CN109983028A - 黏膜黏附性微生物 - Google Patents

黏膜黏附性微生物 Download PDF

Info

Publication number
CN109983028A
CN109983028A CN201780069890.3A CN201780069890A CN109983028A CN 109983028 A CN109983028 A CN 109983028A CN 201780069890 A CN201780069890 A CN 201780069890A CN 109983028 A CN109983028 A CN 109983028A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterium
lactobacillus
polypeptide
nucleic acid
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780069890.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109983028B (zh
Inventor
L·斯蒂德勒
K·范登布洛克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intel Rex Duna Alex Tai Co Timbuktu Fabio
Original Assignee
Intel Rex Duna Alex Tai Co Timbuktu Fabio
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intel Rex Duna Alex Tai Co Timbuktu Fabio filed Critical Intel Rex Duna Alex Tai Co Timbuktu Fabio
Publication of CN109983028A publication Critical patent/CN109983028A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109983028B publication Critical patent/CN109983028B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immunology (AREA)

Abstract

本公开提供了黏蛋白结合和/或细胞粘附特性增强的经遗传修饰的微生物(例如，细菌或酵母)。例如，本公开提供了显示出与Caco‑2细胞体外结合增强和与黏蛋白体外结合增强的细菌。可以使用这类微生物(例如，细菌)例如递送生物活性多肽至哺乳动物对象的胃肠道。以所述方式修饰微生物能够调节微生物(例如，细菌)的胃肠潴留和通过时间。示例性的微生物(例如，乳酸细菌，如乳酸乳球菌)包含编码融合蛋白的外源性核酸，所述融合蛋白包含细胞附着多肽如CmbA和黏蛋白结合多肽如三叶因子(TFF)，例如，人TFF3。本公开还提供了用于制备和使用所述微生物(例如，细菌)的方法。

Description

黏膜黏附性微生物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年09月13日提交的美国临时申请号62/394,024的申请日权益。
序列表的引用
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。2017年09月11日创建的所述ASCII拷贝命名为205350-0031-00-WO_SL.txt，大小为122,643字节。
背景技术
已经使用遗传修饰的微生物(例如，细菌)将治疗分子递送至粘膜组织。参见例如，Steidler,L.,等,Nat.Biotechnol.2003,21(7):785-789；Robert S.和Steidler L.,Microb.Cell Fact.2014,13增补1:S11；Braat等,Clin.Gastroenterol.Hepatol.2006,4(6):754-759；和Steidler等,Science 2000,289(5483):1352-1355。
本领域需要具有改善的药代动力学和药效学特性的微生物(例如，细菌)菌株，并且需要有效、靶向和受控的方法，用于治疗可用这类经遗传修饰的细菌治疗的各种疾病。本发明解决了这些需要。
发明内容
本公开提供了细胞黏附和/或黏蛋白结合特性增强的微生物(例如，细菌或酵母)。例如，本公开提供了显示出与Caco-2细胞体外结合增强和与黏蛋白体外结合增强的细菌。这类微生物(例如，细菌)可以用于，例如，递送生物活性多肽至哺乳动物对象的胃肠道，同时，描述的遗传修饰能够用于调节微生物(例如细菌)的胃肠潴留和通过时间。所述技术能够用于调节微生物(例如细菌)表达的生物活性多肽的药代动力学和药效学特性。例如，在乳酸细菌(LAB)(如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))细胞壁中表达、分泌和锚固包含三叶因子(trefoil factor)(TFF)和细胞黏附多肽，如CmbA(参见例如，Jensen等,Microbiology 2014,160(4):671-681)(例如，TFF3-CmbA)的融合蛋白使得细菌与肠上皮细胞附着(adherence)，并且能够进一步使细菌与黏蛋白结合。
组合物
在一些方面中，本公开提供了包含外源性核酸的微生物(例如，细菌或酵母)，所述外源性核酸编码含有细胞附着多肽的融合蛋白。在一些实例中，本公开提供了包含外源性核酸的微生物(例如，细菌或酵母)，所述外源性核酸编码融合蛋白，其中，编码融合蛋白的外源性核酸包含编码细胞附着多肽的序列。在一些实例中，细胞附着多肽选自：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)(参见例如，Jensen等,Microbiology 2014,160(4):671-681)，黏液结合蛋白或mub结构域蛋白(Mub)(参见例如，Boekhorst等,Microbiology 2006,152(1):273-280)，黏液黏附促进蛋白(MapA)(参见例如，Miyoshi等,Biosci.Biotechnol.Biochem.2006,70(7):1622-8)，乳球菌黏蛋白结合蛋白(MbpL)(参见例如，等,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(22):7993-8000)。可以添加细胞壁锚固肽，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A锚固片段(SpaX)(参见例如，Steidler等,Appl.Environ.Microbiol.1998,64(1):342-5)。在一些实例中，本公开提供了包含外源性核酸的微生物(例如，细菌或酵母)，所述外源性核酸编码融合蛋白，其中融合蛋白包括CmbA多肽。在一些实例中，CmbA多肽是来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的CmbA。参见例如，ATCC PTA6474，例如，如Jensen等,同上所公开。根据上述实施方式中任一项的一些实例中，细胞附着多肽是具有与SEQ ID NO:1至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CmbA多肽。根据上述实施方式中任一项的其他实例中，细胞附着多肽是由与SEQ ID NO:2具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的外源核酸序列编码的CmbA多肽。
根据上述实施方式中任一项的其他实例中，融合蛋白包含黏蛋白结合多肽，如三叶因子(TFF)多肽(例如，TFF1，TFF2或TFF3)或MucBP多肽(参见例如，Lukic等,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(22):7993-8000)。因此，在一些实例中，本公开提供了包含外源性核酸的微生物(例如，细菌或酵母)，所述外源性核酸编码融合蛋白，其中融合蛋白包含细胞附着多肽(例如，CmbA多肽)和黏蛋白结合多肽(例如，TFF多肽)。在一些实例中，TFF多肽是人TFF多肽(hTFF1、hTFF2或hTFF3)。根据上述实施方式中任一项的一些实例中，黏蛋白结合多肽是具有与SEQ ID NO:3至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的人TFF3多肽。根据上述实施方式中任一项的其他实例中，黏蛋白结合多肽是由与SEQ ID NO:4具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的外源核酸序列编码的人TFF3多肽。在一些实施方式中，TFF多肽是哺乳动物TFF多肽，如牛、猪、羊、狗、猫或马TFF。在其他实例中，TFF是两栖动物TFF。本文描述并引用参引了示例性TFF多肽，例如，在Conlon等,Peptides 2015,72:44-49中，各公开通过引用其全部内容纳入本文。在其他实例中，TFF多肽是三叶样结构域根据该实施方式的示例性多肽在Fujita等,Mol.Reprod.Dev.2006,75(7):1217-1228中公开，其公开通过引用其全部内容纳入本文。
根据上述实施方式中任一项的一些实例中，本公开提供了包含编码融合蛋白的外源性核酸的细菌(例如，乳酸细菌，如乳酸乳球菌)，所述融合蛋白包含(1)选自TFF多肽(例如，人TFF1，人TFF2或人TFF3)和MucBP多肽的黏蛋白结合多肽；和(2)选自CmbA多肽、Mub多肽、MapA多肽、MbpL多肽和SpaX多肽的细胞附着多肽。在根据该实施方式的一些实例中，融合蛋白包含CmbA多肽(例如，罗伊氏乳杆菌CmbA)和TFF多肽(例如，人TFF1、人TFF2或人TFF3)。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸被整合到微生物的染色体中，例如，细菌的染色体。在一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸在微生物(例如，细菌)中组成型表达。在其他实例中，编码融合蛋白的外源性核酸位于质粒上。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，融合蛋白由微生物(例如，细菌)表达。在其他实例中，融合蛋白锚固于微生物(例如，细菌)的细胞壁。例如，融合蛋白在微生物(例如，细菌)的表面(即，外膜)上展示。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸还包含编码分泌信号肽的分泌前导序列。在一些实例中，分泌前导序列包含编码未鉴定的45-kDa分泌蛋白(Usp45)的分泌前导物的核苷酸序列。这类分泌前导序列或肽在本文中称之为SSusp45。在一些实例中，SSusp45具有与SEQ ID NO:5至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在其他实例中，SSusp45由这样的核酸序列编码，所述核酸序列与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。源自革兰氏阳性细菌的任何分泌前导序列，例如，源自乳酸乳球菌的任何分泌前导序列能够用于上述实施方式内。在根据上述实施方式中任一项的其他实例中，分泌信号肽(例如，SSups45)与黏蛋白结合多肽结合，如TFF多肽。在根据该实施方式的一些实例中，SSups45与人TFF多肽结合。例如，融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:8至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在其他实例中，融合蛋白可以由与SEQ ID NO:9至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的外源核酸序列编码。
在其他实例中，微生物(例如，细菌)包含编码融合蛋白质的外源性核酸，所述融合蛋白包含TFF多肽和CmbA多肽，其中分泌信号肽与TFF多肽(例如，SSusp45)结合。例如，融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:10至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(或由其组成)。在其他实例中，融合蛋白可以由外源核酸序列编码，所述外源核酸序列包含与SEQ ID NO:11至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列(或由其组成)。
在一些实例中，分泌信号肽包括接头肽。在一些实例中，分泌信号肽切割自融合蛋白，例如，当融合蛋白锚固于微生物(例如，细菌)的细胞壁时。
在一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸由启动子转录性调节，所述启动子对于微生物(例如，细菌)为内源性的。在其他实例中，融合蛋白的表达由外源性启动子控制。在一些实例中，启动子选自thyA启动子(PthyA)，hlla启动子(PhllA)和gapB启动子。在其他实例中，编码融合蛋白的核酸受PthyA启动子转录性调节。在其他实例中，编码融合蛋白的外源性核酸受PhllA启动子转录性调节。其他启动子包括那些前述基因holA，soda，enoA，tufa，fbaA，acpA，ps431，malG，ptsH，dpsA，pgk，ahpC，pdhD，pts_II，pfk，trePP，ptnD，pgiA，usp45。其他合适的启动子述于例如美国专利公开2014/0105863中，其公开的内容通过引用全部纳入本文。
