PT2227552E - Níveis de produção de folato aumentado por fermentação de sumo de melão com lactobacillus - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
NÍVEIS DE PRODUÇÃO DE FOLATO AUMENTADO POR FERMENTAÇÃO DE SUMO
DE MELÃO COM LACTOBACILLUS
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da microbiologia e da produção de um alimento, suplemento para alimentos ou comida para animais usando a fermentação microbiana do sumo de melão. São providos métodos de produção de níveis altos de folato por fermentação do sumo de melão, assim como alimentos, suplementos para alimentos e comidas que compreendem ou que consistem em sumo de melão fermentado e/ou folato (vitamina B9/B11) obtidos a partir destes métodos de fermentação. Também, na presente invenção é descrito o uso do sumo de melão (ou partes dele e/ou diluições e/ou concentrações dele) como um meio de fermentação ou suplemento de fermentação das bactérias produtoras de folato. Outra forma de realização é o uso do ácido p-aminobenzóico ou paminobenzoato (p-ABA) (em combinação com sumo de melão) para aumentar a produção de folato durante a fermentação microbiana.
DEFINIÇÕES GERAIS "Bactérias do ácido láctico" (LAB) refere-se às bactérias, que produzem ácido láctico ou outro ácido orgânico (tal como ácido propiónico) como um produto final de fermentação, tal como, mas não limitado a, bactérias do género Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Oenococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Carnobacterium, Propionibacterium, Enterococcus e Bifidobacterium. "Qualidade alimentar" são componentes que podem ser ingeridos de forma segura (por exemplo oralmente) por seres humanos ou animais. 1/38 "Probióticos" ou "estirpes (s) probiótica(s)" refere-se às estirpes de bactérias, que têm um efeito benéfico no hospedeiro quando é ingerido por um sujeito e que são geralmente consideradas como seguras (GRAS) para os seres humanos. "Qualidade alimentar" refere-se aos produtos que são considerados como seguros para o consumo humano e/ou animal, por exemplo pelas autoridades reguladoras pertinentes tais como a Agência norte-americana para os alimentos e medicamentos (US Food and Drug Administration - FDA). "Bactérias do ácido láctico probióticas" são, portanto, aquelas estirpes de LAB que também têm propriedades probióticas, isto é que são estirpes probióticas. "Estirpes bacterianas não modificadas geneticamente" refere-se a estirpes que não foram modificadas geneticamente pela intervenção humana, isto é que não compreendem sequências de ácidos nucleicos homólogas ou heterólogas introduzidas nas células ou genoma. Por exemplo, que não foram introduzidos genes quiméricos (compreendendo sequências de ácidos nucleicos funcionalmente ligados, tais como um promotor, sequência codificante e terminador) ou vectores nas bactérias. "Estirpes bacterianas modificadas geneticamente" ou "estirpes recombinantes" são neste documento estirpes que foram modificadas geneticamente por intervenção humana, por exemplo por introdução de genes homólogos ou heterólogos no genoma, tal como um gene quimérico. "Estirpes bacterianas não mutantes" refere-se neste documento a estirpes de tipo selvagem, isto é estirpes que não foram tratadas pelos seres humanos com agentes mutagénicos. Estirpes do "tipo selvagem" são estirpes que estão na natureza, ou originalmente foram isoladas da natureza e que são geneticamente essencialmente as mesmas que a estirpe selvagem. 2/38 "Extracto de melão" refere-se neste documento ao extracto da fruta de melão de plantas da espécie Cucumis melo, por exemplo (C. melo var. reticulans, melão de Galia), melão Musk,
Cantalupo, melão de Hami, , melao Honeydew (Cucumis melo var. inodorus), melão Pele de Sapo, e melão doce, Cucumis melo subesp. agrestis; Cucumis melo subesp. melo .; Cucumis melo var. cantalupensis; Cucumis melo var. conomon, e outros. "Sumo de melão" refere-se à fase não sólida (fase liquida) obtida depois da liquidificação do extracto de melão. "Folato" e "ácido fólico" [ácido N-N-[4-{[2-amino-l,4-dihidro-4-οχο-6-pteridinil)metil]] Amino} benzoil] - L-glutámico] são usados neste documento de forma permutável para referir o ácido fólico e derivados do ácido fólico, que por exemplo diferem no estado de oxidação, substituições de mono-carbono ou número de resíduos de glutamato. Nomes alternativos são vitamina B9, vitamina B10, vitamina Bll, vitamina B9/B11 ou vitamina M. Exemplos de derivados são tetra-hidrofolato, 5-formil tetrahidrofolato, 5,10-metileno tetrahidrofolato, 10-formil tetrahidrofolato, 5-metil tetrahidrofolato, 5,10-metenil tetrahidrofolato, etc. Estão por exemplo abrangidos neste documento por poliglutamil folato e/ou produtos de hidrólise mais curta tais como di, tri- e/ou mono-glutamil-folato.
ou para-bloco de GTP, p-ABA "p-ABA" refere-se ao ácido para-aminobenzóico aminobenzoato ou ácido 4-aminobenzóico e é um construção de folato na via biossintética de folato. e glutamato formam os precursores de folato. "Fermentação" ou "cultura por fermentação" refere-se a culturas de crescimento usados para o crescimento de bactérias que convertem os hidratos de carbono em álcool e/ou ácidos, normalmente (mas não necessariamente) sob condições anaeróbicas. 3/38 "Meio de fermentação" refere-se ao meio de crescimento a ser usado para criar o cultivo de fermentação, enquanto que "caldo de fermentação" é geralmente usado para nos referirmos ao meio fermentado (isto é, durante e/ou depois da fermentação). No entanto, neste documento ambos os termos podem ser usados de forma permutável e o significado será claro no contexto. "Alimento" ou "produto alimentar" refere-se a produtos alimentares líquidos, semi-sólidos e/ou sólidos (composições nutricionais), adequados para o consumo humano e/ou animal. "Suplemento alimentar" refere-se a uma composição ingerida pelos seres humanos além da ingestão diária normal de alimentos. Geralmente, os suplementos alimentares estão na forma de comprimidos, pó, saquetas, pílulas, etc. "Ingrediente de produto alimentar" ou "ingrediente de suplemento alimentar" refere-se a um produto que é adequado para ser adicionado a um produto alimentar final, ou suplemento alimentar, ou durante o processo de produção de um produto alimentar, ou de um suplemento alimentar. 0 termo "que compreende" deve ser interpretado como que especifica a presença das partes, fases ou componentes estabelecidas, mas não exclui a presença de uma ou mais partes, fases ou componentes adicionais.
Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto requeira claramente que há um e somente um dos elementos. Assim, o artigo indefinido "um" ou "uma" significa "pelo menos um". "Fase de crescimento" refere-se às fases de crescimento comummente conhecidas de microrganismos, por exemplo nas culturas de fermentação por lotes, tais como a fase lag, fase de 4/38 crescimento exponencial e a fase estacionária posterior, seguida da fase de morte. "Percentagens (%) de identidade das sequências" refere-se às percentagens de nucleotideos ou aminoácidos idênticos entre duas sequências e podem ser determinadas usando por exemplo ferramentas de alinhamento local em pares tais como o programa "water" de EmbossWIN (versão 2.10.0) usando parâmetros por defeito, (penalização por abertura de espaço 10.0 e penalização por extensão de espaço 0.5, usando Blosum62 para proteínas e matrizes DNAFULL para ácidos nucleicos) ou "Bestfit" de GCG Wisconsin Package, comercializado por Accelrys Inc., 9685
Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, usando os parâmetros por defeito. Alternativamente, pode também ser usado a análise BLAST usando os ajustes por defeito, tais como BLAST de proteínas de NCIMB (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast. cgi), com uma penalização por criação de espaço de 11 e penalização por extensão de espaço de 1 .
