ES2351150T3 - Bacterias que producen folato de manera natural. - Google Patents

Abstract

Una bacteria mutante, caracterizada porque la bacteria comprende una cantidad aumentada de folato intracelular y/o extracelular en comparación con el tipo salvaje y tiene una tasa de crecimiento de al menos 0,1 μ por hora cuando se cultiva en un medio que comprende 1,25 mg/l de metotrexato y que carece de metabolitos dependientes del folato, dichos metabolitos dependientes del folato siendo metabolitos o precursores de la biosíntesis o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al metotrexato de una célula cuando están presentes en el medio circundante.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a unos métodos para seleccionar bacterias mutantes que producen niveles de folato aumentados. En estos métodos el antifolato metotrexato (MTX) se utiliza como agente de selección. También se proporcionan unos alimentos y unas composiciones de suplementos alimentarios que comprenden las bacterias mutantes o derivados o extractos de las bacterias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los análogos del folato y en particular los inhibidores de la dihidrofolato reductasa han sido el tema de investigación durante muchos años debido a su papel potencial en la quimioterapia para el cáncer y como agentes contra el parásito de la malaria. Uno de los primeros análogos del folato descritos en la literatura es el metotrexato de los laboratorios Lederle. Este compuesto ya se ha utilizado en 1948 para el tratamiento de la leucemia aguda (Hitchings, g. H., Jr., 1989, In Vitro Cell Dev Biol 25:303-10).

La actividad del metotrexato (MTX) se basa en la inhibición competitiva de la enzima diana dihidrofolato reductasa. Esta enzima es necesaria para la producción y el reciclaje del tetrahidrofolato (THF) que utiliza dihidrofolato (DHF) como sustrato. La especificidad del metotrexato puede explicarse por pequeñas diferencias estructurales de las dihidrofolato reductasas en diferentes especies (Chang et al., 1978, Nature 275:617-24). El metotrexato impide que las células produzcan suficiente tetrahidrofolato para la biosíntesis de metionina, ADN y ARN. Sin embargo en presencia de purinas, timidina, glicina, metionina y ácido pantoténico (todos ellos metabolitos que necesitan tetrahidrofolato para su propia biosíntesis) puede disminuir la demanda de las células para sintetizar tetrahidrofolato (Harvey, R. J., 1973, J Bacteriol 114:309-22). Sin embargo las células verán siempre de alguna forma obstaculizado su crecimiento por el MTX, porque el THF es esencial para la formación de metionil-RNAtfmet, un compuesto que es indispensable para la iniciación de la síntesis de proteínas, independientemente de la presencia de metabolitos dependientes del folato (Baumstark et al., 1977, J Bacteriol 129:457-71).

Las bacterias del ácido láctico como Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei muestran un alto grado de variabilidad en su respuesta al metotrexato y a otro análogo del folato, el trimetoprim. Se sabe que L. lactis es insensible a ambos antifolatos (Leszczynska et al., 1995, Appl Environ Microbiol 61:561-6). Se ha demostrado para numerosos organismos que una exposición prolongada a antifolatos resulta en una selección de tipos de células resistentes. Se han descrito varios mecanismos subyacentes para explicar el mecanismo de resistencia tanto de líneas de células eucariotas como de bacterias al metotrexato (MTX). Tamura et al. (1997, Microbiology 143: 2639-46) investigaron los mecanismos que llevaban a la resistencia al MTX en Enterococcus hirae. Descubrieron varios efectos fenotípicos que incluían (i) actividad aumentada de la reductasa del ácido fólico (FAR) (ii) dihidrofolato reductasa aumentada (DHFR), (iii) disminución de la síntesis y retención intracelular del MTX que contenía dos residuos glutamil, (iv) disminución de la captación de MTX acompañada de la disminución de la captación de los folatos; y (v) reducción de la capacidad de unión al folato. La forma de folato presente en el medio durante el desarrollo de la resistencia influía en las actividades DHFR y FAR y en el transporte de los folatos.

Sin embargo, aunque se sabe que la exposición a MTX puede utilizarse para seleccionar células con una resistencia aumentada al MTX, no se ha descrito ningún vínculo entre resistencia al MTX y niveles de folato de las células en la técnica anterior. A diferencia de los mecanismos de resistencia al MTX descritos anteriormente, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que las células bacterianas tienen otra manera de generar resistencia al MTX. Este mecanismo es la producción de niveles de folato altos. Este hallazgo puede ser aprovechado en el cribado y selección de bacterias mutantes (espontáneas) que producen niveles de folato altos, mediante el uso de metotrexato como agente de selección. Tales bacterias, especialmente bacterias de uso alimentario, pueden utilizarse para enriquecer productos alimentarios con folato. El folato es una vitamina B soluble, necesaria para el buen crecimiento y funcionamiento celular. Muchos productos alimentarios, como el pan, cereales, productos lácteos, etc. se complementan con ácido fólico para garantizar una ingesta adecuada de folato. Las bacterias mutantes de la presente invención posibilitan el enriquecimiento de productos alimentarios con folato natural mediante por ejemplo la fermentación utilizando las bacterias mutantes.

DEFINICIONES

"Bacterias del ácido láctico" como se utiliza en la presente memoria, son bacterias, que producen ácido láctico como producto final de la fermentación, tales como las bacterias del género Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus y Bifidobacterium.

Una "cepa" o un "aislado" bacteriano se utilizan en la presente memoria indistintamente y se refieren a una bacteria que no cambia genéticamente al crecer o multiplicarse. Se incluyen la multiplicidad de bacterias idénticas.

Una "bacteria mutante" o una "cepa o aislado bacteriano mutante" se refiere a una bacteria mutante natural (espontánea, natural) o a una bacteria mutante inducida que comprende una o más mutaciones en su genoma (ADN) que están ausentes en el ADN de tipo salvaje. Un "mutante inducido" es una bacteria donde la mutación fue inducida por el tratamiento humano, tales como el tratamiento con mutágenos químicos, radiación UV o gamma, etc. Por el contrario, un "mutante espontáneo" o "natural" no ha sido mutagenizado por el hombre. Las bacterias mutantes en la presente memoria son no-GMO, es decir, no modificadas por la tecnología del ADN recombinante.