本公开进一步提供了包含融合蛋白(例如，锚固于微生物例如细菌的细胞壁)的微生物(例如，细菌)，其中融合蛋白包含TFF多肽和CmbA多肽。在一些实例中，微生物(例如，细菌)包含外源性核酸，该外源性核酸包含分泌前导序列，编码TFF多肽的序列和编码CmbA多肽的序列。在一些实例中，分泌前导序列编码分泌信号肽，该分泌信号肽切割自所述融合蛋白，例如，当融合蛋白穿过微生物(例如，细菌)胞质膜(例如，锚固于细胞壁)时。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，微生物是细菌。在根据上述实施方式中任一项的其他实例中，这类细菌是革兰氏阳性细菌，例如，非病原性革兰氏阳性细菌。在根据上述实施方式中任一项的其他实例中，细菌是乳酸细菌(LAB)。本文公开了示例性的乳酸细菌，其各自可以用于这些实施方式中。在一些实施方式中，LAB选自：乳球菌(Lactococcus species)，乳杆菌(Lactobacillus sp.)，双歧杆菌(Bifidobacteriumsp.)，链球菌(Streptococcus sp.)和肠球菌(Enterococcus sp.)。在一些实例中，LAB是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。在其他实例中，LAB选自乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)，乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactissubsp.hordniae)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。在一些实例中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亚种，如乳酸乳球菌菌株MG1363。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，细菌)包含编码融合蛋白的外源性核酸，所述融合蛋白包含TFF多肽和细胞附着多肽(例如，CmbA)。在根据该实施方式的一些实例中，TFF多肽选自TFF1、TFF2和TFF3。在根据该实施方式的其他实例中，TFF多肽选自人TFF，小鼠TFF，猪TFF，狗TFF，猫TFF，牛TFF和羊TFF。在一些实例中，TFF多肽是人TFF。在其他实例中，TFF多肽选自人TFF1，人TFF2和人TFF3。在其他一些实例中，TFF多肽是人TFF3。在一些实例中，TFF多肽具有与SEQ ID NO:3至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在其他实例中，TFF多肽是TFF变体多肽，例如，与相应的野生型TFF多肽相比黏蛋白结合能力增强的TFF变体多肽。在其他实例中，TFF多肽是两栖动物或鱼TFF多肽。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，细菌)还包含编码至少一种治疗性多肽的外源性核酸。在一些实例中，治疗性多肽是细胞因子，如白介素(IL)。基于待激活或抑制的是何种宿主响应进行细胞因子的选择。在一些实例中，细胞因子是IL-2、IL-10或IL-22。在其他实例中，治疗性多肽是抗原。在其他实例中，治疗性多肽是抗原和白介素，如IL-2、IL-10或IL-22。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，抗原是自体抗原，例如，T1D特异性抗原。示例性的T1D特异性抗原包括胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)，锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样多肽(ppIAPP)，外周蛋白和瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)，和它们的组合。上述T1D特异性抗原的示例性的氨基酸序列和核酸序列公开于例如国际专利申请公开号WO2017/122180中，其公开通过引用其全部内容纳入本文。在其他实例中，抗原是过敏原，例如树花粉过敏原，杂草花粉过敏原，草花粉过敏原，食物过敏原，尘螨过敏原，霉菌过敏原，动物皮屑过敏原或其组合。在一些实例中，过敏原是杂草花粉过敏原，例如，豚草花粉过敏原。在其他实例中，过敏原是树花粉过敏原，例如桦树花粉过敏原或日本柳杉花粉过敏原。在其他实例中，过敏原是食物过敏原，例如花生过敏原，奶过敏原，蛋过敏原，谷蛋白过敏原(麦醇溶蛋白表位)或其组合。
在其他实例中，治疗性多肽是抗体或其片段。例如，抗体是单结构域抗体(例如，骆驼或鲨鱼抗体)或纳米抗体。示例性的抗体包括细胞因子中和抗体，如对IL-4的抗体，对IL-5的抗体，对IL-7的抗体，对IL-13的抗体，对IL-15的抗体，以及对免疫球蛋白E(IgE)的抗TNFα抗体，或它们的任何片段。在一些实例中，治疗性多肽是融合蛋白。例如，治疗性抗体包含可溶性受体，如TNF受体(例如，可溶性TNF受体2)和抗体或抗体片段，如抗体的Fc区域。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，治疗性多肽包含人免疫球蛋白(例如，人IgG1Fc)的Fc区域。在一些实例中，治疗性多肽包含与人IgG1Fc融合的可溶性TNF受体2。在一些实例中，治疗性多肽是依那西普。
在其他实例中，治疗性多肽是酶或其片段(例如，功能性片段)，例如，苯丙氨酸脱氨酶(PAL)、氨基酸脱羧酶或其组合。在一实例中，治疗性多肽是PAL或其功能性片段。
在其他实例中，治疗性多肽是胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)或其任何组合。在另一实例中，治疗性多肽是生长因子，如表皮生长因子(EGF)，例如，人EGF或猪EGF。在其他实例中，治疗性多肽是TFF，如TFF1、TFF2、TFF3或其组合。
治疗性多肽可以是上述治疗性多肽中任何的组合。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，编码至少一种治疗性多肽的外源性核酸受选自下述的启动子转录性调节：gapB启动子(PgapB)、thyA启动子(PthyA)和hlla启动子(PhllA)。在一些实例中，编码至少一种治疗性多肽的外源性核酸受gapB启动子转录性调节(例如，在其控制下)。其他启动子包括那些前述基因holA，soda，enoA，tufa，fbaA，acpA，ps431，malG，ptsH，dpsA，pgk，ahpC，pdhD，pts_II，pfk，trePP，ptnD，pgiA，usp45。其他合适的启动子述于例如美国专利公开2014/0105863中，其公开的内容通过引用全部纳入本文。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，LAB)还包含突变和插入的组合以促进海藻糖累积，这将增强LAB针对胆盐与干燥的存活性。例如，它们可以是：
(i)染色体整合的一个或多个海藻糖转运体，如PhllA>>转运体1>>基因间区域>>转运体2，如llmg_0453和/或llmg_0454，用于摄取海藻糖；
(ii)位于usp45(Gene ID:4797218)下游的染色体整合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(otsB；Gene ID:1036914)以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；
(iii)失活的(例如，通过基因缺失)海藻糖-6-磷酸磷酸化酶基因(trePP；GeneID:4797140)；和
(iv)失活的纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(Gene ID:4796893)，ptcC，(例如，446的密码子位置30处的tga；tga30)。
例如，编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸，例如，otsB，如大肠杆菌otsB。在根据这些实施方式的一些实例中，编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸经染色体整合。在一些实例中，编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸经染色体整合未鉴定的45-kDa分泌蛋白基因(usp45)的3’。在根据该实施方式的一些实例中，LAB包含第二多顺反子表达盒，其包含usp45启动子，usp45基因(例如，启动子的3’)，和编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸(例如，usp45基因的3’)。在一些实例中，第二多顺反子表达盒进一步包含介于usp45基因和编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸之间的基因间区域。在一些实例中，第二多顺反子表达盒这样阐释：Pusp45>>usp45>>基因间区域>>otsB。在根据这些实施方式的一些实例中，基因间区域是如本文上述的rpmD(例如，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)。然后，第二多顺反子表达盒可以这样阐释：Pusp45>>usp45>>rpmD>>otsB。
在根据任何上述实施方式的一些实例中，在微生物(例如，LAB)中破坏或失活海藻糖-6-磷酸磷酸化酶基因(trePP)。例如，已经通过去除trePP基因或其片段将trePP失活，或已经通过插入终止密码子将trePP破坏。因此，在根据这些实施方式的一些实例中，微生物(例如，LAB)缺少trePP活性。
在根据任何上述实施方式的其他实例中，已经在微生物(例如，LAB)中破坏或失活纤维二糖特异性PTS系统IIC组分基因(ptcC)。例如，已经通过插入终止密码子破坏ptcC，或已经通过去除ptcC或其片段使ptcC失活。因此，在根据这些实施方式的一些实例中，微生物(例如，LAB)缺少ptcC活性。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，LAB进一步包含编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因。在一些实例中，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因对LAB为内源性的。在一些实例中，LAB过表达编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因。在根据这些实施方式的一些实例中，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因位于外源性启动子例如hllA启动子(PhllA)的3’处。例如，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因受PhllA转录性调节。在根据这些实施方式的一些实例中，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因选自llmg_0453、llmg_0454和其任何组合。在一些实例中，llmg_0453和llmg_0454由PhllA转录性调节。
在一些实例中，根据上述实施方式中任一项，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因包含编码两个或更多个海藻糖转运体的两个基因，其中基因间区域位于两个基因之间。在一些实例中，基因间区域是rpmD，例如，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。在一些实例中，微生物(例如，LAB)包含多顺反子表达盒，其包含编码两个不同海藻糖转运体(转运体1和转运体2序列)的两个核酸序列(例如，基因)以及介于编码两个不同海藻糖转运体的两个核酸之间的基因间区域。这类表达盒可以这样阐释：PhllA>>转运体1>>基因间区域>>转运体2。在根据这些实施方式的一些实例中，基因间区域是如本文上述的rpmD(例如，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)。然后，多顺反子表达盒可以这样阐释：PhllA>>转运体1>>rpmD>>转运体2。
因此，在一些实施方式中，LAB在单个菌株中包含数个有用的特征。在一实施方式中，LAB是乳酸乳球菌，其包含
(A)染色体整合的启动子>>分泌信号>>黏蛋白和细胞附着融合蛋白；
(B)一个或多个染色体整合的启动子>>分泌信号>>治疗蛋白；
(C)突变和插入的组合，用以促进海藻糖累积，其将增强LAB针对胆汁盐和干燥的生存能力。这些突变选自：
(i)一个或多个染色体整合的海藻糖转运体，如PhllA>>转运体1>>基因间区域>>转运体2，如llmg_0453和/或llmg_0454，用于摄取海藻糖；
(ii)位于usp45(Gene ID:4797218)下游的染色体整合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(otsB；Gene ID:1036914)以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；
(iii)失活的(例如，通过基因缺失)海藻糖-6-磷酸磷酸化酶基因(trePP；GeneID:4797140)；和
(iv)失活的纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(Gene ID:4796893)，ptcC，(例如，446的密码子位置30处的tga；tga30)。
LAB也可以包含用于生物容纳的营养缺陷型突变，如thyA。一个或更多个这样的功能(即，黏蛋白和细胞附着，治疗性蛋白质，海藻糖累积)可以在多顺反子操纵子中，其中各基因可以由基因间区域分离。
在一实施方式中，LAB是乳酸乳球菌，其具有：
(A)thyA突变，用于生物容纳
(B)染色体整合的PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA，以输出并连接至细胞壁黏液和细胞结合融合蛋白。
(C)染色体整合的PgapB>>gapB>>基因间区域(如rpmD)>>SSusp45>>pal，以由LAB分泌成熟PAL；
(D)一个或多个染色体整合的海藻糖转运体，如PhllA>>转运体1>>基因间区域>>转运体2，如llmg_0453和/或llmg_0454，用于摄取海藻糖；
(E)失活的(例如，通过基因缺失)海藻糖-6-磷酸磷酸化酶基因(trePP；Gene ID:4797140)；
