JP7382959B2 - 改変型菊酸エステラーゼ - Google Patents
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Description
[1]配列番号1のアミノ酸配列において、以下の(1)~(23)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている)を有し、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が向上している改変型エステラーゼ:
(1)変異点がF58、置換後のアミノ酸がE、I、C、A、M又はY;
(2)変異点がD227、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H、G、F又はV;
(3)変異点がI228、置換後のアミノ酸がY、S、T又はW;
(4)変異点がL229、置換後のアミノ酸がY、F又はV;
(5)変異点がL231、置換後のアミノ酸がM、A又はG;
(6)変異点がS244、置換後のアミノ酸がF;
(7)変異点がA245、置換後のアミノ酸がN又はG;
(8)変異点がV297、置換後のアミノ酸がR、W、Q、A又はI;
(9)変異点がF298、置換後のアミノ酸がS;
(10)変異点がA328、置換後のアミノ酸がN;
(11)変異点がA328、置換後のアミノ酸がG;
(12)変異点がA328とF58、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F58の置換後のアミノ酸がL又はE;
(13)変異点がA328とL151、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ、R、H、W、A、V、M、N、C、T又はI;
(14)変異点がA328とF217、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R、E、V又はY;
(15)変異点がA328とS220、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ、L、N又はG;
(16)変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R、G又はS;
(17)変異点がA328とD227、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点D227の置換後のアミノ酸がE又はC;
(18)変異点がA328とI228、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点I228の置換後のアミノ酸がL又はG;
(19)変異点がA328とL229、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V、I又はH;
(20)変異点がA328とV297、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点V297の置換後のアミノ酸がC又はL;
(21)変異点がA328とA221とD326、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV;
(22)変異点がA328とA221とD326とF298、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL;
(23)変異点がA328とA221とD326とF298とN222、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL、変異点N222の置換後のアミノ酸がD。
[2](1)の置換後のアミノ酸がE、I、C、A又はMであり、
(2)の置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H又はGであり、
(3)の置換後のアミノ酸がY又はSであり、
(4)の置換後のアミノ酸がY又はFであり、
(5)の置換後のアミノ酸がM又はAであり、
(8)の置換後のアミノ酸がR、W又はQであり、
(12)の変異点F58の置換後のアミノ酸がLであり、
(13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQ又はRであり、
(14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R又はEであり、
(15)の変異点S220の置換後のアミノ酸がQ又はLであり、
(16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R又はGであり、
(19)の変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V又はIである、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
[3](4)の置換後のアミノ酸がYであり、
(5)の置換後のアミノ酸がMであり、
(8)の置換後のアミノ酸がR又はWであり、
(13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQであり、
(14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D又はTであり、
(16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E又はRである、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
[4]アミノ酸置換が(11)~(23)の中のいずれか一つであり、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上している、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
[5]アミノ酸置換が、A328G、A328G/F217W、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、又はA328G/I228Lである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
[6]アミノ酸置換がA328G/A221Fであり、(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用する、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
[7]アミノ酸置換がA328G/A221F/D326Vである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
[8]アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298Lである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
[9]アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298L/N222Dである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
[10]前記同一性が95%以上である、[1]~[9]のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼ。
[11]配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列からなる、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
[12][1]~[11]のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼをコードする遺伝子。
[13]配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、[12]に記載の遺伝子。
[14][12]又は[13]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
