ID NO: 9: Description of artificial sequence : D3W / F305W variant SEQ ID NO: 10: Artificial sequence description: Y34W / F305W variant SEQ ID NO: 11: Artificial sequence description: V65I / F305W variant SEQ ID NO: 12: Artificial sequence description: S303K / F305W variant SEQ ID NO: 13: Description of artificial sequence: S303R / F305W variant SEQ ID NO: 14: Description of artificial sequence: R5H variant

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

トランスグルタミナーゼの改良に有効な新たな変異を見出し、有用性の高い改変型のトランスグルタミナーゼを提供することを課題とする。　高温反応性の向上又は弱酸性域のpH安定性の低下をもたらすアミノ酸置換を施した有用性の高い改変型トランスグルタミナーゼが開示される。

Description

改変型トランスグルタミナーゼ
　本発明はトランスグルタミナーゼに関する。詳しくは、特性が変化ないし向上した改変型トランスグルタミナーゼ及びその用途等に関する。
　トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ－カルボキシルアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素であり、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε－アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε－（γ－Ｇｌｎ）－Ｌｙｓ架橋結合を形成させる。従って、トランスグルタミナーゼの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼ（例えば特許文献１を参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。また、食品分野に限らず、線維分野、医療分野、香粧品分野等でのトランスグルタミナーゼの利用も検討されている。このような利用拡大に伴い、トランスグルタミナーゼの特性（耐熱性、比活性、基質特異性、安定性など）を改良することが試みられている（例えば特許文献２～４、非特許文献１～４を参照）。
特開平４－１０８３８１号公報 特開２００２－２５３２７２号公報 特開２００８－１９４００４号公報 国際公開第２０１９／１０７２８８号パンフレット
Marx CK et al., J. Biotechnol. 2008 Sep 10;136(3-4):156-62. Tagami U et al., Protein Eng. Des. Sel. 2009 Dec; 22(12): 747-752. Yokoyama K et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 87:2087-2096. Buettner K et al., Amino Acids. 2012 Feb;42(2-3):987-96.
　上記の通り、これまでにも、耐熱性や比活性の向上等を目的としてトランスグルタミナーゼの改良が試みられているが、その有用性の高さや用途の更なる拡大等の理由から、トランスグルタミナーゼの改良に対するニーズは依然として高い。そこで本発明は、トランスグルタミナーゼの改良に有効な新たな変異を見出し、有用性の高い改変型のトランスグルタミナーゼ（変異体）及びその用途などを提供することを課題とする。
　上記課題を解決すべく本発明者らは、アミノ酸置換（特定のアミノ酸残基を別のアミノ酸へ変換すること）による、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼの改良を試みた。試行錯誤の末、その特性の変化（高温反応性の向上、弱酸性域のpH安定性の低下）に有効な複数の変異（アミノ酸残基及び置換後のアミノ酸の組合せ）を同定することに成功した。
　ところで、同種の酵素については構造（一次構造、立体構造）の類似性が高く、同様の変異が同様の効果を生む蓋然性が高いという技術常識に鑑みれば、配列番号１のアミノ酸配列を有するストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼにおいて見出された有用な変異を、当該トランスグルタミナーゼとの間で構造上の類似性が高い他のトランスグルタミナーゼに対して適用すれば、同等の効果が奏される蓋然性が高く、また、当業者であれば、このような適用が有効であることを認識し得る。
　以下の発明は以上の成果及び考察に基づく。
［１］配列番号１のアミノ酸配列において、以下の(1)～(11)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列（但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている）を有し、前記アミノ酸置換に対応した特性変化が認められる改変型トランスグルタミナーゼ：
　(1)変異点がY34とF305、変異点Y34の置換後のアミノ酸がW、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
　(2)変異点がM288、置換後のアミノ酸がL、F又はY、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
　(3)変異点がD3、置換後のアミノ酸がW又はK、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
　(4)変異点がD3とF305、変異点D3の置換後のアミノ酸がG、K、N、P又はW、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
　(5)変異点がV65とF305、変異点V65の置換後のアミノ酸がI、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
　(6)変異点がS303とF305、変異点S303の置換後のアミノ酸がR又はK、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
　(7)変異点がR5、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
　(8)変異点がV6、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
　(9)変異点がW59、置換後のアミノ酸がT、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
　(10)変異点がS61、置換後のアミノ酸がG又はR、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
　(11)変異点がV290、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
　［２］前記同一性が82%以上である、［１］に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
　［３］前記同一性が85%以上である、［１］に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
　［４］前記同一性が90%以上である、［１］に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
　［５］配列番号２～２２のいずれかのアミノ酸配列からなる、［１］に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
　［６］［１］～［５］のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
　［７］配列番号２３～４３のいずれかの塩基配列を含む、［６］に記載の遺伝子。
　［８］［６］又は［７］に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
　［９］［８］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
　［１０］［１］～［５］のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼを含む酵素剤。
　［１１］以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型トランスグルタミナーゼの調製法：
　(I)［１］～［５］のいずれか一項の改変型トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
　(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
　(III)発現産物を回収するステップ。
　［１２］前記アミノ酸配列が配列番号２～２２のいずれかのアミノ酸配列である、［１１］に記載の調製法。
　［１３］前記核酸が、配列番号２３～４３のいずれかの塩基配列を含む、［１２］に記載の調製法。
　説明の便宜上、本発明に関して使用する用語の一部について以下で定義する。