(F)染色体整合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(otsB；Gene ID:1036914)(位于usp45(Gene ID:4797218)下游处以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；和
(G)失活的纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(Gene ID:4796893)，ptcC，(例如，446的密码子位置30处的tga；tga30)。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，与不包含所述遗传修饰的相应微生物(例如，细菌)，即不包含所述编码融合蛋白的外源性核酸或不包含所述融合蛋白的相应微生物(例如，细菌)相比，微生物(例如，细菌)胃肠(GI)通过时间延长。在一些实例中，胃肠通过时间延长至少约10％，至少约30％，至少约50％，至少约80％，至少约100％(至约2倍)。在一些实例中，胃肠通过时间延长至少约10％至约500％，至少约20％至约400％，至少约20％至约300％，至少约20％至约300％或至少约30％至约300％。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，与未经本文所述遗传修饰的相应微生物(例如，细菌)，即不包含编码融合蛋白的外源性核酸或不包含融合蛋白的相应微生物(例如，细菌)相比，微生物(例如，细菌)显现出体外黏蛋白结合能力增强。在一些实例中，体外黏蛋白结合能力增强至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或至少约100％(至约2倍)。在一些实例中，黏蛋白结合能力增强至少约10％至约500％，至少约10％至约400％，至少约10％至约300％，至少约10％至约200％，至少约20％至约200％，至少约20％至约300％或至少约20％至约500％。
可以根据任何本领域所认可的方法测量黏蛋白结合能力，例如，本文所述的那些。在一些实例中，体外黏蛋白结合能力这样测量：通过将微生物(例如，细菌)与固定的黏蛋白(例如，来自猪胃的黏蛋白)接触并结合，并且测量与黏蛋白结合的微生物细胞(例如，细菌细胞)的数量，例如，通过在合适波长下检测吸光率，例如，在405nm(OD405)；或通过用染料(例如，结晶紫)对结合的微生物细胞(例如，结合的细菌细胞)进行染色，随后在所用染料合适的波长下检测吸光率。例如，如果使用结晶紫对与黏蛋白结合的细菌细胞进行染色，可以在595nm(OD595)下测量吸光率。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，与不具有本文所述遗传修饰的相应微生物(例如，细菌)，即不包含编码融合蛋白的外源性核酸或不包含融合蛋白的相应微生物(例如，细菌)相比，微生物(例如，细菌)显现出体外Caco-2细胞结合能力增强。在一些实例中，体外Caco-2细胞结合能力增强至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约80％，至少约100％(至约2倍)，至少约200％，至少约300％或至少约400％(约5倍)。在一些实例中，体外Caco-2细胞结合能力增强至少约10％至约200％，至少约10％至约300％，至少约10％至约400％或至少约10％至约500％。Caco-2细胞结合能力可以根据任何本领域所认可的方法测量，例如，本文所公开的那些。例如，Caco-2细胞结合能力这样测量：(i)将微生物(例如，细菌)，例如微生物(例如，细菌)的培养物与Caco-2细胞接触；(ii)洗涤Caco-2细胞以去除未结合的微生物(例如，细菌细胞)；(iii)分离与Caco-2细胞结合的微生物细胞(例如，细菌细胞)；和(iv)确定分离的细菌细胞的数量(即，滴定测量分离的细胞)，例如，如本文所述。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，与不具有本文所述遗传修饰的相应微生物(例如，细菌)，即不包含编码融合蛋白的外源性核酸或不包含融合蛋白的相应微生物(例如，细菌)相比，微生物(例如，细菌)显现出对粘膜的附着增强。在一些实例中，微生物(例如，细菌)对肠粘膜的附着增强至少约10％至约100％(至约2倍)，至少约10％至约200％，至少约10％至约400％或至少约10％至约500％。
本公开还提供了包含本文公开的微生物(例如，细菌)的组合物，例如，上述实施方式中任一项所述的微生物(例如，细菌)。例如，本公开提供了包含微生物(例如，细菌)的组合物，所述微生物含有融合蛋白(例如，锚固于微生物例如细菌的细胞壁)，其中融合蛋白包含TFF多肽和CmbA多肽。在一些实例中，微生物(例如，细菌)包含外源性核酸，该外源性核酸包含分泌前导序列(例如，Ssusp45)，编码TFF多肽的序列和编码CmbA多肽的序列。在一些实例中，分泌前导序列编码分泌信号肽，该分泌信号肽切割自融合蛋白，例如，当融合蛋白穿过细菌的胞质膜时。
本公开还提供了包含本文公开的微生物(例如，细菌)和药学上可接受的运载体的药物组合物。例如，药物组合物包含上述实施方式中任一项所述的微生物(例如，细菌)。
本公开还提供了本文公开的微生物(例如，细菌)的组合物或本公开的组合物(例如，药物组合物)在治疗疾病中的用途。本公开还提供了微生物(例如，细菌)或组合物(例如，药物组合物)在制备用于预防或治疗疾病的药物中用途。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，疾病选自：自身免疫疾病，过敏，营养或代谢疾病，胃肠疾病和遗传疾病。本文描述了可以使用本公开的微生物(例如，细菌)和组合物治疗的其他疾病。
本公开还包括编码融合蛋白的分离核酸，所述核酸包含：(i)编码黏蛋白结合多肽如TFF多肽(例如，TFF1、TFF2或TFF3)或MucBP多肽的序列；(ii)编码细胞附着多肽如CmbA多肽、Mub多肽、MapA多肽或MbpL多肽的序列。在一些实例中，根据这些实施方式，细胞附着多肽是CmbA多肽。相应地，本公开提供了编码多肽的分离核酸，其中该核酸包含(i)编码TFF多肽如TFF1(例如，人TFF1)、TFF2(例如，人TFF2)或TFF3(例如，人TFF3)的序列，和(ii)编码CmbA多肽的序列。
本公开还提供了包含本文公开的分离核酸的质粒，例如，根据上述实施方式中任一项所述的分离核酸。
本公开还提供了包含本文公开的分离核酸或本公开的质粒的微生物(例如，细菌)宿主细胞。
本公开还提供了试剂盒，其包括(1)微生物(例如，细菌)，组合物，药物组合物或本公开的单位剂型；和(2)用于给予微生物(例如，细菌)，组合物，药物组合物或本公开的单位剂型至哺乳动物(如动物或人对象或患者)的说明书。
方法
本公开还提供了在有此需要的对象中治疗疾病的方法。示例性的方法包括：向对象给予治疗有效量的本发明的微生物(例如，细菌)，组合物，药物组合物。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，细菌)包含编码本文所述治疗性多肽的外源性核酸。本文描述了可以使用本公开的微生物(例如，细菌)和组合物治疗的示例性疾病。在一些实例中，疾病是自身免疫疾病，过敏，营养或代谢疾病，胃肠疾病，遗传疾病或其组合。在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，疾病是自身免疫疾病，如1型糖尿病(T1D)在其他实例中，疾病是代谢性疾病，如苯丙酮尿(PKU)。在其他实例中，疾病是胃肠疾病，如乳糜泻，或炎症性肠病(IBD)，例如，克罗恩病或溃疡性结肠炎。在其他实例中，疾病是生长迟缓。
在一些实施方式中，疾病是苯丙酮尿(PKU)。在根据该实施方式的一些实例中，微生物(例如，细菌)包含编码多肽的外源性核酸，例如，能够降解苯丙氨酸(Phe)的酶，例如，在胃肠道中，例如，在给予微生物的对象吸收Phe之前。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，细菌)包含编码苯丙氨酸脱氨酶(PAL)的外源性核酸，所述PAL将Phe转化成肉桂酸。因此，本公开提供了在有此需要的对象中治疗PKU的方法。示例性的方法包括：向对象给予治疗有效量的本发明的微生物(例如，细菌)，组合物，药物组合物，其中，所述微生物(例如，细菌)包含编码PAL的外源性核酸。抑制Phe吸收和PKU的治疗可以使用小鼠PKU模型分析，例如，利用(enu2/2)小鼠(参见例如，Sarkissian,C.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96:2339-2344)或使用大鼠模型(参见例如，Chang等,Artif.Cells Blood Substit.Immobil.Biotechnol.1995,23(1):1-21)。
本公开还提供了用于制备遗传修饰的微生物(例如，细菌)的方法。示例性的方法包括：将编码融合蛋白的外源性核酸与微生物(例如，细菌)接触，其中编码融合蛋白的外源性核酸包含编码细胞附着多肽的序列，如CmbA多肽、Mub多肽、MapA多肽或MbpL多肽。在一些实例中，细胞附着多肽是CmbA，例如，罗伊氏乳杆菌CmbA。在一些实例中，进行上述方法(即，将微生物与外源性核酸接触)产生这样的微生物(例如细菌)，所述微生物包含编码融合蛋白的外源性核酸。在其他实例中，将微生物(例如，细菌)与外源性核酸接触产生这样的微生物(例如，细菌)，其包含编码融合蛋白的外源性核酸，从而表达外源性核酸编码的融合蛋白。在一些实例中，该方法还包括培养微生物(例如，细菌)并在微生物(例如，细菌)中表达融合蛋白。在一些实例中，接触发生在足以使所述细菌将外源性核酸内化的条件下。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，外源性核酸位于质粒。在根据这些实施方式的一些实例中，外源性核酸被整合到细菌的染色体中。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸还包含编码黏蛋白结合肽如三叶因子(TFF)多肽或MucBP多肽的序列。在一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸包含编码CmbA的序列和编码TFF多肽的序列。相应地，本公开还还提供了用于制备遗传修饰的微生物(例如，细菌)的方法，所述方法包括：将编码融合蛋白的外源性核酸与微生物(例如，细菌)接触，其中编码融合蛋白的外源性核酸包含(i)编码TFF多肽(例如，TFF1、TFF2或TFF3)的序列和(ii)编码CmbA的序列。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸经染色体整合(例如，被整合到细菌的染色体中)，例如，通过使用同源重组。根据该实施方式，该方法可以还包括形成这样的质粒(即，整合质粒)，所述质粒包含编码融合蛋白的外源性核酸。
在根据上述实施方式中任一项的一个实例中，该方法还包括将微生物(例如，细菌)与编码治疗性多肽的外源性核酸接触，例如，在将微生物(例如，细菌)与编码融合融合蛋白的外源性核酸接触之前或之后。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，与未经本方法修饰的相应微生物(例如，细菌)，即不包含编码融合蛋白的外源性核酸的相应微生物(例如，细菌)相比，通过上述方法制备的遗传修饰的微生物(例如，细菌)显现出黏液粘附和/或细胞粘附特性增强。
在相关实施方式中，对粘膜和/或细胞的粘附对粘膜和/或细胞的类型具有特异性。由于对特定细胞或黏液中存在的特定受体的优选结合，细菌可以定位于特定位点。以此方式，有可能保证将细菌定位于递送特定分子最有效的位点。在一些实施方式中，位置可能是粘膜(肠、口腔、眼、耳、泌尿生殖)。在一些实施方式中，位置可能是小肠，在一些实施方式中，位置可能是小肠上部。
在一些实例中，该方法还包括将遗传修饰的细菌的培养物与至少一种冷冻剂组合以形成细菌混合物。该方法可以还包括使细菌混合物干燥(例如，冻干或喷雾干燥)以形成干燥的(例如，冻干的)组合物。该方法可以还包括将遗传修饰的细菌或干燥的组合物(例如，冷冻干燥的组合物)与药学上可接受的运载体组合以形成药物组合物。该方法可以还包括将遗传修饰的细菌、干燥的(例如，冻干的)组合物或药学组合物配制成药学单位剂型，如片剂、胶囊或颗粒。
本公开还提供了单位剂型，其包含本公开的至少一种微生物(例如，细菌)、组合物或药学组合物。在一些实例中，这类单位剂型是口服剂型。在根据这些实施方式的一些实例中，单位剂型是胶囊(例如，含有粉末或含有微丸或微颗粒的胶囊)、片剂、颗粒、囊剂或包装的液体，例如，悬浮液。在其他实施方式中，单位剂型是计量的气雾剂或栓剂。
在一些实施方式中，剂型中包含的微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)是干粉形式或其压缩的形式。
本公开还提供了单位剂型，其包含约1×104至约1×1012菌落形成单位(cfu)本公开的微生物，例如，非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。在一些实施方式中，单位剂型包含约1×106至约1×1012菌落形成单位(cfu)的微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。在其他实施方式中，单位剂型包含约1×109至约1×1012菌落形成单位(cfu)的微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。
在上述方法中任一项的一些实施方式中，口服给予对象微生物(例如，细菌)。例如，微生物(例如，细菌)以用于口服给予的药物组合物的形式(例如，胶囊、片剂、颗粒或液体)给予对象，其包含微生物(例如，细菌)和药物学上可接受的运载体。在其他实例中，微生物(例如，细菌)以食物产品的形式给予对象或添加到食物(例如，饮品)。在其他实例中，微生物(例如，细菌)以膳食补充品的形式给予对象。在其他实例中，微生物(例如，细菌)以栓剂产品的形式给予对象。在一些实例中，本公开的组合物适用于多肽的粘膜递送，其通过微生物(例如，细菌)表达。例如，可以配制组合物用于在对象的胃肠道中有效释放治疗性多肽。
本公开还提供了根据上述实施方式中任一项的方法制备的遗传修饰的细菌，组合物，药物组合物或单位剂型。