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O folato é essencial para a dieta humana e animal e a sua deficiência pode resultar numa gama de doenças e distúrbios, tais como defeitos do tubo neural dos recém-nascidos. Muitas plantas, fungos e bactérias sintetizam o folato, incluindo as bactérias lácticas (LAB), pelo qual as concentrações de folato nos produtos lácteos fermentados são maiores do que as do produto lácteo não fermentado. A sequência de genoma anotada de
Lactococcus lactis subesp. lactis IL1403 mostra os genes do cluster biossintético do folato. Os genes de folato de outros clusters de genes foram também identificados, tais como os de
Lactococcus lactis MG1363, e foram usados para criar geneticamente bactérias com uma produção de folato aumentado, por exemplo através da sobre-expressão do gene folKE (Sybesma et al., 2003, Applied and Environm. Microb. Vol. 69(6), pp. 3069- 5/38 3076). A sobre-expressão controlada de folKE resultou num aumento de três vezes a produção de folato total e um aumento de 10 vezes a produção de folato extracelular.
Nem todas as LAB são capazes de produzir folato. Por exemplo, Sybesma et al. (2003, Applied and Environm. Microbiology Vol. 69(8) pp. 4542-4548) descobriu que enquanto as espécies de Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus e Leuconostoc foram capazes de produzir folato, muitas espécies de
Lactobacillus testadas não o foram, com a excepção de L. plantarum. Os níveis totais de folato (extracelular e intracelular) desconjugados variarão muito e os níveis máximos foram 291 μg/L para a estirpe de L. lactis ssp. lactis NZ9010 (crescimento aerobicamente no meio de cultura M17; a estirpe é defeituosa de lactato desidrogenase), enquanto que L. plantarum WCFS1 por exemplo só produziu 45 μg/L no meio MRS. Também variou a proporção excretada no meio.
Sybesma et al. (supra) também estudaram os efeitos das condições da cultura tais como pH, p-ABA e hemina na produção e distribuição de folato em dois LAB comummente usados, L. lactis MG 1363 e S. thermophilus NIZO estirpe B 119. Os meios de cultura incluíam meio M 17, meio definido quimicamente (CDM) e meio MRS. Na cultura continua um aumento no pH de 5.5 para 7.5 resultou numa produção de folato aumentado nestas duas estirpes por um factor 2-3, atingindo 534 μg/L para S. thermophilus crescido no meio M17 e 107 pg/L para L. lactis crescido em CDM. Para L. lactis, a adição de p-ABA em concentrações que variam de l-ΙΟΟμΜ também aumentou a produção de folato, enquanto que as quantidades de p-ABA acima de 100μΜ não tiveram nenhum efeito. De maneira interessante, a adição de substâncias inibidoras do crescimento também resultou num aumento de folato.
Como o anteriormente mencionado, as espécies de Lactobacillus não produzem nenhum nível ou produzem níveis muito baixos de 6/38 folato. As espécies de Lactobacillus são importantes na produção de produtos fermentados e o aumento da produção de folato por estas espécies seria altamente desejável. As espécies de Lactobacillus são por exemplo usadas industrialmente para a produção de iogurte, queijo, chucrute, picles, e outros alimentos fermentados, assim como comida para animais, tal como a silagem. Adicionalmente, o uso de meios de fermentação natural (qualidade alimentar), em vez dos sintéticos tem a vantagem de que os meios naturais podem ser usados como tais para a produção de alimentos, comida para animais ou suplementos alimentares, eliminando a necessidade de purificar o folato da cultura. Estes objectivos são satisfeitos com a presente invenção. 0 Pedido Internacional de Patente W002/097063 descreve a produção de ácido fólico biodisponível por microrganismos recombinantes (bactérias geneticamente modificadas). As bactérias recombinantes são postas a crescer em meios sintéticos. 0 Pedido Internacional de Patente W02006/013588 descreve estirpes de bifidobactérias probióticas que produzem ácido fólico e o seu uso. Estas podem ser usadas nas formulações juntamente com outros LAB probióticos. 0 Pedido Internacional de Patente W02006/093408 refere-se a bactérias mutantes que são resistentes ao metotrexato e produzem folato em excesso. As bactérias são identificadas com o uso de metotrexato como agente de selecção. Não há indicação de que os meios de fermentação naturais possam aumentar a produção de folato. 0 Pedido de Patente japonesa JP 1063352 descreve esmagar finamente as frutas e as verduras tais como melancias, hidrolizando e submetendo o produto à fermentação láctica. 7/38
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Métodos de produção de folato de acordo com a invenção A presente invenção provê métodos para níveis de folato aumentados produzidos por espécies de Lactobacillus produtoras de folato. Os inventores descobriram que os níveis de folato totais, e/ou o rácio folato:vitamina B12, produzidos durante a fermentação das espécies de Lactobacillus são significativamente aumentadas quando os extractos de melão e/ou sumo de melão ou partes dos mesmos são usados ou adicionados ao meio de fermentação. Adicionalmente, os alimentos tais como alimentos com fruta ou alimentos derivados da fruta são comummente conservados por fermentação, de modo que um método para a conservação alimentar (isto é, para reduzir a perecibilidade dos alimentos) é descrito neste documento, com o qual o produto resultante tem como benefício adicional um nível de folato aumentado e/ou um rácio aumentado entre o folato e a vitamina B12 .
Assim numa forma de realização de acordo com a invenção ela provê um método para a produção de folato e para níveis de folato totais aumentados produzidos por uma espécie de Lactobacillus produtora de folato que compreende as fases seguintes : (a) prover um extracto de uma fruta de melão de uma espécie de Cucumis melo; (b) usar todo ou parte do extracto de fruta de melão para preparar um meio de fermentação; (c) inocular o dito meio de fermentação com uma ou mais estirpes de Lactobacillus; (d) Deixar que se dê a fermentação; e opcionalmente 8/38 (e) usar todo ou parte do meio fermentado para a preparação de um alimento, comida para animais ou suplemento alimentar com niveis de folato altos e/ou com um rácio alto entre folato:vitamina B12.
Na fase (a) a fruta da espécie Cucumis melo pode ser usada para preparar um extracto. Numa forma preferida de realizar a invenção a fruta usada compreende ou consiste em melão de Galia. Um extracto é preparado a partir de parte ou toda de uma ou várias frutas. As misturas de fruta (ou partes de fruta) de distintas espécies, subespécies ou variedades de Cucumis melo podem ser usadas. Preferencialmente no entanto nenhuma outra fruta de espécies de fruta é usada para preparar o extracto e/ou o meio de fermentação. A fruta e/ou os pedaços de fruta usados podem ser de qualquer fase de amadurecimento/desenvolvimento, por exemplo de fruta madura ou de fases anteriores de amadurecimento/de desenvolvimento da fruta e/ou misturas destas. Opcionalmente as sementes da fruta podem ser retiradas da fruta de forma a que o extracto esteja sem sementes.
Preferencialmente o extracto é um extracto liquido, isto é o sumo de frutas. 0 sumo de frutas pode ser facilmente preparado por liquefacção dos tecidos de fruta usando métodos conhecidos, (espremer, cortar, amassar, misturar, fundir, aquecer, etc.) e opcionalmente retirar todos ou parte dos componentes sólidos da fruta por exemplo por filtração ou centrifugação ou outros métodos conhecidos na técnica. Preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90% ou ainda mais preferencialmente 99% ou 100% dos componentes sólidos vegetais são retirados. Preferencialmente (mas não necessariamente) O extracto é também esterilizado, por exemplo por filtração ou aquecimento, para eliminar ou matar os microrganismos presentes (tais como bactérias ou fungos não desejados). 9/38
Na fase (b) todo ou parte do extracto de fruta de melão é usado para preparar um meio de fermentação. Por outras palavras, preferencialmente o meio de fermentação compreende ou consiste em extracto de fruta de melão. Mais preferencialmente, o meio de fermentação final compreende pelo menos 50% (vol/vol), mais preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais (por exemplo, 95% ou 99% ou 100%) de extracto de fruta de melão, por exemplo sumo de melão, obtido directamente da fruta de melão. O extracto de fruta de melão pode ser diluído usando por exemplo um ou mais tampões de qualidade alimentar, tal como um tampão de fosfato, e opcionalmente o pH é ajustado a um pH específico, tal como aproximadamente pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5 ou qualquer pH que esteja dentro destes valores. Numa forma de realizar a invenção o meio de fermentação não contém extractos de fruta (por exemplo sumos) de espécies vegetais diferentes do que das derivadas de Cucumis melo.