[15][14]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[16][1]~[11]のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼを含む酵素剤。
[17]以下のステップ(I)~(III)を含む、改変型エステラーゼの調製法:
(I)[1]~[11]のいずれか一項の改変型エステラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
[18]前記アミノ酸配列が配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列である、[17]に記載の調製法。
[19]前記核酸が、配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、[17]に記載の調製法。
[20][1]~[11]のいずれか一項の改変型エステラーゼを(1R,3S)-菊酸エチルに作用させることを特徴とする、(1R,3S)-菊酸の製造方法。
[21](1R,3S)-菊酸エチルが、(1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル及び(1S,3R)-菊酸エチルと共存した状態である、[20]に記載の製造方法。
(用語)
用語「改変型エステラーゼ」とは、基準となるエステラーゼ(以下、「基準エステラーゼ」と呼ぶ)を改変ないし変異して得られる酵素である。基準エステラーゼは、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列を有する、アルスロバクター属微生物(Arthrobacter globiformis)由来のエステラーゼである。
メチオニン:M、セリン:S、アラニン:A、トレオニン:T、バリン:V、チロシン:Y、ロイシン:L、アスパラギン:N、イソロイシン:I、グルタミン:Q、プロリン:P、アスパラギン酸:D、フェニルアラニン:F、グルタミン酸:E、トリプトファン:W、リジン:K、システイン:C、アルギニン:R、グリシン:G、ヒスチジン:H
本発明の第1の局面は改変型エステラーゼ(改変型酵素)に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列において、一又は二以上の特定のアミノ酸置換(変異)を含むアミノ酸配列を有する。当該特徴により、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼと比較して、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性又は選択性或いはこれらの両者が向上している。尚、配列番号1のアミノ酸配列は、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼ)の配列である。
(2)変異点がD227、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H、G、F又はV。好ましくは、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H又はG。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がI、S、A、W又はH。
(3)変異点がI228、置換後のアミノ酸がY、S、T又はW。好ましくは、置換後のアミノ酸がY又はS。
(4)変異点がL229、置換後のアミノ酸がY、F又はV。好ましくは、置換後のアミノ酸がY又はF。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がY。
(5)変異点がL231、置換後のアミノ酸がM、A又はG。好ましくは、置換後のアミノ酸がM又はA。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がM。
(6)変異点がS244、置換後のアミノ酸がF。
(7)変異点がA245、置換後のアミノ酸がN又はG
(8)変異点がV297、置換後のアミノ酸がR、W、Q、A又はI。好ましくは、置換後のアミノ酸がR、W又はQ。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がR又はW。
(9)変異点がF298、置換後のアミノ酸がS。
(10)変異点がA328、置換後のアミノ酸がN。
(11)変異点がA328、置換後のアミノ酸がG。
(12)変異点がA328とF58、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F58の置換後のアミノ酸がL又はE。好ましくは、変異点F58の置換後のアミノ酸がL。
(13)変異点がA328とL151、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ、R、H、W、A、V、M、N、C、T又はI。好ましくは、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ又はR。更に好ましくは、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ。
(14)変異点がA328とF217、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R、E、V又はY。好ましくは、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R又はE。更に好ましくは、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D又はT。
(15)変異点がA328とS220、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ、L、N又はG。好ましくは、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ又はL。
(16)変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R、G又はS。好ましくは、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R又はG。更に好ましくは、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E又はR。
(17)変異点がA328とD227、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点D227の置換後のアミノ酸がE又はC。
(18)変異点がA328とI228、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点I228の置換後のアミノ酸がL又はG。
(19)変異点がA328とL229、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V、I又はH。好ましくは、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V又はI。
(20)変異点がA328とV297、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点V297の置換後のアミノ酸がC又はL。
(21)変異点がA328とA221とD326、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV。
(22)変異点がA328とA221とD326とF298、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL。
(23)変異点がA328とA221とD326とF298とN222、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL、変異点N222の置換後のアミノ酸がD。
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に-173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