本公开还提供了用于促进哺乳动物生长的方法。示例性的方法包括向哺乳动物给予治疗有效量的本发明的微生物(例如，细菌)，组合物，药物组合物或单位剂型。在一些实例中，哺乳动物是人，家畜(例如，猪，牛，山羊或绵羊)，狗，猫或其他家养动物。在一些实例中，配制微生物(例如，细菌)、组合物、药物组合物或单位剂型，用于给予哺乳动物，例如，配制用于口服给予。在一些实例中，在该方法中采用的微生物(例如，细菌)包含编码生长因子或生长激素的外源性核酸。在根据该实施方式的一些实例中，生长因子或生长激素在微生物(例如，细菌)中组成型表达。在一些实例中，生长因子是EGF。在其他实例中，哺乳动物是猪，并且EGF是猪EGF。
本公开还提供了用于增加微生物(例如，细菌)与肠粘膜结合的方法(例如，由与黏蛋白制备物的体内结合测量)。示例性的方法包括，将微生物(例如，细菌)与编码融合蛋白的外源性核酸接触，其中编码融合蛋白的外源性核酸包含编码CmbA多肽的序列；并在微生物(例如，细菌)中表达编码融合蛋白的外源性核酸。在一些实例中，编码融合蛋白的外源性核酸还包含编码黏蛋白结合多肽如TFF多肽的序列。在一些实例中，由微生物(例如，细菌)表达编码融合蛋白的外源性核酸产生这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含TFF多肽和CmbA多肽。
在根据如上所述组合物和方法中任一项的一些实例中，微生物是非病原性微生物，例如，由哺乳动物对象消化安全的任何微生物。在其他实施方式中，在上述组合物和方法中的微生物是酵母。酵母可选自酵母属(Saccharomyces)，汉逊酵母(Hansenula)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)，萨左酵母(Schizzosaccharomyces)，接合酵母(Zygosaccharomyces)，毕赤酵母(Pichia)，红曲霉(Monascus)，地丝菌(Geothchum)和耶氏酵母。在一些实例中，酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在上述组合物和方法的其他实施方式中，非病原性组合物细菌是非病原性微生物。在根据该实施方式的一些实例中，非病原性细菌是革兰氏阳性细菌。在其他实例中，革兰氏阳性细菌是乳酸发酵细菌(LAB)，例如，选自乳球菌Lactococcus(例如，乳酸乳球菌Lactococcus lactis)，乳杆菌Lactobacillus和双歧杆菌Bifidobacterium。在其他方法中，非病原性细菌是链球菌Streptococcus或肠球菌Enterococcus。本文公开了三个其他细菌物种。
附图说明
图1是PthyA>>SSusp45-htff3-CmbA表达/thyA整合载体pAGX2005的质粒图。缩写：thyA5’，MG1363胸苷合酶A(thyA)基因的5’侧接区；PthyA，MG1363的thyA启动子；SSups45，编码MG163蛋白usp45分泌信号的基因；hTFF3，具有对乳酸乳球菌的优选密码子的编码人三叶因子3的基因；CmbA，编码罗伊氏乳杆菌ATCC PTA6474细胞和黏液结合蛋白A的基因；thyA3’，MG1363的thyA基因的3’侧接区域；ORI，质粒pORI19的复制起点；Em，红霉素抗性标志物。
图2A-B是显示细菌(乳酸乳球菌)细胞对黏蛋白结合增强的图表，并且其中使用OD405(图2A)或结晶紫染色(图2B)来测量黏蛋白结合。pAGX1417：携带空质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX1894：携带用于在细菌表面表达hTFF1-SpaX的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX2005:携带用于在细菌表面上表达hTFF3-CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108。II型黏蛋白＝来自猪胃的黏蛋白，结合的唾液酸，～1％；III型黏蛋白＝来自猪胃的黏蛋白，结合的唾液酸(0.5-1.5％)。
图3显示了细菌(乳酸乳球菌)细胞对Caco-2细胞的附着增强。pAGX1417：携带空质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX1893：携带用于在细菌表面表达CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX1894：携带用于在细菌表面表达hTFF1-spaX的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX2005：携带用于在细菌表面表达hTTF3-CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108。
图4显示了示例性的SSusp45-htff3构建体(氨基酸和核酸序列分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)。
图5A-D一起显示了示例性的SSusp45-hTFF3-CmbA的构建体(氨基酸和核酸序列分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)。
图6是显示细菌(乳酸乳酸菌)细胞与Caco-2细胞附着增强的图表，其中细胞附加体型或组成型表达示例性的细胞附着多肽(CmbA)或示例性的融合蛋白(hTFF3-CmbA)。％回收＝洗涤后回收自黏蛋白涂覆的孔的乳酸乳球菌细胞相较于全部施用的乳酸乳球菌细胞的％，其由集落形成单位计数确定。pAGX1893：携带用于在细菌表面表达CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX2005：携带用于在细菌表面表达hTFF3-CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；sAGX0618：组成型表达示例性治疗性多肽PAL(PgapB>>pal)和组成型表达CmbA于细菌表面(thyA-；PthyA>>cmbA)的乳球菌菌株MG1363；sAGX644：组成型表达示例性治疗性多肽PAL(PgapB>>pal)和组成型表达融合蛋白hTFF3-CmbA于细菌表面的乳酸乳球菌菌株MG1363，其中编码融合蛋白的外源性核酸由thyA基因座处内源性thyA启动子转录性调节(thyA-；PthyA>>SSusp45-htff3-mbA)；sAGX660：组成型表达示例性治疗性多肽PAL(PgapB>>pal)和组成型表达融合蛋白hTFF3-CmbA于细菌表面的乳酸乳球菌菌株MG1363，其中编码融合蛋白的外源性核酸由thyA基因座的hllA启动子转录性调节(thyA-；PhllA>>SSusp45-htff3-cmbA)。
图7是显示细菌(乳酸乳酸菌)细胞与黏蛋白结合增强的图表，其中细胞附加体型或组成型表达示例性的细胞附着多肽(CmbA)或示例性的融合蛋白(hTFF3-CmbA)，并且其中黏蛋白结合使用OD405(图7A)或结晶紫染色(图7B)测量，如本文所述，例如，在实施例6中。pAGX1893：携带用于在细菌表面表达CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；pAGX2005：携带用于在细菌表面表达hTFF3-CmbA的质粒的乳酸乳球菌菌株LL108；sAGX0618：组成型表达示例性治疗性多肽PAL(PgapB>>pal)和组成型表达CmbA于细菌表面(thyA-；PthyA>>cmbA)的乳球菌菌株MG1363；sAGX644：组成型表达示例性治疗性多肽PAL(PgapB>>pal)和组成型表达融合蛋白hTFF3-CmbA于细菌表面的乳酸乳球菌菌株MG1363，其中编码融合蛋白的外源性核酸由thyA基因座处内源性thyA启动子转录性调节(thyA-；PthyA>>SSusp45-htff3-cmbA)；sAGX660：组成型表达示例性治疗性多肽PAL(PgapB>>pal)和组成型表达融合蛋白htff3-CmbA于细菌表面的乳酸乳球菌菌株MG1363，其中编码融合蛋白的外源性核酸由thyA基因座的hllA启动子转录性调节(thyA-；PhllA>>SSusp45-htff3-cmbA)。
图8是显示由细菌细胞产生示例性治疗性多肽(PAL)的图表，所述细菌细胞不表达粘膜粘附性多肽(sAGX0599)，在细胞表面表达示例性细胞附着多肽CmbA(sAGX0618)，或在细胞表面表达示例性融合蛋白hTFF3-CmbA(sAGX0644(thyA-；PthyA>>SSusp45-htff3-cmbA)和sAGX0660(thyA-；PhllA>>SSusp45-htff3-cmbA))。PAL生产(μg/109细胞)在产PAL的菌株之间相当。
图9A-D显示了口服给予表达PAL的乳酸乳球菌降低苯丙氨酸的血液浓度。阴性CTR＝无乳酸乳球菌，仅丸剂；阳性CTR＝乳酸乳球菌菌株NZ9000[pAGX1886]，尼生素诱导的PAL(AGX No 3151)；乳酸乳球菌-PAL＝sAGX0599(AGX No 2947)，分泌PAL；乳酸乳球菌-PAL+TFF3-CmbA＝sAGX0645粘膜粘附菌株(AGX No 3290)，分泌PAL并且具有表面TFF3-CmbA，其是细胞和粘膜粘附。图9A-B显示了给予放射性标记的Phe的丸剂后随时间测量的Phe和Tyr的血液水平，而图9C-D显示了相应的AUC。新的构建体与较低水平的血液Phe相关。给予表达PAL和TFF3-CmbA融和蛋白的乳酸乳球菌的小鼠中Phe的最终水平最低。
具体实施方式
本公开提供微生物(例如，乳酸细菌，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))，该微生物显示出对黏蛋白的体外结合增强和对细胞的体外结合增强，例如，对Caco-2细胞的附着增强。在一些实施方式中，这类微生物具有延长的胃肠通过时间。例如，这类微生物还可以表达治疗性多肽。在一些实例中，向哺乳动物对象口服给予这类细菌后，细菌在胃肠道不同部分的停留时间延长，并且对象暴露于胃肠道中的治疗性多肽持续较长的一段时间。例如，一旦例如，由十二指肠中保护涂覆的胶囊释放细菌，则通过表面展示/表达与肠粘膜结合或相互作用的黏液和细胞粘附蛋白来延长延长空肠和回肠中细菌的停留时间。相应地，可以降低细菌剂量，具有较低表达概况的微生物对于给予治疗有效剂量变的可以接受，可以研发较小的单位剂量，并且可以采用具有较低给药频率的方案(例如，提高患者依从性)。
例如，本公开提供了包含外源性核酸的微生物，所述外源性核酸编码人三叶因子(hTFF3)与乳酸乳球菌表面罗伊氏乳杆菌的细胞和黏蛋白结合蛋白A(CmbA)的融合蛋白。示例性的融合蛋白包括乳酸乳球菌蛋白usp45的分泌信号(参见例如，Van Asseldonk等,Mol.Gen.Genet.1993,240:428-434)，融合至hTFF3(参见例如，Tomasetto等,Gastroenterology 2000,118(1):70-80)和罗伊氏乳杆菌CmbA(例如，不具有其分泌信号)。SSusp45-hTFF3-CmbA融合蛋白通过usp45分泌信号的方式分泌，并当hTFF3-CmbA融合蛋白穿过乳酸乳球菌胞质膜时切割分泌信号肽。CmbA的外部部分可以结合肠上皮细胞。通过融合hTTF3至CmbA蛋白，添加了额外的黏液结合单位。hTFF3-CmbA的表达和表面展示能够增强对肠粘膜的附着并导致经修饰的乳酸乳球菌细胞的肠道穿过时间变慢。
定义
在本说明书和权利要求中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。例如，术语“一个细胞”可以包括多个细胞，并包括其混合物。类似地，除非上下文另有明确规定，否则使用“一种化合物”来治疗或制备如本文所述的药物包括使用一种或多种本发明的化合物进行这种治疗或制备。
与参考数值相关的术语“约”及其在此使用的语法等同物可以包括参考数值本身和从该参考数值加上或减去10％的值的范围。例如，术语“约10”包括10和从9到11的任何量。在一些情况下，与参考数值相关的术语“约”还可以包括值的范围加或减该参考数值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％。在一些实施方式中，与通过特定方法测量的范围或数字有关的“约”指示给定的数值包括通过该方法变异确定的值。
如本文所用，术语“包括”或“包含”意在表示所述组合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。当用以定义组合物和方法时，“基本由……组成”应表示排除对于该组合物具有任何基本意义的其它要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的运载体，例如磷酸盐缓冲盐水，防腐剂等。“由……组成”表示排除多于用于给予本发明的组合物的微量元素的其它成分和基本方法步骤。通过各这些转换术语定义的实施方式在本发明范围内。
可以使用商业上可获得的算法计算多肽序列间的百分比相同性，所述算法比较参考序列与查询序列。在一些实施方式中，使用默认参数，多肽与参考多肽或其片段是70％，至少70％，75％，至少75％，80％，至少80％，85％，至少85％，90％，至少90％，92％，至少92％，95％，至少95％，97％，至少97％，98％，至少98％，99％或至少99％或100％相同(例如，通过BLASTP或CLUSTAL或其他比对软件)。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以是与参考核酸或其片段50％，至少50％，60％，至少60％，70％，至少70％，75％75％，80％，至少80％，85％，至少85％，90％，至少90％，95％，至少95％，97％，至少97％，98％，至少98％，99％，至少99％或100％相同(例如，通过BLASTN或CLUSTAL或使用默认参数的其他比对软件测量)。当一个分子被认为与较大分子具有一定百分比的序列相同性时，这意味着当两个分子是最佳比对时，较小分子中所述百分比的残基根据两个分子最佳比对的顺序在较大分子中找到匹配残基，并且根据较小分子的长度计算“％(百分比)”相同。
应当理解的是，细菌内外来蛋白质的表达通常需要修饰。这些修饰包括修饰核酸以去除细菌不识别的内含子和其他真核核酸基序，并且优化对宿主的密码子使用。