"Cepa de tipo salvaje" o "aislado de tipo salvaje " se refiere a la forma no mutada de una bacteria, tal como se encuentra en la naturaleza.

"Metabolitos dependientes del folato" se refiere a metabolitos o precursores de la biosíntesis o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al MTX de una célula cuando están presentes en el medio circundante. "Cantidad inhibitoria de MTX" se refiere a la cantidad requerida para prácticamente inhibir el crecimiento de una célula. Por lo general, para las células procariotas una cantidad de al menos aproximadamente 1,25 mg/L de medio de cultivo es inhibitoria para las células sensibles al MTX. "Folato total" se refiere a los niveles de folato extracelular (secretados) e intracelular producidos por una cepa.

Microorganismos "de uso alimentario" son en particular organismos, que se consideran como no peligrosos, cuando son ingeridos por un sujeto humano o animal.

La expresión "que comprende" se interpreta como especificando la presencia de las partes, etapas o componentes indicados, pero no excluye la presencia de una o más partes, etapas o componentes adicionales. Una composición que comprende la cepa bacteriana X, puede por lo tanto comprender cepas adicionales, otros componentes, etc. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" por tanto significa normalmente "al menos uno".

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Mientras se sometía a ensayo si las bacterias recombinantes sobreproductoras de folato han modificado su susceptibilidad al MTX, se descubrió que un número de cepas de tipo salvaje de L. plantarum, que fueron incubadas durante más de aproximadamente 40 horas en cantidades inhibitorias de MTX (1,25 mg/L) no fueron inhibidas por el MTX, sino que tuvieron una tasa de crecimiento similar a la del medio que carecía de MTX. Al analizar los niveles de folato de estas cepas, aproximadamente el 5% de estas colonias mostraron una producción de folato significativa mayor en comparación con la cepa de tipo salvaje (no mutada). Los pools de folato total fueron 4% a 63% superiores en comparación con los niveles de tipo salvaje (promedio). Esta observación demostró que el MTX puede utilizarse para seleccionar de manera eficaz bacterias naturales (no GMO) sobreproductoras de folato. La resistencia al MTX se mantuvo, incluso cuando las cepas fueron cultivadas durante más de 50 generaciones en un medio sin MTX, lo que indicaba que la resistencia es causada por mutaciones estables (espontáneas) en el genoma bacteriano.

El mismo efecto, que la producción aumentada de folato lleva a una alta resistencia contra el MTX, fue visto en cepas recombinantes de L. plantarum, que se transformaron con el grupo completo de genes de biosíntesis del folato bajo el control de un promotor fuerte. Estas cepas recombinantes producían altos niveles de folato y eran resistentes al MTX cuando se cultivaban en un medio sin los metabolitos dependientes del folato. Sin limitar el alcance de la invención, se especula que los niveles de dihidrofolato intracelular compiten con el MTX acumulado por el sitio activo de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR).

Este hallazgo se aplicó para desarrollar un método de cribado rápido, basado en el crecimiento en presencia de MTX, para seleccionar cepas bacterianas que sobreproducían folato. Las sobreproductoras de folato que se identificaron en este estudio mostraron un fuerte aumento en los niveles de folato en comparación con las productoras de folato de tipo salvaje. Los niveles de folato total oscilaban entre 20 y 60 veces el nivel del tipo salvaje. Los pools de folato intracelular en las sobreproductoras de folato fueron 10 a 20 veces superiores en comparación con los niveles encontrados en la cepa de tipo salvaje. Estos niveles de folato intracelular aumentados generan una disminución de la sensibilidad (es decir, resistencia) al MTX. Esto explicaba por qué el crecimiento de las cepas sobreproductoras de folato no se vio afectado significativamente por el MTX. La sensibilidad del tipo salvaje al MTX se observó sólo cuando todos los metabolitos que se asocian con el folato fueron suprimidos del medio.

Bacterias de acuerdo con la invención

Por lo tanto, en una forma de realización de la invención se proporcionan unas bacterias mutantes que comprenden una cantidad aumentada de folato intracelular y/o extracelular en comparación con el tipo salvaje y que tienen una tasa de crecimiento (μ) de al menos 0,1 h-1 cuando se cultivan en un medio que comprende (al menos) 1,25 mg/l de metotrexato y carece de metabolitos dependientes del folato (es decir, que se dice que son "resistentes" al MTX). Preferentemente bajo estas condiciones de crecimiento, la tasa de crecimiento de la bacteria mutante no es significativamente diferente de la de la cepa de tipo salvaje cuando la cepa de tipo salvaje se cultiva en el mismo medio sin MTX (es decir, "crecimiento normal"). Lo que es más importante, la bacteria mutante muestra un crecimiento significativo a una concentración de MTX que es inhibitoria para la cepa de tipo salvaje. Una "concentración inhibitoria" es la concentración de MTX que tiene como resultado prácticamente el no crecimiento de la cepa de tipo salvaje. La figura 3, por ejemplo, muestra que a concentraciones de 1,25, 1,5, 2,0 y 2,5 mg/l de MTX, el tipo salvaje tiene una tasa de crecimiento cercana a cero (μ < 0,05 h-1), mientras que las cepas sobreproductoras de folato tienen una tasa de crecimiento (μ) por encima de 0,1 h-1, especialmente alrededor de 0,15 h-1. El medio de crecimiento no debería complementarse con metabolitos dependientes del folato, ya que en su presencia no puede verse ninguna diferencia significativa en la resistencia al MTX, probablemente porque la cepa de tipo salvaje compensa sus niveles de folato más bajos usando los metabolitos del folato del medio. Un medio de cultivo adecuado es por ejemplo CDM (medio químicamente definido) modificado, que carece de glicina, inosina, ácido orótico, timidina, guanina, adenina, uracilo y xantina.