（用語）
　用語「改変型トランスグルタミナーゼ」とは、基準となるトランスグルタミナーゼ（以下、「基準トランスグルタミナーゼ」と呼ぶ）を改変ないし変異して得られる酵素である。基準トランスグルタミナーゼは、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）由来のトランスグルタミナーゼである。
　用語「ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼ」とは、その起源がストレプトマイセス・モバラエンシスであるトランスグルタミナーゼのことであり、ストレプトマイセス・モバラエンシスが産生するトランスグルタミナーゼ又は当該トランスグルタミナーゼの遺伝情報を利用して他の微生物等で発現させたトランスグルタミナーゼなどを含む。
　本発明では、改変ないし変異として「アミノ酸置換」が行われる。従って、改変型トランスグルタミナーゼと基準トランスグルタミナーゼを比較すると、一部のアミノ酸残基に相違が認められる。尚、本明細書では、改変型トランスグルタミナーゼのことを改変型酵素又は変異体とも呼ぶ。
　本明細書では慣例に従い、以下の通り、各アミノ酸を１文字で表記する。
　メチオニン：M、セリン：S、アラニン：A、トレオニン：T、バリン：V、チロシン：Y、ロイシン：L、アスパラギン：N、イソロイシン：I、グルタミン：Q、プロリン：P、アスパラギン酸：D、フェニルアラニン：F、グルタミン酸：E、トリプトファン：W、リジン：K、システイン：C、アルギニン：R、グリシン：G、ヒスチジン：H
　本明細書では、成熟体トランスグルタミナーゼのN末端のアミノ酸残基を１番目としてN末端からC末端に向かって付けた番号によって変異点の位置を特定する。
　慣例に従い、アミノ酸置換を施すアミノ酸残基、即ち「変異点」を、アミノ酸の種類を表す１文字とアミノ酸の位置を表す数字との組合せで表現する。また、アミノ酸置換による変異を、変異点の表示の右に置換後のアミノ酸の種類を表す１文字を追加したものによって表現する。従って、例えば、3位のアスパラギン酸が変異点であれば「D3」と表現され、3位のアスパラギン酸がグリシンに置換される変異であれば「D3G」と表現さる。
　本明細書において、「弱酸性域」とはpH 4以上pH 5以下の領域を指し、「中性域」とはpH 5超pH 8未満の領域を指す。
１．改変型トランスグルタミナーゼ
　本発明の第１の局面は改変型トランスグルタミナーゼ（以下、「改変型酵素」と呼ぶ）に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列において、一又は二以上の特定のアミノ酸置換（変異）を含むアミノ酸配列を有する。当該特徴により、配列番号１のアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼに対して、「高温反応性向上」又は「弱酸性域のpH安定性低下」の特性変化が認められる。高温反応性が向上した改変型酵素は、高温下においても高い活性を発揮し、例えば、高温条件（例えば60℃～80℃）で製造される食品や食品原料への適用に有利である。一方、弱酸性域のpH安定性が低下した改変型酵素は、それを適用した食品等のpH低下に伴って失活し得るため、例えば乳酸発酵食品（具体例はヨーグルト）の製造用途での利用価値が高い。より具体的には、弱酸性域のpH安定性が低下した改変型酵素を乳酸発酵食品の製造に使用する場合には、発酵原料に当該改変型酵素を作用させた後に乳酸発酵を行ってもよく、また、発酵原料に対して当該改変型酵素を作用させるのと同時に乳酸発酵を進行させてもよい。尚、配列番号１のアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼの配列である。
　本明細書において「アミノ酸置換を含む」とは、変異点（即ち、特定のアミノ酸置換が生ずるアミノ酸残基の位置）が置換後のアミノ酸になっていることを意味する。従って、アミノ酸置換を含むアミノ酸配列（変異アミノ酸配列）を、アミノ酸置換を含まない配列番号１のアミノ酸配列（基準アミノ酸配列）と比較すれば、当該アミノ酸置換の位置においてアミノ酸残基の相違が認められることになる。
　高温反応性は、例えば、後述の実施例に示す活性測定法（但し、反応温度を37℃から60℃に変更する）で算出した活性に基づき評価することができる。高温反応性が向上した改変型酵素では、その60℃での活性が基準トランスグルタミナーゼよりも高くなる。改変型酵素の60℃での活性は、基準トランスグルタミナーゼの活性の例えば180%以上、好ましくは200%以上、更に好ましくは250%以上、特に好ましくは270％以上である。
　弱酸性域のpH安定性低下は、例えば、pH4.0～5.0で30℃、60分間処理した場合の残存活性に基づき評価できる（残存活性の測定及び評価の詳細は後述の実施例に示される）。弱酸性域のpH安定性が低下した改変型酵素では、弱酸性域（具体的にはpH4.0～pH5.0の範囲）において、pH低下に伴う活性の低下が顕著となる。従って、基準トランスグルタミナーゼよりも急激な活性残存率の低下が認められる。弱酸性域のpH安定性が低下した改変型酵素の活性残存率は、pH4.0処理によって0%となり、好ましくはpH4.5処理によっても0%となる。
　弱酸性域のpH安定性が低下した改変型酵素は、変化した特性の点において基準トランスグルタミナーゼよりも有用であるが、例えば使用量（酵素量）の低減を可能にすべく、活性を示すことが期待される中性域（例えばpH6）での活性は高い方がよい。例えば、弱酸性域のpH安定性が低下した改変型酵素のpH6における活性は基準トランスグルタミナーゼの活性の30%以上であることが好まく、同50%以上であることがより好ましく、同80%以上であることが更に好ましく、同100%以上であること（即ち、基準トランスグルタミナーゼと同等以上の活性を示すこと）がより一層好ましい。
　以下、上記の各特性変化をもたらすアミノ酸置換（変異点及び置換後のアミノ酸）を列挙する。
＜高温反応性向上に有効なアミノ酸置換＞
　(1)変異点がY34とF305、変異点Y34の置換後のアミノ酸がW、変異点F305の置換後のアミノ酸がW
　(3)変異点がD3、置換後のアミノ酸がW又はK
　(4)変異点がD3とF305、変異点D3の置換後のアミノ酸がG、K、N、P又はW、変異点F305の置換後のアミノ酸がW
　(5)変異点がV65とF305、変異点V65の置換後のアミノ酸がI、変異点F305の置換後のアミノ酸がW
　(6)変異点がS303とF305、変異点S303の置換後のアミノ酸がR又はK、変異点F305の置換後のアミノ酸がW
　以上のアミノ酸置換の中でも、下記のアミノ酸置換は高温反応性向上の程度が大きく、より好ましいアミノ酸置換である。
　D3PとF305Wの二重変異
　D3WとF305Wの二重変異
　Y34WとF305Wの二重変異
＜弱酸性域のpH安定性低下に有効なアミノ酸置換＞
　(2)変異点がM288、置換後のアミノ酸がL、F又はY
　(7)変異点がR5、置換後のアミノ酸がH
　(8)変異点がV6、置換後のアミノ酸がD
　(9)変異点がW59、置換後のアミノ酸がT
　(10)変異点がS61、置換後のアミノ酸がG又はR
　(11)変異点がV290、置換後のアミノ酸がI
　以上のアミノ酸置換の中でも、下記のアミノ酸置換は弱酸性域のpH安定性低下の程度が大きく、より好ましいアミノ酸置換である。
　M288L
　M288Y
　尚、S61G、S61R、M288F、M288L及びV290Iは、弱酸性域のpH安定性低下に加え、中性域（pH6）で高い活性を示す点で有用性が高い。
　本発明の改変型酵素の具体例として、配列番号２～２２のいずれかのアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼ（順に、D3G変異体、D3K変異体、D3W変異体、D3G/F305W変異体、D3K/F305W変異体、D3N/F305W変異体、D3P/F305W変異体、D3W/F305W変異体、Y34W/F305W変異体、V65I/F305W変異体、S303K/F305W変異体、S303R/F305W変異体、R5H変異体、V6D変異体、W59T変異体、S61G変異体、S61R変異体、M288F変異体、M288L変異体、M288Y変異体、V290I変異体、が対応する）を挙げることができる。
　一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部を変異させた場合において変異後のタンパク質が変異前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の変異がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が変異前後において維持されることがある。一方、二つのタンパク質のアミノ酸配列の同一性が高い場合、両者が同等の特性を示す蓋然性が高い。これらの技術常識を考慮すれば、上記改変型酵素のアミノ酸配列、即ち、「配列番号１のアミノ酸配列において、上記(1)～(11)のいずれかのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列（当該アミノ酸配列の具体例は配列番号２～２２のアミノ酸配列）」と完全に同一（即ち100％の同一性）でないものの、高い同一性を示すアミノ酸配列を有し、且つ所望の特性変化を認めるものであれば、上記改変型酵素と実質的に同一の酵素（実質同一トランスグルタミナーゼ）であると見なすことができる。ここでの同一性は、70%以上、80％以上、82%以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上、98％、又は99%以上である。同一性は高いほど好ましい。従って、最も好ましい態様では、同一性が99%以上となる。