Na fase (b) também diferentes extractos de fruta de melão podem ser misturados na preparação do meio de fermentação. Assim, por exemplo o sumo de melão de uma espécie de Cucumis melo pode ser misturada com sumo de melão de outras espécies de Cucumis melo. Estas misturas têm o mesmo efeito que o da coextracção de diferentes espécies de Cucumis melo. Numa forma preferida de realizar a invenção o meio de fermentação compreende ou consiste em extracto de melão Galia. O extracto de melão, assim como o sumo de melão, não necessita de estar preparado recentemente para fazer o meio de fermentação, mas que pode também ser extraído e seguidamente congelado, como uma extracção ou como um concentrado ou como uma diluição (por exemplo em água estéril ou tampão) para um uso posterior. Da mesma forma o extracto de melão liofilizado e/ou sumo de melão pode ser usado, por exemplo como tal ou depois da reconstituição com água ou tampão ou similar. 10/38
Todos os componentes usados na preparação do meio de fermentação são preferencialmente de qualidade alimentar. Além do(s) extracto(s) da fruta de melão, o meio de fermentação pode também compreender agentes tampão, agentes de diluição (água, tampão), aminoácidos adicionais (por exemplo unidades estruturais de folato, tais como a metionina, serina, glicina, timina, inosina, xantina, adenina e/ou guanina), açúcares, aromatizantes, agentes corantes, nucleobases, nucleosideos, fontes de carbono adicionais, etc. 0 uso de aditivos depende também do uso posterior do meio fermentado (ou partes dele) e se o meio fermentado é para ser usado como um aditivo para fazer um alimento ou comida para animais fortificado com folato ou se ele é usado como tal, por exemplo na forma de cápsulas ou de pó (como um alimento ou suplemento alimentar) ou se o folato produzido deve ser purificado do meio fermentado ou usado juntamente com todo ou parte do meio
Numa forma de realização de acordo com a invenção o p-ABA é adicionado ao meio de fermentação numa quantidade que aumenta o rendimento do folato em comparação com a fermentação na ausência de p-ABA adicional. Preferencialmente pelo menos 5 mg de p-ABA são adicionados por litro de meio de fermentação e/ou por litro de sumo de melão e/ou por extracto de melão, mais preferencialmente pelo menos 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg ou 100 mg por litro. Também mais p-ABA pode ser adicionado, tal como pelo menos aproximadamente 150 mg, 200 mg, 500 mg, 1000 mg por litro do meio de fermentação, ou mais. p-ABA pode ser obtido comercialmente em diferentes graus de pureza de Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, MO, USA, ver por exemplo número de catálogo A9878). Apesar de que nem todas as estirpes de Lactobacillus respondem a p-ABA mediante a produção de mais folato, o técnico especializado pode facilmente determinar se a adição de p-ABA tem um efeito de aumento de folato para uma estirpe dada. As estirpes de Lactobacillus plantarum, por exemplo a estirpe WCFS1, respondem positivamente à adição de p-ABA. 11/38
Outra forma de realização consiste em que a própria estirpe bacteriana produtora de folato produza p-ABA, por exemplo naturalmente ou depois da modificação genética (ver por exemplo Wegkamp et al. 2007, Applied and Environmental Microbiology Vol. 73 pp. 2673-2681), e/ou que uma ou mais estirpes adicionais produtoras de p-ABA (naturalmente ou depois da modificação) são adicionadas ao meio. O cluster de genes de p-ABA de outras bactérias, tal como o cluster de genes biossintéticos de p-ABA de Lactococcus lactis, pode assim ser introduzido e expresso em excesso na estirpe produtora de folato e/ou noutra estirpe, que pode ser seguidamente co-inoculado na fase (c).
Na fase (c) uma quantidade adequada de uma ou mais estirpes de Lactobacillus é usada como inóculos do meio de fermentação. As quantidades de inoculo podem variar, mas em geral uma cultura que tem uma concentração de aproximadamente lxlO5 - lxlO10 células/ml (por exemplo aproximadamente lxl08/ml) de células bacterianas vivas ou viáveis pode ser adicionada ao meio de fermentação a aproximadamente um volume de 1% do volume final do meio de fermentação, ou mais, ou menos (por exemplo volume de 0.8%, 0.5%) .
Em principio qualquer estirpe de Lactobacillus que é capaz de produzir folato totalmente (isto é, que compreende os genes biossintéticos de folato) pode ser usado, incluindo estirpes de tipo natural/selvagem, estirpes recombinantes (modificadas geneticamente) e estirpes mutantes. As estirpes recombinantes podem também ser estirpes que foram transformadas com um ou mais genes biossintéticos de folato, assim como também os níveis de produção de folato destas estirpes podem ser aumentadas adicionalmente quando os métodos de acordo com a invenção são usados. Por exemplo, o cluster dos genes biossintéticos de folato pode ser clonado e/ou introduzido de uma estirpe noutra estirpe. O vector pNZ7026 transporta o cluster dos genes de folato de L. plantarum WCFS I (ver os exemplos) e este cluster 12/38 assim, de genes pode, assim, ser introduzido noutras estirpes de Lactobacillus por exemplo por electroporação ou conjugação ou pelos genes (folB, folK, folE, folC2, xtp2, folP) que podem ser usados para identificar e isolar os genes homólogos de outras espécies ou estirpes de Lactobacillus.
Podemos testar facilmente se uma estirpe é capaz de produzir folato totalmente, por exemplo cultivando a estirpe num meio apropriado e analisando e/ou quantificando se o folato é intracelularmente e/ou extracelularmente produzido usando por exemplo HPLC, LC-MS, ensaio microbiológico e outros. A inoculação do meio de fermentação é feita usando os métodos microbiológicos standards, tais como por exemplo preparando culturas iniciadores frescas da(s) estirpe(s) e/ou usando inoculo previamente preparado tal como soluções padrão bacterianas congeladas que têm uma quantidade definida de células bacterianas. As estirpes que contêm o cluster de genes biossintéticos de folato ou seus ortólogos (por exemplo sequências que compreendem pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou mais identidade de sequências ao nível dos ácidos nucleicos e/ou aminoácidos aos genes biossintéticos de folato e/ou proteínas), por exemplo aos de L. plantarum WCFS1, são propensas a ser capazes de produzir folato. Assim, a análise genética e/ou bioinformático pode também ser usado para identificar as estirpes apropriadas.
Numa forma preferida de realizar a invenção são usadas estirpes de tipo natural/selvagem (não modificadas geneticamente e não mutantes), isto é estirpes conforme foram isoladas de fontes naturais ou derivadas não modificadas das mesmas. Estas estirpes estão disponíveis nas instituições depositárias de estirpes ou podem ser isoladas de fontes naturais. A(s) estirpes(s) usada(s) são preferencialmente todas as de qualidade alimentar, isto é, deveriam ter (ou deveriam ser capazes de obter) o estado GRAS.
Também, as estirpes são estirpes preferencialmente probióticas.
Exemplos de estirpes incluem estirpes de Lactobacillus das 13/38 seguintes espécies: L. reuteri, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. helveticus, L. delbrueckii, L. brevis, L. crispatus, L. sakei, L. jensenii, L. sanfransiscensis, L. fructivorans, L. kefiri, L. curvatus, L. paraplantarum, L. kefirgranum, L. parakefir, L. fermentum, L. acidophilus, L. johnsonii, L. gasseri, L. xylosus, L. salivarius, L. murinus, L. minutis, L. gallinarium, L. amylovorus, etc.