La tasa de crecimiento puede medirse por diversos medios. Por ejemplo, en determinados instantes en el tiempo después de la inoculación del medio con la cepa o aislado bacteriano pueden hacerse lecturas espectrofotométricas y calcularse la tasa de crecimiento a lo largo del tiempo.

La bacteria mutante comprende preferentemente una cantidad aumentada de folato intracelular y/o extracelular en comparación con la cepa de tipo salvaje. Preferentemente, la cantidad de folato total es al menos aproximadamente un 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, más preferentemente al menos aproximadamente un 60%, 63% (o más) superior a la cantidad promedio de folato intracelular de la(s) cepa(s) de tipo salvaje. Como en algunas especies bacterianas las cepas de tipo salvaje muestran una variación significativa de los niveles de folato intracelular, es preferible analizar un número de cepas diferentes de tipo salvaje (P. ej., 2, 3, 4 o más cepas) para los niveles de folato intracelular y calcular el nivel de folato promedio. Puede determinarse la cantidad total, intracelular o extracelular de folato producida por una cepa o aislado bacteriano y cuantificarse mediante métodos conocidos en la técnica, como el ensayo microbiológico de L. casei descrito por Sybesma (véase el ejemplo 1.3) o variantes del mismo, mediante análisis HPLC u otros métodos conocidos. Una prueba microbiológica puede utilizar por ejemplo una cepa indicadora (p. ej., una cepa L. casei), que se cultiva en folato producido por la cepa de prueba. Si la cepa de prueba produce grandes cantidades de folato, la cepa indicadora crece bien, resultando en una medición de OD alta después de un período de crecimiento especificado. Por el contrario, si la cepa de prueba produce cantidades bajas de folato, se medirán valores DO menores. La bacteria mutante es preferentemente un mutante espontáneo (natural), seleccionado por ejemplo mediante el método de acuerdo con la invención (véase más adelante). La bacteria es de cualquier especie de la que la cepa de tipo salvaje muestre sensibilidad natural al MTX, como L. plantarum, L. casei, u otras especies del grupo de bacterias del ácido láctico. Ser sensible al MTX significa que el crecimiento de la bacteria es prácticamente inhibido por al menos 1,25 mg/L de MTX, cuando la cepa se cultiva en un medio sin metabolitos dependientes del folato. Puede probarse fácilmente si una especie bacteriana muestra sensibilidad al MTX cultivando la bacteria en un medio complementado con MTX y sin metabolitos dependientes del folato. La bacteria es preferentemente una bacteria de uso alimentario, en una forma de realización, pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Leuconostoc y Streptococcus.

Preferentemente es una bacteria del ácido láctico de uso alimentario. Puede ser una especie seleccionada del grupo que consiste en Lactobacillus reuteri, L. fermentum,

L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. johnsonii, L. casei, L. plantar, L. paracasei,

L. murinus, L. jensenii, L. salivarius, L. minutis, L. brevis, L. gallinarum, L. amylovorus, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lc. lactis, Pediococcus damnosus, P. acidilactici, P. parvulus, Bifidobacterium bifidum, B. longum,

B. infantis, B. breve, B. adolescente, B. animalis, B. gallinarum, B. magnum y

B. thermophilum.

En una forma de realización alternativa la bacteria mutante es un mutante inducido que tiene el folato aumentado y que es resistente al MTX. Un mutante de este tipo puede obtenerse utilizando el mismo método que en la selección de mutantes naturales (descrito más adelante en la presente memoria), salvo porque antes del método de cribado se incluye una etapa de mutagénesis. Una etapa de mutagénesis puede incluir uno o más métodos de mutagénesis conocidos, como la exposición a un mutágeno químico y/o físico (p. ej., N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina; radiación UV, radiación gamma, etc.). Tras la mutagénesis, se cultivan las bacterias en/sobre un medio que comprende cantidades inhibitorias de MTX y los aislados que crecen se seleccionan y analizan para el contenido de folato.

En todavía otra forma de realización, las bacterias mutantes de acuerdo con la invención pueden caracterizarse por su patrón de expresión de genes. Esto se ilustra mediante el hallazgo de que las cepas de L. plantarum resistentes que producen al menos un 50% más de folato en comparación con el tipo salvaje muestran una sobreexpresión 2 veces mayor (o más) de uno o más de los genes folC en el genoma. El gen folC codifica para la enzima dihidrofolatosintasa. En una forma de realización las bacterias de acuerdo con la invención muestran sobreexpresión en comparación con el tipo salvaje de uno o más genes que codifican para las enzimas de la ruta de la biosíntesis del folato. Además del gen directamente implicado en la biosíntesis del folato, también se encontraron mayores niveles de la transcripción para los genes siguientes: FK (que codifica para la fructoquinasa), POX (piruvato oxidasa), LOX (lactato oxidasa) y PDH (piruvato deshidrogenasa). En comparación con el tipo salvaje, se encontró un nivel significativamente inferior de transcrito para: DAK (dihidroxiacetona fosfotransferasa o DHA quinasa). De esta manera, en una forma de realización de la invención, la bacteria/las bacterias de acuerdo con la invención comprenden unos niveles significativamente mejorados de transcrito de ARNm de uno o más genes del grupo que codifica para la dihidrofolato sintasa (EC 6.3.2.17), fructoquinasa (EC 2.7.1.4), piruvato oxidasa (EC 1.2.3.3) y 6-fosfo-β-glucosidasa (EC 3.2.1.86). Además o de manera alternativa, las bacterias comprenden unos niveles de transcrito de ARNm considerablemente reducidos del gen que codifica para la dihidroxiacetona fosfotransferasa (= glicerol quinasa) (EC. 2.7.1.29).