　上記改変型酵素と実質同一トランスグルタミナーゼを比較すれば、アミノ酸配列の僅かな相違が認められることになる。但し、アミノ酸配列の相違は上記アミノ酸置換が施された位置以外の位置で生ずることとする。従って、例えば、同一性の基準が配列番号２のアミノ酸配列の場合は3位G以外の位置、同一性の基準が配列番号３のアミノ酸配列の場合は3位K以外の位置、同一性の基準が配列番号４のアミノ酸配列の場合は3位W以外の位置、同一性の基準が配列番号５のアミノ酸配列の場合は3位Gと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号６のアミノ酸配列の場合は3位Kと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号７のアミノ酸配列の場合は3位Nと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号８のアミノ酸配列の場合は3位Pと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号９のアミノ酸配列の場合は3位Wと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号１０のアミノ酸配列の場合は34位Wと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号１１のアミノ酸配列の場合は65位Iと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号１２のアミノ酸配列の場合は303位Kと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号１３のアミノ酸配列の場合は303位Rと305位W以外の位置、同一性の基準が配列番号１４のアミノ酸配列の場合は5位H以外の位置、同一性の基準が配列番号１５のアミノ酸配列の場合は6位D以外の位置、同一性の基準が配列番号１６のアミノ酸配列の場合は59位T以外の位置、同一性の基準が配列番号１７のアミノ酸配列の場合は61位G以外の位置、同一性の基準が配列番号１８のアミノ酸配列の場合は61位R以外の位置、同一性の基準が配列番号１９のアミノ酸配列の場合は288位F以外の位置、同一性の基準が配列番号２０のアミノ酸配列の場合は288位L以外の位置、同一性の基準が配列番号２１のアミノ酸配列の場合は288位Y以外の位置、同一性の基準が配列番号２２のアミノ酸配列の場合は290位I以外の位置、においてアミノ酸配列の相違が生じることになる。換言すれば、配列番号２のアミノ酸配列と上記の同一性（70%以上、80％以上、82%以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上、98％、又は99%以上）を示すアミノ酸配列では、3位アミノ酸Gはである。同様に、配列番号３のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸はKであり、配列番号４のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸はWであり、配列番号５のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸はG、305位アミノ酸はWであり、配列番号６のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸Kは、305位アミノ酸Wはであり、配列番号７のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸はN、305位アミノ酸Wはであり、配列番号８のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸はP、305位アミノ酸はWであり、配列番号９のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では3位アミノ酸はW、305位アミノ酸はWであり、配列番号１０のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では34位アミノ酸はW、305位アミノ酸はWであり、配列番号１１のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では65位アミノ酸はI、305位アミノ酸はWであり、配列番号１２のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では303位アミノ酸Kは、305位アミノ酸はWであり、配列番号１３のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では303位アミノ酸はR、305位アミノ酸はWであり、配列番号１４のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では5位アミノ酸はHであり、配列番号１５のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では6位アミノ酸はDであり、配列番号１６のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では59位アミノ酸はTであり、配列番号１７のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では61位アミノ酸はGであり、配列番号１８のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では61位アミノ酸はRであり、配列番号１９のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では288位アミノ酸はFであり、配列番号２０のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では288位アミノ酸はLであり、配列番号２１のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では288位アミノ酸はYであり、配列番号２２のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では290位アミノ酸はIである。
　ここでの「アミノ酸配列の僅かな相違」は、アミノ酸の欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組合せにより生じる。典型的には、アミノ酸配列を構成する１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。「アミノ酸配列の僅かな相違」は、好ましくは保存的アミノ酸置換により生じている。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。尚、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼ（配列番号１）の活性残基は64位システインであることが知られていることから、変異を施す際には当該酸残基に影響がないようにするとよい。
　ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの塩基配列（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
　二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77に記載されたアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
　二つのアミノ酸配列の同一性を、EMBOSSパッケージのGAPプログラムを用いて、Blosum 62マトリックスを使用し、ギャップ加重＝10、ギャップ長加重＝2として決定することができる。また、二つの塩基配列の同一性を、EMBOSSパッケージ（http://emboss.open-bio.org/で利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