此外，修饰蛋白质以去除天然宿主中适当处理需要但是不被细菌宿主识别的基序，如真核生物或其他种类的细菌的分泌信号。因此，当参考正在细菌中表达的外来蛋白质时，本领域技术人员将理解其指代成熟形式。例如，人IL-10在人细胞中翻译，具有分泌前导序列，该序列不存在于由细胞分泌的成熟IL-10中。真核分泌前导序列在细菌中无功能。相应地，乳酸乳球菌还包含表达“IL-10”的核酸，其包含成熟的IL-10蛋白。
如本文所用，术语“表达”基因或多肽或“产生”多肽(例如，PAL，或IL-2多肽或T1D特异性抗原多肽)意在分别包括“能够表达”和“能够产生”。例如，含有外源核酸的微生物可以在充分条件下(例如，充分水合和/或在营养物存在下)产生由外源核酸编码的多肽。然而，微生物可能不总是主动产生编码的多肽。可以将微生物(例如，细菌)干燥(例如，冷冻干燥)，并且在该状态下可以认为是休眠的(即，不是主动产生多肽)。然而，一旦微生物经受足够的条件，例如，给予对象并释放(例如，进入对象的胃肠道)，它可以开始产生多肽。因此，“表达”基因或多肽或“产生”本公开的多肽的微生物包括处于其“休眠”状态的微生物。
本文所用术语“组成型”在启动子上下文中(或通过与多肽的分泌或基因表达关联延伸)表示允许连续转录其相关基因的启动子。
术语“染色体整合”或“整合到染色体中”或其任何变化指核酸序列(例如，基因；开放阅读框；编码多肽的外源性核酸；启动子；表达盒；等)位于微生物(例如，细菌)染色体(整合到其中)，即并不位于附加型载体如质粒上。在一些实施方式中，其中的核酸序列经染色体整合，组成型表达由这类染色体整合的核酸编码的多肽。
术语“分泌前导序列”，“分泌前导物”和“分泌信号序列”在本文中可互换使用。该术语根据其本领域公认的含义使用，并且通常指核酸序列，其编码“信号肽”或“分泌信号肽”，导致多肽由微生物表达并包含待由微生物分泌的信号肽，即，导致多肽离开胞内空间，例如，分泌到周围介质中，或锚固于细胞壁，并且该多肽的至少部分暴露于周围介质，例如，微生物的表面上。
治疗性多肽
术语“治疗性多肽”包括具有治疗性、预防性或其他生物活性(例如，在哺乳动物对象中)或具有激发生物活性潜能的任何多肽。实例包括已知的生物制剂(经批准和经研究)，和任何信号多肽，如激素和细胞因子，和它们的受体、激动剂和拮抗剂。“治疗性多肽”可由相应的野生型多肽修饰。在一些实例中，治疗性多肽是细胞因子，例如，白介素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21或IL-22。
在其他实例中，治疗性多肽是抗原。在根据该实施方式的一些实例中，抗原是“自体抗原”或自身抗原。术语“自身抗原”或“自体抗原”在本文中可互换使用。这些术语在本文中根据本领域公认的自身抗原或自抗原的含义使用，并且通常是指源自对象自身体内(由对象自身体内产生)的多肽/蛋白质，其中所述抗原被对象自身的免疫系统识别，通常产生针对这种抗原的抗体。自身免疫疾病通常与某些疾病特异性自身抗原相关。例如，在T1D中，对象的免疫系统可以产生针对与β细胞破坏过程相关的至少一种抗原的抗体。在一些实例中，自体抗原是T1D-特异性抗原。示例性的T1D-特异性抗原包括胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、锌转运蛋白(ZnT8)及其任何组合。临床T1D还可以与由β细胞表达的其他候选靶分子相关，例如嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样蛋白多肽(ppIAPP)，外周蛋白，和瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)及其任何组合。上述T1D特异性抗原的示例性的氨基酸序列和核酸序列公开于例如临时专利申请62/350,472(申请于2016年6月15日)中，其公开通过引用其全部内容纳入本文。在一些实例中，T1D-特异性抗原是PINS，如野生型人PINS。参见例如，访问号NM_000207.2中包含的CDS，或与这类野生型人PINS至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％序列相同的序列。其他示例性PINS核苷酸序列由NCBI登录号AY899304(完整CDS，可选剪接)；NM_000207(转录物变体1)；NM_001185097(转录物变体2)；NM_001185098(转录物变体3)；NM_001291897(转录物变体4)的编码序列及其部分序列表示。示例性PINS氨基酸序列包括由任何一种上述PINS核酸序列编码的那些。
在其他实例中，抗原是过敏原，例如树花粉过敏原，杂草花粉过敏原，草花粉过敏原，食物过敏原，尘螨过敏原，霉菌过敏原，动物皮屑过敏原，或其组合。在一些实例中，过敏原是杂草花粉过敏原，例如，豚草花粉过敏原。在其他实例中，过敏原是树花粉过敏原，例如桦树花粉过敏原或日本柳杉花粉过敏原。在其他实例中，过敏原是食物过敏原，例如花生过敏原，奶过敏原，蛋过敏原，谷蛋白过敏原(麦醇溶蛋白表位)，或其组合。在其他实例中，治疗性多肽是抗原和白介素，如IL-2、IL-10或IL-22。
在其他实例中，治疗性多肽是抗体或其片段。例如，抗体是单结构域抗体或纳米抗体。示例性的抗体包括细胞因子中和抗体，如对IL-4的抗体，对IL-5的抗体，对IL-7的抗体，对IL-13的抗体，对IL-15的抗体，以及抗TNFα抗体，对免疫球蛋白E(IgE)的抗体，或其任何片段。
在其他实例中，治疗性多肽是酶或其片段(例如，功能性片段)，例如，苯丙氨酸脱氨酶(PAL)、氨基酸脱羧酶、或其组合。在一实例中，治疗性多肽是PAL或其功能性片段。能够用于该实施方式的示例性PAL公开于，例如，国际专利申请公开号WO 2014/066945中，其公开的内容通过引用全部纳入本文。PAL代谢苯丙氨酸并因此可以降低由肠吸收Phe进入血液的水平，并因此可以用于治疗苯丙酮尿。还可以使用其他酶来降解Phe，如芳香族氨基酸脱羧酶，如苯丙氨酸脱羧酶。在一些实施方式中，给予对象表达并分泌PAL和次级苯丙氨酸降解酶的细菌。在一些实施方式中，给予对象表达并分泌PAL的细菌，和表达并分泌次级苯丙氨酸降解酶的另一细菌。
在另一实例中，细菌经工程改造以增强细胞内Phe摄取和利用。给予这类细菌可以进一步减少患者吸收Phe的量。
在其他实例中，治疗性多肽是胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)或其任何组合。在另一实例中，治疗性多肽是生长因子，如表皮生长因子(EGF)，例如，人EGF或猪EGF。在其他实例中，治疗性多肽是TFF，如TFF1、TFF2、TFF3或其组合。
在一些实例中，治疗性多肽是免疫调节化合物。术语“免疫调节化合物”或“免疫调节剂”在本文中根据其本领域公认的含义使用。免疫调节化合物可以是本领域技术人员已知的任何免疫调节化合物。在一些实施方式中，免疫调节化合物是耐受诱导型化合物。例如，通过诱导调节性T细胞，或以间接方式，例如通过激活未成熟树突细胞以耐受树突细胞和/或抑制Th2免疫应答诱导在成熟的树突状细胞上“共刺激”因子的表达，可以获得耐受性诱导。免疫调节和免疫抑制化合物是本领域技术人员已知的，包括但不限于细菌代谢物如精胍菌素(spergualin)，真菌和链霉素代谢物如他克莫司或环孢菌素，免疫抑制细胞因子如IL-4，IL-10，IFNα，TGFβ(作为调节性T细胞的选择性佐剂)Flt3L，TSLP和Rank-L(作为选择性致耐受性DC诱导剂)，抗体和/或拮抗剂(例如，抗体)如抗CD40L，抗CD25，抗-CD20，抗IgE，抗CD3和蛋白质，肽或融合蛋白，例如CTL-41g或CTLA-4激动剂融合蛋白。在一些实施方式中，免疫调节化合物是免疫抑制化合物。在其他实施方式中，免疫抑制化合物是免疫抑制细胞因子或抗体。在其他实施方式中，免疫抑制细胞因子是耐受性增强细胞因子或抗体。本领域技术人员将理解，术语“免疫调节化合物”还包括其功能同源物。功能同系物是具有与预期目的基本相同或相似的功能的分子，但可以在结构上不同。在一些实例中，免疫调节化合物是抗-CD3抗体或其功能同源物。
本公开的微生物可以表达超过一种或至少一种治疗性多肽。治疗性多肽可以是上述治疗性多肽中任一项的组合。
疾病
本文的微生物(例如，细菌)、组合物和方法可以用于治疗或预防任何疾病，例如，可以通过在粘膜(例如，胃肠粘膜)位置处具有活性的生物活性多肽治疗的那些疾病。可以使用本公开的方法治疗或预防的示例性疾病包括自身免疫疾病，过敏，营养或代谢疾病，胃肠疾病和遗传疾病或其任何组合。
术语“营养疾病”包括与加工食品或营养不足相关并且可能导致(例如在营养不良中)体重降低或其他并发症狀(如胀气)的任何疾病。“营养疾病”可能与加工食品或食品成分如脂类和碳水化合物的特定酶(如脂肪酶，蛋白酶或糖降解酶)的不足产生相关。术语“营养疾病”包括生物体中可以增强的任何代谢过程，即使不存在限定的病症或疾病(“代谢增强”，例如，某些农场动物如猪、牛、鸟或羊可以经治疗以更快速地生长或累积更高的体重)。在一些实例中，“营养疾病”是基于这些食品或食品成分的代谢不足或异常如乳糖不耐症而对某些食品或食品成分的不耐受。术语“营养疾病”涉及“代谢疾病”或“代谢紊乱”，在本文中可互换使用。术语“代谢疾病”根据其本领域公认的含义在本文中使用，并且通常指任何病症，其中身体中的不正常化学反应改变正常的代谢过程。在一些实例中，代谢疾病由遗传缺陷导致，并且可以是遗传的。代谢疾病的实例包括酸碱失衡，代谢性脑疾病，钙代谢紊乱，DNA修复缺陷症，葡萄糖代谢紊乱，高乳酸血症，铁代谢紊乱和脂质代谢紊乱。
营养或代谢疾病的其他实例包括葡萄糖和/或半乳糖吸收不良，莱施-奈恩(Lesch-Nyhan)综合征，曼克斯(Menkes)综合征，肥胖症，胰腺癌，普拉德-威利(Prader-Willi)综合征，卟啉症，雷夫叙姆病(Refsum disease)，丹吉尔病(Tangier disease)，威尔森氏病(Wilson’s disease)，贺勒氏(Hurler)综合征(例如，特征在于骨结构异常和发育迟缓)，尼曼匹克病(Niemann-Pick disease)(例如，婴儿出现肝脏肿大，喂养困难和神经损伤)，泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)(例如，特征在于幼儿进行性衰弱，进展为严重神经损伤)，戈谢病(例如，特征在于骨痛，肝脏肿大，血小板计数低)；法布里病(例如，特征在于幼年期的四肢疼痛，以及在成年期的肾脏和心脏病和中风)，克拉伯病(例如，特征在于进行性神经损伤，幼儿发育迟缓)；半乳糖血症(例如，特征在于糖半乳糖分解受损，可导致新生儿进行母乳或配方奶喂养后出现黄疸，呕吐和肝脏肿大)；枫糖浆尿病(例如，特征在于酶BCKD缺乏，导致体内氨基酸累积)；苯丙酮尿症(PKU)，糖原贮积病(例如，特征在于低血糖水平，肌肉疼痛和虚弱)；线粒体疾病，弗里德赖希共济失调(例如，特征在于与蛋白质共济蛋白有关的问题，其可能导致神经损伤、心脏问题、无法行走)和过氧化物酶体疾病(例如，特征在于过氧化物酶体内部酶功能差，其可能导致积聚有毒代谢物)。示例性的过氧化物酶体异常包括，例如，赵苇格氏症(Zellweger syndrome)(例如，特征在于婴儿异常的面部特征，肝脏增大和神经损伤)，和肾上腺脑白质营养不良(例如，特征在于儿童期或成年早期的神经损伤症状)。其他营养或代谢紊乱包括金属代谢紊乱(例如，特征在于体内蛋白质故障和金属的毒性积累)。实例包括，例如，威尔森病(Wilson disease)(例如，以肝脏、大脑和其他器官中毒性铜水平积累为特征)和血色素沉着症(例如，遗传性血色素沉着症)，例如，肠吸收过多的铁，进而在肝脏、胰腺、关节和心脏中积聚，造成伤害。营养或代谢紊乱的其他实例包括有机酸症(organic acidemias)(如甲基丙二酸血症和丙酸血症)，尿素循环紊乱(如鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏和瓜氨酸血症)。在一些实例中，营养或代谢疾病是苯丙酮尿(PKU)。在其它实例中，营养或代谢疾病是与能量失调相关的代谢紊乱(例如，非酒精性脂肪性肝炎)。
在一些实例中，疾病是自身免疫疾病。示例性自身免疫疾病包括心肌炎，心肌梗塞后综合征，心包切开术后综合征，亚急性细菌性心内膜炎(SBE)，抗肾小球基底膜肾炎，间质性膀胱炎，狼疮性肾炎，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化(PBC)，原发性硬化性胆管炎，抗合成酶综合征，斑秃，自身免疫性血管性水肿，自身免疫性黄体酮皮炎，自身免疫性荨麻疹，大疱性类天疱疮，瘢痕性类天疱疮，疱疹性皮炎，盘状红斑狼疮，大疱性表皮松解症，结节性红斑，妊娠性类天疱疮，脓疱性汗腺炎，扁平苔癣，硬化性苔藓，线性IgA病(LAD)，硬斑病，寻常性天疱疮，急性苔藓痘疮样糠疹(pityriasis lichenoides et varioliformisacuta)，穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)，牛皮癣，系统性硬皮病，白癜风，艾迪生氏病(Addison’s disease)，1型自身免疫性多内分泌综合征(APS)，2型自身免疫性多内分泌综合征(APS)，3型自身免疫性多内分泌综合征(APS)，自身免疫性胰腺炎(AIP)，1型糖尿病，自身免疫性甲状腺炎，奥德氏甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)，格雷夫斯病(Graves’disease)，自身免疫性卵巢炎，子宫内膜异位症，自身免疫性睾丸炎，干燥综合征，自身免疫性肠病，腹腔疾病，克罗恩病，显微镜结肠炎(microscopic colitis)，溃疡性结肠炎，抗磷脂综合征(APS，APLS)，再生障碍性贫血，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性淋巴增生综合征，自身免疫嗜中性白血球减少症，自身免疫性血小板减少性紫癜，冷凝集素病，特发性混合性冷凝球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)，埃文斯综合征(Evanssyndrome)，阵发性夜间运动(paroxysmal nocturnal)，血红蛋白尿，恶性贫血，纯红细胞再生障碍，血小板减少症，痛性肥胖症(adiposis dolorosa)，成体发作的斯蒂尔氏病(adult-onset Still’s disease)，强直性脊柱炎，CREST综合征，药物性狼疮，起止点炎相关关节炎(enthesitis-related