CN101939441B - 增加乳杆菌发酵瓜类汁液中的叶酸盐产生水平 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含高水平叶酸盐的食品、饲料和食品添加物领域，在此所述叶酸盐由乳杆菌属菌株在瓜类果实提取物上发酵产生。还提供了用于增加乳杆菌属菌株的叶酸盐生产的方法。

Description

增加乳杆菌发酵瓜类汁液中的叶酸盐产生水平
技术领域
本发明涉及微生物学领域以及利用微生物发酵瓜类汁液来生产食品、饲料和食品添加物的领域。本发明提供了通过发酵瓜类汁液生产高水平叶酸盐的方法，以及包含从这类发酵方法得到的发酵瓜类汁液和/或叶酸盐（维生素B9/B11）或者由其组成的食品、饲料和食品添加物。同时，本文提供了瓜类汁液（或者其部分和/或其稀释物和/或其浓缩物）作为产叶酸盐细菌的发酵培养基或发酵添加物的用途。另一个实施方案是使用对氨基苯甲酸或对氨基苯甲酸盐（p-ABA）（与瓜类汁液结合）来增加微生物发酵中的叶酸盐生产。
一般性定义
“乳酸菌”（LAB）是指产生作为发酵终产物的乳酸或另一有机酸（例如丙酸）的细菌，例如但不限于以下各属的细菌：乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、酒球菌属（Oenococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、片球菌属（Pediococcus）、肉杆菌属（Carnobacterium）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、肠球菌属（Enterococcus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）。
“食品级”是可被人或动物安全摄入（例如经口）的组分。
“益生菌”或“益生菌株”是指这样的菌株，即这些菌株在被受试者摄入时对宿主具有有益效应，并且一般被认为对人是安全的（GRAS）。
“食品级”是指被相关管理机构（例如美国食品和药品管理局（FDA））认为可安全用于对人和/或动物食用。
“益生乳酸菌”因此是那些还具有益生性质的LAB菌株，即它们是益生菌株。
“非gmo菌株”是指未经人为干涉进行遗传修饰的菌株，即它们不包含导入至细胞或基因组中的同源或异源的核酸序列。例如，嵌合基因（包含可操作地连接的核酸序列，例如启动子、编码序列和终止子）或载体尚未被导入所述细菌。
“Gmo菌株”或“重组体菌株”在本文中是经人为干涉进行遗传修饰的菌株，例如通过将同源或异源基因（例如嵌合基因）导入至基因组。
“非突变体菌株”在本文中是指野生型菌株，即未被人以诱变剂处理的菌株。“野生型”菌株是存在于自然界的菌株或初始从自然界分离并且在遗传上与野生菌株基本相同的菌株。
“瓜类提取物”在本文中是指来自以下各植物种的瓜类果实提取物：甜瓜（Cucumis melo）例如（网纹甜瓜（C.melo var.reticulans），加利亚甜瓜（Galia melon））、香瓜（Muskmelon）、哈密瓜（Cantaloupe）、哈密瓜（Hami melon）、蜜瓜（Honeydew melon）（冬甜瓜（Cucumis melovar.inodorus））、Piel de Sapo和糖甜瓜（Sugar melon）、马泡瓜（Cucumismelo subsp.agrestis）；厚皮甜瓜（Cucumis melo subsp.melo.）；硬皮甜瓜（Cucumis melo var.cantalupensis）；越瓜（Cucumis melo var.conomon）等。
“瓜类汁液”是指在瓜类提取物流体化后得到的非固相（液相）。
“叶酸盐”和“叶酸”[N-[4-{[2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6-蝶啶)甲基]氨基}苯甲酰基]-L-谷氨酸]在本文中可替换使用，是指叶酸和叶酸的衍生物，例如氧化状态、单碳置换或谷氨酸残基的数量的差异。其他的名称有维生素B9、维生素B10、维生素B11、维生素B9/B11或维生素M。衍生物的实例有四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸等。本文涵盖例如多谷氨酰叶酸盐和/或更短的水解产物，例如二谷氨酰叶酸盐、三谷氨酰叶酸盐和/或单谷氨酰叶酸盐。
“p-ABA”是指对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸盐或4-氨基苯甲酸，是叶酸盐生物合成途径中的叶酸构建材料。GTP、p-ABA和谷氨酸盐形成叶酸盐的前体。
“发酵物”或“发酵培养物”是指用于细菌生长的生长培养物，所述细菌可将糖转换成醇和/或酸，这通常（但不必须）在无氧条件下。
“发酵培养基”是指用于建立所述发酵培养物的生长培养基，而“发酵液”通常用于指所述发酵的培养基（即发酵过程中和/或之后）。然而，此两术语在本文中可互换使用，其意义可根据上下文是显而易见的。
“食品”或“食物产品”是指适合于人和/或动物食用的液体、半固体和/或固体食品（营养组合物）。
“食品添加物”是指在正常日常食物摄入外，人所摄入的组合物。通常，食品添加物为片剂、粉剂、囊剂、丸剂等形式。
“食物产品成分”或“食品添加物成分”是指适合于加入至最终食物产品或食品添加物的产品，或者适合在食物产品或食品添加物的生产过程中加入的产品。
术语“包括”可解释为：指出所陈述部分、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个另外的部分、步骤或组分的存在。
另外，通过不定冠词“一个”或“一种”提及某一要素时，不排除存在多于一个/种该要素的可能性，除非上下文中明确地要求有且仅有一个/种该要素。不定冠词“一个”或“一种”因此通常是指“至少一个/种”。
“生长期”是指通常已知的微生物（例如分批发酵培养物形式）的生长期，例如延滞期、对数生长期和随后的稳定期，接下来是死亡期。
“序列同一性百分数（%）”是指两序列之间相同核苷酸或氨基酸的百分数，可使用例如成对局部比对工具确定，例如EmbossWIN（版本2.10.0）的使用缺省参数的程序“water”（空位开放罚分10.0和空位扩展罚分0.5，对于蛋白使用Blossum62，对于核酸使用DNAFULL矩阵），或者Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA92121-3752USA的GCG Wisconsin软件包的“Bestfit”（使用缺省参数）。或者，还可以用使用缺省设置的BLAST分析，例如NCIMB（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）的蛋白Blast（proteinBlast），空位形成罚分为11且空位扩展罚分为1。