本発明の第2の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
配列番号13:A328G変異体
配列番号14:A328G/A217W変異体
配列番号15:A328G/A221F変異体
配列番号16:A328G/A221M変異体
配列番号17:A328G/A221L変異体
配列番号18:A328G/A221V変異体
配列番号19:A328G/I228L変異体
配列番号20:A328G/A221F/D326V変異体
配列番号21:A328G/A221F/D326V/F298L変異体
配列番号22:A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体
本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本発明の改変型酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する(ステップ(I))。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号2~11のアミノ酸配列はいずれも、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼをコードする遺伝子に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸(遺伝子)を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例えば、Quick change(ストラタジーン社)等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(ストラタジーン社)などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
本発明の更なる局面は改変型酵素の用途に関し、本発明の改変型酵素を用いた、(1R,3S)-菊酸の製造方法が提供される。本発明の製造方法では、本発明の改変型酵素を(1R,3S)-菊酸エチルに作用させて加水分解し、(1R,3S)-菊酸を生成させる。所望の加水分解反応が達成させる限りにおいて反応条件は特に限定されない。例えば、グリシン-NaOHやPIPES等の緩衝液を利用し、pH6~11、温度40℃~60℃の条件下で反応させることができる。基質として、純度の高い(1R,3S)-菊酸エチル(例えば純度が98%以上)を使用しても、或いは(1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル及び(1S,3R)-菊酸エチルが共存した状態の基質(例えば、(1R,3R):(1S,3S):(1R,3S):(1S,3R)=3:3:2:2の混合菊酸エチル等)を使用することにしてもよい。反応産物は必要に応じて光学分割した後、各種用途に利用される。光学分割にはカラムクロマトグラフィーを用いることができる。改変型酵素は固定化したものを用いても良い。
以下の方法で変異体ライブラリー(CASTing Library及び2点組み合わせ変異体)を作製した。
(1)変異の導入・形質転換
変異導入用PCRプライマーを設計し、以下の条件でPCRを行い、変異を導入した。
<鋳型プラスミド>
pET21b (野性型酵素遺伝子を導入)約30 ng/μL
<PCR反応組成>(総量20μL)
5× Prime STAR GXL Buffer(タカラバイオ): 4μL
dNTP Mixture (2.5mM each): 1.6μL
鋳型(約30 ng/μL): 0.25μL
F-プライマー: 0.2μL
R-プライマー: 0.2μL
Prime STAR GXL DNA Polymerase (タカラバイオ): 0.8μL
以上を混合し、超純水(Milli Q水)で20μLに調整
98℃で1分の反応
98℃で10秒、60℃で15秒及び68℃で2分の反応を20サイクル
68℃で5分の反応
4℃で放置
<ライゲーション反応組成>(総量5.5μL)
DpnI 処理 PCR産物: 2μL
T4 Polynucleotide Kinase: 1μL
Ligation High(東洋紡): 2.5μL
前培養後の各変異株を、アンピシリン(最終濃度0.1mg/mL)を添加したTB培地(invitrogen) 1 mLに植菌した。33℃で48時間培養し(培養開始24時間の時点でIPTG (最終濃度 0.1mM)を添加)、遠心分離(3,000 g × 10分)した。上澄みを除去して菌体を回収した後、溶菌剤にて菌体を溶菌(25℃、2時間以上)させて酵素を抽出した。溶菌液を遠心分離(3,000 g × 10分)後、上澄みを回収して酵素抽出液とした。
A328G変異体を鋳型として、上記(1)と同様の操作でPCRを行った。PCR産物を回収し、上記(2)と同様の操作で酵素抽出液を得た。尚、CASTing Libraryの評価結果とMOE(MOLSIS社)によるドッキングシミュレーションの結果を踏まえてA328Gに組み合わせる変異点の候補を選定した。
A328G/A221F変異体を鋳型として、Error-prone PCRによりランダム変異導入を行った。trans-pNP菊酸を用い、遊離するpNP量を指標にスクリーニングを行った。得られた変異体を鋳型として同様の変異導入及びスクリーニングを繰り返し複数回実施することで、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が増加した多重変異体を作製した。
2-1.CASTing Libraryの評価
以下の方法でCASTing Libraryを評価した。(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性の変化を評価するため、以下の2種類の基質を用いた。
基質1(混合基質):菊酸エチル(純度95%以上、(1R,3R)体、(1R,3S)体、(1S,3R)体、(1S,3S)体の混合物((1R,3R):(1S,3S):(1R,3S):(1S,3R)=3:3:2:2)、東京化学工業)
基質2(単独基質):(1R,3S)-菊酸エチル
1μLの基質(基質1又は基質2)を反応容器に分注し、測定サンプル(上記1.(2)で調製した酵素抽出液)99μLを加え、反応(40℃、24時間)させた。反応後、6N HCl 10μL及びヘキサン150μLを加えた。よく攪拌した後、遠心分離し、有機層100μLを採取した。抽出物を乾固し、分析用溶媒に再溶解した後、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)で分析した。分析条件を以下に示す。
<超臨界流体クロマトグラフ(SFC)の分析条件>
装置:ACQUITY UPC2 PDA システム(Waters社)
カラム:ACQUITY UPC2 Trefoil AMY1(Waters社) 2.5μm, 3.0×150mm
移動相:CO2/10mM 酢酸アンモニウム含有2-プロパノール (0.5% 酢酸) = 92/8
流量:2.0 mL/分
注入量:1μL
分析時間:1.5分
PDA検出機:205-400 nm
解像度:1.2 nm
F58E、F58I、F58C、F58A、F58M、F58Y
D227I、D227S、D227A、D227W、D227H、D227G、D227F、D227V
I228Y、I228S、I228T、I228W
L229Y、L229F、L229V
L231M、L231A、L231G
S244F
A245N、A245G
V297R、V297W、V297Q、V297A、V297I
F298S
A328N、A328G
F58E、F58I、F58C、F58A、F58M
D227I、D227S、D227A、D227W、D227H、D227G
I228Y、I228S
L229Y、L229F
L231M、L231A
V297R、V297W、V297Q
A328G
F58E、F58I、F58C、F58A、F58M
D227I、D227S、D227A、D227W、D227H
I228Y、I228S
L229Y
L231M
V297R、V297W
A328G