　典型的には、配列番号１のアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼ、即ち、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼが変異（上記(1)～(11)のいずれかのアミノ酸置換）することによって、本発明の改変型酵素となる。上記の実質同一トランスグルタミナーゼについては、配列番号１のアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼが変異（上記(1)～(11)のいずれかのアミノ酸置換）したものに更に変異を加えること、配列番号１のアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼを産生するストレプトマイセス・モバラエンシス株と同種同属由来のトランスグルタミナーゼ等、配列番号１のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼに対して同等の変異を加えること、又は当該変異によって得られるものに更に変異を加えること、によって得ることができる。ここでの「同等の変異」では、配列番号１のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列において、本発明における変異点（上記(1)～(11)のいずれかのアミノ酸置換における変異点）のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が置換されることになる。尚、配列番号１のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるトランスグルタミナーゼの例として、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）（以前はストレプトベルティシリウム・ラダカヌム(Streptoverticillium ladakanum)に分類されていた）に由来し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ（アミノ酸列の同一性93％）、ストレプトマイセス・アルビレティクリ（Streptomyces albireticuli）に由来し、配列番号４５のアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ（アミノ酸列の同一性82％）、ストレプトマイセス・ルテイレティクリー（Streptomyces luteireticuli）に由来し、配列番号４６のアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ（アミノ酸列の同一性82％）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Streptomyces cinnamoneus）に由来し、配列番号４７のアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ（アミノ酸列の同一性81％）、ストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces platensis）に由来し、配列番号４８のアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ（アミノ酸列の同一性80％）、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）に由来し、配列番号４９のアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ（アミノ酸列の同一性80％）を挙げることができる。
　本明細書においてアミノ酸残基について使用する場合の用語「相当する」とは、比較されるタンパク質（酵素）間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味する。例えば、基準トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列）に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造（アミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに（このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて立体構造（三次元構造）同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数の酵素の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。変異対象酵素の立体構造情報は例えばProtein Data Bank（http://www.pdbj.org/index#j.html）より取得することができる。
　Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定方法の一例を以下に示す。
（１）タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
（２）作製した結晶にＸ線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はＸ線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に－173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
（３）結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなＸ線散乱能のＸ線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を０に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社（アメリカ）のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS#SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
２．改変型トランスグルタミナーゼをコードする核酸等
　本発明の第２の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
　改変型酵素をコードする遺伝子は典型的には改変型酵素の調製に利用される。改変型酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の改変型酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の改変型酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、改変型酵素をコードする遺伝子の用途は改変型酵素の調製に限られない。例えば、改変型酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは酵素の更なる改変体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
　本明細書において「改変型酵素をコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に当該改変型酵素が得られる核酸のことをいい、当該改変型酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
　改変型酵素をコードする遺伝子の配列（塩基配列）の例を配列番号２３～４３に示す。これらの配列は、下記の通り、後述の実施例に示した変異体をコードする。
配列番号２３：D3G変異体
配列番号２４：D3K変異体
配列番号２５：D3W変異体
配列番号２６：D3G/F305W変異体
配列番号２７：D3K/F305W変異体
配列番号２８：D3N/F305W変異体
配列番号２９：D3P/F305W変異体
配列番号３０：D3W/F305W変異体
配列番号３１：Y34W/F305W変異体
配列番号３２：V65I/F305W変異体
配列番号３３：S303K/F305W変異体
配列番号３４：S303R/F305W変異体
配列番号３５：R5H変異体
配列番号３６：V6D変異体
配列番号３７：W59T変異体
配列番号３８：S61G変異体
配列番号３９：S61R変異体
配列番号４０：M288F変異体
配列番号４１：M288L変異体
配列番号４２：M288Y変異体
配列番号４３：V290I変異体
　本発明の遺伝子を宿主内で発現させる場合には、通常、発現産物である改変型酵素の構造安定化等のために、上記の配列（例えば、配列番号２３～４３のいずれか）の5'末端側にプロペプチド（プロ配列）をコードする配列を付加した遺伝子コンストラクトを宿主に導入することになる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、更に、プロ配列をコードする配列の5'末端側にプレ配列（シグナル配列）をコードする配列を付加した遺伝子コントラクトを用意する。当該遺伝子コンストラクトを用いた場合、プレ配列及びプロ配列が連結されたプレプロ型トランスグルタミナーゼとして発現した後、プレ配列の切断（プロ型トランスグルタミナーゼへの変換）及びプロ配列の切断を経て成熟型トランスグルタミナーゼが得られる。プレ配列をコードする配列、及びプロ配列をコードする配列には、本来の配列、即ち、基準トランスグルタミナーゼ（改変前のトランスグルタミナーゼ）の配列を用いるとよい。プレ配列の具体例を配列番号５１（ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼのプレ配列）、プロ配列の具体例を配列番号５２（ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼのプロ配列）、プレ配列をコードする配列の具体例を配列番号５３（ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼのプレ配列をコードする配列）、プロ配列をコードする配列の具体例を配列番号５４（ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼのプロ配列をコードする配列）に示す。
　本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
　本発明の他の態様では、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう。また、相同核酸を規定する塩基配列を「相同塩基配列」ともいう）が提供される。相同核酸の例として、本発明の改変型酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、改変型酵素に特徴的な酵素活性（即ちトランスグルタミナーゼ活性）を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2～40塩基、好ましくは2～20塩基、より好ましくは2～10塩基である。