El término "sobrerregulado" o "infrarregulado" se refiere a un nivel de la transcripción de ARNm aumentado o a un nivel de la transcripción de ARNm disminuido en comparación con el gen de la cepa de tipo salvaje. Un "nivel de transcrito significativamente mejorado" o un "nivel de la transcripción significativamente mejorado" se refieren a una cantidad de transcrito de ARNm al menos 2 veces mayor, preferentemente al menos 3 veces mayor, o incluso aproximadamente 4 veces mayor o más en comparación con el nivel de transcrito encontrado en el tipo salvaje. Asimismo, "un nivel de transcrito considerablemente reducido" o "nivel de la transcripción" se refiere a una cantidad de transcrito de ARNm al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, etc. inferior al encontrado en el tipo salvaje. Los niveles de transcrito de ARNm de uno o más genes pueden medirse y cuantificarse mediante métodos de biología molecular de rutina, como por ejemplo el análisis Northern y (RT-)PCR transcriptasa inversa cuantitativo. Puesto que la información de la secuencia de ADN/ADNc está disponible para estos genes, los cebadores y sondas adecuadas para hibridarse con el ARNm o ADNc diana están disponibles y sólo se requiere una experimentación de rutina para el análisis de los niveles de transcrito. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de

L. plantarum (cuyo genoma ha sido secuenciado) pueden utilizarse para identificar (p. ej., en análisis in silicio), clonar (p. ej., utilizando métodos basados en PCR, métodos basados en la hibridación, etc.) y/o secuenciar los genes ortólogos de otras especies de bacterias. A continuación pueden utilizarse secuencias de ácidos nucleicos de estos genes, o partes de los mismos, para hacer cebadores o sondas para la detección y cuantificación de los genes diana.

Opcionalmente, el patrón de transcripción (es decir, los niveles de transcrito mejorados o reducidos de uno o más de los genes mencionados anteriormente) puede utilizarse como un criterio de selección. Por ejemplo, las bacterias pueden cribarse en primer lugar para los niveles de expresión alterados en un primer cribado, y posteriormente analizadas para la resistencia al metotrexato y/o los niveles de folato (como se describe más adelante). Asimismo, puede utilizarse como una etapa de cribado/selección adicional en el método que se describe más adelante (por ejemplo entre las etapas (b) y (c) o después de la etapa (d), o incluso puede reemplazar las etapas (a) y (b)).

El perfil de la transcripción de una de las cepas resistentes al metotrexato descritas en la presente memoria (Lactobacillus plantarum NIZO B2550) ha sido comparado con el de la cepa parental (Lactobacillus plantarum WCFS1 (la secuencia completa de

L. plantarum WCFS1 ha sido depositada en la base de datos EMBL bajo el nº de entrada AL935263)). Esto se hizo utilizando micromatrices de ADN del genoma completo de Lactobacillus plantarum WCFS1. Se aislaron muestras de ARNm total de la cepa parental y los mutantes resistentes al metotrexato y posteriormente se trataron con transcriptasa inversa para sintetizar ADNc marcado fluorescentemente. Las muestras de la cepa parental y mutante se marcaron de manera diferencial. Posteriormente, fue hibridada una mezcla de las muestras de ADNc marcadas en la micromatriz de ADN para determinar la abundancia relativa del ARNm de todos los genes en el mutante con respecto a la cepa parental de L. plantarum.

En una forma de realización las bacterias mutantes son las cepas bacterianas (o cualquier derivado de las mismas) depositadas por NIZO Food Research, P.O. Box 20, 6710 BA Ede, Países Bajos en la CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, CT 3584 Utrecht, Países Bajos), bajo el Tratado de Budapest bajo el número de entrada CBS 117120.

Composiciones de acuerdo con la invención

Un aspecto adicional de la invención se refiere a unas composiciones que comprenden bacterias mutantes como se han descrito anteriormente en la presente memoria o derivados o extractos de las mismas, así como a los métodos para la producción de tales composiciones. Las bacterias de la invención son cultivadas bajo condiciones apropiadas, opcionalmente recuperadas a partir del medio de cultivo y opcionalmente formuladas en una composición adecuada para el uso previsto. Los métodos para la preparación de tales composiciones son conocidos per se.

Preferentemente, las bacterias mutantes, derivados o extractos de las mismas, se utilizan para hacer comida o composiciones de suplementos alimentarios que comprenden folato natural.

Una composición preferente de acuerdo con la invención es apta para el consumo por un sujeto, preferentemente un ser humano o un animal. Tales composiciones pueden estar en forma de suplemento alimentario o una composición alimentaria o un alimento integral, que además de las bacterias de la invención también contiene una base alimentaria adecuada. Se entiende que un alimento o una composición alimentaria de la presente memoria incluyen no sólo composiciones sólidas y semisólidas, sino también líquidos para el consumo humano

o animal, es decir, una bebida. El alimento o la composición alimentaria puede ser un alimento o una composición alimentaria sólida, semisólida y/o líquida, y en concreto puede ser un producto lácteo, tal como un producto lácteo fermentado, que incluye pero no se limita a un yogur, una bebida a base de yogur o el suero de leche. Tales alimentos o composiciones alimentarias pueden prepararse de manera conocida per se, p. ej., añadiendo una o más bacterias mutantes de la invención a un alimento o base alimentaria adecuada, en una cantidad adecuada.

También pueden hacerse suplementos alimentarios, que comprendan unas cantidades adecuadas de una o más cepas bacterianas mutantes, o extractos de las mismas (p. ej., folato natural parcialmente o prácticamente purificado). Complementos alimentarios incluyen por ejemplo tabletas de vitaminas, pastillas, cápsulas o polvos, que comprenden cantidades diarias recomendadas de diversas vitaminas, incluyendo el folato. El ácido fólico sintético utilizado normalmente en tales preparados puede sustituirse con el folato natural de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización preferente, las bacterias vivas se utilizan en o para la preparación de un alimento o una composición alimentaria, p. ej. mediante fermentación. Al hacerlo, la bacteria de la invención puede utilizarse de manera conocida per se para la preparación de tales alimentos fermentados o composiciones alimentarias, p. ej., de una manera conocida per se para la preparación de productos lácteos fermentados que utilizan las bacterias del ácido láctico. En tales métodos, las células bacterianas de la invención pueden utilizarse además del microorganismo que suele utilizarse, y/o pueden sustituir uno o más o parte del microorganismo que suele utilizarse. Por ejemplo, en la preparación de productos lácteos fermentados como yogur o bebidas basadas en el yogur, una bacteria mutante de uso alimentario de la invención puede añadirse a, o utilizarse como cultivo de inicio o puede añadirse adecuadamente durante una fermentación de este tipo. El "medio de crecimiento" de la bacteria en este caso es un medio de uso alimentario, como un lácteo.