1μLの基質1を反応容器に分注し、測定サンプル(上記1.(3)で調製した酵素抽出液)99μLを加え、反応(40℃、24時間)させた。反応後、6N HCl 10μL及びヘキサン150μLを加えた。よく攪拌した後、遠心分離し、有機層100μLを採取した。抽出物を乾固し、分析用溶媒に再溶解した後、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)で分析した。分析条件はCASTing Libraryの評価の場合と同様とした。
A328G/F58L、A328G/F58E
A328G/L151Q、A328G/L151R、A328G/L151H、A328G/L151W、A328G/L151A、A328G/L151V、A328G/L151M、A328G/L151N、A328G/L151C、A328G/L151T、A328G/L151I
A328G/F217W、A328G/F217G、A328G/F217A、A328G/F217D、A328G/F217T、A328G/F217R、A328G/F217E、A328G/F217V、A328G/F217Y
A328G/S220Q、A328G/S220L、A328G/S220N、A328G/S220G
A328G/A221F、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、A328G/A221E、A328G/A221R、A328G/A221G、A328G/A221S
A328G/D227E、A328G/D227C
A328G/I228L、A328G/I228G
A328G/L229R、A328G/L229V、A328G/L229I、A328G/L229H
A328G/V297C、A328G/V297L
A328G/F58L
A328G/L151Q、A328G/L151R
A328G/F217W、A328G/F217G、A328G/F217A、A328G/F217D、A328G/F217T、A328G/F217R、A328G/F217E
A328G/S220Q、A328G/S220L
A328G/A221F、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、A328G/A221E、A328G/A221R、A328G/A221G
A328G/I228L、A328G/I228G
A328G/L229R、A328G/L229V、A328G/L229I
A328G/L151Q
A328G/F217W、A328G/F217G、A328G/F217A、A328G/F217D、A328G/F217T
A328G/A221F、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、A328G/A221E、A328G/A221R
A328G/I228L、A328G/I228G
2μLの基質1を反応容器に分注し、測定サンプル(上記1.(3)で調製した酵素抽出液)98μLを加え、反応(40℃、24時間)させた。反応後、6N HCl 10μL及びヘキサン150μLを加えた。よく攪拌した後、遠心分離し、有機層100μLを採取した。抽出物を乾固し、分析用溶媒に再溶解した後、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)で分析した。分析条件はCASTing Libraryの評価の場合と同様とした。
A328G/A221F/D326V
A328G/A221F/D326V/F298L
A328G/A221F/D326V/F298L/N222D
(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性/選択性の向上に有効な複数の変異を同定することに成功した。A328G/A221F変異体は(1R,3S)-菊酸エチル特異的な反応性を示し、極めて特徴的である。A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体は(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性に加え反応性が大きく向上しており、極めて有用である。これらの変異体を含め、特に有効な変異を含む変異体のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子(一例)を以下に示す。
A328G変異体:配列番号2(アミノ酸配列)、配列番号13(遺伝子配列)
A328G/F217W変異体:配列番号3(アミノ酸配列)、配列番号14(遺伝子配列)
A328G/A221F変異体:配列番号4(アミノ酸配列)、配列番号15(遺伝子配列)
A328G/A221M変異体:配列番号5(アミノ酸配列)、配列番号16(遺伝子配列)
A328G/A221L変異体:配列番号6(アミノ酸配列)、配列番号17(遺伝子配列)
A328G/A221V変異体:配列番号7(アミノ酸配列)、配列番号18(遺伝子配列)
A328G/I228L変異体:配列番号8(アミノ酸配列)、配列番号19(遺伝子配列)
A328G/A221F/D326V変異体:配列番号9(アミノ酸配列)、配列番号20(遺伝子配列)
A328G/A221F/D326V/F298L変異体:配列番号10(アミノ酸配列)、配列番号21(遺伝子配列)
A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体:配列番号11(アミノ酸配列)、配列番号22(遺伝子配列)
配列番号3:人工配列の説明:A328G/F217W変異体
配列番号4:人工配列の説明:A328G/A221F変異体
配列番号5:人工配列の説明:A328G/A221M変異体
配列番号6:人工配列の説明:A328G/A221L変異体
配列番号7:人工配列の説明:A328G/A221V変異体
配列番号8:人工配列の説明:A328G/I228L変異体
配列番号9:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V変異体
配列番号10:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L変異体
配列番号11:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体
配列番号13:人工配列の説明:A328G変異体
配列番号14:人工配列の説明:A328G/F217W変異体
配列番号15:人工配列の説明:A328G/A221F変異体
配列番号16:人工配列の説明:A328G/A221M変異体
配列番号17:人工配列の説明:A328G/A221L変異体
配列番号18:人工配列の説明:A328G/A221V変異体
配列番号19:人工配列の説明:A328G/I228L変異体
配列番号20:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V変異体
配列番号21:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L変異体
配列番号22:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体
Claims (20)
- 配列番号1のアミノ酸配列において、以下の(1)~(23)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている)を有し、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が向上している改変型エステラーゼ:
(1)変異点がF58、置換後のアミノ酸がE、I、C、M又はY;
(2)変異点がD227、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H、G、F又はV;
(3)変異点がI228、置換後のアミノ酸がY、S、又はT;
(4)変異点がL229、置換後のアミノ酸がY、F又はV;
(5)変異点がL231、置換後のアミノ酸がM、A又はG;
(6)変異点がS244、置換後のアミノ酸がF;
(7)変異点がA245、置換後のアミノ酸がN;
(8)変異点がV297、置換後のアミノ酸がR、W、Q、A又はI;
(9)変異点がF298、置換後のアミノ酸がS;
(10)変異点がA328、置換後のアミノ酸がN;
(11)変異点がA328、置換後のアミノ酸がG;
(12)変異点がA328とF58、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F58の置換後のアミノ酸がL又はE;