Estirpes úteis são por exemplo (mas não limitado neste documento) as seguintes estirpes: L. plantarum WCFS1, L. reuteri 100-23, L. reuteri JCM 1112, L. delbrueckii subesp. bulgaricus ATCCBAA 365, L. delbrueckii subesp. bulgaricus ATCC 11842, e L. sake subesp. sakei 23 K (espécie conhecida por possuir o cluster dos genes de folato, de acordo com a base de dados de bioinformática de ERGO™, ver Overbeek et al., Nucleic Acids Res. 2003 Jan 1; vol 31(1):164-71).
Assim, numa forma de realizar a invenção uma ou várias (preferencialmente) estirpes e/ou espécies de LAB (do género Lactobacillus) probióticas e/ou de qualidade alimentar são usadas no método.
Para algumas aplicações, tal como para a preparação de alimentos ou suplementos alimentares para por exemplo vegetarianos, é também desejado que a estirpe não só produza folato durante a fermentação mas também vitamina B12 Assim numa forma de realizar a invenção a estirpe de Lactobacillus usada é capaz de produzir folato assim como vitamina B12. Preferencialmente a(s) estirpes(s) é/são estirpe(s) probiótica(s). Um exemplo de uma espécie de Lactobacillus que é capaz disso é a Lactobacillus reuteri, por exemplo L. reuteri JCM 1112, mas mais espécies e/ou estirpes podem ser encontradas, por exemplo nos géneros de Clostridium, Geobacillus, Listeria, Propionibacterium,
Fusobacterium, Salmonella, entre outros. As dietas vegetarianas estritas são na maioria das vezes baixas em vitamina B12, enquanto que são relativamente ricas em folato. Isto conduz ao 14/38 risco de que a deficiência da vitamina B12 é disfarçada com o folato, pelo qual existe uma necessidade de produtos que compreendem folato assim como vitamina B12.
Os exemplos mostram que a produção de folato pela estirpe WCFS1 de L. plantarum (originalmente obtida de saliva humana; número de acesso NCIMB 8826, Colecção Nacional de Bactérias Marinhas e Industriais, Aberdeen, U.K) foi aumentada 2-3 vezes no meio de sumo de melão (aproximadamente 58 ^g/~L de meio) em comparação com o meio sintético (CDM) (29 lig/L de meio) . A produção de folato da estirpe L. reuteri JCM112 (originalmente obtida do intestino humano; número de acesso NCIMB 11951, Colecção Nacional de Bactérias Marinhas e Industriais, Aberdeen, U.K) aumentou quase 10 vezes, de 8-35μρ/Ε em CDM a 310 μg/'L· no meio de sumo de melão. O uso destas duas estirpes para a produção de folato e opcionalmente também para a produção concomitante de vitamina B12 (por exemplo por L. reuteri) de acordo com a invenção é também uma forma de realização neste documento. Estas duas estirpes podem também ser usadas como controlos no método descrito.
Quando pelo menos uma estirpe que é capaz de produzir o folato assim como vitamina B12 é usada, o rácio folato: vitamina B12 no caldo de fermentação aumenta significativamente durante e/ou no fim da fermentação (isto é, durante a fase estacionária), dando como resultado um desvio do rácio comum 1:1 folato:vitamina B12. 0 rácio resultante folato:vitamina B12 é preferencialmente pelo menos 2:1, 5:1, 10:1, 50:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, ou mais, ou qualquer rácio que esteja dentro de estes. Ver por exemplo o exemplo 3 e a figura 2, que mostram que estirpes que expressam folato em excesso do tipo selvagem e recombinantes produzem um rácio significativamente aumentado folato:vitamina B12 no meio de melão de acordo com a invenção em comparação com outros meios, tal como meio CDM ou de pepino. 15/38
Opcionalmente, podemos alternativa ou adicionalmente usar estirpes diferentes durante o processo de fermentação (isto é, misturas de estirpes), pelo qual pelo menos uma estirpe produz quantidades de folato aumentadas e pelo menos outra estirpe produz vitamina B12. Por exemplo os arqueões não produzem folato, mas produzem vitamina B12. Assim uma co-inoculação de uma estirpe produtora de folato com uma quantidade adequada de uma estirpe produtora de vitamina B12 é também uma forma de realização neste documento. 0 técnico especializado pode facilmente identificar estirpes bacterianas ou outros microrganismos tais como arqueões, fermento ou fungos, que produzem vitamina B12. A vitamina B12 pode ser medida e/ou quantificada no caldo de fermentação usando métodos standards, tais como os mencionados para a quantificação de folato. A produção de folato obtida da fermentação no meio de extracto de melão é significativamente maior quando comparada com a
produção de folato da fermentação usando a mesma estirpe em CDM (meio quimicamente definido, como o descrito por Teusink, B., van Enckevort, F.H., Francke, C., Wiersma, A., Wegkamp, A.,
Smid, E.J. & Siezen, R.J., 2005, Appl Environ Microbiol 71, 7253-7262)). "Significativamente maior" refere-se pelo menos a 2x, preferencialmente pelo menos aproximadamente 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, lOx 15x, 16x, ou mais, do folato total (a soma do folato extracelular e intracelular, corrigido para o folato base que está presente no meio) sendo produzido para o final da fermentação (no caldo de fermentação) em comparação com a fermentação em CDM. Os níveis de folato base são preferencialmente determinados no meio não inoculado com bactérias mas que são ainda assim tratados da mesma maneira. Por exemplo, um caldo de fermentação que compreende (durante e/ou depois da fermentação de acordo com a invenção) uma quantidade total de folato de pelo menos aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 16/38 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000 μg ou mais folato por litro de caldo de fermentação está provido neste documento, dependendo da estirpe ou combinação das estirpes usadas. Ainda niveis mais altos podem ser obtidos, por exemplo se uma ou mais estirpes modificadas geneticamente (por exemplo produtoras de folato em excesso) é/são usada(s), e opcionalmente também p-ABA é adicionada, podemos produzir folato de acordo com a presente invenção em quantidades de pelo menos 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 μρ de folato ou mais por litro de caldo de fermentação (ver os exemplos). O teor de folato total pode ser medido usando técnicas conhecidas, tal como por exemplo o ensaio microbiológico descrito por Home & Patterson (1988, Clin Chem 34:2357-2359) ou por Sybesma et al. 2003 (Appl. Environm. Microbiol 69:3069-3076). Outros ensaios quantitativos incluem por exemplo análise por HPLC ou LC-MS. O folato é preferencialmente medido no fim da fermentação, isto é durante uma fase estacionária das estirpes do inoculo.
As quantidades adequadas de inoculo de cada estirpe de Lactobacillus podem variar, mas geralmente aproximadamente 1% do volume de uma cultura crescida totalmente (contendo por exemplo aproximadamente 1*108 células por ml) é adicionada a um meio de fermentação fresco. Para produzir o inoculo, podem ser usados métodos microbiológicos standards.
Quando do uso de 2 ou mais estirpes de Lactobacillus, os niveis de inoculo podem ser adaptados, no entanto, o volume total de inoculo (de 2 ou mais estirpes) preferencialmente não excede 1% do volume do meio de fermentação final.
Opcionalmente outras bactérias produtoras de folato de qualidade alimentar e/ou outras bactérias de qualidade alimentar, tais como as estirpes probióticas podem ser adicionadas ao meio de 17/38 fermentação antes e/ou durante a fermentação e/ou depois da fermentação e/ou ao produto nutracéutico, alimentar ou comida para animais fabricado e que compreende (ou que consiste em) meio fermentado de extracto de melão (ver mais abaixo) . No entanto, numa forma de realizar a invenção preferencialmente o meio de fermentação não está inoculado com qualquer outro microrganismo diferente do da(s) estirpe(s) de Lactobacillus produtora(s) de folato (e/ou vitamina B12) seleccionadas, e opcionalmente um ou mais microrganismos produtores de vitamina B12. Portanto numa forma de realizar a invenção o meio está livre de microrganismos de qualidade não alimentar, microrganismos patogénicos, microrganismos de degradação e/ou qualquer outra espécie ou estirpe bacteriana não desejada e/ou não inoculada, tal como por exemplo estirpes de Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus, e/ou Lactococcus, ou outras. A fermentação de acordo com a fase (d) é levada a cabo usando métodos standards, como por exemplo os descritos nos exemplos.
