RU2342426C2 - Получение биологически доступной фолиевой кислоты - Google Patents
Получение биологически доступной фолиевой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2342426C2 RU2342426C2 RU2003137558/13A RU2003137558A RU2342426C2 RU 2342426 C2 RU2342426 C2 RU 2342426C2 RU 2003137558/13 A RU2003137558/13 A RU 2003137558/13A RU 2003137558 A RU2003137558 A RU 2003137558A RU 2342426 C2 RU2342426 C2 RU 2342426C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- folate
- lactic acid
- acid bacterium
- genes
- gene
- Prior art date
Links
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 title claims description 145
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 title description 125
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 title description 122
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 title description 3
- 108010062699 gamma-Glutamyl Hydrolase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102100021023 Gamma-glutamyl hydrolase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108010065780 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridine pyrophosphokinase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010089355 dihydroneopterin aldolase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- FJUSJWBIWLXZEN-GJZGRUSLSA-N (4S)-4-amino-5-[(4S)-4-[[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]oxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)OC(CC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)C1=CC=C(NCC2=CN=C3N=C(N)NC(=O)C3=N2)C=C1)=O FJUSJWBIWLXZEN-GJZGRUSLSA-N 0.000 claims description 28
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 25
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 108010023555 GTP Cyclohydrolase Proteins 0.000 abstract description 22
- 102000036509 GTP Cyclohydrolase Human genes 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 abstract 1
- PXZAWHSJYIECNQ-UHFFFAOYSA-N apholate Chemical compound C1CN1P1(N2CC2)=NP(N2CC2)(N2CC2)=NP(N2CC2)(N2CC2)=N1 PXZAWHSJYIECNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 abstract 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 119
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 26
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 23
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 23
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 23
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 20
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 19
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 101001075370 Rattus norvegicus Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 14
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 13
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 11
- 101150004665 GCH1 gene Proteins 0.000 description 10
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 10
- 101100228523 Ostertagia ostertagi gch gene Proteins 0.000 description 10
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 8
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 101150073342 folC gene Proteins 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 5
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 5
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 5
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 101150102771 gch gene Proteins 0.000 description 5
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108700016256 Dihydropteroate synthases Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- -1 folate Chemical compound 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGGUVLXVLHAAGT-XINAWCOVSA-N 7,8-dihydroneopterin 3'-triphosphate Chemical compound N1CC([C@H](O)[C@H](O)COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)=NC2=C1N=C(N)NC2=O DGGUVLXVLHAAGT-XINAWCOVSA-N 0.000 description 3
- 101100227595 Chlamydia pneumoniae folKP gene Proteins 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 3
- 102100035067 Folylpolyglutamate synthase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 101100063392 Mycobacterium leprae (strain TN) folP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 101150045875 folP gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 101150064613 pepN gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- 241000194102 Bacillus intermedius Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010093223 Folylpolyglutamate synthetase Proteins 0.000 description 2
- 102100027346 GTP cyclohydrolase 1 Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N Glycolaldehyde Chemical compound OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 2
- 102000030722 folylpolyglutamate synthetase Human genes 0.000 description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 2
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 2
- 125000002642 gamma-glutamyl group Chemical group 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- CQQNNQTXUGLUEV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-6-(hydroxymethyl)-7,8-dihydropteridin-4-ol Chemical compound N1CC(CO)=NC2=C1N=C(N)NC2=O CQQNNQTXUGLUEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000330 Diphosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000003936 Diphosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 101100460472 Lactococcus lactis subsp. lactis nisK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460474 Lactococcus lactis subsp. lactis nisR gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- 101000931108 Mus musculus DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- BRUQQQPBMZOVGD-XFKAJCMBSA-N Oxycodone Chemical compound O=C([C@@H]1O2)CC[C@@]3(O)[C@H]4CC5=CC=C(OC)C2=C5[C@@]13CCN4C BRUQQQPBMZOVGD-XFKAJCMBSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229920000370 gamma-poly(glutamate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000015205 orange juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002085 oxycodone Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000009057 passive transport Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- CPNGPNLZQNNVQM-UHFFFAOYSA-N pteridine Chemical group N1=CN=CC2=NC=CN=C21 CPNGPNLZQNNVQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 235000019159 vitamin B9 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011727 vitamin B9 Substances 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/065—Microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/15—Vitamins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1235—Diphosphotransferases (2.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C2220/00—Biochemical treatment
- A23C2220/20—Treatment with microorganisms
- A23C2220/202—Genetic engineering of microorganisms used in dairy technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. В молочнокислой бактерии обеспечивают сверхэкспрессию фермента, выбранного из гамма-глутамилгидролазы, GTP циклогидролазы, дигидронеоптеринальдолазы и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридинпирофосфокиназы. Данную бактерию используют в ферментативном способе получения моноглутамилфолата и в составе пищевого продукта, в том числе, молочного. Применение изобретения позволяет получить повышенное количество фолата в биодоступной форме. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
Область техники к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности, в частности, к повышению продукции фолата, как в общем плане, так и специфического биологически доступного фолата, т.е. фолата, который может легко поглощаться в желудочно-кишечном тракте млекопитающих, с использованием генетически измененных микроорганизмов.
Уровень техники
Фолат(N-[4-{[(2-амино-1,4-дигидро-4-оксо-6-птеридинил)метил]амино}бензоил]-L-глутаминовая кислота; витамин В11; витамин М) представляет собой кроветворный витамин, играющий важную роль в сохранении здоровья и лечении людей и животных. Фолат не может продуцироваться млекопитающими. Главным источником фолата являются растения, в особенности шпинат и другая зелень, травы, дрожжи и другие микроорганизмы, а также, косвенно, органы животных (почки, печень). В настоящее время, снабжение организма фолатом осуществляется за счет его применения, как такового, или в витаминных препаратах. Однако следует отметить, что применение таких витаминов вне рамок обычного питания является дорогостоящим и не всегда приемлемым.
Фолат является общим термином, имеющим отношение к большому числу различных производных фолиевой кислоты; такие соединения могут отличаться по степени окисления, природе заместителя по углеродному атому в птеридиновом кольце и по числу глутаминовых остатков. Эти отличия связаны с различными физико-химическими свойствами, которые, совместно с некоторыми пищевыми компонентами, могут оказывать влияние на биологическую доступность фолата. Одним из важнейших факторов, определяющих биологическую доступность фолата, является его устойчивость. Воздействие кислорода, тепла и, что наиболее важно, кислотно-пепсиновой среды желудка, понижает устойчивость фолата. Защитой от такой неустойчивости может служить наличие в пище таких антиоксидантов, как аскорбиновая кислота и восстановленные тиолы.
Другим фактором, оказывающим влияние на биологическую доступность фолата, является присутствие в нем полиглутаминовых остатков. Имеющаяся информация по этому вопросу показывает, что биодоступность моноглутамилфолата выше, чем биологическая доступность полиглутамилфолата. Полиглутамилфолаты должны быть гидролизованы в моноглутамильные производные, прежде чем они будут поглощаться в кишечнике. Такое превращение катализируется кишечными гидролазами. Однако действие таких ферментов может ингибироваться некоторыми компонентами пищи. Кроме этого, активность этих ферментов также зависит от длины цепи глутамата (Gregory, 1989). Из сказанного можно сделать вывод, что присутствие фолата в виде моноглутамильного производного повышает биологическую доступность фолатов.