　相同核酸は、基準となる塩基配列に対して、例えば60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80％以上、より一層好ましくは85％以上、さらに好ましくは約90％以上、更に一層好ましくは95％以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する。
　以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
　本発明の他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
　本発明の更に別の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその相同塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として、具体的には、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃～約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃～約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。
　本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10～約100塩基長、好ましくは約20～約100塩基長、更に好ましくは約30～約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
　本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（改変型酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
　使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）、pET21等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
　宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、麹菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）、バチルス属細菌（例えばバチルス・サチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミノリクファシエンス）、ブレビバチルス属細菌（例えばブレビバチルス・チョウシネンシス）、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることができるが、組換えDNAが複製可能で且つ改変型酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。好ましくは大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を用いることができる。ストレプトマイセス属微生物（例えばストレプトマイセス・モラバエンシス）を宿主にすることもできる。また、大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
　本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁(1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁(1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)）、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は、本発明の改変型酵素を生産することに利用することができる。
３．改変型トランスグルタミナーゼを含む酵素剤
　本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明の改変型酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、各種タンパク質、各種タンパク質の分解物、各種エキス類、各種塩類、各種酸化防止剤、システイン、グルタチオン、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、貝殻焼成カルシウム、二酸化ケイ素などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。タンパク質の例は、大豆タンパク質、小麦タンパク質、トウモロコシタンパク質、乳タンパク質、動物由来タンパク質などである。エキス類の例は肉エキス、植物エキス、酵母エキスなどである。塩類の例は、塩化塩、リン酸塩、ポリリン酸塩、ピロリン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、炭酸塩などである。酸化防止剤の例は、L-アスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウムなどである。本発明の酵素製剤の形状は特に限定されず、例えば粉末状、顆粒状、液体状、カプセル状等である。
４．改変型トランスグルタミナーゼの調製法
　本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明の改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、本発明の改変型酵素のアミノ酸配列（例えば配列番号２～２２のいずれか）をコードする核酸を用意する（ステップ(I)）。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列（アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい）が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「本発明の改変型酵素のアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、本発明の改変型酵素のアミノ酸配列は基準トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、基準トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子に対して必要な変異を加えることによっても、「本発明の改変型酵素のアミノ酸配列をコードする核酸」を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である（J.Mol.Biol.331,585-592(2003)）。例えば、Quick change（ストラタジーン社）等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16, 7351-7367(1988)）を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-（東洋紡社）、Pfu turbo（ストラタジーン社）などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
　ステップ（I)に続いて、用意した核酸を発現させる（ステップ(II)）。例えば、まず上記核酸を挿入した発現ベクターを用意し、これを用いて宿主細胞を形質転換する。
　次に、発現産物である改変型酵素が産生される条件下で形質転換体を培養する。形質転換体の培養は常法に従えばよい。培地に使用する炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
　一方、培養温度は30℃～40℃の範囲内（好ましくは33～37℃付近）で設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型酵素の産生特性などを考慮して設定することができる。培地のpHは、形質転換体が生育し且つ酵素が産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のpHを6.0～9.0程度（好ましくはpH7.0付近）とする。
　続いて、発現産物（改変型酵素）を回収する（ステップ(III)）。培養後の菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より発現産物を一旦回収する。発現産物が分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Sephadex）ゲル（GEヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B（GEヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースCL-6B（GEヘルスケアバイオサイエンス）、CMセファロースCL-6B（GEヘルスケアバイオサイエンス））などを組み合わせて分離、精製を行ことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理、物理破砕処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。