Depois de que a fermentação se tenha dado durante um período adequado, preferencialmente até que não seja observado nenhum aumento adicional na densidade óptica, o meio fermentado (também referido neste documento como "caldo de fermentação") (ou uma parte dele) é ainda opcionalmente usado para por exemplo purificar o folato a partir dele e/ou para fazer produtos que compreendem ou consistem no meio fermentado (ou partes dele) compreendendo o folato produzido pela(s) estirpe(s) de Lactobacillus.
Também podem ser usadas partes do meio fermentado. Por exemplo as bactérias podem ser eliminadas do meio (por exemplo por filtração ou centrifugação) e o meio sem bactérias pode ser também utilizado. Alternativamente, o meio fermentado que compreende as bactérias pode ser usado como tal. Isto é particularmente atractivo nos casos onde o LAB usado é uma estirpe probiótica, especialmente uma estirpe de LAB probiótica 18/38 capaz ela própria de produzir tanto o folato como a vitamina B12. Outra opção é matar ou inactivar a maior parte ou todas as bactérias, por exemplo por aquecimento ou por ultra-sons.
Ao fabricar um alimento, comida ou produto nutracéutico que compreende ou que consiste num meio de fermentação feito de acordo com a invenção (ou uma parte dele) , é uma forma de realização adicionar o caldo de fermentação (ou parte dele), que compreende as bactérias vivas e/ou bactérias viáveis, ao produto ou ingredientes do produto, por exemplo para o adicionar antes, durante e/ou depois do processo de produção do alimento ou comida para animais.
Produtos e composições de acordo com a invenção
Também são providas composições e produtos que compreendem ou que consistem em caldo de fermentação (ou uma ou mais partes delas) preparada de acordo com o método anterior. 0 meio fermentado (o caldo de fermentação) é usado numa forma de realizar a invenção como tal, mas pode opcionalmente ser concentrado ou diluído ou tratado previamente antes de ser usado para preparar uma composição de alimento, comida ou suplemento alimentar. Os pré-tratamentos incluem filtração e/ou centrifugação, esterilização, liofilização, congelação, e outros. 0 meio de fermentação como tal e/ou o meio de fermentação pré-tratado são na sua essência os produtos primários do método anterior. Estes produtos primários podem ser utilizados como tal ou podem ser usados como um ingrediente de alimento e/ou suplemento alimentar, isto é pode-se usar uma quantidade adequada do produto primário como ingrediente no momento da feitura de um suplemento alimentar ou de alimento final.
Por exemplo o caldo de fermentação e/ou o caldo de fermentação tratado previamente podem ser usados como ingredientes na 19/38 preparação de alimento, comida para animais ou suplemento alimentar fortificado com folato tais como alimentos líquidos (por exemplo bebidas, sopas, iogurtes ou bebidas à base de iogurte, batidos de leite, refrescos, bebidas de fruta, produto lácteo fermentado, substitutos de refeições, fruta fermentada e/ou produtos de sumo, etc.) ou alimentos/comidas sólidas (comidas, substitutos de refeições, aperitivos tais como barras de chocolate, comida para animais, produtos lácteos fermentados, alimentos ou comidas fermentadas, produtos congelados, aditivos de alimentos liofilizados, queijos, etc.) ou alimentos semi-sólidos (sobremesas, etc.) . 0 meio fermentado e/ou o meio de fermentação pré-tratado pode simplesmente ser adicionado ou usado durante o processo de produção destes produtos. 0 caldo de fermentação obtido do método de fermentação anterior pode ser pré-tratado por concentração, diluição, filtração e/ou liofilização antes de ser usado como produto ou ingrediente de produto. A concentração e a diluição com água ou tampão ou outros líquidos de qualidade alimentar (por exemplo sumos de fruta, leite, etc.) pode ser levada a cabo para chegar a um nível de folato apropriado no alimento, comida ou suplemento alimentar final. A filtração pode ser usada para eliminar as bactérias do caldo. Numa forma de realização de acordo com a invenção o caldo de fermentação (ou um seu concentrado, uma sua diluição e/ou um seu filtrado) é liofilizado para fazer um pó fortificante com folato. Este pó é seguidamente usado na preparação de um alimento, comida para animais ou suplemento alimentar na forma sólida, liquida ou semi-sólida. Os suplementos podem ser formulados como bebidas, comprimidos, cápsulas, gel, pó, pílulas, etc. pelo qual o suplemento compreende uma quantidade adequada de produto primário e assim também uma quantidade adequada de folato.
Apesar de que o caldo de fermentação possa ser pré-tratado para eliminar e/ou inactivar as bactérias, em certas formas de realizar a invenção é preferível que as bactérias não sejam 20/38 eliminadas e/ou não sejam inactivadas, especialmente se as bactérias têm propriedades probióticas. Assim, preferencialmente as composições de acordo com a invenção compreendem bactérias vivas e/ou viáveis (por exemplo liofilizadas).
As composições de alimento, comida para animais ou suplemento de acordo com a invenção compreendem ou consistem numa quantidade adequada de produto primário (caldo de fermentação, por exemplo como tal ou pré-tratado). A quantidade de produto primário a ser usado na preparação da composição variará, dependendo da concentração de folato no caldo de fermentação e da quantidade desejada que estará presente na composição a ser feita. Preferencialmente o produto compreende uma quantidade de folato que é equivalente pelo menos aproximadamente a 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, mais preferencialmente 100%, 150%, 200%, 300% ou mais da quantidade diária recomendada de folato. Uma composição para mulheres grávidas ou com a intenção de ficarem grávidas pode, por exemplo, compreender uma quantidade de caldo de fermentação que provê por exemplo aproximadamente 400 μg de folato ao dia ou 600 μρ de folato ao dia (200% ou 300% Quantidade Diária Recomendada - Recommended Daily Allowance -RDA) , enquanto que as composições para mulheres não grávidas pode compreender aproximadamente 200 μρ folato/dia (100% Quantidade Diária Recomendada. É de notar que os níveis de ingestão recomendados varia de país para país, na Europa varia entre 200 e 400 μρ de folato ao dia para mulheres não grávidas e grávidas, respectivamente, enquanto que nos EUA estes níveis são mais altos, onde são recomendadas 400 e 600 μρ de folato para mulheres não grávidas e grávidas, respectivamente. Assim, a composição pode por exemplo compreender entre aproximadamente 20 μρ e 600 μρ de folato por dose diária, ou mais. Tal e como é mencionado a RDA para países diferentes pode ser diferente, de modo que quantidades eficazmente diferentes de folato podem estar presentes nos produtos feitos para mercados diferentes. 21/38
Numa forma de realizar a invenção a composição compreende ainda vitamina B12, preferencialmente na RDA para vitamina B12. Preferencialmente a vitamina B12 e o folato são produzidos pelo mesmo microrganismo (isto é, por uma única estirpe, por exemplo L. reuteri) no método de acordo com a invenção, ou pelo menos são produzidos no mesmo processo de fermentação (isto é, pela(s) mesma(s) estirpe(s) ou diferente(s) adicionada (s) ao meio de fermentação)
Ao preparar um alimento, comida para animais ou suplemento alimentar que compreende ou que consiste em ingredientes primários obteníveis de acordo com o método anterior, obviamente que podem ser seguidos métodos standards de produção e formulação de alimentos, comidas para animais e suplementos alimentares. Por exemplo, podem ser adicionados outros componentes durante o processo de produção, tais como proteínas, hidratos de carbono, gorduras, minerais (ferro, cálcio, cobre, magnésio, selénio, zinco, etc.), prebióticos, outras vitaminas (vitamina Bl, B2, B3, B5, B6, B12, C, D, e, betacaroteno, biotina, etc.), agentes aglutinantes, agentes de humidificação, agentes corantes, agentes aromatizantes, estabilizadores, emulsionantes, etc. Se a vitamina B12 já está presente numa quantidade desejada no caldo de fermentação (por exemplo RDA é aproximadamente 1 μq para seres humanos), mais adição não será desejada. Além disso, podem ser adicionados outros ingredientes bioactivos e podem estar compreendidos no produto final, tais como bactérias probióticas, medicamentos, etc.