背景技术
叶酸盐对于人和动物的日常饮食是必需的，缺乏会导致一系列疾病和障碍，例如新生儿的神经管缺陷。许多植物、真菌和细菌均合成叶酸盐，它们包括乳酸菌（LAB），从而叶酸盐浓度在发酵乳制品中高于在非发酵乳制品中。乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）IL1403的注释基因组序列示出了叶酸盐生物合成簇的基因。来自其他基因簇的叶酸盐基因也已经被鉴定（例如乳酸乳球菌MG1363的叶酸盐基因），并且被用于对叶酸盐产生增加的细菌进行遗传改造，例如通过过表达folKE基因（Sybesma et al.,2003,Applied and Environm.Microb.Vol.69(6),pp3069-3076）。folKE的受控过表达导致总叶酸盐产量增加3倍，以及细胞外叶酸盐产量增加10倍。
不是所有LAB都能产生叶酸盐。例如，Sybesma等人（2003,Appliedand Environm.Microbiology Vol.69(8)pp4542-4548）发现，虽然乳酸乳球菌、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和明串珠菌属（Leuconostoc）菌种能够产生叶酸盐，但除了植物乳杆菌（L.plantarum）外，测试的大多数乳杆菌属菌种不能产生。总（细胞内和细胞外）去轭合的叶酸盐水平变化很大，菌株乳酸乳球菌乳酸亚种NZ9010（有氧培养于M17培养基上；菌株是乳酸脱氢酶缺陷的）的最大水平为291μg/L，而植物乳杆菌WCFS1例如在MRS培养基上仅产生45μg/L。分泌至培养基中的比例也是不同的。
Sybesma等人（见上文）还研究了培养条件例如pH、p-ABA和氯高铁血红素对叶酸盐在两常用LAB——乳酸乳球菌MG1363和嗜热链球菌NIZO菌株B119——中的产量和分布的影响。培养基包括M17培养基、化学成分确定的培养基（CDM）和MRS培养基。在连续培养中，pH从5.5增加至7.5导致这两种菌株中叶酸盐产量增加2-3倍，培养于M17培养基上的嗜热链球菌的叶酸盐产量达到534μg/L，培养于CDM上的乳酸乳球菌的叶酸盐产量达到107μg/L。对于乳酸乳球菌，加入浓度范围为1-100μM的p-ABA也增加了叶酸盐的产量，但量高于100μM的p-ABA无效应。有意思的是，加入生长抑制物质也导致了叶酸盐的增加。
如已提及的，乳杆菌属菌种不产生或产生很低水平的叶酸盐。乳杆菌属菌种在发酵制品的生产中是重要的，非常需要这些菌种的叶酸盐产量增加。例如，乳杆菌属菌种在工业上被用于生产酸奶、奶酪、酸菜（sauerkraut）、泡菜及其他发酵食品，以及动物饲料如青贮饲料。另外，使用天然（食品级）而非合成的发酵培养基的优势在于，天然培养基同样可用作例如食品、饲料或食品添加物的生产，避免了从培养物中纯化叶酸盐的需求。这些目标通过本发明得到满足。
WO02/097063描述了重组体微生物（遗传修饰的细菌）的可生物利用叶酸的生产。所述重组体细菌培养于合成培养基上。
WO2006/013588描述了产生叶酸的益生双歧杆菌属菌株及它们的用途。这些菌株可以与其他益生LAB一块用于制剂中。
WO2006/093408涉及对甲氨蝶呤有抗性并过量产生叶酸盐的突变细菌。通过使用甲氨蝶呤作为选择剂鉴定该细菌。这未表明，天然发酵培养基可增加叶酸盐的产量。
具体实施方式
本发明生产叶酸盐的方法
本发明提供了用于增加产生叶酸盐的乳杆菌属菌种所产生的叶酸盐水平的方法。本发明人发现，当瓜类提取物和/或瓜类汁液或者其部分被用于或被加入发酵培养基时，在乳杆菌属菌种发酵过程中产生的总叶酸盐水平和/或叶酸盐:维生素B12比例显著增加。另外，食品例如包含果实或源自果实的食品通常通过发酵进行保存，因此，本发明提供了一种用于食品保存（即用于减少食品的易腐烂性）的方法，藉此，所形成的产品具有以下额外优点：增加的叶酸盐水平和/或增加的叶酸盐与维生素B12的比例。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于由乳杆菌属菌种产生叶酸盐、增加由该菌种产生的总叶酸盐水平和/或由该菌种产生的增加叶酸盐:维生素B12比例的方法，包括如下步骤：
(a)提供来自甜瓜种的瓜类果实的提取物；
(b)使用所述瓜类果实提取物的全部或部分来制备发酵培养基；
(c)以一种或多种乳杆菌属菌株接种所述发酵培养基；
(d)使发酵发生；以及任选地
(e)将所述发酵培养基的全部或部分用于制备具有高叶酸盐水平和/或高叶酸盐:维生素B12比例的食品、饲料或食品添加物产品。
在步骤(a)中，甜瓜种的果实可用于制备提取物。在一个优选的实施方案中，所使用的果实包括加利亚瓜或由加利亚瓜组成。提取物制备自一种或多种果实的部分或全部。可以使用来自甜瓜的不同种、亚种或变种的果实（或果实部分）的混合物。然而，优选无其他水果种的果实用于制备所述提取物和/或所述发酵培养基。所使用的果实和/或果实部分可以来自所述果实的任何果实成熟/发育阶段，例如来自成熟果实或者来自较早的果实成熟/发育阶段，以及/或者它们的混合物。优选将果实种子从果实除去，使得提取物不含种子。
提取物优选为液体提取物，即果实汁液。果实汁液可以通过如下方法容易地制备：使用已知方法（挤压、切开、捣碎、拌和、掺和、加热等）将果实组织流体化，并任选通过例如过滤、离心或现有技术已知的其他方法除去所述固体果实组分的全部或部分。优选除去所述固体植物组分的至少70%、80%、90%，或甚至更优选除去99%或100%。所述提取物还优选（但不必须）例如通过过滤或加热灭菌，以除去或杀死存在的微生物（例如不需要的细菌或真菌）。
在步骤(b)中，所述瓜类果实提取物的全部或部分用于制备发酵培养基。换句话说，所述发酵培养基优选包含瓜类果实提取物或者由瓜类果实提取物组成。所述终发酵培养基最优选包含至少50%（体积/体积），更优选至少60%、70%、80%、90%或更多（例如95%、99%或100%）的直接获自瓜类果实的瓜类果实提取物，例如瓜类汁液。所述瓜类果实提取物可使用例如一种或多种食品级缓冲液例如磷酸盐缓冲液稀释，并任选将pH调整至特定pH，例如约pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5或这些值之间的任意pH。在一个实施方案中，所述发酵培养基不包含源自非甜瓜的植物种的果实提取物（例如汁液）。