　上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
　通常は、以上のように適当な宿主－ベクター系を利用して遺伝子の発現～発現産物（改変型酵素）の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
　タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
　用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。In vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
＜特性の向上に有効な変異点の探索＞
　有用性の高い改変型のトランスグルタミナーゼの取得を目指し、蛋白質工学を用い、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼ（野生型酵素、配列番号１）の酵素機能の改良（高温反応性の向上、弱酸性域でのpH安定性低下）を試みた。まず、アミノ酸置換による変異を導入することにし、CASTing library（例えばAngew Chem Int Ed Engl. 2006 Feb 13;45(8):1236-41.を参照）及びアラニンスキャニング（Ala scanning）（例えばJ Mol. Biol. 1995 Feb 17;246(2):317-30.を参照）を利用して変異点の候補を選出した。次に、以下の方法で各変異点に変異を導入し、変異酵素を調製した。
１．変異酵素の調製
１－１．変異の導入
(1)変異導入用のPCRプライマーを設計した。
(2)各変異点用のプライマーセットを用い、トランスグルタミナーゼ遺伝子（配列番号５０）が組み込まれたプラスミドpET20bを鋳型としてPCR（98℃で1分の反応の後、98℃で10秒、60℃で15秒、68℃で2分の反応を15サイクル行い、68℃で5分反応させた後、4℃で放置）を行った。
(3)PCR反応液（25μL/チューブ）にDpnI（1.5μL/チューブ）を添加して処理（37℃、3時間以上）した。
(4)T4キナーゼを用い、ライゲーション処理（16℃、一晩）した。
(5)ライゲーション反応液（11μL/チューブ）でE.coli BL21(DE3)を形質転換し、アンピシリン含有LB培地で培養（37℃、一晩）した。
１－２．酵素抽出液の取得
(1)変異が導入された株（変異株）をアンピシリン含有TB培地に植菌し、33℃、48時間培養する。培養開始から24時間の時点でIPTG（最終濃度0.1mM）を添加した。
(2)培養液を遠心分離（3,000 g×10分）した後、上澄みを除去して菌体を回収した。
(3)溶菌剤を添加して菌体を溶菌させる。
(4)溶菌液を遠心分離（3,000 g×10分）した後、上澄みを回収して酵素抽出液とした。
１－３．成熟体化（プロペプチド配列の除去）
(1)酵素抽出液と2mg/mLプロテアーゼ（ディスパーゼ）溶液を等量混合し、反応（30℃、2時間以上）させた。
(2)混合液を遠心分離（3,000 g×10分）した後、上澄みを回収して成熟体化酵素とした。
２．酵素の精製
　TALON Spin columns（タカラバイオ社）、HisTALON Buffer Set（タカラバイオ社）を用い、添付のプロトコールに従って各成熟体化酵素を精製した。変異酵素の特性評価の際には精製した成熟体化酵素を使用した。
３．変異酵素の特性評価
　調製した各変異酵素の特性を評価する際には以下の活性測定法を用いた。
＜活性測定法＞
　成熟体化酵素を200mM Tris-HCl pH6.0で適当な濃度に希釈する（サンプル溶液）。サンプル溶液10μLに基質溶液(R-1) 100μLを添加し混合した後、37℃で10分間反応させた。発色溶液（R-2） 100μLを加えて反応を停止させるともにFe錯体を形成させた後、525nmの吸光度を測定した。対照として、予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、サンプル溶液との吸光度差を求めた。別途、酵素液の代わりにＬ－グルタミン酸－γ－モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求めた。1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位（1U）とした。
（基質溶液（R-1））
　2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1.3-プロパンジオール 2.42g、塩酸ヒドロキシアンモニウム 0.70g、還元型グルタチオン 0.31g、Z-Gln-Gly (ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミニルグリシン) 1.01gを蒸留水に溶解し総量100 mLとした（pH 6.0）。
（基質溶液（R-2））
　3M 塩酸溶液 30 mL、12％トリクロロ酢酸溶液 30 mL、5％ 塩化鉄(III)溶液 30 mLを混合した。
３－１．高温反応性の評価
　成熟体化酵素を200mM Tris-HCl pH6.0で5倍希釈し（サンプル溶液）、反応温度60℃で活性測定した。
　反応温度60℃における活性を野生型に比較することで、高温反応性向上に有効なアミノ酸置換を特定した。
　高温反応性の評価結果を表１に示す。全てのアミノ酸置換において高温反応性が向上しており、有効なアミノ酸置換と判断した。特にD3P/F305W置換、D3W/F305W置換、及びY34W/F305Wでは野生型と比較して活性が250%以上に向上しており、特に有効なアミノ酸置換と判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３－２．pH安定性の評価
　pH処理サンプルは、成熟体化酵素を各pHの200mM Britton-Robinson Buffer（pH4、4.5、5、5.5、6）で2倍希釈し、30℃で60分処理した。未処理サンプルは、成熟体化酵素を200mM Tris-HCl pH6.0で2倍希釈した。未処理サンプル及びpH処理サンプルを500mM Tris-HCl pH6.0で2倍希釈後、活性測定し、野生型酵素の未処理サンプルの活性を100としたときの相対活性で評価した。
　pH4.0又はpH4.5における相対活性が0となるアミノ酸置換を特定した。
　弱酸性域でのpH安定性低下の評価結果を表２に示す。全てのアミノ酸置換でpH4.0における相対活性が0となり、弱酸性域でのpH安定性低下に有効なアミノ酸置換と判断した。M288L置換とM288Y置換ではpH4.5における相対活性も0となり、特に有効なアミノ酸置換と判断した。M288L置換は中性域（pH6）で高い活性を示す点でもその有用性は高い。中性域（pH6）での活性の点ではS61G置換、S61R置換、M288F置換及びV290I置換も有用性が高いといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の改変型トランスグルタミナーゼは実用上重要な特性が改善しており、産業的価値が高い。従って、既存の用途での利用はもとより、新たな用途への適用も期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
配列番号２：人工配列の説明：D3G変異体
配列番号３：人工配列の説明：D3K変異体
配列番号４：人工配列の説明：D3W変異体
配列番号５：人工配列の説明：D3G/F305W変異体
配列番号６：人工配列の説明：D3K/F305W変異体
配列番号７：人工配列の説明：D3N/F305W変異体
配列番号８：人工配列の説明：D3P/F305W変異体
配列番号９：人工配列の説明：D3W/F305W変異体
配列番号１０：人工配列の説明：Y34W/F305W変異体
配列番号１１：人工配列の説明：V65I/F305W変異体
配列番号１２：人工配列の説明：S303K/F305W変異体
配列番号１３：人工配列の説明：S303R/F305W変異体
配列番号１４：人工配列の説明：R5H変異体
配列番号１５：人工配列の説明：V6D変異体
配列番号１６：人工配列の説明：W59T変異体
配列番号１７：人工配列の説明：S61G変異体
配列番号１８：人工配列の説明：S61R変異体
配列番号１９：人工配列の説明：M288F変異体
配列番号２０：人工配列の説明：M288L変異体
配列番号２１：人工配列の説明：M288Y変異体
配列番号２２：人工配列の説明：V290I変異体
配列番号２３：人工配列の説明：D3G変異体
配列番号２４：人工配列の説明：D3K変異体
配列番号２５：人工配列の説明：D3W変異体
配列番号２６：人工配列の説明：D3G/F305W変異体
配列番号２７：人工配列の説明：D3K/F305W変異体
配列番号２８：人工配列の説明：D3N/F305W変異体
配列番号２９：人工配列の説明：D3P/F305W変異体
配列番号３０：人工配列の説明：D3W/F305W変異体
配列番号３１：人工配列の説明：Y34W/F305W変異体
配列番号３２：人工配列の説明：V65I/F305W変異体
配列番号３３：人工配列の説明：S303K/F305W変異体
配列番号３４：人工配列の説明：S303R/F305W変異体
配列番号３５：人工配列の説明：R5H変異体
配列番号３６：人工配列の説明：V6D変異体
配列番号３７：人工配列の説明：W59T変異体
配列番号３８：人工配列の説明：S61G変異体
配列番号３９：人工配列の説明：S61R変異体
配列番号４０：人工配列の説明：M288F変異体
配列番号４１：人工配列の説明：M288L変異体
配列番号４２：人工配列の説明：M288Y変異体
配列番号４３：人工配列の説明：V290I変異体