Фолат присутствует в таких пищевых продуктах, как мясо, овощи и молочные продукты. Количество моноглутамилфолатов, и, следовательно, биодоступность фолата, сильно изменяется в зависимости от природы пищевого продукта; как показал анализ, яичный желток содержит 72% моноглутамил фолатов (MGF), коровья печень содержит 56% MGF, апельсиновый сок содержит 21% MGF, капуста содержит 6% MGF, лимская фасоль содержит 5% MGF, а салат содержит менее 1% MGF (Seyoum and Selhub, 1998).
Внутриклеточный фолат молочнокислых бактерий, главным образом присутствует в виде полиглутамилфолата. Одной из функций глутаматного остатка полиглутамилфолатов, содержащихся в микроорганизмах, является удерживание фолата в клетках (Shane and Stokstad, 1975). Вследствие этого, существует возможность, что полиглутамилфолаты остаются внутри бактерии при проходе через желудочно-кишечный (GI) тракт и не являются доступными для поглощения организмом человека. Решение такой проблемы состоит в увеличении количества моноглутамилфолата и, следовательно, уменьшении степени удерживания внутриклеточного фолата.
Фолат может быть синтезирован по многоферментному маршруту из предшественников GTP, парааминобензойной кислоты и глутамата (см. фигуру 1). В некоторых микроорганизмах, включающих молочнокислые бактерии Lactococcus lactis, гены, кодирующие такой путь превращения - gch, folC, folP, dhna, hppk и dhfr - организованы в виде кластера гена. GTP циклогидролаза I (gch, ЕС 3.5.4.16) катализирует реакцию от GTP до дигидронеоптеринтрифосфата с образованием промежуточного соединения и выделением формиата. Затем фосфатный остаток удаляется, предположительно, под воздействием фосфатазы (Pase). Под воздействием дигидронеоптерин альдолазы (ЕС 4.1.2.25) на продукт реакции, происходит синтез гликолевого альдегида и 6-гидроксиметил-7,8-дигидроптерина, который превращается в 6-гидроксиметил-7,8-дигидроптерин пирофосфат при помощи 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназы (hppk, ЕС 2.5.1.15). Под воздействием дигидроптероатсинтазы (dps, folP, EC 6.3.2.17) происходит сочетание парааминобензоата с получением 7,8-дигидроптероата. Фолатсинтаза (folC, ЕС 6.3.2.17) обеспечивает связывание глутамата с дигидрофолатредуктазой с образованием дигидрофолата. После дополнительного восстановления в тетрагидрофолат, под действием дигидрофолат редуктазы (dhfr, EC 1.5.1.3), в результате присоединения глутамата к карбоксильной группе боковой цепи ранее связанных глутаматных остатков с помощью фолил полиглутамат синтазы (folC, EC 6.3.2.17) происходит образование полиглутамилтетрагидрофолата (на фигуре 1 не показан).
В WO 01/00845 содержится информация о последовательностях четырех ферментов, участвующих в синтезе фолата в Corynebacterium glutamicum: GTP циклогидролазы I (Fol E), дигидроптероат синтазы (Fol В), дигидронеоптерин альдолазы (Fol P) и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназы (Fol К). Предлагается вводить такие Corynebacterium гены в Corynebacterium или другие микроорганизмы, однако, не приводится никаких сведений о природе используемых генов и ожидаемых результатах. Кроме этого геномная организация генов, кодирующих такие ферменты, сильно отличается для Corynebacterium, с одной стороны, и других микроорганизмов, например. Bacillus, молочнокислых бактерий и дрожжей, с другой стороны.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что могут быть получены микроорганизмы, способные продуцировать не только большее количество фолата, но также продуцировать фолат в биодоступной форме. В соответствии с этим, настоящее изобретение предусматривает рекомбинантный микроорганизм пищевого сорта, способный продуцировать полиглутамилфолат и содержащий активный гетерологический или гомологический гамма-глутамилгидролазный ген, или генетически измененный микроорагнизм, способный вырабатывать не только большее количество фолата за счет сверхпродукции индивидуального биосинтетического гена, но также относительно меньшее количество полиглутамилфолатов, что благоприятствует выделению фолата во внешнюю среду. Кроме этого настоящее изобретение предусматривает полигенный экспрессирующий кластер, содержащий гамма-глутамил гидролазный ген или такой биосинтетический ген, как GTP циклогидролазный ген с подходящими, предпочтительно, микробными регуляторными последовательностями, а также способ получения фолата с помощью культивируемых микроорагнизмов, продуцирующих фолат и содержащих полигенный экспрессирующий кластер. Кроме этого настоящее изобретение предусматривает пищевые продукты, особенно такие молочные продукты, как йогурт и другие ферментированные продукты, содержащие микроорганизмы, продуцирующие большие количества биологически доступного фолата.
Осуществление изобретение
Настоящее изобретение касается повышения продукции фолата, и особенно, биологически доступного фолата, т.е. такого фолата, который может легко поглощаться в желудочно-кишечном тракте млекопитающих. Изобретение относится к повышению продукции различных производных фолата и превращению различных производных полиглутамилфолата, образующихся в организме in vivo, в соответствующие производные моноглутамилфолата. Настоящее изобретение имеет три основных следствия:
- Во-первых, с помощью настоящего изобретения соотношение между производными поли- и моноглутамилфолата изменяется в пользу моноглутамилфолатных производных, в результате чего повышается общая биологическая доступность производных фолата, в частности производных моноглутамилфолата.
- Во-вторых, с помощью настоящего изобретения ограничивается удерживание производных фолата в клетках фолат-продуцирующего хозяина, что усиливает диффузию или транспорт фолата во внеклеточную среду. Вследствие этого повышается биодоступность фолата, поскольку внутриклеточный фолат недоступен для поглощения в желудочно-кишечном тракте млекопитающих.
- В третьих, настоящее изобретение обеспечивает клеткам возможность продуцирования больших количеств общего фолата.
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, способному продуцировать большие количества внутриклеточного фолата в результате сверхсинтеза гомологических или гетерологических ферментов, участвующих в биосинтезе моноглутамилфолата, или содержащих гетерологический глутамилгидролазный ген. Термин глутамилгидролазный ген подразумевает ген, в ходе экспрессии которого образуется фермент, способный деконьюгировать полиглутамилфолат с образованием моноглутамилфолата.
Фолатные биосинтетические гены, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут представлять собой один из следующих генов в кластере гена фолата, GTP циклогидролазу I (gch), дигидронеоптерин альдолазу (dhna), и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназу (hppk), или их комбинации, например такие как gch и hppk. Измененная ферментативная активность может быть следствием измененной экспрессии ферментов, кодируемых указанными выше генами, например, наличием множественных копий гомологических или гетерологических генов, и/или присутствием сильных промоторов таких генов. Измененная активность может представлять собой повышенную или пониженную активность, каждая из которых обеспечивает относительное увеличение продукции моноглутамилфолата.