在步骤(b)中，还可以混合数种瓜类果实提取物用于制备所述发酵培养基。因此，例如，来自一个甜瓜种的瓜类汁液可以与来自另一甜瓜种的瓜类汁液混合。这种混合物具有与来自不同甜瓜种的共提取物相同的效应。在一个优选的实施方案中，所述发酵培养基包含来自加利亚瓜的提取物或者由来自加利亚瓜的提取物组成。
所述瓜类提取物例如瓜类汁液不必在制备之后立即用于制备发酵培养物，而是可以先提取，然后作为提取物、浓缩物或稀释物（例如在无菌水或缓冲液中）冷冻备用。同样可使用冷冻干燥的瓜类提取物和/或瓜类汁液，例如原样或者在以水、缓冲液等重新配制后使用。
用于制备所述发酵培养基的所有组分优选为食品级。除瓜类果实提取物外，所述发酵培养基还可以包含缓冲剂、稀释剂（水、缓冲液）、另外的氨基酸（例如叶酸盐构建材料，如甲硫氨酸、丝氨酸、甘氨酸、胸腺嘧啶、肌苷、黄嘌呤、腺嘌呤和/或鸟嘌呤）、糖、调味剂、着色剂、核碱基、核苷、另外的碳源等。添加物的使用还取决于所述发酵培养基（或其部分）的进一步用途，并取决于所述发酵培养基是否被用作添加物来制造叶酸盐强化食品或饲料，它是否原样地例如以胶囊形式或粉末形式（作为食品添加物或饲料添加物）使用，或者所产生的叶酸盐是从所述发酵培养基中纯化出来还是与所述培养基的全部或部分一块使用。
在本发明的一个实施方案中，将p-ABA以这样的量加入所述发酵培养基，即与不加入另外的p-ABA的发酵相比，该量提高了叶酸盐产量。优选每升发酵培养基中以及/或者每升瓜类汁液和/或瓜类提取物中加入至少5mg p-ABA，更优选至少10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg/升。还可以加入更多的p-ABA，例如每升发酵培养基至少约150mg、200mg、500mg、1000mg或更多。p-ABA可以以不同的纯化级别购自Sigma Aldrich Inc.（St.Louis,MO,USA,参见例如货号A9878）。虽然不是所有乳杆菌属菌株都通过产生更多的叶酸盐来对p-ABA作出响应，但对于给定的菌株，本领域技术人员可以容易地确定加入p-ABA是否具有提高叶酸盐的效应。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌株例如菌株WCFS1就会对加入p-ABA作出积极响应。
以下也是本发明的一个实施方案：所述产叶酸盐菌株本身产生p-ABA（例如天然地或者在基因修饰后（参见例如Wegkamp et al.2007,Applied and Environmental Microbiology Vol.73,p2673-2681）），以及/或者将一种或多种产生p-ABA（天然地或者在修饰后）的另外菌株加入所述培养基。因此来自其他细菌的p-ABA基因簇（例如乳酸乳球菌的p-ABA生物合成基因簇）可被导入所述产叶酸盐的菌株和/或其他菌株并在其中过表达，所述菌株然后可以在步骤(c)中被共接种。
在步骤(c)中，将合适量的一种或多种乳杆菌属菌株用作所述发酵培养基的接种物。接种物的量可以不同，但通常可以将浓度约1×105-1×1010个细胞/ml（例如约1×108/ml）活的或能存活的细菌细胞的培养物以所述发酵培养基终体积的约1%或1%上下（例如0.8%体积、0.5%体积）加入至所述发酵培养基。
原则上，可以使用能够在根本上产生叶酸盐的任何乳杆菌属菌株（即其包含叶酸盐生物合成基因），包括天然/野生型菌株、重组体（gmo）菌株和突变体菌株。重组体菌株还可以是已经以一种或多种叶酸盐生物合成基因转化的菌株，这是因为在使用本发明的方法时这些菌株的叶酸盐产生水平也可以进一步增加。例如，可以将所述叶酸盐生物合成基因簇克隆并且/或者从一种菌株导入至另一种菌株。载体pNZ7026携带植物乳杆菌WCFS1的叶酸盐基因簇（参见实施例），因此可以通过例如电穿孔或结合（conjugation）将该基因簇导入至其他乳杆菌属菌株中，或者可将这些基因（folB、folK、folE、folC2、xtp2、folP）用于鉴定和分离其他乳杆菌属菌种或菌株的同源基因。
通过如下方式可以容易地测试菌株是否能够在根本上产生叶酸盐，例如，在合适的培养基上培养所述菌株，并且使用例如HPLC、LC-MS、微生物学测定等分析并/或定量叶酸盐是否在细胞内和/或细胞内产生。对所述发酵培养基的接种可以使用标准的微生物学方法进行，例如制备所述（一种或者多种）菌株的新鲜起始培养物和/或使用以前制备的接种物，如具有确定细菌细胞数量的冷冻细菌原种。包含所述叶酸盐生物合成基因簇或其直系同源物（例如与所述叶酸盐生物合成基因和/或蛋白在核酸和/或氨基酸水平有至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更高序列同一性的序列）的菌株，例如植物乳杆菌WCFS1菌株，可能能够产生叶酸盐。因此，遗传分析和/或生物信息学分析也可用于鉴定合适的菌株。
在一个优选的实施方案中，使用了天然/野生型（非gmo和非突变体）菌株，即分离自天然源的菌株及其非修饰的衍生菌株。这类菌株可在菌株保藏机构得到，或者可从天然的源分离。所使用的菌株优选地都是食品级的，即它们应具有（或者应能够获得）GRAS状态。同时，所述菌株优选为益生菌株。菌株实例包括属于以下种的乳杆菌属菌株：罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、干酪乳杆菌（L.casei）、副干酪乳杆菌（L.paracasei）、瑞士乳杆菌（L.helveticus）、德氏乳杆菌（L.delbrueckii）、短乳杆菌（L.brevis）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）、清酒乳杆菌（L.sakei）、詹氏乳杆菌（L.jensenii）、旧金山乳杆菌（L.sanfransiscensis）、食果糖乳杆菌（L.fructivorans）、开菲尔乳杆菌（L.kefiri）、弯曲乳杆菌（L.curvatus）、类植物乳杆菌（L.paraplantarum）、高加索酸奶粒乳杆菌（L.kefirgranum）、类高加索酸奶乳杆菌（L.parakefir）、发酵乳杆菌（L.fermentum）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、约氏乳杆菌（L.johnsonii）、加氏乳杆菌（L.gasseri）、木糖乳杆菌（L.xylosus）、唾液乳杆菌（L.salivarius）、小鼠乳杆菌（L.murinus）、小乳杆菌（L.minutis）、鸡乳杆菌（L.gallinarium）、食淀粉乳杆菌（L.amylovorus）等。