En una forma de realización adicional las bacterias utilizadas pueden estar muertas (p. ej., lisadas) o no ser viables, o estar liofilizadas.

Las composiciones fabricadas utilizando una o más cepas bacterianas mutantes de acuerdo con la invención o complementadas con una cantidad adecuada de una o más de las cepas, comprenden una cantidad mayor de folato natural, producido por las bacterias. Pueden mezclarse una o más cepas que son grandes sobreproductoras de folato o pueden añadirse secuencialmente a la composición o durante su producción. La cantidad total de folato presente en el producto final puede analizarse por ejemplo mediante el análisis HPLC.

Métodos y usos de acuerdo con la invención

El metotrexato se utiliza para la selección de bacterias con unos niveles de folato total aumentados e intracelular aumentados.

En una forma de realización se proporciona un método para seleccionar bacterias con unos niveles de folato total y/o intracelular aumentados. El método comprende las etapas de:

(a)

cultivar las bacterias sobre (o en) un medio que comprende metotrexato, en el que el medio no se complementa con metabolitos dependientes del folato,

(b)

seleccionar las bacterias con una tasa de crecimiento (μ) de al menos 0,1 por hora,

(c)

determinar el nivel de folato de las bacterias seleccionadas en la etapa b

(d)

y seleccionar las bacterias de tener niveles de folato aumentados en comparación con el tipo salvaje u otro control adecuado,

(e)

opcionalmente repetir las etapas (b), (c) y/o (d).

"Cultivar" en la etapa (a) también puede significar poner en contacto las bacterias con un medio de este tipo. El medio puede comprender diversas concentraciones de MTX. Por ejemplo una primera ronda de selección puede llevarse a cabo en una concentración relativamente baja, como 1,25, 1,5, 2,0, 2,5 mg/l de medio. A continuación, los aislados que crecen en una o más de estas concentraciones pueden cribarse directamente o pueden someterse a una o más rondas adicionales de selección MTX, utilizando por ejemplo una mayor concentración de MTX, como 4, 5, 10 o más mg/litro. El rigor del proceso de selección puede modificarse seleccionando más rigurosamente, p. ej., sólo aislados con una alta tasa de crecimiento a una concentración alta, o con menor rigor, p. ej., aislados que muestran un crecimiento moderado a unas concentraciones relativamente bajas de MTX. Preferentemente, en cada etapa de selección MTX, los aislados se cultivan sobre o en el medio durante al menos 40 horas, más preferentemente al menos 50 horas o más. Siempre deberían incluirse controles adecuados, p ej., aislados de tipo salvaje, ya que los mutantes se seleccionan en base a la diferencia de crecimiento entre el mutante y el control (p. ej., el tipo salvaje). El control no tiene que ser necesariamente un tipo salvaje, sino que también puede ser una cepa seleccionada anteriormente. La temperatura de incubación óptima, el pH del medio, y otros parámetros pueden ser determinados fácilmente por la persona experta. Las condiciones exactas dependen de las especies bacterianas utilizadas.

Preferentemente, el método se configura de tal manera que puedan cribarse un gran número de aislados simultáneamente, p. ej., en placas de microtitulación de 96 pocillos o similares.

El método puede aplicarse en todas las bacterias que muestren una sensibilidad natural al metotrexato. Utilizando el análogo del folato metotrexato, se pueden seleccionar y aislar de manera eficaz las bacterias sobreproductoras de folato natural que pueden utilizarse para la producción de productos alimentarios fermentados con una concentración de folato aumentada (enriquecimiento natural o enriquecimiento por fermentación) como se ha descrito anteriormente.

Cualquier bacteria que pueda obtenerse de acuerdo con el método y que tenga unos niveles de folato significativamente aumentados está contenida en la presente memoria.

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la invención empleará los métodos convencionales estándar de biología molecular, virología, microbiología o bioquímica. Tales técnicas se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; y en los volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edición, Academic Press (RU); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.).

Leyendas de las figuras

Figura 1: Producción de folato de la cepa de tipo salvaje de L. plantarum (1) y las cepas de

L. plantarum que hospedan pNZ7019 (2) y pNZ7021 (3) cultivadas en CDM. Leyenda: niveles de folato extracelular; (barra blanca), niveles de folato intracelular; (barra gris), niveles de folato total; (barra negra).

Figura 2: Tasa de crecimiento de la cepa de L. plantarum de tipo salvaje (1), y de dos cepas de

L. plantarum que hospedan el vector pNZ7019 (2) y pNZ7021 (3). El rendimiento del crecimiento de las tres cepas de L. plantarum fue sometido a ensayo en CDM (a) y el CDM modificado (b), que contenía una concentración cada vez mayor de metotrexato 0, 0,3125, 0,625, 1,25 y 2,5 mg/L (MTX).

Figura 3: Niveles de producción de 15 cepas sobreproductoras de folato, seleccionadas en base a la resistencia al MTX. La producción de folato de las 15 cepas se compara con la producción de folato del tipo salvaje

EJEMPLOS 1. Materiales y métodos

1.1 Cepas y condiciones de cultivo

5 Se cultivaron cepas WCFS1 de L. plantarum de tipo salvaje y sus derivados a 37°C en medio químicamente definido (CDM), que contenía 19 g/L de β-fosfoglicerato (6) o CDM modificado. En este CDM modificado, se suprimieron la glicina, inosina, ácido orótico, timidina, guanina, adenina, uracilo y xantina del CDM normal. Además se añadieron 8 ng/ml de cloranfenicol a todos los medios utilizados. Se añadió metotrexato (Sigma, aminopterina) a

10 ambos tipos de CDM, en concentraciones que iban de 0 a 10 mg/l.