Было обнаружено, что повышенная экспрессия дигидроптероатсинтазы (dps) или фолатсинтазы (folC) не приводит к увеличению продукции фолата и что повышенная экспрессия дигидрофолатредуктазы (dhfr) даже понижает продукцию фолата. В соответствие с настоящим изобретением, наиболее предпочтительным геном для увеличения продукции фолата является gch.
Глутамилгидролаза может представлять собой эндопептидазу, т.е. глутамилгидролазу, воздействующую на внутреннюю часть полиглутамильной цепи, что в результате приводит к удалению полиглутамильной цепи за одну стадию. Глутамилгидролаза также может представлять собой экзопептидазу, т.е. энзим, отщепляющий глутамильные остатки от окончания полиглутамильной цепи, в результате чего удаление моноглутамильных остатков происходит на повторяющихся стадиях. Эндо-глутамилгидролазные гены могут представлять собой, например, гены крыс, тогда как экзо-глутамилгидролазные гены имеют человеческое происхождение.
Глутамилгидролазный ген и фолатные биосинтетические гены, введенные в микроорганизмы, могут представлять собой оригинальные (немодифицированные) гены. Для этой цели также могут использоваться модифицированные гены, по меньшей мере, содержащие область, кодирующую каталитический домен глутамилгидролазы и фолатных биосинтетических энзимов. Глутамилгидролаза, закодированная гетерологическим геном, демонстрирует, по меньшей мере, 65% идентичность последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, 75% идентичность, согласно определению идентичности с использованием традиционного BLAST алгоритма, аминокислотным последовательностям крысиной или человеческой гамма-глутамилгидролазы, что описано Yao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93(19): 10134-8 и J. Biol. Chem. 1996 271(15): 8525-8, и/или ее коррелирующая последовательность способна к гибридизации в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, описанной Yao et al.
Термин «фолат» охватывает фолиевую кислоту и ее любую соль, сложный эфир и производное, включающее метилированные производные. Термин «полиглутамилфолат» относится к фолату, содержащему, по меньшей мере, два соседних глутамильных остатка в боковой цепи, тогда как термин «моноглутамилфолат» относится к такому фолату, значительная часть которого, например, по меньшей мере, 25% фолатных молекул, содержат только одну глутамильную группу.
Таким образом, настоящее изобретение относится к внутриклеточной экспрессии генов, кодирующих гамма-глутамилгидролазу или фолатные биосинтетические гены, происходящие из позвоночных растений, грибков или бактерий в пищевых микроорганизмах, приводящей к внутриклеточной гамма-глутамильной гидролитической активности. Особенно предпочтительными объектами являются гамма-глутамилгидролаза крыс (Yao с сотр. 1996а), человека (Yao et al 1996а, US 5801031), Arabidopsis thaliana (Huangpu et al. 1996), сои (Huangpu et al. 1996), и грамм-положительных бактерий Bacillus subtilis (Margot et al. 1999), Bacillus sphaericus (Hourdou et al, 1992) и Bacillus intermedius (Leshchinskaya et al, 1997), а также функционально эквивалентные гидролазы, имеющие, по меньшей мере, 65% идентичность последовательности, или даже, по меньшей мере, 75% идентичность последовательности последовательностям таких белков. Если говорить более конкретно, настоящее изобретение основано на такой интеграции гена, кодирующего указанные гамма-глутамилгидролазы в плазмиде или в хромосоме пищевых микроорганизмов, что эффективная экспрессия гена происходит конститутивно, или после индукции.
Настоящее изобретение также относится к экспрессии генов, кодирующих гамма-глутамилгидролазы, или генов, кодирующих фолатные биосинтетические гены, упомянутые выше, причем экспрессия происходит таким образом, что образуется полностью или частично активный фермент. Активность таких ферментов в результате приводит к деконьюгации полиглутамилфолатных производных. В такой реакции моно-и/или полиглутаматные остатки подвергаются ферментативному гидролизу, в результате которого полиглутамилфолатные производные превращаются в моноглутамилфолатные производные, или фолат синтезируется таким образом, что он содержит только один глутаматный остаток.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает увеличение продукции всех форм фолата и, особенно, моноглутамильных производных фолата, образующихся из производных полиглутамилфолата после экспрессии гена, кодирующего гамма-глутамил гидролазы, или прямым путем, без присоединения полиглутамильного фрагмента, в результате сверхэкспресии фолата биосинтетических генов, как описано ранее. Это ограничивает сохранение производных полиглутамилфолата в клетке, и предоставляет возможность активного или пассивного транспорта моноглутамилфолата через клеточную мембрану во внеклеточную среду. Вследствие этого, реализуется повышенная продукция и обеспечивается биодоступность фолатных производных в целом, и моноглутамилфолатных производных, в частности, в ферментированных пищевых продуктах.
Как показано ниже, в примере 1, внутриклеточная экспрессия и трансляция крысиной или человеческой гамма-глутамил гидролазы в молочнокислых бактериях приводит к деконьюгации полиглутамилфолата в моноглутамилфолат, снижает степень удерживания внутриклеточного фолата, повышает количество моноглутамил фолата и внеклеточного фолата. Таким образом, продукты и способ настоящего изобретения обеспечивают повышенную биологическую доступность фолата в ферментированных пищевых продуктах. Такое повышение биологической доступности является результатом двух явлений. Во-первых, повышение количества моноглутамилфолата ограничивает необходимость в активности природных кишечных гидролаз в процессе деконьюгации полиглутамилфолатов, что является преимуществом, которое связано с влиянием некоторых пищевых компонентов на активность кишечных гидролаз. Во-вторых, активность гамма-глутамилгидролаз, экспрессированных в микроорганизмах, ограничивает степень удерживания фолатов в клетке, обеспечивающую повышенную концентрацию внеклеточного фолата, что оказывается выгодным в условиях, когда молочнокислые бактерии остаются интактными при прохождении через GI тракт и не происходит выделения фолата. Кроме этого, повышенный экспорт (моно) глутамилфолата из клетки увеличивает общую скорость биосинтеза фолата, что связано со снижением регуляции с обратной связью.
Пример 2 иллюстрирует эффект сверхпродукции GTP-циклогидролазы (ЕС 3.5.4.16) и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназы (ЕС 2.7.6.3) в Lactococcus lactis. В L. lactis, ген gch кодирует бифункциональный белок двух ферментов. Эффект состоит не только в повышении общей продукции фолата в культурах, где используется рекомбинантный L. lactis, но и в специфическом повышении количества моноглутамилфолатов за счет полиглутамилфолатов. Наблюдаемый эффект может объясняться относительно низкой активностью энзима фолилполиглутаматсинтазы, кодируемой геном folC, которая недостаточно высока для аккомодации к высокой скорости биосинтеза фолата в ходе свехрпродукции GTP-циклогидролазы. Моноглутамилфолаты способны легче выделяться бактериями L. lactis с образованием ферментативного бульона, который содержит не только большие количества фолата, но и большее количество его биодоступных форм, которые выделяются в среду в виде моноглутамильной формы.