As quantidades diárias de folato e/ou vitamina B12 naturalmente que podem ser administradas de uma só vez ou podem ser subdivididas em duas, três ou mais doses ao dia. As composições podem, assim, também compreender ou consistir num caldo de fermentação adequado para uma única administração ao dia ou para várias administrações diárias. 22/38
Para alguns sujeitos, a ingestão diária não será necessária e os produtos que provêm folato podem ser consumidos de uma só vez cada dois ou três dias ou uma vez à semana, ou menos frequentemente. Por exemplo os alimentos ou comidas fortificadas com folato (por exemplo alimentos ou comidas fermentadas) não necessitam ser tomados diariamente, ainda que parece ser melhor tomar folato em demasia do que pouco, devido que a deficiência é mais dramática do que a sobredose. Uma toma diária (uma ou mais vezes ao dia) é portanto uma forma preferida de realizar a invenção aqui.
Os produtos de acordo com a invenção são preferencialmente para a ingestão oral por seres humanos e/ou animais, tais como animais de companhia (cães, gatos, etc.) ou animais de criação (vacas, cavalos, porcos, galos, ovelhas, etc.) ou qualquer outro animal (animais selvagens, por exemplo mantidos nos jardins zoológicos, etc.) . Os produtos são especialmente adequados para pessoas que necessitam uma toma de folato mais regulada ou pessoas que necessitam uma toma de folato melhorada, tais como atletas, mulheres grávidas, pessoas com deficiência de folato, e outros .
Os produtos preferidos incluem por exemplo bebidas à base de sumo de melão, ou bebidas à base de triturado de melão, contendo altos níveis de folato e preferencialmente também de vitamina B12 e que preferencialmente têm um prazo de validade grande para transporte e armazenamento, especialmente nos países menos desenvolvidos onde as populações que sofrem de deficiências vitamínicas podem ser tratadas (terapeuticamente ou profilacticamente).
Meio de fermentação e caldo de fermentação de acordo com a invenção 0 meio de fermentação e/ou caldo de fermentação é também uma forma de realização aqui como tal. Assim numa forma de realizar 23/38 a invenção um meio de fermentação de Lactobacillus é provido que compreende ou consiste em extracto de fruta de melão como o descrito anteriormente e compreende além disso p-ABA, onde o dito meio de fermentação não compreende extractos de frutas de outras espécies vegetais. Noutra forma de realização um caldo de fermentação (como tal e/ou pré-tratado) está provido, como o descrito, que pode ser usado para fazer alimentos, comidas para animais ou suplementos alimentares fortificados com folato. Este produto primário pode também ser armazenado durante períodos maiores por exemplo congelados ou liofilizados antes de serem usados como ingrediente para a produção do produto final.
Usos de acordo com a invenção
Noutra forma de realizar a invenção é descrito o uso de extracto de fruta de melão para a preparação do meio de fermentação (como o acima descrito).
Adicionalmente o uso do caldo de fermentação, obtenível da fermentação de Lactobacillus do meio de fermentação (que compreende ou que consiste em extracto de fruta de melão), para a preparação de um alimento, comida para animais ou suplemento alimentar é provido neste documento.
Os seguintes exemplos não limitativos ilustram a invenção. A não ser que seja indicado o contrário, a prática da invenção empregará métodos convencionais standards de biologia molecular, farmacologia, microbiologia ou bioquímica. Estas técnicas estão descritas em Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA e Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985), Microbiology: A Laboratory Manual (6th Edition) by James Cappuccino, Laboratory Methods in 24/38
Food Microbiology (3rd edition) by W. Harrigan (Author) Academic Press.
EXEMPLOS
1. Fermentação em 80% de sumo de melão em comparação com a fermentação em CDM
Neste exemplo foi determinado se a fermentação do sumo de melao produzia mais folato em comparação com CDM 1.1 Material e métodos 1.1.1 Estirpes e preparação de inoculo
Foram usadas as estirpes seguintes:
Lactobacillus reuteri JCM 1112 e Lactobacillus plantarum WCFS 1. Para ambas as estirpes 1% de inoculo foi usado para a inoculação dos meios desenvolvidos. O isolado humano L. reuteri JCM1112T foi obtido da Colecção Japonesa de microrganismos (RIKEN BioResource Center, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198, Japan). L. plantarum WCFS1, um isolado humano obtido da colecção de culturas de investigação alimentar NIZO (Ede, the Netherlands). 1.1.2 Construção das estirpes sobreprodutoras de folato O ADN genómico de L. plantarum WCFS1 foi isolado usando procedimentos estabelecidos (Ferain, T., Garmyn, D., Bernard, N., Hols, P. and Delcour, J. (1994) Lactobacillus plantarum ldhl
gen: overexpression and deletion. J Bacteriol 176, 596-601). PCR foi executado da seguinte maneira; 30 seg. de desnaturalização a 94 °C, 30 seg. de recozimento do iniciador a 45 °C, e alongamento a 68 °C durante 1 min por quilo-base, esta sequência especifica foi repetida durante 30 ciclos. Pfx polimerase (Invitrogen, Breda, Netherlands) foi usada para a amplificação. 25/38 A ligação de ADN foi executada usando T4 ADN ligase (Invitrogen) por incubação durante toda a noite a 16 °C, os fragmentos de ADN foram misturados com uma rácio 1:5 de plasmideo:inserto. 0 cluster dos genes de folato foi amplificado por PCR usando folBKpnF (iniciador directo, GAAAGAGGCTGGGTACCATTATGGGCATGATTC) , e folPXbaR (iniciador invertido CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG). Os iniciadores folBKpnF e folPXbaR foram modificados na sua sequência para introduzir um sitio de restrição Kpnl, e Xbal, respectivamente (bases modificadas sublinhadas). 0 cluster dos genes de folato foi amplificado de 18 pares de bases a montante de folB a 52 pares bases a jusante de folP. A expansão linear do ADN amplificado foi parcialmente digerido, por Kpnl (Invitrogen) e Xbal (Invitrogen). A digestão parcial é essencial porque folP contém um sitio de restrição de Xbal adicional. 0 cluster dos genes de folato digerido, contém o comprimento máximo do cluster dos genes de folato. 0 plasmideo pNZ7021 (Wegkamp, A., van Oorschot, W., de Vos, W.M. & Smid, E.J. (2007) Characterization of the Role of para-Aminobenzoic Acid Biosynthesis in Folate Production by Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 73, 2673-2681) foi também digerido com Xbal e Kpnl. Os dois pedaços digeridos de ADN foram misturados num rácio 1:5 (plasmideo:inserto) , e foram ligados por T4 ADN ligase. O ADN ligado foi transferido às células competentes de estirpes NZ9000AylgG L. lactis (Klaus et al. 2005) usando electroporação por procedimentos estabelecidos (de Vos, W.M., Vos, P., de Haard, H. & Boerrigter, I. (1989) Cloning and expression of the Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 gene encoding an extracellular serine proteinase. Gene 85, 169-176).
Posteriormente, a estirpe de L. lactis transformado foi cultivada durante 40 horas em placas M 17 com 10 mg/L de CM. As colónias resistentes ao cloranfenicol foram controladas para a presença do plasmideo por PCR usando folpF (iniciador directo, CATGGCATCGATATTGAACGAATTG); e nisRKR (iniciador invertido, GTTCTATCGAAAGCGAAATC). Os transformantes positivos foram escolhidos e inoculados em caldo M17 com 10 mg/L de CM. O teor de plasmideo total foi isolado das culturas completas postas a 26/38 crescer durante toda a noite e os plasmídeos foram isolados usando colunas Jetstar (Genomed GmbH, Bad Oeynhausem, Germany). 0 plasmideo foi controlado por análise de restrição e pósteriormente sequenciado usando procedimentos standards como o abaixo descrito. 0 plasmideo resultante foi designado como pNZ7026. Depois, os plasmídeos pNZ7021 e pNZ7026 foram transferidos a células competentes de L. reuteri por electroporação como o descrito noutro lugar (Walter, J., N. W.C. Heng, W. P. Hammes, D. M. Loach, G. W. Tannock, & C. Hertel. 2003. Identification of Lactobacillus reuteri genes specifically induced in the mouse gastrointestinal tract. Appl Environ
Microbiol 69:2044-51). Os transformantes foram postos a crecer durante 40 horas nas placas de MRS com 10 mg/L CM e as células resistentes CM foram analisadas para a presença dos plasmídeos apropriados por PCR. Para L. plantarum que contém o pNZ7026, os iniciadores folpF e nisRKR foram usados como sondas. Os iniciadores CmdownF (iniciador directo) e nisRKR foram usados para monitorizar a presença de pNZ7021 na estirpe hospedeira.