arthritis)，嗜酸性筋膜炎，费尔蒂综合征(Felty syndrome)，IgG4相关疾病，幼年型关节炎，莱姆病(Lyme disease)(慢性)，混合性结缔组织病(MCTD)，回文性风湿病，帕里伯格综合症(Parry Romberg syndrome)，帕森吉-特纳综合征(Parsonage-Turner syndrome)，银屑病关节炎，反应性关节炎，复发性多软骨炎，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)，系统性红斑狼疮(SLE)，未分化结缔组织病(UCTD)，皮肌炎，纤维肌痛，包涵体肌炎，肌炎，重症肌无力，神经肌张力增生，副肿瘤性小脑变性，多发性肌炎，急性播散性脑脊髓炎(ADEM)，急性运动轴索性神经病，抗-N-甲基-D-天冬氨酸(抗-NMDA)受体脑炎，巴洛同心硬化，比克斯塔夫氏脑炎(Bickerstaff’s encephalitis)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，格林-巴利综合征(Guillain–Barrésyndrome)，桥本氏脑病(Hashimoto’s encephalopathy)，特发性炎症性脱髓鞘疾病，兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)，多发性硬化症(MS)，模式II，奥舒兰综合征(Oshtoran Syndrome)，与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神紊乱(PANDAS)，渐进性炎症神经病变，不安腿综合征(restless legsyndrome)，僵硬综合征，西登哈姆舞蹈病(Sydenham chorea)，横贯性脊髓炎(transversemyelitis)，自身免疫性视网膜病变，自身免疫性葡萄膜炎，科根综合征(Cogan syndrome)，格雷夫斯眼病(Graves ophthalmopathy)，中间葡萄膜炎，木质结膜炎，蚕蚀性角膜溃疡(Mooren’s ulcer)，视神经脊髓炎，斜视眼阵挛肌阵挛综合征，视神经炎，巩膜炎，苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)，交感性眼炎，痛性眼肌麻痹综合征(Tolosa-Hunt Syndrome)，自身免疫性内耳疾病(AIED)，梅尼埃病(Ménière’s disease)，贝赫切特氏病(disease)，嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(EGPA)，巨细胞动脉炎，肉芽肿伴多血管炎(GPA)，IgA血管炎(IgAV)，川崎氏病(disease)，白细胞碎裂性血管炎，狼疮性血管炎，类风湿性血管炎，显微镜多血管炎(MPA)，结节性多动脉炎(PAN)，风湿性多肌痛，荨麻疹性血管炎，血管炎和原发性免疫缺陷。在一些实例中，自身免疫疾病是1型糖尿病(T1D)。
在其他实例中，疾病是胃肠疾病，如短肠综合征，乳糜泻，或炎症性肠病(IBD)，例如，克罗恩病或溃疡性结肠炎。
在一些实例中，疾病是炎性疾病(例如，Th2和/或IgE驱动的炎症)。示例性的炎症疾病包括，寻常痤疮，哮喘，自身炎症疾病，慢性前列腺炎，肾小球肾炎，过敏症，炎症性肠病(IBD)，盆腔炎，再灌注损伤，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，移植排斥，移植物抗宿主病，血管炎，水疱性脓疱，憩室炎，间质性膀胱炎。自身炎症疾病的实例包括家族性地中海热(FMF)，高度免疫球蛋白血症D伴反复发热(HIDS)，甲羟戊酸尿症，甲羟戊酸激酶缺乏症，TNF受体相关周期综合征(TRAPS)，穆克-威尔士综合征(Muckle-Wells syndrome)(荨麻疹耳聋淀粉样变性)，家族性冷荨麻疹，新生儿发病多系统炎症疾病(NOMID)，周期性发热，口疮性口炎，咽炎和腺炎(PFAPA综合征)，布劳综合征(Blau syndrome)，化脓性无菌性关节炎，坏疽性脓皮病，痤疮(PAPA)，白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏症(DIRA)。
在其他实例中，疾病是生长迟缓。在其他实例中，疾病是2型糖尿病(T2D)，肥胖或疼痛(例如，神经性疼痛)。
在其他实例中，疾病是过敏，例如，对选自下述的过敏原过敏：树花粉过敏原，杂草花粉过敏原，草花粉过敏原，食物过敏原，尘螨过敏原，霉菌过敏原，动物皮屑过敏原，或其组合。在一些实例中，疾病是对杂草花粉过敏原过敏，例如，豚草花粉过敏原。在其他实例中，疾病是对树花粉过敏原过敏，如桦树花粉过敏原或日本柳杉花粉过敏原。在其他实例中，疾病是对食物过敏原过敏，如花生过敏原，奶过敏原，蛋过敏原，谷蛋白过敏原(麦醇溶蛋白表位)，或其组合。
苯丙酮尿
在一些实例中，本公开提供了用于治疗苯丙酮尿(PKU)的方法。术语“苯丙酮尿”在本文中根据其本领域公认的含义使用。苯丙酮尿(PKU)是氨基酸代谢最常见的紊乱之一。遗传缺陷(酶PAH的缺陷)导致高水平的血苯丙氨酸(Phe)，如果未被察觉，其可以导致重度精神发育迟滞，并且需在生命早期接受治疗。即使有饮食依从性，PKU患者也会从青春期开始出现认知障碍。
启动子
述及“启动子”通常意指核酸分子例如DNA分子的区域，RNA聚合酶与其结合并启动转录。例如，启动子位于其所控制转录的序列的上游，即，5'。本领域技术人员将意识到的是，启动子可以与其他天然调节序列或区域例如操纵子相关。表达所需的调节性区域的精确性质在不同生物体之间可以不同，但是通常应包括启动子区域，在原核生物中其包含启动子(其指导RNA转录的启动)以及DNA序列，当将其转录到RNA中时，将发信号启动蛋白质合成。这类区域将通常包括涉及启动转录和翻译的这些5'非编码序列，如普里布诺盒(Pribnow-box)(参见TATA盒)，Shine-Dalgarno序列等。
术语“可操作地连接”表示并置位置，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以在与控制序列相容的条件下完成编码序列表达的方式连接。例如，如果连接或结合允许或影响所述基因的转录，据信启动子将操作性地连接基因，开放阅读框或编码序列。在另一实例中，如果连接或结合允许或影响至少3'基因的转录，据信5'和3'基因，顺反子，开放阅读框或编码序列将操作性地连接于多顺反子表达单元例如，如果序列间连接的性质并不(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子指导开放阅读框转录的能力或25(3)干扰开放阅读框被启动子区域序列转录的能力，据信DNA序列例如启动子和开放阅读框将操作性地连接。
表达盒
术语“表达盒”或“表达单元”根据本领域通常理解的含义使用，并且指这样的核酸，其包含一个或多个基因和控制一个或多个基因表达的序列。示例性的表达盒包含至少一个启动子序列和至少一个开放阅读框。
多顺反子表达盒
术语“多顺反子表达盒”、“多顺反子表达单元”或“多顺反子表达系统”在本文中可以互换使用，并且根据其本领域通常理解的含义使用。它们指核酸序列，其中两个或多个基因的表达通过共同调节机制控制，如启动子、操纵子等。本文所用术语多顺反子(polycistronic)表达单元是多重顺反子(multicistronic)表达单元的同义词。多顺反子表达单元的实例并不限于双顺反子、三顺反子、四顺反子表达单元。包含下述的任何mRNA都包括在术语多顺反子内：两个或多个，如3、4、5、6、7、8、9、10或更多个编码单个表达产物，如蛋白质、多肽和/或肽的编码区域或开放阅读框。多顺反子表达盒包括至少1个启动子，和受启动子控制的至少2个开放阅读框，其中，整合区域任选地被置于2个开放阅读框之间。
在一些实例中，“多顺反子表达盒”包括一个或多个内源性基因和一个或多个外源性基因，通过对微生物(例如，LAB)为内源性的启动子对其进行转录控制。在另一实施方式中，本文所述多顺反子表达单元或系统通过对微生物(例如，LAB)外源性的启动子进行转录控制。在另一实施方式中，如本文所述的翻译偶联的或转录偶联的一个或多个内源性基因和一个或多个外源性基因通过所述一个或多个内源性基因(之一)的天然启动子进行转录控制。在另一实施方式中，多顺反子表达单元通过所述一个或多个内源性基因(之一)的天然启动子进行转录控制，所述内源性基因包含在所述多顺反子表达单元中。在另一实施方式中，多顺反子表达单元操作性地连接革兰氏阳性内源性启动子。在一示例性实施方式中，启动子可以位于其操作性连接的一个或多个开放阅读框的上游，即5'。在另一实施方式中，启动子是多顺反子表达单元中内源性基因最5'(即，最上游)的天然启动子。因此，在一些实例中，多顺反子表达单元包含内源性基因和1个或多个外源性基因，其转录偶联所述1个或多个内源性基因的3'末端，例如，其中所述1个或多个外源性基因是多顺反子表达单元的3'基因。
如本文所用，术语“转录偶联”与术语“翻译偶联”或“翻译连接”同义。这些术语主要涉及多顺反子表达盒或单元。当一个或多个共同调节元件，特别是诸如共同启动子以编码两个或多个基因、开放阅读框或编码序列的1个mRNA实现所述两个或多个基因的转录时，据信两个或多个基因、开放阅读框或编码序列将转录偶联，其后可以翻译成两个或多个单独的多肽序列。本领域技术人员将意识到，细菌操纵子是自然存在的多顺反子表达系统或单元，其中2个或多个基因经翻译或转录偶联。
基因间区域
如本文所用，术语“基因间区域”与术语“基因间接头”或“基因间间隔子”同义。将基因间区域定义为介于邻接(即，位于相同多核酸序列上)基因、开放阅读框、顺反子或编码序列之间的多核酸序列。通过延伸，基因间区域可以包括通过所述基因间区域连接的3'基因的起始密码子和/或5'基因的终止密码子。如本文所定义，术语基因间区域具体涉及多顺反子表达单元中邻接基因间的基因间区域。例如，本文所定义的基因间区域可以存在于操纵子中邻接基因之间。相应地，在实施方式中，本文所定义的基因间区域是操纵子基因间区域。
在一些实例中，基因间区域、接头或间隔子选自这样的基因间区域，所述基因间区域位于革兰氏阳性细菌的rplW、rpl P、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN之前，即其5'，更具体地，紧接其5'。在一些实施方式中，革兰氏阳性细菌是乳酸细菌，例如，乳球菌(Lactococcus)，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和其任何亚种或菌株。在实施方式中，所述基因间区域包括rplW、rpl P、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN的起始密码子和/或基因前即5'的终止密码子。在一些实施方式中，本发明涉及革兰氏阳性细菌或重组核酸，如本文所述，其中内源性基因和一个或多个外源性基因通过在革兰氏阳性细菌中有活性的一个或多个基因间区域转录性偶联，例如，其中一个或多个基因间区域对所述革兰氏阳性细菌为内源性的，例如，其中内源性基因间区域选自先于plW、rpl P、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN rplM、rplE和rplF的基因间区域。
本领域技术人员将意识到，如果基因间区域包括5'终止密码子和/或3'起始密码子，那么在一些情况下的这些相应的密码子不存在于通过所述基因间区域连接的基因中，从而避免双起始密码子和/或终止密码子，其可以影响正确翻译起始和/或终止。用于鉴定基因间区域的方法为本领域所知。通过进一步的指导，例如，鉴定基因间区域可以基于预测操纵子，以及相关启动子和开放阅读框，用于其的软件是已知的并可以在本领域获得。示例性的基因间区域术语国际专利申请公开WO2012/164083，其全部内容通过引用纳入本文。
对象
“对象”是生物体，其可以受益于例如根据本公开内容的方法施用本公开的组合物。对象可以是哺乳动物(“哺乳动物对象”)。示例性哺乳动物对象包括人，农场动物(例如牛，猪，马，绵羊，山羊)，宠物(例如狗，猫和兔)和其他动物，例如小鼠，大鼠和灵长类动物。在一些实例中，哺乳动物对象是人患者。
粘膜
术语“粘膜”或“黏膜”在本文中根据其本领域公认的含义使用。“粘膜”可以是体内发现的任何粘膜，例如口腔粘膜，直肠粘膜，胃粘膜，肠粘膜，尿道粘膜，阴道粘膜，眼粘膜，颊粘膜，支气管或肺粘膜，以及鼻粘膜或嗅粘膜。粘膜可以还指代表面粘膜，例如，鱼和两栖类动物存在的那些。
如本文所用的术语“粘膜递送”根据其本领域公认的含义使用，即，例如通过使本公开的组合物与粘膜接触而递送至粘膜。口腔粘膜递送包括口腔，舌下和牙龈递送途径。因此，在一些实施方式中，“粘膜递送”包括胃递送，肠递送，直肠递送，口腔递送，肺部递送，眼部递送，鼻腔递送，阴道递送和口服递送。本领域普通技术人员将会理解的是口腔递送可以影响向胃肠道远端的递送。
术语“粘膜耐受”是指在对象通过粘膜途径暴露于抗原后，抑制哺乳动物对象(例如人类患者)中对抗原的特异性免疫应答。在一些情况中，粘膜耐受是全身耐受。低剂量口服耐受是由低剂量抗原诱导的口服耐受，并且通过主动免疫抑制表征，由可以转移对幼稚宿主的耐受的环磷酰胺敏感的调节性T细胞介导。高剂量口服耐受是由高剂量抗原诱导的口服耐受，对环磷酰胺治疗不敏感，并且通过抗原特异性T细胞的无反应性和/或缺失进行T细胞低反应性的诱导。对环磷酰胺的敏感性差异可用于区分低剂量和高剂量耐受(Strobel等,1983)。在一些情况中，口服耐受是低剂量口服耐受，如Mayer和Shao(2004)所述。
黏蛋白
术语“黏蛋白”在本文中根据其本领域公认的含义使用。黏蛋白是由人和动物中的上皮组织产生的高分子量糖基化蛋白质(糖偶联物)家族。黏蛋白具有形成凝胶的能力，并且是凝胶样分泌的重要成分。一些黏蛋白是膜-结合的，因为存在疏水性跨膜结构域。大多数的黏蛋白作为黏液的主要成分由粘膜分泌，或分泌以成为唾液的成分。黏蛋白基因包括MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20和MUC21。MUC2主要分泌在肠道，但是也分泌在气道中。成熟的黏蛋白由两个不同的区域组成：氨基-和羧基-末端区域被轻度糖基化，但是富含半胱氨酸。半胱氨酸残基参与在黏蛋白单体内和之间建立二硫键。由10至80个残基序列的多个串联重复序列形成了大中心区域，其中多达一半的氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。该区域由主要是O-连接的寡糖而饱和。黏蛋白(例如，MUC1)的过表达与许多类型的癌症相关。在本公开的上下文中，“黏蛋白”还可以表示“黏蛋白制备物”或“含有黏蛋白的黏液或其他制备物”。