Хотя пример 1 относится к крысиной или человеческой гамма-глутамилгидролазе и штамму бактерий Lactococcus lactis NZ , в качестве бактерий, продуцирующих (поли/моно)-глутамилфолат, следует иметь в виду, что настоящее изобретение также охватывает другие гамма-глутамилгидролазы в целом, и гамма-глутамилгидролазы пищевого сорта, в частности. Примерами других гамма-глутамилгидролаз, которые могут экспрессироваться в молочнокислых бактериях, являются производные Arabidopsis, соевых бобов или Bacillus intermedius. Область настоящего изобретения также включает экспрессию упомянутых гамма-глутамилгидролаз в любом другом пищевом микроорганизме, отличном от штамма NZ 9000 L. Lactis, например, в других молочнокислых бактериях, дрожжах и грибках. В рассматриваемом примере, гены гамма-глутамилгидролазы зрелой крысы или человека клонировали ниже низин - индуцибельного промотора. Кроме этого изобретение охватывает экспрессию гамма-глутамилгидролаз под контролем других индуцибельных промоторов, например, промотора, присутствующего в лактозном опероне (Van Rooijen et al. 1990, 1992), или конститутивного промотора, например, pepN гена (Tan et al. 1992).
Хотя пример 2 относится к сверхэкспрессии GTP-циклогидролазы, кодируемой гомологичным геном gch в Lactococcus lactis, приводящей к повышенной продукции фолата и специфическому увеличению количества моноглутамилфолатов по сравнению с полиглутамилфолатами, настоящее изобретение также охватывает сверхэкспрессию других гомологических и гетерологических фолатных биосинтетических генов, например, dhna и/или hppk, но не folP (dps), folC или dhfr, в L.lactis. Кроме этого настоящее изобретение охватывает экспрессию таких фолатных биосинтетических генов в пищевых микроорганизмах, отличных от штамма NZ 9000 L.Lactis, например, таких, как другие молочнокислые бактерии, дрожжи и грибки. В примере 2 gch ген клонировали на участке ниже низин-индуцируемого промотора. В область настоящего изобретения также входит экспрессия GTP-циклогидролазы и, необязательно, других фолатных биосинтетических ферментов под контролем различных индуцируемых промоторов, например, промотора, присутствующего в лактозном опероне (Van Rooijen et al. 1990, 1992) или конститутивного промотора, обнаруженного напротив pepN гена (Tan et al. 1992).
Пример 1
Материалы и методы
Зрелую экзопептидазу человеческой γ-глутамилгидролазы получали из кДНК полной длины (Yao et al. 1996 a), клонированной в векторе pCR2 с использованием полимеразной цепной реакции. Вектор был предоставлен The laboratory of Molecular Diagnostics в Wadswoth Center, Albany, New York. Продукт PCR из 885 пар оснований, кодирующий зрелую человеческую γ-глутамилгидролазу, получали с использованием следующих праймеров:
HGH-f (CATGCCATGGGACCCCACGGCGACACCGCCAAG) и
HGH-r (GCTCTAGATCAATCAAATATGTAACATTGCTG).
Прямой праймер был удлинен по 5' - концу с образованием сайта рестрикции Ncol, обеспечивающего транскрипционное слияние с индуцируемым низиновым промотором в векторе pNZ 8048 (Kuipers et al.). Использование указанного выше прямого праймера приводило к некоторой модификации зрелого гена (нуклеотиды указаны курсивом). Обратный праймер был подвергнут инсерции по 3' - концу с получением сайта рестрикции XbaI, обеспечивающего лигирование с липкими концами в вектор pNZ 8048. Вновь синтезированный вектор, несущий зрелый человеческий γ-глутамилгидролазный ген был обозначен, как pNZ 7001.
Зрелая, эндопептидазная, крысиная γ-глутамилгидролаза была получена из кДНК полной длины (Yao et al. 1996b), клонированной в вектор pCR 3 с использованием цепной полимеразной реакции. Вектор был предоставлен The laboratory of Molecular Diagnostics в Wadswoth Center, Albany, New York. Продукт PCR из 884 пар оснований, кодирующий зрелую человеческую γ-глутамилгидролазу, получали с использованием следующих праймеров:
HGH-f (CATGCCATGGGATCCTATGAGCGCGCGGCTCCAAG) и
HGH-r (GCTCTAGATCAGTTAAACATATAAGCTTGCTG).
Прямой праймер был удлинен по 5' - концу, образуя сайт рестрикции Ncol, обеспечивающий транскрипционное слияние с индуцируемым NIS промотором в векторе pNZ 8048 (Kuipers et al.). Использование указанного выше прямого праймера приводило к некоторой модификации зрелого гена (нуклеотиды указаны курсивом). Продукт PCR с тупыми концами клонировали в дефосфолированный вектор PCR (Invirogen) и трансформировали в Eschericia coli. Частично переваренный NcoI-KpnI фрагмент выделяли и лигировали в pNZ 8048. Вновь синтезированный вектор, несущий зрелый человеческий γ-глутамилгидролазный ген был обозначен, как pNZ 7002.
Вектор, несущий зрелый крысиный или человеческий γ-глутамилгидролазный ген, трансформировали электропорацией в штамм NZ 9000 Lactococcus latis, несущий nisR и nisK гены хромосомы. Экспрессию зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного гена проводили по следующему протоколу NICE системы (низин индуцированная контролируемая экспрессия) (De Ruter et al. 1996). Для экспрессии и трансляции человеческого γ-глутамилгидролазного гена использовали концентрации низина в интервале 0,1-5 нг/мл. Вестерн-блоттинг человеческой γ-глутамилгидролазы проводили с использованием поликлонального антитела, предоставленного Laboratory of Molecular Diagnostics в Wadsworth, Albany, New-York, USA.
Активность зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного энзима определяли выращиванием L.lactis штамма NZ 9000, несущего pNZ 7001 или pNZ 7002 в 5 мл M17 (Terzaghi and Sandine, 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. Значение OD 600 для GM17 составило 0,5. При OD600=0,5 в систему добавляли низин (1 нг/мл) с целью индуцирования экспрессии зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного гена. Через два часа роста готовили 20-кратно концентрированный клеточный экстракт (1 мл 0,1 М меркаптоэтанола, 0,1 М Na-PO4 буфер рН 7,0) с использованием гранулированного оксида кремния и клеточного дезинтегратора FP120 fastprep™ (Savant Instruments Inc, Holbrook, NY, USA). 500 мкл концентрированного клеточного экстракта добавляли в раствор дрожжевого экстракта (0,5 г/л дрожжевого экстракта, Difco Laboratories, Detroit, USA), в 20 мл 0,1 М Na-PO4 буфера, рН 7,0, 1% аскорбиновая кислота) в качестве источника полиглутамилфолатных производных. Инкубацию полученной системы при 37°С продолжали в течение четырех часов с периодическим отбором образцов. Реакцию останавливали путем нагревания образцов в течение 10 минут при 100°С. Концентрацию фолата определяли с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, по методике, описанной Horne и Patterson (1988). Отрицательные контрольные эксперименты проводили с использованием штамма NZ 9000, трансформированного pNZ 8048 (лишенная низина экспрессионная кассета).