1.2 Técnicas de ADN, construcción de plásmidos y transformaciones

Los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. 15 Tabla 1

Plásmido

Características relevantes

pNZ8148

Cmr; vector de expresión inducible que lleva el promotor nisA

pNZ7019

Cmr; derivado de pNZ7017 que contiene el grupo de genes del folato de L. lactis detrás del promotor pepN (Wegkamp et al., Appl Environ Microbiol. 2004, 70:3146-3148)

pNZ7020

Cmr; derivado de pNZ8148 que contiene el promotor pepN en lugar del promotor nisA

pNZ7020a

Cmr; derivado de PNZ7020 que contiene una parte del grupo de genes del folato de L. plantarum, gen folB a un gen folP truncado

pNZ7021

Cmr; derivado de pNZ7020a que contiene el grupo completo de genes del folato de L. plantarum folB a folP

El vector pNZ8148 es un vector vacío que contiene el promotor inducible de la nisina, un sitio de clonación múltiple, y un marcador de resistencia al cloranfenicol. Se 20 aislaron los derivados de pNZ8148 y el ADN genómico de L. plantarum mediante los procedimientos establecidos. Se llevó a cabo un PCR utilizando Pfx ADN polimerasa (Invitrogen, Paisley, RU) en un aparato de PCR Mastercycler (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) utilizando los siguientes ciclos: desnaturalización a 94°C durante 30s (3 minutos el primer ciclo), templado a 45°C durante 25s, y elongación a 68°C durante 1 minuto por 25 1000 bps para un total de 30 ciclos. El vector pNZ8148 fue digerido utilizando SphI y Bg1II, con lo que se escindió el promotor de la nisina. En un experimento paralelo el promotor

constitutivo pepN de L. lactis (Van Alen-Boerrigter et al., 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57:2555-61) fue digerido a partir del vector pNZ7017 utilizando SphI y Bg1II. A continuación ambos fragmentos fueron ligados utilizando la T4 ADN ligasa (Invitrogen), el plásmido resultante fue denominado vector pNZ7020. El grupo de genes del folato de

L. plantarum fue amplificado a partir de ADN cromosómico utilizando los siguientes cebadores: (i) folBKpn-F (5'-GAAAGAGGCTGGGTACCATTATGGGCATGATTC-3'), que se extendió en el 5' con un sitio de restricción KpnI, superponiéndose así al codón de inicio del gen folB y (ii) el cebador inverso LpfPxba-R (5'-CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG-3') que se extendió en el extremo 5' para crear un sitio de restricción XbaI, permitiendo una fusión entre el codón de terminación de folC y el vector. El fragmento de ADN amplificado fue digerido con XbaI y KpnI, resultando en una versión truncada del grupo de genes folB-folP, (folP contiene un sitio de restricción XbaI). El vector pNZ7020 también fue digerido con XbaI y KpnI, a continuación ambos fragmentos fueron ligados con T4 ADN ligasa, el vector resultante fue denominado pNZ7020a. La parte que faltaba del gen folP fue amplificada mediante PCR utilizando los siguientes cebadores lpfP-F (5'-CATGGCATCGATATTGAACGAATTG-3') y el cebador lpfPxba-R (5'-CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG-3'). El ADN amplificado fue digerido con XbaI. A continuación el vector pNZ7020a fue digerido con XbaI y posteriormente fosforilado utilizando fosfatasa alcalina (Pharmacia Biotech) para evitar la autoligación. Ambos trozos de ADN digeridos con XbaI fueron ligados utilizando una T4 ADN ligasa, la orientación del fragmento insertado se comprobó mediante PCR. El vector resultante fue denominado pNZ7021. Los tres vectores enumerados en la Tabla 1 fueron a continuación transferidos a células competentes de L. lactis NZ9000 en un fondo de ylgG. Posteriormente, los preparados intermedios de los tres vectores se transformaron en L. plantarum mediante los procedimientos establecidos.

1.3 Cuantificación de folato mediante el ensayo microbiológico

Se analizaron los niveles de folato de las tres cepas modificadas genéticamente de

L. plantarum. mediante el ensayo microbiológico de Lactobacillus casei como se ha descrito anteriormente (Sybesma et al., 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69:3069-76.)

1.4 Monitorización del crecimiento de las cepas

Se utilizaron placas Microtiter para determinar la tasa de crecimiento de las tres cepas de L. plantarum que hospedaban los diferentes vectores. El crecimiento de las tres cepas fue monitorizado en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante 35 horas utilizando un espectrofotómetro (SPECTRAmax®, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EEUU). El crecimiento fue sometido a ensayo en los dos tipos de medio, y cada constructo fue analizado por triplicado en ambos medios para las siguientes concentraciones de MTX: 0, 0,3125, 0,625, 1.25 y 2,5 mg/l.

1.5

Selección para sobreproductores naturales de folato

El L. plantarum de tipo salvaje WCFS1 que contenía pNZ8148 fue cultivado nuevamente en CDM modificado que contenía 2,5 mg/L de MTX, pero este medio de cultivo se separó en 96 pocillos de las placas de microtitulación. Esta placa de microtitulación fue incubada durante 3 días, y a continuación se dispersaron alícuotas de cada uno de los 96 pocillos en dos placas de microtitulación de 96 pocillos frescas que contenían el CDM modificado con esta vez 10 mg/L de MTX. A través de cada etapa la placa de microtitulación original fue mezclada con un 60% de glicerol y almacenada en un congelador a -80°C. Las placas de microtitulación almacenadas con glicerol se utilizaron para inocular las células mutadas o adaptadas en medio CDM modificado fresco. Los niveles de folato de estos 288 cultivos de resistencia al MTX se verificaron mediante un método de cribado rápido. Este método se basa en el ensayo microbiológico normal como se ha descrito anteriormente, sin embargo se adoptaron algunos cambios. En este método de cribado rápido el folato producido por el tipo salvaje se compara con el folato producido por las cepas mutantes. El cultivo de la cepa indicadora en el folato producido por el tipo salvaje lleva a una densidad óptica relativa baja. La densidad óptica de la cepa indicadora en las sobreproductoras de folato será mayor que la del tipo salvaje. Las cepas que producían una densidad óptica aumentada de la cepa indicadora se volvieron a analizar utilizando el extendido ensayo microbiológico de Lb. casei.