有用的菌株有例如（但不限于）以下菌株：植物乳杆菌WCFS1、罗伊氏乳杆菌100-23、罗伊氏乳杆菌JCM1112、德氏乳杆菌保加利亚亚种（L.delbrueckii subsp.bulgaricus）ATCCBAA365、德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842和清酒乳杆菌清酒亚种（L.sake subsp.sakei）23K（已知具有叶酸盐基因簇的菌种，依据ERGOTM生物信息学数据库，参见Overbeek et al.,Nucleic Acids Res.2003Jan1;vol31(1):164-71）。
因此，在一个实施方案中，将一种或多种（优选）食品级的和/或益生的（乳杆菌属）LAB菌株和/或菌种用于所述方法中。
对于一些应用，例如对于面向例如素食主义者的食品或食品添加物的制备，还需要所述菌株不仅在发酵过程中产生叶酸盐，而且还产生维生素B12。因此，在本发明的一个实施方案中，所用的乳杆菌属菌株能够产生叶酸盐和维生素B12二者。所述菌株优选为益生菌株。能够实现这一点的乳杆菌属菌种的实例有罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），如罗伊氏乳杆菌JCM1112，但例如在梭菌属（Clostridium）、地芽孢杆菌属（Geobacillus）、李斯特氏菌属（Listeria）、丙酸杆菌属、梭杆菌属（Fusobacterium）、沙门氏菌属（Salmonella）等中还可发现更多的菌种和/或菌株。严格的素食者饮食的维生素B12经常较低，但所述饮食的叶酸盐相对丰富。这会导致这样的风险，即维生素B12缺乏被叶酸盐掩盖，因而需要叶酸盐和维生素B12都存在的产品。
实施例显示，植物乳杆菌菌株WCFS1（最初获自人唾液；NationalCollection of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen,U.K，登记号NCIMB8826）在瓜类汁液培养基上的叶酸盐产量（约58μg/L培养基）增加到在合成培养基（CDM）上产量（29μg/L培养基）的2-3倍。菌株罗伊氏乳杆菌JCM112（最初获自人肠；National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria,Aberdeen,U.K，登记号NCIMB11951）的叶酸盐产量增加到近乎10倍，从在CDM上的8-35μg/L增加至在瓜类汁液培养基上的310μg/L。根据本发明，这两株菌株用于叶酸盐产生及任选伴有维生素B12产生（例如由罗伊氏乳杆菌）的用途也是本文的实施方案。这两株菌株还可以在所描述的方法中用作对照。
当使用至少一种能够产生叶酸盐和维生素B12二者的菌株时，发酵液中叶酸盐:维生素B12的比例在发酵过程中和/或结束时（即在稳定期中）显著增加，从而使叶酸盐:维生素B12的比例偏离通常的1:1。所形成的叶酸盐:维生素B12比例优选为至少2:1、5:1、10:1、50:1、100:1、150:1、200:1、250:1或更大，或者它们之间的任一比例。参见例如实施例3和图2，显示了与其他培养基如CDM或黄瓜培养基相比，野生型菌株和过表达叶酸盐的重组体菌株在本发明的瓜类培养基上可产生显著增大的叶酸盐:维生素B12比例。
任选地，人们可以在发酵过程中替代地或者额外地使用不同的菌株（即菌株的混合物），藉此，至少一种菌株产生的叶酸盐量增加，且至少另一种菌株产生维生素B12。例如，古细菌不产生叶酸盐，但产生维生素B12。因此，产叶酸盐菌株与合适量的产维生素B12菌株的共接种也是本文的实施方案。本领域技术人员可容易地鉴定产维生素B12的菌株或其他微生物，例如古细菌、酵母或真菌。
可以使用标准的方法在发酵液中测量和/或定量维生素B12，例如所述用于叶酸盐定量的那些方法。
在瓜类提取物培养基上发酵得到的叶酸盐产率显著高于使用相同菌株在CDM（化学成分确定的培养基，如Teusink,B.,van Enckevort,F.H.,Francke,C.,Wiersma,A.,Wegkamp,A.,Smid,E.J.and Siezen,R.J.,2005,Appl Environ Microbiol71,7253-7262中所述）上发酵的叶酸盐产率。“显著高于”是指在发酵结束时（发酵液中）产生的总叶酸盐（胞内外叶酸盐之和，已就培养基中存在的背景叶酸盐对该和进行了校正）为在CDM上发酵的至少2×，优选至少约3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、16×或更高。背景叶酸盐水平优选地在未接种细菌、但在其他方面进行了同样处理的培养基中确定。例如，根据所使用的菌株或菌株的结合物，本文提供了这样的发酵液，即该发酵液包含（在本发明的发酵过程中和/或之后）的叶酸盐总量为至少约40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000μg或更高叶酸盐/升发酵液。甚至可以达到更高的水平，例如如果使用一种或多种gmo菌株（例如叶酸盐过量产生）并任选还加入p-ABA，那么根据本发明，叶酸盐可以以每升发酵液至少2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000μg叶酸盐或更多叶酸盐的量产生（参见实施例）。
可以使用已知的技术测量总叶酸盐含量，所述已知的技术例如由Horne和Patterson（1988,Clin Chem34:2357-2359）或者由Sybesma等人在2003年（Appl.Environm.Microbiol69:3069-3076）描述的微生物学测定。其他定量测定包括例如HPLC或LC-MS分析。叶酸盐优选在发酵结束时即在所述接种物菌株的稳定期测量。