Claims (13)

  1. 　配列番号１のアミノ酸配列において、以下の(1)～(11)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列（但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている）を有し、前記アミノ酸置換に対応した特性変化が認められる改変型トランスグルタミナーゼ：
    　(1)変異点がY34とF305、変異点Y34の置換後のアミノ酸がW、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
    　(2)変異点がM288、置換後のアミノ酸がL、F又はY、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
    　(3)変異点がD3、置換後のアミノ酸がW又はK、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
    　(4)変異点がD3とF305、変異点D3の置換後のアミノ酸がG、K、N、P又はW、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
    　(5)変異点がV65とF305、変異点V65の置換後のアミノ酸がI、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
    　(6)変異点がS303とF305、変異点S303の置換後のアミノ酸がR又はK、変異点F305の置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が高温反応性向上；
    　(7)変異点がR5、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
    　(8)変異点がV6、置換後のアミノ酸がD、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
    　(9)変異点がW59、置換後のアミノ酸がT、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
    　(10)変異点がS61、置換後のアミノ酸がG又はR、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
    　(11)変異点がV290、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が弱酸性域のpH安定性低下；
  2. 　前記同一性が82%以上である、請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
  3. 　前記同一性が85%以上である、請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
  4. 　前記同一性が90%以上である、請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
  5. 　配列番号２～２２のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼ。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
  7. 　配列番号２３～４３のいずれかの塩基配列を含む、請求項６に記載の遺伝子。
  8. 　請求項６又は７に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
  9. 　請求項８に記載の組換えDNAを保有する微生物。
  10. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の改変型トランスグルタミナーゼを含む酵素剤。
  11. 　以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型トランスグルタミナーゼの調製法：
    　(I)請求項１～５のいずれか一項の改変型トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
    　(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
    　(III)発現産物を回収するステップ。
  12. 　前記アミノ酸配列が配列番号２～２２のいずれかのアミノ酸配列である、請求項１１に記載の調製法。
  13. 　前記核酸が、配列番号２３～４３のいずれかの塩基配列を含む、請求項１２に記載の調製法。
PCT/JP2021/007453 2020-03-03 2021-02-26 改変型トランスグルタミナーゼ WO2021177181A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022505186A JPWO2021177181A1 (ja) 2020-03-03 2021-02-26
EP21765318.7A EP4116424A1 (en) 2020-03-03 2021-02-26 Modified transglutaminase
US17/908,761 US20230125821A1 (en) 2020-03-03 2021-02-26 Modified transglutaminase
CN202180018320.8A CN115210379A (zh) 2020-03-03 2021-02-26 修饰型转谷氨酰胺酶