治疗
本文所用的术语“治疗”、“处理”等是指改善或缓解疾病或病症(例如PKU或T1D)的特征性症状或表现。例如，T1D的治疗可导致对象中抗原特异性免疫耐受的恢复或诱导。在其他实例中，治疗意指阻止自身免疫性糖尿病或逆转自身免疫性糖尿病。如本文所用，这些术语还包括，预防或延迟疾病或病症或与疾病或病症相关的症状的发作，包括在患有所述疾病或病症之前降低疾病或病症或其相关症状的严重性。在痛苦之前的这种预防或减少是指将本公开所述的微生物(例如，细菌)或组合物给予患者，该患者在给药时不患有疾病或病症。“预防”还包括预防疾病或病症或与其相关的症状的复发或复发预防，例如在一段时间的改善之后。
治疗“有此需要的”对象表示对象患有疾病或病症，并以治疗具体疾病或病症的计划目的进行本发明的治疗性方法。
治疗有效量
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当根据期望的治疗方案施用时将引起期望的治疗效果或响应的非病原性微生物或本公开的组合物的量。在一些实例中，化合物或组合物以单位剂型提供，例如片剂或胶囊，当每天给药一次或多次时，其含有相当于治疗有效量的活性成分的量。
本领域普通技术人员将理解，实现期望的治疗效果(例如，用于有效治疗T1D)所需的治疗有效量的重组微生物将变化，例如，取决于由微生物表达的多肽的性质，给药途径，以及接受者的年龄、体重和其他特征。
分泌肽的量可以基于cfu确定，通过最先进的方法诸如Q-PCR确定，或通过使用ELISA。例如，特定微生物可以每109cfu分泌至少约1ng至约1μg的活性多肽。基于此，技术人员可以计算在其他cfu剂量下分泌的抗原多肽的范围。
治疗有效量可以与本文所述的任何给药方案一起施用。活性多肽的日剂量可以全天以1、2、3、4、5或6份给药。此外，每日剂量可以施用任何天数，在施用期之间具有任意数量的休息期。例如，可以每隔一天施用约0.01至约3.0M IU/天/对象的活性物质(例如，白细胞介素)的剂量，总共6周。在其他实例中，PAL以0.1至1000mg/天范围的剂量给予，如在各餐时以1-100mg的剂量。
T1D特异性抗原
在一些实施方式中，在上述组合和方法中的任一项中，T1D特异性抗原选自T1D中使用的已知自身抗原，并且包括胰岛素原(PINS)；胰岛素(INS)；谷氨酸脱羧酶(GAD)(例如，GAD65、GAD67或GAD2)；胰岛瘤相关蛋白2(胰岛抗原-2；IA-2)(还称之为蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体型，N(PTPRN)，酪氨酸磷酸酶样蛋白质或ICA512)(参见例如，Long等,Diabetes2013,62(6),2067-2071)；胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前体)胰岛淀粉多肽(ppIAPP)，外周蛋白，瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(例如，GRP78)；参加例如，Rondas等,Diabetes 2015；64(2):573-586；和Ye等,Diabetes 2010,59(1):6-16)，以及这些抗原中的两种或更多种的组合。在其他实施方式中，在上述组合物和方法中，T1D特异性抗原是PINS、GAD65或IA-2。在其他实施方式中，在上述组合物和方法中，T1D特异性抗原是PINS。在各种实施方式中，T1D特异性抗原由比全长(例如，野生型)基因短的变体核酸序列编码，因此“修整的”型式通常被使用的微生物(例如，乳酸乳球菌)更有效地表达和/或分泌。虽然分泌更加有效，但是许多“修整的”形式保留其所有(或主要部分)的生物活性，例如，保留足够的Treg刺激和/或诱导耐受的能力。
微生物
在根据如上所述组合物和方法中任一项的一些实例中，微生物是非病原性微生物，例如，非病原性和非侵入性细菌。在其它实施方式中，微生物是非病原性和非侵入性酵母。
在一些实施方式中，微生物是选自下述的酵母菌株：酵母菌属(Saccharomycessp.)，汉逊酵母属(Hansenula sp.)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)，裂殖酵母属(Schizzosaccharomyces sp.)，接合酵母属(Zygosaccharomyces sp.)，毕赤酵母属(Pichia sp.)，红曲霉属(Monascus sp.)，地丝菌属(Geothchum sp)和亚罗酵母属(Yarrowia sp.)。在一些实施方式中，酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其他实施方式中，酿酒酵母是布拉氏酵母(boulardii)亚种。在本发明的一实施方式中，重组酵母宿主载体系统是生物学遏制(contained)的系统。生物容纳是本领域技术人员已知的，并且可以通过引入营养缺陷型突变来实现，例如，自杀营养缺陷型突变，例如ThyA突变，或其等同物。或者，生物遏制可以在携带编码多肽的基因的质粒水平上实现，例如，通过使用不稳定的附加体构建体，其在几代后丢失。如果需要，几种水平的遏制可以组合，例如质粒不稳定性和营养缺陷型，以确保高水平的遏制。
在本发明的其他实施方式中，微生物是细菌，如非病原性细菌，例如，食品级细菌菌株。在一些实例中，非病原性细菌是革兰氏阳性细菌，例如，革兰氏阳性食品级细菌菌株。在一些实施方式中，革兰氏阳性食品级细菌菌株是乳酸发酵细菌菌株(即，乳酸细菌(LAB)或双歧杆菌(Bifidobacterium))。
在一些实施方式中，乳酸发酵细菌菌株是乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacterium)。如本文所用，乳球菌或乳杆菌不限于特定种或亚种，而是意指包括任何乳球菌或乳杆菌种或亚种。示例性的乳球菌种包括：格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鱼类乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)和棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)。在一些例子中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.Cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactissubsp.Hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)。
示例性的乳杆菌种包括：耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、活泼乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviariussubsp.Araffinosus)、鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.Aviaries)、白鲑乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、倍发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卡尼乳杆菌(Lactobacillus carnis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌不发酵乳糖亚种(Lactobacillus caseisubsp.Alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.Casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus casei subsp.Pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus caseisubsp.Tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯乳杆菌(Lactobacillus confuses)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.Coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种(Lactobacillus curvatus subsp.Curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacilluscurvatus subsp.Melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)、广布乳杆菌(Lactobacillus divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacilluspanis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.Tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.Camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakeisubsp.Sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.Salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius subsp.Salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)和婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)。在一些例子中，LAB是乳酸乳球菌(LL)。
在其它实例中，细菌选自下组：阿尔氏肠球菌(Enterococcus alcedinis)、阿桂氏肠球菌(Enterococcus aquimarinus)、亚洲肠球菌(Enterococcus asini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、卡氏肠球菌(Enterococcus caccae)、山茶肠球菌(Enterococcuscamelliae)、坎氏肠球菌(Enterococcus canintestini)、犬肠球菌(Enterococcuscanis)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcuscecorum)、鸽肠球菌(Enterococcus columbae)、多样肠球菌(Enterococcus devriesei)、迪埃丝肠球菌(Enterococcus diestrammenae)、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚韧肠球菌(Enterococcus durans)、埃肯肠球菌(Enterococcus eurekensis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、浅黄肠球菌(Enterococcus gilvus)、溶过氧化肠球菌(Enterococcus haemoperoxidus)、荷曼氏肠球菌(Enterococcus hermanniensis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、乐玛尼肠球菌(Enterococcus lemanii)、病臭肠球菌(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、橄榄肠球菌(Enterococcus olivae)、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcusrotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcussilesiacus)、孤立肠球菌(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcussulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcusthailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcusureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcusvillorum)、和香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)。
在其它实例中，细菌选自下组：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马蹄足链球菌(Streptococcus equines)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
在本发明的特定方面中，革兰氏阳性食品级细菌菌株是乳酸乳球菌或其亚种中的任一种，包括乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordniae)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)。在本发明的另一方面，重组革兰氏阳性细菌菌株是生物学遏制的系统，如无质粒乳酸乳球菌菌株MG1363，其丧失了正常生长和在乳中产酸的能力，(Gasson,M.J.(1983)J.Bacterid.154:1-9)；或苏氨酸-和嘧啶-营养缺陷型衍生物乳酸乳球菌菌株(Sorensen等，(2000)Appl.Environ.Microbiol.66:1253-1258；和Glenting等(2002)68:5051-5056)。