每种乳杆菌属菌株的合适的接种物量可以不同，但通常将约1%体积的完全生长培养物（包含例如约1*108个细胞/ml）加入新鲜发酵培养基。为了产生接种物，可以使用标准的微生物学方法。
当使用2种或更多种乳杆菌属菌株的混合物时，可以调整接种物水平，但接种物（2种或更多种菌株的）总体积优选不超过终发酵培养基体积的1%。
任选地，其他食品级产叶酸盐细菌和/或其他食品级细菌（例如益生菌株）可以在发酵之前和/或期间和/或发酵后加入发酵培养基中，并且/或者加入包含瓜类提取物发酵培养基的制备食品、饲料或营养食品产品中（见后文）。然而，在一个实施方案中，所述发酵培养基优选不接种任何其他微生物，而只是接种所选的产叶酸盐（和/或维生素B12）的乳杆菌属菌株以及任选的一种或多种产维生素B12的微生物。因此，在一个实施方案中，所述培养基中不含非食品级微生物、病原性微生物、腐败微生物以及/或者任何其他非所需和/或非接种的菌种或菌株，如双歧杆菌、肠球菌、链球菌和/或乳球菌等。
步骤(d)的发酵可使用标准方法进行，如例如实施例中描述的方法。
在发酵进行合适的时长后，优选直至观察到光密度不再增加，所述发酵培养基（本文中也称为“发酵液”）（或其一部分）任选地进一步用于例如从中纯化叶酸盐以及/或者制备包含所述发酵培养基（或其部分）的产品或者由所述发酵培养基（或其一部分）组成的产品，所述发酵培养基（或其一部分）包含由所述乳杆菌属菌株产生的叶酸盐。
还可以使用发酵培养基的部分。例如，可以将细菌从培养基中除去（例如通过过滤或离心），并进一步使用所述无细菌的培养基。或者，含有细菌的发酵培养基可原样使用。在如下情形下是这是特别吸引人的：其中所使用的LAB为益生菌株，特别是自身能够产生叶酸盐和维生素B12二者的益生LAB菌株。另一选择是通过例如加热或超声处理杀死大多数或所有细菌或使其失活。
当制造包含根据本发明制备的发酵培养基（或其一部分）或者由其组成的食品、饲料产品或营养食品产品时，一个实施方案为将包含活细菌和/或可存活细菌的所述发酵液（或其一部分）加入所述产品或产品成分，例如在所述食品或饲料生产过程之始、之中和/或之后将其加入。
本发明的产品和组合物
还提供了包含根据以上方法制备的发酵液（或其一或多部分）或者由其组成的组合物和产品。
在一个实施方案中，所述发酵培养基（发酵液）原样使用，但任选可以在用于制备食品、饲料或食品添加物组合物之前进行浓缩、稀释或预处理。预处理包括过滤和/或离心、灭菌、冻干、冷冻等。原样的发酵培养基和/或经预处理的发酵培养基本质上是以上方法的原始产品。这些原始产品可以原样使用，或者可以用作食物产品和/或食品添加物成分，即合适量的原始产品可用作制造终食品或食品添加物产品时的成分。
例如，发酵液和/或经预处理的发酵液可用作制备叶酸盐加强的食品、饲料或食品添加物产品时的成分，例如液体食品（如饮料、汤、酸奶或基于酸奶的饮料、奶昔、软饮料、果实饮料、发酵的乳制品、膳食替代物、发酵的果实和/或汁液产品等）、固体食品/饲料（膳食、膳食替代物、点心如糖棒、动物饲料、发酵的乳制品、发酵的食品或饲料产品、冰冻产品、冷冻干燥的食品添加物、奶酪等）或半固体食品（甜点等）。所述发酵培养基和/或所述经预处理的发酵培养基可在这类产品的生产过程中直接地加入或者使用。
从上述发酵方法得到的发酵液可通过浓缩、稀释、过滤和/或冻干（冷冻干燥）进行预处理，然后用作产品或产品成分。可进行浓缩以及以水、缓冲液或其他食品级液体（例如汁液、乳等）进行稀释，以在所述终食品、饲料或食品添加物产品中达到合适的叶酸盐水平。过滤可用于从所述发酵液中除去细菌。在本发明的一个实施方案中，将所述发酵液（或者其浓缩物、稀释物和/或滤液）冷冻干燥，以制备叶酸盐加强的粉末。然后，将这类粉末用于制备固体形式、液体形式或半固体形式的食品、饲料或食品添加物。可以将添加物配制为饮料、片剂、胶囊、凝胶、粉剂、丸剂等，由此所述添加物包含合适量的原始产品，并从而也包含合适量的叶酸盐。
虽然可以预处理所述发酵液，以除去所述细菌和/或使其失活，但在本发明的一些实施方案中优选不除去所述细菌和/或不使其失活，特别是对于所述细菌具有益生性质的情况。因此，本发明的组合物优选包含活和/或可存活的（例如冷冻干燥的）细菌。
本发明的食品、饲料或食品添加物组合包含合适量的原始产品（发酵液，例如原样的或经预处理的发酵液）或者由其组成。在制备所述组合物中使用的原始产品的量是变化的，取决于所述发酵液中的叶酸盐浓度以及需要在所制备组合物中存在的量。所述产品优选包含这样的叶酸盐量，即该量相当于推荐的叶酸盐每日量的至少约20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，更优选100%、150%、200%、300%或更多。例如，用于孕妇或计划怀孕的女性的组合物可包含例如这样的发酵液量，即该量可提供例如约400μg叶酸盐/天或600μg叶酸盐/天（推荐的日摄食量的200%或300%），而用于未怀孕受试者的组合物可包含约200μg叶酸盐/天（推荐的日摄食量的100%）。应注意，推荐的摄食水平在国家之间有不同，在欧洲，对未怀孕个体和怀孕个体分别为每日200至400μg叶酸盐，而在美国这些水平更高，对未怀孕个体和怀孕个体分别推荐400和600μg叶酸盐。因此，所述组合物例如可包含约20μg-600μg叶酸盐或更高的日剂量。如所述，RDA对于不同国家可能不同，因此在面向不同市场而制造的产品中可以存在实际不同量的叶酸盐。
在一个实施方案中，所述组合物还包含维生素B12，优选RDA的维生素B12。优选地，维生素B12和叶酸盐在本发明的方法中由同一微生物（即由单菌株，例如罗伊氏乳杆菌）产生，或者至少它们在同一发酵过程中（即由加入至所述发酵培养基中的相同菌株或不同菌株）产生。
在制备包含可根据上述方法获得的原始成分或者由其组成的食品、饲料或食品添加物时，很显然，可以依照标准的食品/饲料/食品添加物的生产和配制方法。例如，在产生过程中可加入其他组分，例如蛋白、碳水化合物、脂肪、矿物质（铁、钙、铜、镁、硒、锌等）、益生元、其他维生素（维生素B1、B2、B3、B5、B6、B12、C、D、E、β-胡萝卜素、生物素等）、结合剂、润湿剂、着色剂、调味剂、稳定剂、乳化剂等。如果在所述发酵液中已存在所需量的维生素B12（例如对于人RDA为约1μg），那么可不需要另外加入。另外，其他生物活性成分可加入并且可包括在终产品中，例如益生菌、药物等。
叶酸盐和/或维生素B12的每日量当然可一次性给予，或者可以分成每天2、3或更多个剂量。因此，所述组合物还可以包含适合每天单次给药或每日数次给药的发酵液，或者由其组成。