1.1.3 Preparação do meio da fermentação e CDM
Meios quimicamente definidos foram feitos como o descrito por
Teusink, B. , van Enckevort, F.H., Francke, C., Wiersma, A. , Wegkamp, A. , Smid, E . J . & Siezen, R.J., 2005, Appl Environ Microbiol 71, 7253 -7262) . 0 sumo de melão foi feito como o abaixo descrito. 0 meio de melão foi feito a partir de Cucumis melo var. reticulatus depois de descascar e retirar as sementes. O melão foi liquidificado usando uma batedeira de cozinha e a pasta resultante foi espremida através de um tecido de algodão. O fluxo passante foi centrifugado duas vezes a 10.000 RPM durante 10 min à temperatura ambiente usando um centrifugador Sorvall (Newton, CT, USA) . O sobrenadante foi armazenado a -20 °C até ser usado. Antes da inoculação, os meios de melão foram diluídos com um tampão de potássio-f osf ato 0.5 M (pH 5.8) num rácio 4:1 (v/v) . O pH final foi ajustado a 6.0 e o meio dos 27/38 meios de melão foi forçado através de um filtro de 0.22 μιη para assegurar a esterilidade. Quando mencionado, ambos meios de fruta foram suplementados com p-ABA até uma concentração final de 10 mg/L. 1.1.4 Fermentação
Os meios de melão e de pepino foram inoculados com L. reuteri tipo selvagem, controlo (pNZ7021 vector vazio) e produtor em excesso de folato (pNZ7026 plasmideo que expressa em excesso o cluster de genes de folato) . Para L. plantarum WCFS1 o tipo selvagem foi inoculado. Os meios inoculados foram cultivados durante 40 horas a 37 °C. 1.1.5 Medições de folato 0 teor de folato total foi medido usando o ensaio microbiológico descrito por Home & Patterson (1988, Clin Chem 34:2357-2359) ou por Sybesma et al. 2003 (Appl. Environm. Microbiol 69: 3069- 3076) . As amostras de folato foram tomadas depois de aproximadamente 40 horas do crescimento da cultura desde a fase estacionária. Adicionalmente, os niveis base destas vitaminas foram determinadas a partir das amostras tratadas identicamente mas não inoculadas. 1.2 Resultados
Os niveis de produção de folato foram determinados para L. reuteri e L. plantarum em CDM e 80% de sumo de melão.
Os resultados são mostrados nos quadros 1 e 2 para L. reuteri JCM 1112 e nos quadros 3 e 4 para L. plantarum WCFS 1. 28/38
Quadro 1 - Fermentação da estirpe JCM1112 de L. reuteri em 80% de meio de sumo de melão
Estirpe Pool da produção de folato total \xq/L Desvio padrão.μq/L Pool de produção de folato total μg/L por ODeoo Número de vezes* que os pools de folato aumentaram em comparação com o quadro 2 JCM 1112 tipo selvagem 325.12 12,96 103.65 5.4x + pNZ 7 021a 321,34 5, 51 131,66 4, 6x + PNZ 7 0 2 6b 237,01 14,61 115,96 n.d. + pNZ7026 + P-ABAC 7451,09 182,11 2518,17 1.6 7x Brancod 22 1 n.d. = não determinado a, vector vazio b, plasmideo da produção em excesso de folato c, plasmideo da produção em excesso de folato, contendo adicionalmente 10 mg/L de p-ABA d, sumo de melão *, o número de vezes é calculado tendo como base a pool de produção de folato total.
Quadro 2 - Fermentação da estirpe JCM 1112 de L. reuteri no meio
CDM com p-ABA
Estirpe Pool da produção de folato total μq/'Lι Desvio padrão. μq/'L· Οϋβοο JCM 1112 tipo selvagem 59.92 5 2.84 + pNZ7021a 69.05 8 2.75 + PNZ7026b 4449.05 201 2.42 a, vector vazio b, plasmideo da produção em excesso de folato
Quadro 3 - Fermentação de L. plantarum WCFS1 em 80% meio de sumo de melão
Pool da Desvio padrão, μq/L Pool da Número de Estirpe produção de folato produção de folato vezes* que os pools de total total μq/'L folato 29/38 μg/'Lι por OD60o aumentaram em comparação com o quadro 4 WCFS1 tipo selvagem 394,51 1,00 96.63 13.6x Branco3 22 1 a, sumo de melão *, número de vezes de aumento é calculado com base no pool de produção de folato total.
Quadro 4 - Fermentação da estirpe WCFS I de L. plantarum no meio
CDM com p-ABA
Estirpe Pool da produção de folato total μg/'L Desvio padrao, μg/'L· ODêoo WCFS1 1 Tipo selvagem 29 3 3.53 1.3 Conclusão
Os resultados mostram que a produção de folato de ambas as estirpes de tipo selvagem e estirpes de Lactobacillus recombinantes podem ser significativamente melhoradas quando o sumo de melão é usado como meio de fermentação, em comparação com CDM.
Exemplo 2
Neste exemplo a possibilidade de estender as conclusões acima descritas para outros representantes da fruta do género Cucumis foi investigado. A mesma experiência foi testada usando sumo de pepino, Cucumis sativus. 2,1,1 Estirpes e preparaçao de inoculo
Foram usadas as estirpes seguintes: Lactobacillus reuteri JCM1112. Um 1% de inoculo foi usado para a inoculação dos meios desenvolvidos. 30/38
2.1.2 Preparação do meio de fermentação e CDM
Meios quimicamente definidos foram feitos como o descrito por Teusink, B., van Enckevort, F.H., Francke, C., Wiersma, A. , Wegkamp, A. , Smid , E . J . & Siezen, R.J., 2005, Appl Environ
Microbiol 71, 7253-7262). 0 sumo de pepino foi feito da seguinte maneira. Os meios de sumo de pepino foram preparados por liquidificação de pepino intacto (Cucumis sativus) usando uma batedeira de cozinha (Moulinex, Masterchef 370, France). A pasta resultante foi forçada através de um tecido de algodão, e o fluxo passante foi filtrado com um filtro de celulose (0.15 mm) antes de ser centrifugado duas vezes a 10.000 RPM durante 10 min a 4 °C usando um centrifugador Sorvall (Newton, CT, USA) equipado com um rotor GSA600. O sobrenadante foi armazenado a -20 °C até um uso posterior. Antes da inoculação, o sumo de pepino foi diluído em 1 volume de 0.2 M tampão de potássio-fosfato (pH 5.8) . O pH final foi ajustado a 6.0 e o meio de pepino foi forçado além de um filtro de 0.22 μιη para assegurar a esterilidade. Quando mencionado, ambos os meios de fruta foram suplementados com p-ABA até uma concentração final de 10 mg/L. 2.1.3 Fermentação
Os meios de pepino e de CDM foram inoculados com um controlo de L. reuteri (pNZ7021 vector vazio) e produtor em excesso de folato (pNZ7026 plasmídeo de expressão em excesso do cluster dos genes de folato). Os meios inoculados foram cultivados durante 40 horas a 37 °C. 2.1.4 Medições de folato O teor de folato total foi medido usando o ensaio microbiológico descrito por Horne & Patterson (1988, Clin Chem 34:2357-2359) ou por Sybesma et al. 2003 (Appl. Environm. Microbiol 69:3069-31/38 tomadas depois de da cultura da fase 3076) . As amostras de folato foram aproximadamente 40 horas do crescimento estacionária. 2.2 Resultados
Os Pools da produção de folato são mostrados nos quadros 1 e 2 para L. reuteri JCM 1112
Quadro 1 - Fermentação da estirpe JCM1112 de L. reuteri em 80% de meio de sumo de pepino
Estirpe Pool da produção de folato total \lq/L Desvio padrão. \iq/~L Pool de produção de folato total μg/L por OD60o Número de vezes* que os pools de folato aumentaram em comparação com o quadro 2 + pNZ 7 021a 22, 14 1,00 8,64 0,32x + PNZ7026b 64.00 7, 00 33.77 n.d. + pNZ7026 + P—ABAC 385,99 19.34 501,37 0.09x Brancod 9.96 0.44 n.d. = não determinado a, vector vazio b, plasmídeo da produção em excesso de folato c, plasmídeo da produção em excesso de folato, contendo adicionalmente 10 mg/L de p-ABA d, sumo de pepino *, o número de vezes é calculado tendo como base a pool de produção de folato total.