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-035920 2020-03-03
JP2020035920 2020-03-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021177181A1 true WO2021177181A1 (ja) 2021-09-10

Family

ID=77613366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/007453 WO2021177181A1 (ja) 2020-03-03 2021-02-26 改変型トランスグルタミナーゼ

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230125821A1 (ja)
EP (1) EP4116424A1 (ja)
JP (1) JPWO2021177181A1 (ja)
CN (1) CN115210379A (ja)
WO (1) WO2021177181A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023058765A1 (ja) * 2021-10-07 2023-04-13 天野エンザイム株式会社 改変型トランスグルタミナーゼ

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04108381A (ja) 1990-08-27 1992-04-09 Amano Pharmaceut Co Ltd ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法
JP2002253272A (ja) 2000-08-17 2002-09-10 Ajinomoto Co Inc 微生物由来トランスグルタミナーゼの改変方法
JP2008194004A (ja) 2007-02-15 2008-08-28 Ajinomoto Co Inc 変異体トランスグルタミナーゼ
WO2010101256A1 (ja) * 2009-03-06 2010-09-10 味の素株式会社 放線菌由来の耐熱性トランスグルタミナーゼ
WO2019094301A1 (en) * 2017-11-07 2019-05-16 Codexis, Inc. Transglutaminase variants
WO2019107288A1 (ja) 2017-11-30 2019-06-06 天野エンザイム株式会社 改変型トランスグルタミナーゼ

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04108381A (ja) 1990-08-27 1992-04-09 Amano Pharmaceut Co Ltd ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法
JP2002253272A (ja) 2000-08-17 2002-09-10 Ajinomoto Co Inc 微生物由来トランスグルタミナーゼの改変方法
JP2008194004A (ja) 2007-02-15 2008-08-28 Ajinomoto Co Inc 変異体トランスグルタミナーゼ
WO2010101256A1 (ja) * 2009-03-06 2010-09-10 味の素株式会社 放線菌由来の耐熱性トランスグルタミナーゼ
WO2019094301A1 (en) * 2017-11-07 2019-05-16 Codexis, Inc. Transglutaminase variants
WO2019107288A1 (ja) 2017-11-30 2019-06-06 天野エンザイム株式会社 改変型トランスグルタミナーゼ

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current protocols in molecular biology", 1987, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ALTSCHUL ET AL., AMINO ACIDS RESEARCH, vol. 25, no. 17, 1997, pages 3389 - 3402
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 10
ANGEW CHEM INT ED ENGL., vol. 45, no. 8, 13 February 2006 (2006-02-13), pages 1236 - 41
BUETTNER K ET AL., AMINO ACIDS, vol. 42, no. 2-3, February 2012 (2012-02-01), pages 987 - 96
CHUNG ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 86, 1989, pages 2172
FEIGNER, P. L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 84, 1984, pages 7413 - 7417
GENE, vol. 96, 1990, pages 23
J MOL BIOL, vol. 246, no. 2, 17 February 1995 (1995-02-17), pages 317 - 30
J. MOL. BIOL., vol. 166, 1983, pages 557
J. MOL. BIOL., vol. 331, 2003, pages 585 - 592
J. MOL. BIOL., vol. 53, 1970, pages 159
KARLINALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 77
MARX CK ET AL., J. BIOTECHNOL., vol. 136, no. 3-4, 10 September 2008 (2008-09-10), pages 156 - 62
MU DONGDONG, LU JIAOJIAO, SHU CHANG, LI HAOWEN, LI XINGJIANG, CAI JING, LUO SHUIZHONG, YANG PEIZHOU, JIANG SHAOTONG, ZHENG ZHI: "Improvement of the activity and thermostability of microbial transglutaminase by multiple-site mutagenesis", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 82, no. 1, 2 January 2018 (2018-01-02), pages 106 - 109, XP055852274 *
NUCLEIC ACID RES., vol. 16, 1988, pages 7351 - 7367
SHIMIZU, Y. ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 19, 2001, pages 751 - 755
TAGAMI U ET AL., PROTEIN ENG. DES. SEL, vol. 22, no. 12, December 2009 (2009-12-01), pages 747 - 752
YOKOYAMA K ET AL., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 87, 2010, pages 2087 - 2096

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023058765A1 (ja) * 2021-10-07 2023-04-13 天野エンザイム株式会社 改変型トランスグルタミナーゼ

Also Published As

Publication number Publication date
CN115210379A (zh) 2022-10-18
EP4116424A1 (en) 2023-01-11
JPWO2021177181A1 (ja) 2021-09-10
US20230125821A1 (en) 2023-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019107288A1 (ja) 改変型トランスグルタミナーゼ
CN102597232B (zh) 变异型酶的设计法、制备方法和变异型酶
US7553650B2 (en) Polynucleotide encoding a mutant transglutaminase
US8580537B2 (en) Thermotolerant transglutaminase originating in actinomyces
JP7382959B2 (ja) 改変型菊酸エステラーゼ
CN106604991B (zh) 修饰型β-半乳糖苷酶
WO2021177181A1 (ja) 改変型トランスグルタミナーゼ
JPWO2019044531A1 (ja) 改変型リパーゼ及びその用途
WO2021256518A1 (ja) 新規トランスグルタミナーゼ
JP2002253272A (ja) 微生物由来トランスグルタミナーゼの改変方法
JP2007189905A (ja) 好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、および好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法
JP6605489B2 (ja) デヒドロゲナーゼ化した変異酵素及びその用途
JP7311496B2 (ja) 改変型エステラーゼ及びその用途
WO2022264963A1 (ja) トランスグルタミナーゼを含む酵素剤及びその用途
KR101778878B1 (ko) 박테로이데스 속 미생물 유래의 ｇａｂａ 생성 고활성 글루탐산탈탄산효소 및 이의 용도
WO2023058765A1 (ja) 改変型トランスグルタミナーゼ
WO2023157936A1 (ja) 改変型ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ
WO2022141411A1 (zh) 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
CN116590268A (zh) 一种热稳定性增强的胆盐水解酶以及制备与方法和应用
CN113699129A (zh) 一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
JP2010207168A (ja) アスパラギナーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21765318

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022505186

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021765318

Country of ref document: EP

Effective date: 20221004