对于一些受试者，每日摄入不是必需的，提供叶酸盐的产品可以仅数日食用一次或每周食用一次，或者以更低的频率食用。例如，叶酸盐加强的食品或饲料产品（例如发酵的食品或饲料产品）无需每日服用，但似乎是服用过多的叶酸盐优于服用太少的叶酸盐，这是因为缺乏比过量更严重。因此，在本文中日摄入（每天一次或多次）是一个优选的实施方案。
本发明的产品优选被人和/或动物口服摄入，所述动物例如宠物（狗、猫等）或农场动物（牛、马、猪、鸡、羊等）或任何其他动物（野生动物，例如动物园中的动物等）。所述产品尤其适合于需要对叶酸盐摄入作出更多调控的受试者，或者需要增加叶酸盐摄入的受试者，例如运动员、孕妇、叶酸盐缺乏受试者等。
例如，优选的产品包括基于瓜类汁液的饮料或基于瓜类压榨物的饮料，所述饮料含高水平的叶酸盐，并优选还含有高水平的维生素B12，并且优选具有长的运输和储存保存期，尤其是在较不发达的国家，在这些国家可（治疗性地或预防性地）面向维生素缺乏者。
本发明的发酵培养基和发酵液
原样的所述发酵培养基和/或发酵液也是本文的实施方案。因此，在一个实施方案中提供了乳杆菌属发酵培养基，其包含上述的瓜类果实提取物或者由其组成。在又一实施方案中提供了如所述的发酵液（原样的和/或经预处理的），所述发酵液可用于制造叶酸盐加强的食品、饲料或食品添加物。该原始产品还可以储存更长时间例如冰冻或冷冻干燥，然后将其用作生产终产品的成分。
本发明的用途
在又一实施方案中提供了瓜类果实提取物用于制备发酵培养基（如上述）的用途。
另外，在本文中提供了可从所述发酵培养基（包含瓜类果实提取物或者由其组成）的乳杆菌属发酵得到的发酵液用于制备食品、饲料或食品添加物产品的用途。
下述的非限制性实例描述了本发明。除非另外声明，否则实施本发明将采用分子生物学、药理学、微生物学或生物化学的标准常规方法。这类技术记载于Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY，in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994)Current Protocolsin Molecular Biology，Current Protocols,USA and Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company，Philadelphia,Pa.,17th ed.(1985),Microbiology:A Laboratory Manual(6th Edition)byJames Cappuccino,Laboratory Methods in Food Microbiology(3rdedition)by W.Harrigan(Author)Academic Press，所有这些通过引证的方式纳入本文。
实施例
1.在80%瓜类汁液上发酵与在CDM上发酵对比
在该实施例中确定了瓜类汁液发酵产生的叶酸盐生产量汇总（pool）是否高于CDM。
1.1材料和方法
1.1.1菌株和接种物制备
使用了如下的菌株：
罗伊氏乳杆菌JCM1112和植物乳杆菌WCFS1。对于这两种菌株，都将1%的接种物用于接种所述改良的培养基。人分离株罗伊氏乳杆菌JCM1112T获自日本微生物菌种保藏中心（Japanese Collection ofMicroorganisms）（RIKEN BioResource Center，2-1 Hirosawa,Wako,Saitama351-0198,Japan）。人分离株植物乳杆菌WCFS1获自NIZO食品研究培养物中心（Ede,The Netherlands）。
1.1.2过量产生叶酸盐的菌株的构建
使用公认的步骤分离植物乳杆菌WCFS1的基因组DNA（Ferain,T.,Garmyn,D.,Bernard,N.,Hols,P.and Delcour，J.(1994)Lactobacillusplantarum ldhL gene:overexpression and deletion.J Bacteriol176,596-601）。按如下方式进行PCR：94℃下变性30秒、45℃下引物退火30秒，68℃下每千碱基延伸1分钟，将该特定顺序重复30个循环。将Pfx聚合酶（Invitrogen,Breda,The Netherlands）用于扩增。使用T4DNA连接酶（Invitrogen）通过在16℃下孵育过夜进行DNA连接，以1:5的质粒:插入物比例混合DNA片段。通过PCR使用folBKpnF（正向引物，GAAAGAGGCTGGGTACCATTATGGGCATGATTC）和folPXbaR（反向引物，CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG）扩增叶酸盐基因簇。改变所述folBKpnF和folPXbaR引物的序列，以分别引入KpnI和XbaI限制性位点（改变的碱基以下划线标出）。从folB上游18个碱基对至folP下游52个碱基扩增叶酸盐基因簇。以KpnI（Invitrogen）和XbaI（Invitrogen）部分地消化扩增DNA的线性片段。部分消化是必要的，这是因为folP包含另外的XbaI限制位点。消化的叶酸盐基因簇包含全长的叶酸盐基因簇。也以XbaI和KpnI消化质粒pNZ7021（Wegkamp,A.,van Oorschot,W.,de Vos,W.M.and Smid,E.J.(2007)Characterization ofthe Role of para-Aminobenzoic Acid Biosynthesis in Folate Production byLactococcus lactis.Appl Environ Microbiol73,2673-2681）。将两个经消化的DNA片段以1:5（质粒:插入物）的比例混合，并以T4DNA连接酶连接。使用电穿孔通过公认的步骤（de Vos,W.M.,Vos,P.,de Haard,H.andBoerrigter，I.(1989)Cloning and expression of the Lactococcus lactissubsp.cremoris SK11 gene encoding an extracellular serine proteinase.Gene85,169-176）将所连接的DNA转染至NZ9000ΔylgG乳酸乳球菌菌株的感受态细胞（Klaus et al.2005）。随后，将所述转化的乳酸乳球菌菌株在含10mg/L CM的M17板上培养40小时。