Активность зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного энзима в отношении роста молочнокислых бактерий, определяли по росту L.lactis штамма NZ 900, несущего pNZ 7001 или pNZ 7002 в M 17 (Terzaghi and Sandine, 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM 17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. При значении OD 600=0,5 добавляли низин (1,0 нг/мл) и из растущей культуры периодически отбирали образцы. Образцы центрифугировали до отделения клеток от супернатанта. Супернатант разбавляли в соотношении 1:1 0,1 М NaAc буфером с рН 4,8 в присутствии 1% аскорбиновой кислоты. Полученные гели промывали 0,1 М NaAc с рН 4,8, 1% аскорбиновая кислота, и повторно суспендировали в исходном объеме 0,1 М NaAc буфера с рН 4,8, содержащего 1% аскорбиновой кислоты. Все образцы в течение десяти минут нагревали при 100°С, после чего проводили определение концентрации фолата с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, описанного Home and Patterson (1988). Наличие полиглугамилфолата определяли путем инкубации образцов в течение четырех часов при 37°С в присутствии человеческой плазмы (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, NL) в качестве источника γ-глутамилгидролазы, после чего определяли концентрацию фолата.
Результаты
Добавление 1,0 нг/мл низина приводило к экспрессии экспрессирующего гена человеческой γ-глутамилгидролазы, что может быть визуализировано вестерн-блоттингом с использованием поликлонального антитела. Крысиная γ-глутамилгидролаза не может быть визуализирована вестер-блоттингом в связи с недоступностью специального антитела.
Функциональная экспрессия человеческой гамма-глутамилгидролазы, контролируемая in vitro
Проведение микробиологического анализа на содержание фолата позволило, главным образом, детектировать фолатные производные с тремя или менее глутаматными остатками. Реакция роста при детекции микроорганизма на более длинные фолатные цепи (n>3) резко понижается пропорционально длине цепи (Tamura et al. 1972). Следовательно, в источнике, который включает полиглутамилфолаты, содержащие более трех глутамильных остатков, как это имеет место, например, в случае дрожжевого экстракта, который преимущественно содержит гептаглутамилфолаты (Bassett et al. 1976), фолаты могут детектироваться с помощью микробиологического анализа при удалении полиглутамильных хвостов. В связи с этим, дрожжевой экстракт используется для тестирования функциональной экспрессии человеческой γ-глутамилгидролазы в Lactococcus lactis. Добавление клеточного экстракта L.lactis NZ 9000, несущего pNZ 7001 или pNZ 7002, индуцированных низином, приводит к деконьюгации полиглутамилфолата, как это видно из данных микробиологического анализа. При добавлении клеточного экстракта L.lactis NZ 9000, несущего pNZ 8048 (лишенная низина экспрессирующая кассета), не детектируется какой-либо деконьюгирующей активности (Фигура 2).
Внутриклеточная экспрессия гамма-глутамилгидролазы, контролируемая in vivo
Штамм NZ 9000, несущий pNZ 7001 или pNZ 7002 или pNZ 8048 (лишенная низина экспрессирующая кассета), демонстрирует идентичные ростовые характеристики. Индукция низином при OD 600, равном 0,5, не влияет на скорость роста. После индукции низином измеряли концентрацию фолата в супернатанте и в клеточных экстрактах штаммов. L. lactis штаммы NZ 9000, несущие pNZ 7001 или pNZ 7002, характеризуются увеличением концентрации внеклеточного фолата в ходе роста. Концентрация внеклеточного фолата в штамме L.lactis NZ 9000, несущем pNZ 8048, остается постоянной в ходе роста. Концентрация внутриклеточного фолата в штаммах, экспрессирующих γ-глутамилгидролазы, не увеличивается в ходе роста, в отличие от концентрации внутриклеточного фолата в контрольном штамме. Фигура 3 иллюстрирует распределение внутри- и внеклеточного фолата через два часа после индукции низином. Штамм NZ 9000-pNZ 7002 характеризуется наивысшей концентрацией внеклеточного фолата, что, возможно, связано с эндопептидазной активностью крысиной γ-глутамилгидролазы, приводящей к немедленному восстановлению полиглутамилфолатов в моноглутамилфолаты. Экзопептидазная активность человеческой γ-глутамилгидролазы снижает концентрацию полиглутамилфолата за счет образования моноглутамилфолатов с промежуточным образованием более коротких полиглутамилфолатов. Клеточные экстра полиглутамилфолата, запасенного внутри клеток. Содержание фолата определяли с использованием микробиологического анализа после инкубации в присутствии человеческой плазмы в качестве источника γ-глутамилгидролазы. Штаммы NZ 9000-pNZ 7001 и pNZ 7002 не содержат полиглутамилфолат и концентрация фолата не меняется в ходе роста. Как видно из Фигуры 3, внутриклеточный фолат в штамме NZ 9000-pNZ 8048 частично состоит из полиглутамилфолатов. Повышение концентрации внеклеточного фолата в ферментационном бульоне штаммов после деконьюгации, как правило, вызвано присутствием полиглутамилфолата из дрожжевого экстракта, который присутствует в бактериальной растительной среде GM 17. Из полученных результатов можно сделать вывод, что ферментативная активность экспрессированных γ-глутамилгидролаз, способствует деконьюгации внутриклеточного полиглутамилфолата, что уменьшает время пребывания производных фолата в клетке и способствует увеличению концентрации внеклеточного фолата.
Информация о ДНК генов, кодирующих человеческую и крысиную γ-глутамилгидролазу, содержится в работе Yao et al. 1996 а и b.