2.

Resultados

2.1 Cepas recombinantes

Los niveles de producción de folato de L. plantarum de tipo salvaje que llevaba pNZ8148 y los dos constructos genéticos pNZ7019 y pNZ7021 fueron estudiados en medio CDM normal. La producción de folato de la cepa de L. plantarum WCFS1 que contenía el vector vacío pNZ8148 resultó ser 100 ng de folato/ml de cultivo (Fig. 1). La L. plantarum que llevaba pNZ7019 (el grupo de genes de biosíntesis del folato de L. lactis) produce hasta 2000 ng/ml de folato en el cultivo (Fig. 1). Esto se corresponde con aproximadamente 20 veces la sobreproducción en comparación con el tipo salvaje. La transformación de

L. plantarum WCFS1 con el vector pNZ7021, que lleva el grupo de genes de biosíntesis del folato de L. plantarum, resulta en una cepa que produce niveles de folato de 6000 ng/ml de cultivo (Fig. 1).

A continuación, se compararon las tasas específicas de crecimiento de las dos cepas sobreproductoras de folato y la cepa de tipo salvaje, en CDM con y sin metabolitos dependientes del folato en presencia de una gama de concentraciones de metotrexato (MTX) (Fig. 2). En presencia de los metabolitos dependientes del folato, ninguna de las cepas sometidas a ensayo fue inhibida significativamente por el MTX (Fig. 2a). La tasa de crecimiento de la L. plantarum portadora del plásmido pNZ7021 es menor comparada con las otras dos cepas, a todas las concentraciones de MTX sometidas a ensayo. En un medio en el que están ausentes los metabolitos dependientes del folato, surge de una imagen completamente diferente. En este medio, las sobreproductoras de folato son claramente más resistentes al MTX comparadas con la cepa de tipo salvaje (Fig. 2b). A una concentración de 2,5 mg/L de MTX, se observó la completa inhibición del crecimiento de la cepa de tipo salvaje en el CDM modificado, mientras que ambas cepas sobreproductoras de folato crecieron bien en este medio. Entre 0 y 2,5 mg/L de MTX, se observó la inhibición del crecimiento dependiente de la dosis para la cepa de L. plantarum de tipo salvaje. Estos resultados muestran que, si se analiza en un medio de crecimiento adecuado, la sobreproducción de folato conduce a la resistencia al MTX. Por lo tanto, puede utilizarse MTX para distinguir las cepas sobreproductoras de folato de las cepas de tipo salvaje.

2.2 Cepas de tipo salvaje

La incubación prolongada (> 40 horas) de L. plantarum WCFS1 de tipo salvaje en CDM modificado complementado con 2,5 mg/L de MTX, resultó en un crecimiento significativo del cultivo. Si este cultivo se diluía en CDM fresco modificado complementado con 2,5 mg/L de MTX, se observaba un crecimiento inmediato del cultivo. Las colonias simples fueron aisladas de este cultivo para comprobar si se seleccionaban los mutantes naturales con una resistencia al MTX aumentada o si tiene lugar algún tipo de adaptación temporal. El CDM modificado que contenía 2,5 mg/l de MTX fue inoculado con una colonia simple derivada de un cultivo resistente al MTX. A continuación, el medio de cultivo se dividió en dos cultivos; un cultivo fue cultivado para 50 generaciones en el CDM modificado con 2,5 mg/l de MTX, el otro cultivo fue cultivado para 50 generaciones en el mismo medio en ausencia de MTX. Después de la generación 50 ambos cultivos fueron transferidos nuevamente a CDM modificado que contenía 2,5 mg/l de MTX. Ambas cepas con una historia diferente revelaron una tasa de crecimiento comparable en este medio lo que indicaba que una mutación estable provoca el fenotipo de resistencia al MTX. Aislamos 288 colonias de cultivos que contenían 2,5 mg/L ó 10 mg/L de MTX.

Estas colonias fueron analizadas por la sobreproducción de folato mediante un método de precribado rápido. En base a este cribado rápido, 5 de las 288 colonias dieron lugar a cultivos con mayores niveles de folato en comparación con el tipo salvaje. Posteriormente estos 5 cultivos fueron colocados en CDM modificado complementado con 2,5 mg/L de MTX. De cada placa 3 colonias simples fueron aisladas, almacenadas y analizadas nuevamente para la producción de folato de la siguiente manera. Los niveles de folato en los cultivos derivados de las 15 colonias positivas fueron monitorizados (Fig. 3). Los niveles de folato promedio son un 20% a 60% superiores a los observados en el tipo salvaje. Para confirmar que todas las colonias seguían siendo L. plantarum, hemos llevado a cabo análisis RAPD. Todas las colonias sometidas a ensayo mostraron una gran similitud con la cepa parental.

2.3. Perfil de la transcripción

Utilizando la tecnología de las micromatrices de oligonucleótidos para el perfil de la transcripción de todo el genoma, hemos identificado genes en la L. plantarum NIZO B2550 mutante resistente al metotrexato (derivada de L. plantarum WCFS1) que son específicamente sobre- o infrarregulados en comparación con el tipo salvaje. Los cultivos de

L. plantarum WCFS1 y NIZO B2550 se cultivaron en CDM modificado y a una turbidez (OD600) de 1, se cosecharon las células y se aisló el ARNm. Las muestras de ARNm se procesaron para el análisis en micromatrices de ADN. La abundancia relativa de ARNm específicos se expresó como el cambio múltiplo en la expresión de genes en la cepa resistente al metotrexato en comparación con los genes correspondientes en la cepa parental. El análisis del perfil del transcriptoma revela que en comparación con la cepa parental, folC1, el gen que codifica para una dihidrofolato sintasa es sobrerregulado específicamente 4 veces más (véase la Tabla 2) en el mutante resistente al metotrexato en comparación con el tipo salvaje. Esta enzima une el L-glutamato al dihidropteroato para formar dihidrofolato, que es un análogo estructural del metotrexato y sirve como sustrato para la enzima dihidrofolato reductasa. Se espera que más dihidrofolato sintasa a través de la sobreexpresión de folC1 lleve a mayores pools de dihidrofolato intracelular, que a su vez podrían competir con el metotrexato para la conversión por la dihidrofolato reductasa. Esta observación revela el mecanismo de resistencia al metotrexato en los mutantes aislados. También explica por qué estos mutantes producen mayores niveles de folato en ausencia de metotrexato.