通过PCR使用folPF（正向引物，CATGGCATCGATATTGAACGAATTG）和nisRKR（反向引物，GTTCTATCGAAAGCGAAATC）检查氯霉素抗性的菌落中所述质粒的存在情况。挑出阳性转化体并接种于含10mg/L CM的M17肉汤上。从完全生长的过夜培养物分离总质粒成分，并使用Jetstar柱（GenomedGmbH,Bad Oeynhausen,Germany）分离质粒。如下文所述，通过限制性分析并随后使用标准步骤测序检查所述质粒。将所形成的质粒命名为pNZ7026。接下来，将质粒pNZ7021和pNZ7026通过别处所述的电穿孔（Walter，J.,N.C.Heng,W.P.Hammes,D.M.Loach,G.W.Tannock,and C.Hertel.2003.Identification of Lactobacillus reuteri genesspecifically induced in the mouse gastrointestinal tract.Appl EnvironMicrobiol69:2044-51）转染至罗伊氏乳杆菌的感受态细胞。将转化体在含10mg/L CM的MRS板上培养40小时，并通过PCR分析CM抗性细胞中合适质粒的存在情况。对于含pNZ7026的植物乳杆菌，将引物folpF和nisRKR用作探针。将引物CmdownF（正向引物）和nisRKR用于监测宿主菌株中pNZ7021的存在情况。
1.1.3发酵培养基和CDM的制备
如Teusink,B.,van Enckevort,F.H.,Francke,C.,Wiersma,A.,Wegkamp,A.,Smid,E.J.and Siezen,R.J.,2005,Appl Environ Microbiol71,7253-7262中所述制备化学成分确定的培养基。如下文所述制备瓜类汁液。在剥皮和去籽后从网纹甜瓜（Cucumis melo var.reticulatus）制备瓜类培养基。使用厨房捣碎器使所述瓜类流体化，并将所产生的糊状物挤压通过棉布。在室温下，使用Sorvall离心机（Newton,CT，USA）将流过物以10.000RPM离心两次，每次10分钟。将上清液于-20℃下保存至进一步使用。在接种前，将所述瓜类培养基用0.5M磷酸钾缓冲液（pH5.8）以4:1（v/v）比例稀释。将终pH调节至6.0，并迫使所述瓜类培养基通过0.22μm滤器以确保无菌。在提及时，两种果实培养基都添加有终浓度为10mg/L的p-ABA。
1.1.4发酵
以野生型罗伊氏乳杆菌、对照罗伊氏乳杆菌（pNZ7021；空载体）和过量产生叶酸盐的罗伊氏乳杆菌（pNZ7026；过表达叶酸盐基因簇的质粒）接种瓜类培养基和黄瓜培养基。对于植物乳杆菌WCFS1，接种所述野生型。将接种的培养基在37℃下培养40小时。
1.1.5叶酸盐测量
使用Horne and Patterson（1988,Clin Chem34:2357-2359）或Sybesma et al.2003（Appl.Environm.Microbiol69:3069-3076）描述的微生物学测定法测量总叶酸盐含量。在生长大约40小时后，从稳定期的培养物取所述叶酸盐样品。另外，从同样处理但未接种的样品确定这些维生素的背景水平。
1.2结果
对CDM和80%瓜类汁液上的罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌确定叶酸盐产生水平。
罗伊氏乳杆菌JCM1112的结果显示于表1和2，植物乳杆菌WCFS1的结果显示于表3。
表1—罗伊氏乳杆菌菌株JCM1112在80%瓜类汁液培养基上的发酵
Figure GDA00002829940100171
Figure GDA00002829940100181
n.d.=未确定
a，空载体
b，过量产叶酸盐的质粒
c，过量产叶酸盐的质粒，包含另外的10mg/L p-ABA
d，瓜类汁液
*，增加倍数是基于总叶酸盐产量汇总来计算。
表2—罗伊氏乳杆菌菌株JCM1112在含p-ABA的CDM培养基上的发酵
Figure GDA00002829940100182
a，空载体
b，过量产叶酸盐的质粒
表3—植物乳杆菌WCFS1在80%瓜类汁液培养基上的发酵
Figure GDA00002829940100183
a，瓜类汁液
*，增加倍数是基于总叶酸盐产量汇总来计算。
表4—植物乳杆菌菌株WCFS1在含p-ABA的CDM培养基上的发酵
Figure GDA00002829940100191
1.3结论
这些结果表明，与CDM相比，当使用瓜类汁液作为发酵培养基时，野生型和重组体乳杆菌属菌株的叶酸盐生产都会显著增强。
实施例2
在该实施例中，研究了将上述结果扩展至黄瓜属（Cucumis）的其他代表性果实的可能性。使用黄瓜（Cucumis sativus）汁液对相同实验进行测试。
2.1.1菌株和接种物制备
使用如下的菌株：罗伊氏乳杆菌JCM1112。将1%接种物用于接种改良的培养基。
2.1.2发酵培养基和CDM的制备
如Teusink,B.,van Enckevort,F.H.,Francke,C.,Wiersma,A.,Wegkamp,A.,Smid,E.J.and Siezen,R.J.,2005,Appl Environ Microbiol71,7253-7262所述制备化学成分确定的培养基。黄瓜汁液制备如下。通过使用厨房捣碎器（Moulinex,Masterchef370,France）使完整黄瓜（Cucumis sativus）流体化制备黄瓜汁培养基。将所产生的糊状物挤压通过棉布，并将流过物以纤维素滤器（0.15mm）过滤，然后在4°C下使用装有GSA600转头的Sorvall离心机（Newton,CT，USA）将流过物以10.000RPM两次，每次离心10分钟。将上清液于-20℃下保存至进一步使用。在接种前，将所述黄瓜汁液稀释于1体积的0.2M磷酸钾缓冲液（pH5.8）中。将终pH调节至6.0，并迫使所述黄瓜培养基通过0.22μm滤器以确保无菌。在提及时，两种果实培养基都添加有终浓度10mg/L的p-ABA。
2.1.3发酵
以对照罗伊氏乳杆菌（pNZ7021；空载体）和过量产生叶酸盐的罗伊氏乳杆菌（pNZ7026；过量表达叶酸盐基因簇的质粒）接种黄瓜培养物和CDM培养基。将接种的培养基在37℃下培养40小时。
2.1.4叶酸盐测量