ПРИМЕР 2
Материалы и методы
Ген gch, кодирующий GTP цклогидролазу, идентифицировали анализом последовательности и сравнительным анализом гомологии части генома L.Lactis штамма MG 1363, фланкированной геном dhfr, кодирующим дигидрофолат редуктазу и dhom, кодирующим гомосериндегидрогеназу, с использованием основной геномной базы данных. Последовательность получали амплификацией геномной области с использованием праймера dhfrF (CGAAT TCCAT GGTTA TTGGA ATATG GGCAG AAG) и dhomR (CGATC CCGGG AAGCC CTGTG CCACT GTCC А). Праймеры получали из информации о последовательности, содержащейся в банке генов под № Х 60681 и Х 96988, соответственно. Исследование гомологии позволило предположить, что часть амплифицированного фрагмента (общей длиной, примерно, в Т.n.о.) содержит информацию о последовательности для GTP циклогидролазы и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдегидроптеридин пирофосфокиназы. PCR продукт, полученный с использованием праймера hppk-2 (CATGC CATGG GGCAA АСААС ТТАТТ TAAGC ATGGG) и гена gch-r3 (GGGGT ACCGA TTCTT GATTA AGTTC TAAG), содержащий потенциальный стартовый кодон 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметил- дегидроптеридин пирофосфокиназы и потенциальный стоп-кодон GTP циклогидролазы, клонировали в Ncol и Kpnl сайт pNZ 8048 (Kuipers et al.) с получением плазмиды pN 7003. Прямой праймер был удлинен по 5'-концу с образованием Ncol рестрикционного сайта, обеспечивающего трансляционное слияние с индуцируемым низиновым промотором в векторе pNZ 8048. Использование упомянутого прямого праймера приводило к некоторой модификации исходного gch гена; экстра глицин вводился после Мет-1, не затрагивая следующую аминокислоту. Обратный праймер подвергали удлинению по 3'-концу с образованием Kpnl рестрикционного сайта, способствующего лигированию с липкими концами в векторе pNZ 8048. Такой вектор вводили в штамм L. lactis NZ 9000 (De Ruyter et al. 1996) путем электропорации с образованием L.lactis штамма NZ9000-pNZ7003. Штамм NZ 9000 экспрессирует nisRK регуляторные гены, стабильно интегрированные в pepN локусе. Экспрессия gch регулируется низиновым промотором в результате добавления низина в ферментационный бульон (De Ruyter et al. 1996). Рестрикцию, лигирование и трансформацию проводили с использованием следующих стандартных протоколов, описанных в книге Sambrook et al.
Определение ферментирующей активности GTP циклогидролазы
Проводили ферментативный анализ с целью определения активной экспрессии GTP циклогидролазы в L.Lactis. Безклеточный экстракт NZ9000-pNZ7003 использовали в качестве источника фермента, а коммерчески доступный GTP использовали в качестве субстрата. Для анализа активности GTP циклогидролазы использовали модифицированный протокол, описанный Saizeieu с сотр. (1995). Штамм L.lactis NZ9000, несущий pNZ 7003, выращивали в среде M 17 (Terzaghi and Sandine 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM 17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. При OD 600, равном 0,5, добавляли низин (2 нг/мл). При значении OD 600 порядка 2,5, собирали клетки из 25 мл культурной среды и их растворяли в 1 мл 0,1 М натрий-фосфатном буфере при рН 6,5. Внутриклеточный материал выделяли с использованием гранулированного оксида кремния и дезинтегратора клеток FP 120 fastprep™ (Savant Instruments Inc., Holbrook, NY, USA). Активность GTP циклогидролазы определяли при 30°С в среде, содержащей 100 мМ Tris/HCI рН 8, 100 мМ KCI, 1 мМ ЭДТА с рН 8, 50 мМ GTP и 2% безклеточного экстракта. Образцы, отобранные через определенные промежутки времени, нагревали в течение 10 минут при 100°С с целью дезактивации фермента. За ходом потребления GTP и образования продукта следили методом ЖХВР. Образцы (25 мкл) пропускали через 8μ 1000А PL-SAX колонку (Polymer Laboratories) с объемной скоростью 1,2 мл/мин, используя проточный буфер, содержащий 50 мМ фосфата, 100 мМ NaCI, pH 6,5. За потреблением GTP следили методом ИК-спектроскопии при длине волны 254 нм, а продукт реакции детектировали флуорометрически; возбуждение при 365 нм, эмиссия при 446 нм (Фигура 4).
Сверхпродукция gch
Влияние на продукцию фолата сверхпродукции gch, кодирующего GTP циклогидролазу и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназу в растущих молочнокислых бактериях, определяли путем выращивания Lactococcus lactis штамма NZ 9000, несущего pHZ 7003, в среде M 17 (Terzaghi and Sandine, 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM 17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. При OD 600, равном 0,5, добавляли низин (2 нг/мл). При OD 600 порядка 2,5, клеточную культуру центрифугировали до отделения клеток от супернатанта. Супернатант разбавляли в соотношении 1:1 0,1 М NaAc буфером при pH 4,8 в присутствии 1% аскорбиновой кислоты. Клетки промывали 0,1 М NaAc pH 4,8, 1% аскорбиновой кислоты и ресуспендировали в исходном объеме 0,1 М NaAc буфера при pH 4,8 в присутствии 1% аскорбиновой кислоты. Образцы нагревали в течение 10 минут при 100°С, после чего проводили определение концентрации фолата с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, описанного Horne и Paterson (1988). Наличие полиглутамилфолата определяли в результате инкубации образцов в течение четырех часов при 37°С в присутствии человеческой плазмы (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, NL) в качестве источника γ-глутамилгидролазы, после чего с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, определяли концентрацию фолата.
Результаты
Анализ на ферментативную активность GTP-циклогидролазы позволил установить увеличение количества продукта реакции во времени при добавлении GTP (Фигура 4). Рассматриваемый продукт реакции имел хроматографические характеристики, аналогичные описанным ранее (время удерживания 9,52 мин) [Saizieu et al. (1995)] и, как было установлено, представлял собой трифосфат дигидронеоптерина, основного продукта реакции GTP циклогидролазы. Реакционная смесь содержала избыток GTP. Уменьшение концентрации GTP и увеличение концентрации трифосфата дигидронеоптерина наблюдалось только в безклеточном экстракте NZ 9000-pNZ 7003. В контрольных реакциях, где использовали безклеточные экстракты штамма NZ 9000-pNZ8048, не наблюдалось значительного уменьшения концентрации GTP и образования продуктов превращения GTP.
Количественный белковый анализ клеточного экстракта NZ 9000-pNZ 7003, индуцированного низином, с использованием метода SDS-PAGE, позволил установить сверхпродукцию протеина размером около 40 kD по сравнению с контрольным штаммом NZ 9000-pNZ 8048.
Индукция низином растущих клеток штамма NZ 9000-pNZ 7003 приводит к увеличению концентрации внутри- и внеклеточного фолата по сравнению с контрольным штаммом NZ 9000-pNZ 8048 (Фигура 5). В результате общая продукция фолата увеличивается вдвое. Большая часть сверпродуцированного фолата находится в растительной среде; концентрация внеклеточного фолата увеличивается примерно в 20 раз по сравнению с контрольным штаммом. Увеличение концентрации внутриклеточного фолата не играет существенной роли. Деконьюгация группы внутриклеточных фолатов показывает, что лишь в контрольном штамме внутриклеточный фолат частично присутствует в виде полиглутамилфолата. Сверхпродуцирующий GTP-циклогидролазу штамм не продуцирует фолат в виде полиглутамилфолата внутри или вне клеток.
Описание чертежей
Фигура 1. Путь биосинтеза фолата. В скобках указаны предполагаемые промежуточные вещества. Трифосфатные остатки обозначены, как (Р)3. Представленные на фигуре данные адаптированы к данным Lacks et al./ 1995.