(13)変異点がA328とL151、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ、R、H、W、A、V、M、N、C、T又はI;
(14)変異点がA328とF217、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R、E、V又はY;
(15)変異点がA328とS220、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ、L、N又はG;
(16)変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R、G又はS;
(17)変異点がA328とD227、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点D227の置換後のアミノ酸がE又はC;
(18)変異点がA328とI228、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点I228の置換後のアミノ酸がL又はG;
(19)変異点がA328とL229、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V、I又はH;
(20)変異点がA328とV297、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点V297の置換後のアミノ酸がC又はL;
(21)変異点がA328とA221とD326、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV;
(22)変異点がA328とA221とD326とF298、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL;
(23)変異点がA328とA221とD326とF298とN222、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL、変異点N222の置換後のアミノ酸がD。 - (1)の置換後のアミノ酸がE、I、C又はMであり、
(2)の置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H又はGであり、
(3)の置換後のアミノ酸がY又はSであり、
(4)の置換後のアミノ酸がY又はFであり、
(5)の置換後のアミノ酸がM又はAであり、
(8)の置換後のアミノ酸がR、W又はQであり、
(12)の変異点F58の置換後のアミノ酸がLであり、
(13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQ又はRであり、
(14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R又はEであり、
(15)の変異点S220の置換後のアミノ酸がQ又はLであり、
(16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R又はGであり、
(19)の変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V又はIである、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。 - (4)の置換後のアミノ酸がYであり、
(5)の置換後のアミノ酸がMであり、
(8)の置換後のアミノ酸がR又はWであり、
(13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQであり、
(14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D又はTであり、
(16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E又はRである、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。 - アミノ酸置換が(11)~(23)の中のいずれか一つであり、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上している、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。
- アミノ酸置換が、A328G、A328G/F217W、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、又はA328G/I228Lである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
- アミノ酸置換がA328G/A221Fであり、(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用する、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
- アミノ酸置換がA328G/A221F/D326Vである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
- アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298Lである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
- アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298L/N222Dである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
- 前記同一性が95%以上である、請求項1~9のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼ。
- 配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。
- 請求項1~11のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼをコードする遺伝子。
- 配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、請求項12に記載の遺伝子。
- 請求項12又は13に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項14に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 請求項1~11のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼを含む酵素剤。
- 以下のステップ(I)~(III)を含む、改変型エステラーゼの調製法:
(I)請求項1~11のいずれか一項の改変型エステラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。 - 前記アミノ酸配列が配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列である、請求項17に記載の調製法。
- 前記核酸が、配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、請求項17に記載の調製法。
- 請求項1~11のいずれか一項の改変型エステラーゼを(1R,3S)-菊酸エチルに作用させることを特徴とする、(1R,3S)-菊酸の製造方法。
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西澤雅子,微生物酵素を用いた光学活性ピレスロイド中間体の製造に関する研究, [オンライン],奈良先端科学技術大学院大学 博士論文,2011年,[検索日: 2020.02.12], インターネット: 〈https://library.naist.jp/mylimedio/dllimedio/showpdf2.cgi/ |
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