使用Horne and Patterson（1988,Clin Chem34:2357-2359）或Sybesma et al.2003（Appl.Environm.Microbiol69:3069-3076）描述的微生物学测定法测量总叶酸盐含量。在生长大约40小时后，从稳定期的培养物取所述叶酸盐样品。
2.2结果
罗伊氏乳杆菌JCM1112的叶酸盐生产量汇总显示于表1和2。
表1—罗伊氏乳杆菌菌株JCM1112在80%黄瓜汁培养基上的发酵
Figure GDA00002829940100201
n.d.=未确定
a，空载体
b，过量产叶酸盐的质粒
c，过量产叶酸盐的质粒，包含另外的10mg/L p-ABA
d，瓜类汁液
*，增加倍数是基于总叶酸盐产量汇总来计算。
表2—罗伊氏乳杆菌菌株JCM1112在含p-ABA的CDM培养基上的发酵
Figure GDA00002829940100202
a，空载体
b，过量产叶酸盐的质粒
2.3结论
这些结果表明，与CDM相比，当使用黄瓜汁液作为发酵培养基时，重组体罗伊氏乳杆菌属菌株的叶酸盐产生不会增强。这些实验清楚地表明，产生高叶酸盐汇总的能力依赖于用作发酵液的汁液的类型。
实施例3—叶酸盐:维生素B12的比例增大的发酵液
在将罗伊氏乳杆菌在CDM和瓜类汁液上发酵后，确定叶酸盐和B12产量的比例。如上文所述进行实验，但另外取样品进行B12分析。
3.1材料和方法
3.1.1菌株和接种物制备
使用了以下菌株：罗伊氏乳杆菌JCM1112和植物乳杆菌WCFS1。对于这两种菌株，将1%接种物用于接种改良的培养基。
3.1.2发酵
以野生型罗伊氏乳杆菌、对照罗伊氏乳杆菌（pNZ7021；空载体）和过量产生叶酸盐的罗伊氏乳杆菌（pNZ7026；过量表达叶酸盐基因簇的质粒）接种瓜类培养基和CDM培养基。将接种的培养基在37℃下培养40小时。
3.1.3B12测量
依照AOAC国际的官方分析方法（Official Methods of Analysis ofAOAC International）使用德氏乳杆菌乳酸亚种（L.delbrueckii subsp.lactis）ATCC7830维生素B12测定法（Horowitz,W.(ed.).2006.Officialmethods of analysis of AOAC International,18th ed.AOAC International,Gaithersburg,Md.）确定维生素B12含量。如以前的描述（Taranto,M.P.,J.L.Vera,J.Hugenholtz,G.F.De Valdez,and F.Sesma.2003.Lactobacillus reuteri CRL1098 produces cobalamin.J Bacteriol185:5643-7.）制备用于B12分析的稳定期培养物的细胞提取物。
3.1.4叶酸盐测量
使用Horne and Patterson（1988,Clin Chem34:2357-2359）或Sybesma et al.2003（Appl.Environm.Microbiol69:3069-3076）描述的微生物学测定法测量总叶酸盐含量。在生长大约40小时后，从稳定期的培养物取所述叶酸盐样品。
3.2结果
结果显示于图1和2
图1显示野生型罗伊氏乳杆菌、对照罗伊氏乳杆菌和过量产生叶酸盐的罗伊氏乳杆菌在CDM上发酵后的叶酸盐生产汇总和B12生产汇总。白色柱表示叶酸盐汇总，黑色柱显示B12水平。
图2显示植物乳杆菌、野生型罗伊氏乳杆菌、对照罗伊氏乳杆菌和过量产生叶酸盐的罗伊氏乳杆菌在黄瓜和瓜类上发酵后的叶酸盐生产汇总和B12生产汇总。白色柱表示叶酸盐汇总，黑色柱显示B12水平。
3.3结论
细菌罗伊氏乳杆菌的野生型和对照菌株在CDM上能够产生1:1的叶酸盐与B12的比例。叶酸盐的过量表达使得出现100:1的叶酸盐:B12比例。瓜类汁液发酵是增加叶酸盐含量的好途径，从而可达到更有利的叶酸盐与B12的比例。对于野生型和对照菌株，出现10:1的叶酸盐与B12的比例，在叶酸盐过量表达的菌株中该比例为250:1。
实施例4
基于以上3个实施例，制备了具有有利性质的食物产品。所述食物产品为产生合适比例的叶酸盐和B12的发酵果实汁液。而且，具有益生性质的乳杆菌可发酵瓜类汁液并增加叶酸盐含量。

Claims (13)

1.一种用于增加乳杆菌属（Lactobacillus）菌种在发酵过程中产生的总叶酸盐水平的方法，包括如下步骤：
a)通过以下方式提供一种来自甜瓜（Cucumis melo）的瓜类果实的提取物：将果实组织流体化，并且任选地除去所述固体果实组分的全部或部分；
b)使用所述瓜类果实提取物的全部或部分来制备发酵培养基；
c)以一种或多种乳杆菌属菌株接种所述发酵培养基，所述乳酸杆菌属菌株包含叶酸盐生物合成基因以使得它们能够产生叶酸盐；并且
(d)使发酵发生。
2.权利要求1的方法，其中所述乳杆菌属菌株为野生型菌株、突变体菌株或重组体菌株。
3.权利要求1的方法，其中所述乳杆菌属菌株为益生菌株。
4.权利要求1的方法，其中所述乳杆菌属菌株属于罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）或植物乳杆菌（L.plantarum）。
5.权利要求1的方法，还包括以下步骤：在步骤b)、c)和/或d)中将对氨基苯甲酸（p-ABA）加入所述发酵培养基中。
6.权利要求1的方法，其中所述瓜类果实提取物为瓜类汁液。
7.一种乳杆菌属发酵培养基，所述发酵培养基包含甜瓜（Cucumismelo）的果实的瓜类果实提取物或者由其组成，并任选还包含p-ABA，其中所述发酵培养基不含其他植物的果实的提取物。
8.权利要求7的发酵培养基，其中所述瓜类果实提取物为瓜类汁液，并且其中所述培养基的至少50%由所述瓜类汁液组成。
9.从权利要求1-6的方法得到的发酵液。
10.一种食品、饲料或食品添加物组合物，所述组合物包含权利要求9的发酵液或者由其组成。
11.权利要求10的食品、饲料或食品添加物组合物，所述组合物选自果实饮料、糖棒、酸奶饮料、发酵的乳制品、膳食替代物、冰淇淋、奶酪和奶昔。
12.权利要求9所限定的发酵液用于制备包含叶酸盐和任选的维生素B12的食品、饲料或食品添加物组合物的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述瓜类果实提取物为瓜类汁液。
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