Фигура 2. Кинетика изменения концентрации фолиевой кислоты в дрожжевом экстракте при оптимальном значении рН согласно данным микробиологического анализа после деконьюгации клеточным экстрактом L.lactis NZ 9000, индуцированным низином и несущим pNZ 7001, кодирующую крысиную гамма-глутамилгидролазу, или pNZ 7002, кодирующую человеческую гамма-глутамил гидролазу, или pNZ 8048 (пустая экспрессионная кассета) в качестве отрицательного контроля.
Фигура 3. Распределение внутри- и внеклеточного фолата через два часа после индукции низином экспоненциального роста клеток. Показано распределение фолата до и после энизиматической деконьюгации в присутствии человеческой плазмы, и дифференциация производных фолата по количеству коротких и более длинных остатков глутаминовой кислоты (N>3). PNZ 8048, RgH и Hgh напоминают L.lactis штамм NZ 9000 с плазмидой pNZ 8048 (пустая экспрессионная кассета), pNZ 7001 (nisA промотор и ген зрелой крысиной гамма-глутамилгидролазы) и pNZ 7002 (nisA промотор и ген зрелой человеческой гамма-глутамилгидролазы), соответственно. Концентрацию фолата измеряли с помощью микробиологического анализа.
Фигура 4. Сверхэкспрессия GTP-циклогидролазы, определенная по концентрации трифосфата дигидронеоптерина, согласно данным ЖХВР и флуоресценции (возбуждение при 365 нм, эмиссия при 446 нм). Легенда: Безклеточный экстракт штамма NZ 9000-pNZ 7003, содержащий gch (←) и контрольный штамм, содержащий NZ 9000-pNZ 8048 (I).
Фигура 5. Внутри- (се) и внеклеточная (sup) концентрация фолата в gch сверхпродуцирующем штамме NZ 9000-pNZ 7003 и контрольном штамме NZ 9000-pNZ 8048 (содержащем пустую плазмиду pNZ 8048). Концентрацию фолата измеряли с помощью микробиологического анализа до и после деконьюгирования в присутствии человеческой плазмы в качестве внешнего источника гамма-глутамилгидролазы.
Литература
De Saizieu A., Vankan P. and Van Loon, A.P. G.M. (1995) Enzymic Characterization of Bacillus subtilis GTP Cyclohydrolase I.Journal of Biochemistry 306: 371-377;
Gregory J.F. Chemical and nutritional aspects of folate research: analytical procedures, methods of folate synthesis, stability, and bioavailability of dietary folates. Adv. Food Nutr. Res. 1989; 33: 1-101;
Home D.W., Patterson D. Lactobacillus casei microbiological assay of folic acid derivatives in 96 well microtiter plates. Clin. Chem 34, 2357-2359 (1988);
Huangpu J., Pak J.H., Graham M.C., Rickle S.A., Graham J.S. Purification and molecular analysis of an extracellular gamma-glutamyi hydrolase present in young tissues of the soybean plant. Biochem. Biophys. Res. Commun. 226, 1-6 (1996);
Kuipers O.P., de Ruyter P., Kleerebezem M., and de Vos W. Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. 1998; 64:15-21;
Lacks S. A., Greenberg B. and Lopez P. (1995) A Cluster of Four Genes Encoding Enzymes for Five Steps in the Folate Biosynthetic Pathway of Streptococcuus pneumoniae. Journal of Bacteriology, 66-74;
Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardano A.M., Sharipova M.R., Blagova E.V., Levdikov V.M., Kuranova I.P., Rudenskaya G.N. and Stepanov V.M. (1997). Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius strain 3-19. Purification, properties, and crystallization. Biochemistry (Mosc) 62: 903-908;
Rooijen R.J. van, Gasson M.J., de Vos W.M. Characterization of the Lactococcus lactis lactose operon promoter: contribution of flanking sequences and LacR represser to promoter activity. J. Bacteriol, 174(7), 2273-80 (1992).
Rooijen R.J. van, de Vos W.M. Molecular cloning, transcriptional analysis, and nucleotide sequence of lacR, a gene encoding the repressor of the lactose phosphotransferase system of Lactococcus lactis. J Biol Chem. 265(30), 18499-503 (1990);
Rosenberg I.H., Godwin H.A. Inhibition of intestinal gamma-glutamyl carboxypeptidase by yeast nucleic acid: an explanation of variability in utilization of dietary polyglutamye folate. J. Clin. Investig. 1971;
Ruyter P.G. de, Kuipers O.P., de Vos W.M. Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol. 1996 Oct.; 62(10): 3662-7;
Seyoum E, Selhub J Properties of food folates determined by stability and susceptibility to intestinal pteroylpolyglutamate hydrolase action. J.Nutr. 1998 Nov.; 128(11): 1956-60;
Shane B. Folylpolyglutamate synthesis and role in the regulation of one-carbon metabolism. Vitam Horm. 1989; 45:263-335;
Tan P.S., van Alen-Boerrigter I.J., Poolman В., Siezen R.J., de Vos W.M., Konings W.N. Characterization of the Lactococcus lactis pepN gene encoding an aminopeptidase homologous to mammalian aminopeptidase N. FEBS Lett. 1992 Jul. 13; 306(1): 9-16;
Terzaghi B.E. and Sandine W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1975; 38: 17-22;
Yao R., Schneider E., Ryan T.J., Galivan J. Human gamma-glutamyl hydrolase: cloning and characterization of the enzyme expressed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996a Sep. 17; 93(19): 10134-8;
Yao R., Nimec Z., Ryan T.J., Galivan J. Identification, cloning, and sequencing of a cDNA coding for rat gamma-glutamyl hydrolase. J. Biol. Chem. 1996b Apr. 12; 271(15): 8525-8.
Claims (9)
1. Генетически измененная пищевая молочнокислая бактерия, способная продуцировать увеличенное количество моноглутамилфолата по сравнению с количеством, продуцируемым немодифицированной молочнокислой бактерией, в результате сверхэкспрессии в указанной генетически модифицированной пищевой молочнокислой бактерии гена, кодирующего фермент гамма-глутамилгидролазу, или гена, выбранного из группы, состоящей из гена, кодирующего фермент GTP циклогидролазу (gch), гена, кодирующего фермент дигидронеоптеринальдолазу (dhna), и гена, кодирующего фермент 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридинпирофосфокиназу (hppk).
2. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанная сверхэкспрессия является следствием наличия множества копий соответствующего гена.
3. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанная сверхэкспрессия является следствием присутствия промотора, усиливающего экспрессию соответствующего гена.
4. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанные гены имеют животное происхождение, предпочтительно происходят из млекопитающих.
5. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанные гены имеют растительное происхождение.
6. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанные гены происходят из пищевых микроорганизмов, предпочтительно молочнокислых бактерий или дрожжей.
7. Способ получения моноглутамилфолата, включающий культивирование молочнокислой бактерии, способной продуцировать увеличенное количество моноглутамилфолата, по любому из пп.1-6 в подходящей культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии указанных генов, и извлечение продуцированных фолатов.
8. Пищевой продукт, содержащий молочнокислую бактерию по любому из пп.1-6.