Quadro 2 - Fermentação da estirpe JCM 1112 de L. reuteri no meio
CDM com p-ABA
Estirpe Pool da produção de folato total μq/'L· Desvio padrao. μ%/1> Οϋβοο + pNZ7021a 69.05 8 2.75 + PNZ7026b 4449.05 201 2.42 a, vector vazio b, plasmídeo da produção em excesso de folato 32/38 2.3 Conclusão
Os resultados mostram que a produção de folato das estirpes recombinantes de Lactobacillus reuteri pode não aumentar quando o sumo de pepino é usado como meio de fermentação, em comparação com CDM. Estas experiências mostram claramente que a capacidade para produzir pools ricos em folato depende do tipo do sumo de frutas que é usado como caldo.
Exemplo 3 - Caldo de fermentação com rácios folato aumentado:vitamina B12 0 rácio de produção entre folato e B12 foi determinado depois da fermentação de L. reuteri em CDM e sumo de melão. As experiências foram executadas como o acima descrito, no entanto, adicionalmente foram tomadas amostras para a análise de B12. 3.1 Materiais e métodos 3.1.1 Estirpes e preparação do inoculo [0094] Foram usadas as estirpes seguintes: Lactobacillus reuteri JCM1112 e Lactobacillus plantarum WCFS 1. Para ambas estirpes 1% de inoculo foi usado para a inoculação dos meios desenvolvidos. 3.1.2 Fermentação [0095] Os meios de melão e CDM foram inoculados com L. reuteri tipo selvagem, controlo (pNZ7021 vector vazio) e produtor em excesso de folato (pNZ7026 plasmideo de expressão em excesso do cluster dos genes de folato) . Os meios inoculados foram cultivados durante 40 horas a 37 °C. 3.1.3 Medições de B12 33/38 0 teor da vitamina B12 foi determinado de acordo com os Métodos Oficiais de Análise da AOAC InternaTional, usando o ensaio de vitamina B12 de L. delbrueckii subesp. lactis ATCC 7830
(Horowitz, W. (ed.)· 2006. Official methods of analysis of AOAC
International, 18th ed. AOAC International, Gaithersburg, Md.). Os extractos celulares das culturas da fase estacionária para a análise de B12 foram preparadas tal e como o previamente descrito (Taranto, Μ. P., J. L. Vera, J. Hugenholtz, G. F. De Valdez, & F. Sesma. 2003. Lactobacillus reuteri CRL1098 produces cobalamin. J Bacteriol 185:5643-7) . 3.1.4 Medições de folato O teor de folato total foi medido usando o ensaio microbiológico descrito por Home & Patterson (1988, Clin Chem 34:2357-2359) ou por Sybesma et al. 2003 (Appl. Environm. Microbiol 69: 3069- 3076). As amostras de folato foram tomadas depois de aproximadamente 40 horas de crescimento da cultura da fase estacionária. 3.2 Resultados
Os resultados são mostrados nas figuras 1 e 2. A figura 1 mostra pools da produção de folato e da produção de B12 depois da fermentação em CDM, para L. reuteri tipo selvagem, controlo e produtor em excesso de folato. As barras brancas indicam os pools de folato, as barras pretas mostram os níveis de B12. A figura 2 mostra os pools da produção de folato e da produção de B12 depois da fermentação no pepino e melão, para L. plantarum, L. reuteri tipo selvagem, controlo e produtor em excesso de folato. As barras brancas indicam pools de folato, as barras pretas mostram os níveis de B12. 3.3 Conclusão 34/38 A bactéria L. reuteri foi capaz de produzir o rácio entre folato e B12 num rácio 1:1 em CDM, para a estirpe do tipo selvagem e de controlo. A expressão em excesso de folato resultou num rácio entre folato e B12 de 100 para 1. A fermentação do sumo de melão é uma boa maneira de aumentar o teor de folato, de modo a que um rácio mais favorável entre folato e B12 possa ser obtido. Para a estirpe tipo selvagem e de controlo um rácio entre folato e B12 de 10:1 foi encontrado, na estirpe produtora em excesso de folato esta foi 250:1.
Exemplo 4
Tendo como base os três exemplos anteriores, foi feito um produto alimentar com propriedades benéficas. O produto alimentar é um sumo de frutas fermentado que produz folato e B12 em rácios adequados. Além disso, os Lactobacilli com propriedades probióticas para fermentar o sumo de melão e aumentar o teor de folato.
Lisboa, 30 de Janeiro de 2012 35/38
REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.
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DE VALDEZ; F. cobalamin. J 38/38
Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um método para aumentar os níveis de folato totais produzidos por uma espécie de Lactobacillus produtor de folato durante a fermentação que compreende as fases seguintes: a) prover um extracto de uma fruta de melão de uma espécie de Cucumis melo; b) usar todo ou parte do extracto de fruta de melão para preparar um meio de fermentação; c) inocular o dito meio de fermentação com uma ou mais estirpes de Lactobacillus produtor de folato; d) permitir que a fermentação se dê; e opcionalmente e) usar todo ou parte do meio fermentado para a preparação de um alimento, comida para animais ou suplemento alimentar.
- 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita estirpe de Lactobacillus ser uma estirpe do tipo selvagem, estirpe mutante ou estirpe recombinante.
- 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a dita estirpe de Lactobacillus ser uma estirpe probiótica.
- 4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a dita estirpe de Lactobacillus pertencer às espécies de L. reuteri ou L. plantarum.
- 5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por este compreender ainda a fase de adicionar o ácido para-aminobenzóico (p-ABA) ao meio de fermentação durante as fases b), c) e/ou d). 1/2
- 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o dito extracto de fruta de melão ser sumo de melão.
- 7. Um meio de fermentação de Lactobacillus que compreende ou que consiste em extracto de fruta de melão de uma fruta das espécies Cucumis melo e que compreende ainda p-ABA, onde o dito meio de fermentação não compreende extractos de frutas de outra espécie vegetal.
- 8. 0 meio de fermentação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o dito extracto de fruta de melão ser sumo de melão e pelo menos 50% do meio consistir no dito sumo de melão.
- 9. Um caldo de fermentação obtido do método de acordo com as reivindicações de 1 a 6.
- 10. Uma composição de alimento, comida para animais ou de suplemento que compreende ou que consiste no caldo de fermentação de acordo com a reivindicação 9.
- 11. A composição de alimento, comida para animais ou de suplemento de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por esta ser seleccionada de uma bebida de fruta, uma barra de chocolate, uma bebida de iogurte, um produto lácteo fermentado, um substituto alimentar, gelado, queijo e um batido.
- 12. Uso de um caldo de fermentação de acordo com a reivindicação 9 para a preparação de uma composição de alimento, comida para animais ou de suplemento que compreende folato e opcionalmente vitamina B 12.
- 13. O uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o dito extracto de fruta de melão ser sumo de melão. Lisboa, 30 de Janeiro de 2012 2/2
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