L. plantarum WCFS1 tiene dos genes folC (folC1 y folC2). Curiosamente, sólo folC1 está sobrerregulado en el mutante resistente al metotrexato. Este gen no se sitúa en un grupo funcional, a diferencia de folC2, que se sitúa en el grupo de biosíntesis del folato.

Además de folC1, se descubrió que una serie de otros genes metabólicos (que codifican para la fructoquinasa, la piruvato oxidasa y la 6-fosfo-betaglucosidasa) estaban sobrerregulados en la cepa resistente al metotrexato (véase la Tabla 2). Se descubrió que tres genes (dak1A, dak1B y dak2) que codificaban para una DHA quinasa (dihidroxiacetona fosfotransferasa) estaban infrarregulados en el mutante en comparación con la cepa parental.

Tabla 2. Genes específicamente sobre-e infrarregulados en L. plantarum NIZO B2550 en comparación con L. plantarum WCFS1.

Gen

Locus en el cromosoma Cambio múltiplo

Sobrerregulado

folC1

Lp_2321 Dihidrofolato sintasa 4,0

folC2

Lp_3296 Dihidrofolato sintasa 1,1

sacK1

Lp_0184 Fructoquinasa 10,2

sacK2

Lp_3637 Fructoquinasa 1,2

pox1

Lp_3587 Piruvato oxidasa 2,1

pox3

Lp_2629 Piruvato oxidasa 1,6

pox4

Lp_0849 Piruvato oxidasa 4,2

pox5

Lp_3589 Piruvato oxidasa 2,7

pbg6

Lp_3011 6-fosfo-β-glucosidasa 6,1

Infrarregulado

dak1A

Lp_0166 DHA quinasa 0,11

dak1B

Lp_0168 DHA quinasa 0,13

dak2

Lp_0169 DHA quinasa 0,29

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una bacteria mutante, caracterizada porque la bacteria comprende una cantidad aumentada de folato intracelular y/o extracelular en comparación con el tipo salvaje y tiene una tasa de crecimiento de al menos 0,1 μ por hora cuando se cultiva en un medio que comprende 1,25 mg/l de metotrexato y que carece de metabolitos dependientes del folato, dichos metabolitos dependientes del folato siendo metabolitos o precursores de la biosíntesis

   o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al metotrexato de una célula cuando están presentes en el medio circundante.

2. 2.

   La bacteria según la reivindicación 1, en la que dicha bacteria es un mutante natural o un mutante inducido.

3. 3.

   La bacteria según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha bacteria muestra sobreexpresión en comparación con el tipo salvaje de uno o más genes que codifican para enzimas de la vía de la biosíntesis del folato.

4. 4.

   La bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la expresión de uno o más de los genes seleccionados de los genes que codifican para la dihidrofolato sintasa, fructoquinasa, piruvato oxidasa y 6-fosfo-β-glucosidasa están sobrerregulados al menos aproximadamente 2 veces más en comparación con el tipo salvaje.

5. 5.

   La bacteria según la reivindicación 1, 2 ó 4, en la que la expresión del gen que codifica para la dihidroxiacetona fosfotransferasa está infrarregulado al menos aproximadamente 2 veces en comparación con el tipo salvaje.

6. 6.

   La bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la cantidad de folato total de la bacteria mutante es al menos un 10% superior que la de la cepa de tipo salvaje.

7. 7.

   La bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la bacteria es de las especies Lactobacillus plantarum, L. casei, L. reuteri, L. fermentum,

   L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. murinus, L. jensenii,

   L. salivarius, L. minutis, L. brevis, L. gallinarum, L. amylovorus, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lc. lactis, Pediococcus damnosus,

   P. acidilactici, P. parvulus, Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. infantis, B. breve,

   B.

   adolescente, B. animalis, B. gallinarum, B. magnum y B. thermophilum.

8. 8. Lactobacillus plantarum cepa CBS 117120.

9. 9.

   Una composición que comprende una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. 10.

    La composición según la reivindicación 9, en la que la composición es una composición alimentaria o una composición de suplemento alimentario.

11. 11.

    La composición según la reivindicación 10 en la que la composición alimentaria es una composición alimentaria fermentada.

12. 12.

    Uso del metotrexato para la selección de bacterias que tienen unos niveles de folato total aumentados e intracelular aumentados.

13. 13.

    Un método para seleccionar bacterias que tienen unos niveles de folato total y/o intracelular aumentados, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (a)

    cultivar las bacterias sobre o en un medio que comprende metotrexato, en el que el medio no se complementa con metabolitos dependientes del folato, dichos metabolitos dependientes del folato siendo metabolitos o precursores de la biosíntesis o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al metotrexato de una célula cuando están presentes en el medio circundante,

    (b)

    seleccionar las bacterias que tienen una tasa de crecimiento (μ) de al menos 0,1 por hora,

    (c)

    determinar el nivel de folato de las bacterias seleccionadas en la etapa (b) y elegir las bacterias de tener niveles de folato aumentados en comparación con el tipo salvaje,

    (d)

    opcionalmente repetir las etapas (a), (b) y/o (c).

14. 14.

    El método según la reivindicación 13, en el que dicho medio comprende al menos 1,25 mg/l de metotrexato y en el que las bacterias se cultivan sobre dicho medio durante al menos 40 horas.