9. Пищевой продукт по п.8, представляющий собой молочный продукт.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01202013A EP1262541A1 (en) | 2001-05-28 | 2001-05-28 | Production of bioavailable folic acid |
| EP01202013.7 | 2001-05-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003137558A RU2003137558A (ru) | 2005-05-20 |
| RU2342426C2 true RU2342426C2 (ru) | 2008-12-27 |
Family
ID=8180380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003137558/13A RU2342426C2 (ru) | 2001-05-28 | 2002-05-28 | Получение биологически доступной фолиевой кислоты |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040214261A1 (ru) |
| EP (2) | EP1262541A1 (ru) |
| JP (1) | JP2004527262A (ru) |
| CN (1) | CN1513056A (ru) |
| BR (1) | BR0209727A (ru) |
| CZ (1) | CZ20033565A3 (ru) |
| HU (1) | HUP0400435A3 (ru) |
| PL (1) | PL368444A1 (ru) |
| RU (1) | RU2342426C2 (ru) |
| SK (1) | SK16332003A3 (ru) |
| WO (1) | WO2002097063A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200309155B (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT2227552E (pt) | 2007-12-06 | 2012-02-08 | Purac Biochem Bv | Níveis de produção de folato aumentado por fermentação de sumo de melão com lactobacillus |
| CN101776665B (zh) * | 2009-01-13 | 2013-09-11 | 上海医药工业研究院 | 一种乳酸链球菌素的hplc检测方法 |
| CN105624182A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-06-01 | 重庆大学 | 生产四氢叶酸的重组质粒、基因工程菌株构建及应用 |
| US20190365147A1 (en) * | 2017-02-17 | 2019-12-05 | Koninklijke Philips N.V. | Temperature control device, food cooking device and method for controlling heating unit for cooking food |
| WO2021035421A1 (en) * | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Chifeng Pharmaceutical Co., Ltd. | Folate producing strain and the preparation and application thereof |
| WO2023180103A1 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-28 | Immundiagnostik Ag | Kit of parts and microbiological method for assessment of the folate status in serum and red blood cells |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2135423T3 (es) * | 1992-03-03 | 1999-11-01 | Meiji Seika Kaisha | Gamma-poliglutamato-hidrolasa y procedimiento de produccion de esta. |
| DE19929363A1 (de) * | 1999-06-25 | 2000-12-28 | Basf Lynx Bioscience Ag | Gene aus Corynebacterium glutamicum für die Folsäurebiosynthese und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure |
-
2001
- 2001-05-28 EP EP01202013A patent/EP1262541A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-05-28 CN CNA028109740A patent/CN1513056A/zh active Pending
- 2002-05-28 BR BR0209727-3A patent/BR0209727A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-28 RU RU2003137558/13A patent/RU2342426C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-05-28 EP EP02733616A patent/EP1392816A1/en not_active Withdrawn
- 2002-05-28 PL PL02368444A patent/PL368444A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-05-28 JP JP2003500232A patent/JP2004527262A/ja active Pending
- 2002-05-28 CZ CZ20033565A patent/CZ20033565A3/cs unknown
- 2002-05-28 WO PCT/NL2002/000340 patent/WO2002097063A1/en active Application Filing
- 2002-05-28 HU HU0400435A patent/HUP0400435A3/hu unknown
- 2002-05-28 US US10/478,994 patent/US20040214261A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-28 SK SK1633-2003A patent/SK16332003A3/sk unknown
-
2003
- 2003-11-25 ZA ZA200309155A patent/ZA200309155B/en unknown
-
2008
- 2008-02-19 US US12/033,655 patent/US20080248553A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Am J Physiol Cell Physiol. 2000 Dec; 279(6): C1889-95. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040214261A1 (en) | 2004-10-28 |
| US20080248553A1 (en) | 2008-10-09 |
| SK16332003A3 (sk) | 2004-07-07 |
| HUP0400435A2 (hu) | 2004-11-29 |
| CN1513056A (zh) | 2004-07-14 |
| HUP0400435A3 (en) | 2005-02-28 |
| EP1262541A1 (en) | 2002-12-04 |
| RU2003137558A (ru) | 2005-05-20 |
| JP2004527262A (ja) | 2004-09-09 |
| WO2002097063A1 (en) | 2002-12-05 |
| CZ20033565A3 (cs) | 2004-04-14 |
| ZA200309155B (en) | 2004-11-25 |
| EP1392816A1 (en) | 2004-03-03 |
| BR0209727A (pt) | 2004-09-14 |
| PL368444A1 (en) | 2005-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Komatsuzaki et al. | Characterization of glutamate decarboxylase from a high γ-aminobutyric acid (GABA)-producer, Lactobacillus paracasei | |
| US10913965B2 (en) | Microbial production of nicotamide riboside | |
| Swindell et al. | Genetic manipulation of the pathway for diacetyl metabolism in Lactococcus lactis | |
| JP3656277B2 (ja) | 組換えｄｎａ法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法 | |
| Goupil et al. | Imbalance of leucine flux in Lactococcus lactis and its use for the isolation of diacetyl-overproducing strains | |
| JP5021720B2 (ja) | 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法 | |
| US20080248553A1 (en) | Production of Bioavailable Folic Acid | |
| US20200255877A1 (en) | Microbial production of nicotinamide riboside | |
| JP2003504048A (ja) | 低温活性ベータ・ガラクトシダーゼ、その製法、及びその使用 | |
| WO2018211051A1 (en) | Microbial production of nicotinamide riboside | |
| JP4525754B2 (ja) | 代謝能力が低減した微生物を用いた生物活性食品成分の保護 | |
| Özçelik et al. | Extracellular production of the recombinant bacterial transglutaminase in Pichia pastoris | |
| KR20080108247A (ko) | 락토스를 발효시키지 않는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 | |
| Arioli et al. | The relevance of carbon dioxide metabolism in Streptococcus thermophilus | |
| Soković-Bajić et al. | Characterization of pH resistance and the proteolytic activity of GABA producing Lactobacillus brevis BGZLS10-17 in preparation of fermented milk beverage and the effects on the symptoms of the experimental autoimmune encephalomyelitis | |
| US20120276245A1 (en) | Method for improved fermentation | |
| EP1466529A1 (en) | Composition with heart rate reducing properties | |
| US20220304323A1 (en) | Production of lactase enzymes using altered regulation strains | |
| EP4162946A1 (en) | Kynurenine aminotransferase and products thereof for the treatment of inflammatory bowel diseases | |
| WO2021177392A1 (ja) | 変異型トランスグルタミナーゼ | |
| US7811784B2 (en) | Transgenic organisms with lower growth temperature | |
| Yu et al. | Isolation and characterization of an L-amino acid oxidase-producing marine bacterium | |
| Sybesma et al. | Control of folate production in lactic acid bacteria by using metabolic engineering | |
| JP2009153412A (ja) | 菌体内のピリドキサールリン酸量を増加させた微生物およびその培養方法 | |
| Olafsson | The effects of ms (2) io (6) A37 tRNA modification on metabolism and cell growth of Salmonella typhimurium. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110529 |