在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，细菌不是大肠杆菌。
在本发明的一实施方式中，重组细菌宿主载体系统是生物学遏制的系统。生物容纳是本领域技术人员已知的，并且可以通过引入营养缺陷型突变来实现，例如，自杀营养缺陷型突变，例如ThyA突变，或其等同物。或者，生物遏制可以在携带编码多肽的基因的质粒水平上实现，例如，通过使用不稳定的附加体构建体，其在几代后丢失。如果需要，几种水平的遏制可以组合，例如质粒不稳定性和营养缺陷型，以确保高水平的遏制。
结合和附着分子
术语“结合”和“附着”在本文基本上是同义词。结合/附着可以通过具有哺乳动物细胞和/或生物表面如黏液、纤连蛋白、胶原或其他无生命表面的体外模型评估；和通过例如测量定殖、持久性或生物效应所暗示而体内评估。
这类结合/附着对靶分子、细胞或位点通常具有特异性。生物体可以产生促进结合和附着于其他细胞、无生命对象和细胞产物如黏液的大量分子(通常是多肽、糖蛋白和碳水化合物)。促进结合和附着的这类分子对靶分子具有各种程度的特异性，所述靶分子特别是其他蛋白质、糖蛋白或碳水化合物。不同结合分子的表达导致对不同生物表面的优选结合。例如，胃肠道的不同细胞表达不同的表面分子，并且特定表面分子沿着胃肠道的频率可以不同。因此，细菌分子可以优选结合特定宿主细胞或胃肠道的特定区域。结合可以与集落增加、在靶位点递送靶蛋白、延长的胃肠通过时间相关。相反地，结合胃肠道中的一个位点可以与降低结合另一胃肠位点相关。
可以补充细菌结合蛋白的自然变异，通过突变，和通过重组，以由其他结合分子(包括由其他生物体)表达基序。这类重组结合蛋白可以单独表达，或作为融合蛋白表达，以在单个分子中提供多种结合特异性。
对于将细菌与生物表面相结合的蛋白质而言，结合多肽通常由细胞质输出并且锚固于细菌的表面。在革兰氏阳性细菌如乳球菌(Lactococcus)中，通常表达粘附分子具有(a)N-末端分泌信号以指导分泌通过细胞质膜和(b)C-末端锚固结构域，其将多肽锚固于细胞壁(即，“细胞壁锚固结构域”)。没有锚固结构域的情况下，在胞外环境中释放多肽。
例如，三叶因子(TFF)由动物细胞分泌，与黏液结合，并且具有许多生物效应，包括治愈黏液膜。通过重组添加细菌分泌信号至TFF，细菌可以经工程改造以分泌TFF到胞外环境中，从而促进黏液膜治愈。通过添加分泌和锚固信号至TFF，细菌还可以经工程改造以具有黏液结合特性。
细胞附着多肽
在本公开的一些实施方式中，微生物(例如，细菌)包含外源性核酸，所述外源性核酸编码含有细胞附着多肽的融合蛋白。显示出细胞附着特性的任何多肽，例如，结合肠细胞或其细胞系(例如，Caco-2、IEC-18或HT29-MTX细胞)的任何多肽，能够用于本公开的上下文。细胞附着能力可以使用本领域认可的方法测量，如本文所公开的那些。在一些实例中，细胞附着多肽选自下述：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)(参见例如，Jensen等,Microbiology2014,160(4):671-681)，黏液结合蛋白或mub结构域蛋白(Mub)(参见例如，Boekhorst等,Microbiology 2006,152(1):273-280)，黏液黏附促进蛋白(MapA)(参见例如，Miyoshi等,Biosci.Biotechnol.Biochem.2006,70(7):1622-8)，乳酸乳球菌黏蛋白结合蛋白(MbpL)(参见例如，等,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(22):7993-8000)。在一些实例中，融合蛋白可以包括细胞壁锚固肽，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A锚固片段(SpaX)(参见例如，Steidler等,Appl.Environ.Microbiol.1998,64(1):342-5)。上述的所有公开内容通过引用其全部内容纳入本文。在一些实例中，细胞附着多肽是CmbA多肽，如来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的CmbA。参见例如，ATCC PTA6474，例如，如Jensen等,同上所公开。
根据上述实施方式中任一项的一些实例中，细胞附着多肽是具有与SEQ ID NO:1至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CmbA多肽。根据上述实施方式中任一项的其他实例中，细胞附着多肽是由与SEQ IDNO:2具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的外源核酸序列序列编码的CmbA多肽。
黏蛋白结合多肽
在本公开的一些实施方式中，微生物(例如，细菌)包含外源性核酸，所述外源性核酸编码含有黏蛋白结合多肽的融合蛋白。显示出黏蛋白结合特性的任何多肽，例如，与黏蛋白制备物体外结合的任何多肽，能够用于本公开的上下文。黏蛋白结合能力可以使用本领域认可的方法测量，如本文所公开的那些。示例性的黏蛋白结合多肽包括三叶因子(TFF)多肽(例如，TFF1、TFF2或TFF3)(参见例如，Caluwaerts,S.等,Oral.Oncol.2010,46:564-570)和MucBP多肽(参见例如，Lukic等,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(22):7993-8000)。在一些实例中，本公开提供了包含外源性核酸的微生物(例如，细菌)，所述外源性核酸编码融合蛋白，其中融合蛋白包含细胞附着多肽(例如，CmbA多肽)和黏蛋白结合多肽(例如，TFF多肽)。在一些实例中，TFF多肽是人TFF多肽(hTFF1、hTFF2或hTFF3)。根据上述实施方式中任一项的其他实例中，黏蛋白结合多肽是具有与SEQ ID NO:3至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的人TFF3多肽。根据上述实施方式中任一项的其他实例中，黏蛋白结合多肽是由与SEQ ID NO:4具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的外源核酸序列编码的人TFF3多肽。在一些实例中，黏蛋白结合多肽是鱼TFF多肽，或两栖动物TFF多肽。在其他实例中，黏蛋白结合多肽包括三叶样结构(或由其组成)，如Fujita等.,Mol.Reprod.Dev.2006,75(7):1217-1228中公开的那些。
构建体
在一些实施方式中，微生物(例如，细菌，如乳酸乳球菌)包含能够表达融合蛋白和任选地表达治疗性多肽的表达载体。例如，融合蛋白在粘膜(例如，在胃肠道中)存在的条件下暴露于细胞表面。微生物(例如，细菌)可以包含能够表达融合蛋白的表达载体，从而使融合蛋白暴露于细胞表面至足以提供所需肠道潴留的程度。本领域技术人员可以调整向对象提供的微生物(例如，细菌)的量以递送所需量的治疗性多肽。
通常，表达系统包括遗传构建体，所述遗传构建体包含至少一种编码至少一种融合蛋白的核苷酸序列，例如，操作性地连接能够指导宿主微生物中序列表达的启动子。适当地，待表达的融合蛋白可以由适合宿主的优选密码子的核酸序列编码。构建体可以进一步包含(所有)其他合适的元件，包括增强子，转录起始序列，信号序列，报道基因，转录终止序列等，在所选宿主中可操作，如本领域技术人员已知的那样，
在一些实例中，构建体处于适于宿主转化的形式和/或可以稳定保持在宿主中的形式，例如载体，质粒或微型染色体。可以选择或构建含有用于导入微生物(例如，细菌)的核酸的合适载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列，终止子片段，增强子序列，标记基因和适当的其他序列。载体可以是质粒，病毒，例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。进一步的细节参见例如，《分子克隆：实验室指南》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)，第二版，Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版社，其相关公开内容通过引用纳入本文。
《分子生物的简要方案》(Short Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等编，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，1992中详细描述了操作核酸的许多已知技术和方法，例如制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及分析蛋白质，其相关公开内容通过引用纳入本文。在一实施方式中，融合蛋白的编码序列包含在操纵子中，即用于多顺反子表达的核酸构建体。在操纵子中，来自启动子的转录产生包含一个以上编码序列的mRNA，每个编码序列在其上游具有其自身适当定位的核糖体结合位点。因此，可以从单个mRNA翻译一种以上的多肽。使用操纵子能够协调融合蛋白和治疗性多肽的表达。细菌宿主细胞中的多顺反子表达系统描述于例如属于Vanden-Broucke等的美国专利申请号2014/0105863中，其通过引用将其全部内容纳入本文。
在一实施方式中，本发明涉及稳定转染的微生物(例如，细菌)。在一些实例中，本公开提供了微生物(例如，细菌)，其中编码融合蛋白的外源性核酸被整合到宿主细胞的染色体中。用于建立稳定转染的微生物的技术是本领域已知的。例如，可以经由同源重组将编码融合蛋白的核酸克隆到宿主的基因组中。在一些实例式中，宿主的必需基因被同源重组事件破坏，例如基因的缺失、导致由必需基因编码的蛋白质的无活性形式的一个或多个氨基酸取代、或导致由必需基因编码的蛋白质的截短形式的移码突变。在一个实施方式中，必需基因是thyA基因。在例如WO 02/090551中描述了示例性的技术，通过引用将其全部内容纳入本文。转化质粒可以是任何质粒，只要其不能补充破坏的必需基因，例如，thyA基因。质粒可以是自我复制的，可以携带1个或多个感兴趣的基因，并且可以携带1个或多个抗性标志物。在一些实例中，质粒是整合型质粒(即，整合质粒)。通过在必需基因的基因座(例如，thyA位点)处引起整合，这类整合型质粒自身可以用于破坏必需基因，因为必需基因(例如，thyA基因)的功能受到破坏。在一些实例中，必需基因(如thyA基因)被双重同源重组取代，通过包含1个或多个感兴趣基因的盒，侧接靶向对必需基因的插入的靶序列，如thyA靶位点。应理解的是，这些靶序列足够长并且足够同源，能够将感兴趣基因整合到靶位点中。
编码融合蛋白的遗传构建体可以存在于宿主细胞染色体外，例如，使用自身复制起点进行自主复制，或者可以被整合到微生物基因组DNA中，例如，细菌或酵母染色体中，例如，乳球菌染色体中。在后一种情况下，可以整合核酸的单个或多个拷贝；整合可以发生在染色体的随机位点，或如上所述，在其预定位点，如在乳球菌(例如乳酸乳球菌)的thyA基因座中
因此，在一些实施方式中，编码融合蛋白的遗传构建体可以还包含序列，该序列配置成实现将遗传构建体插入宿主细胞的染色体中。在一些实例中，可以通过同源重组促进遗传构建体插入宿主细胞的微生物基因组(例如染色体)内的特定位点。例如，本文公开的遗传构建体可包含与宿主细胞染色体内整合位点同源的一个或多个区域。染色体位点处的序列可以是天然的，即天然存在的序列，或者可以是先前遗传工程引入的外源序列。
在一些实例中，同源的区域可以是至少50碱基对(bp)、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp 700bp、800bp、900bp、1000bp或更多。
在一个实例中，可以包括两个同源区域，各自侧接遗传构建体中存在的相关表达单元的各侧。这类构象可以有利地将相关序列插入宿主细胞。进行同源重组(特别是在细菌宿主中)以及选择重组体的方法是本领域公知的。
本领域技术人员已知微生物的转化方法，例如原生质体转化和电穿孔。
通过对微生物(例如，乳酸乳球菌)中存在的表达载体使用同源表达和/或分泌信号可以实现高度表达。表达信号对于本领域技术人员而言是显而易见的。根据纳入的微生物可以优化用于表达的表达载体。例如，已知在乳球菌，乳酸乳杆菌，干酪乳杆菌和植物乳杆菌中提供足够表达水平的特异性表达载体。此外，已知开发用于在非病原性、非定殖、非侵入性食品级细菌乳酸乳球菌中表达异源抗原的系统(参见英国专利GB2278358B，其通过引用纳入本文)。在一些实例中，本公开的构建体包含PCT/NL95/00135(WO-A-96/32487)中所述多拷贝表达载体，其中已经纳入了编码融合蛋白的核苷酸序列。这类构建体特别适合于以高表达水平在乳酸细菌中(特别是在乳杆菌中)表达所需抗原，并且还可以用于将表达的产物导向细菌细胞的表面。构建体(例如，PCT/NL95/00135)的特征在于编码融合蛋白的核酸序列之前是5'非翻译核酸序列，其至少包含核糖体识别和RNA稳定化所需的最小序列。其后可以是翻译起始密码子，其可以接着(紧接)乳酸菌基因翻译的核酸序列的5'末端部分至少5个密码子的片段或片段的结构或功能等同物。片段也可以由启动子控制。PCT/NL95/00135的内容，包括其中所公开的不同实施方式和本说明书中所提及的所有其他文件通过引用纳入本文。本发明的一个方面提供了这样的方法，其允许宿主中异源基因的高水平调节表达和表达与分泌的偶联。在另一个实施方式中，根据WO 93/17117，采用T7噬菌体RNA聚合酶及其同源启动子开发强大的表达系统，其通过引用纳入本文。在一实施方式中，表达质粒源自pT1NX。
在一些实施方式中，根据本发明采用的启动子在细菌中组成型表达。组成型启动子的使用避免了提供诱导物或其他调节信号以进行表达的需要。例如，启动子将表达介导在细菌宿主细胞保持存活的水平，即保留一些代谢活性，即使不维持生长。有利地，这种表达可以处于低水平。例如，当表达产物在细胞内积累时，表达水平可导致表达产物在小于约10％的细胞蛋白质中累积，约或小于约5％，例如约1-3％。启动子可以与所用的细菌同源，即在自然界中在该细菌中发现的细菌。例如，乳球菌启动子可用于乳球菌。用于乳酸乳球菌(或其他乳球菌)的示例性启动子是衍生自乳酸乳球菌染色体的“P1”(Waterfield,N R,Lepage,R W F,Wilson,P W,等(1995).“乳球菌启动子的分离和其在研究乳酸乳球菌中细菌荧光素酶合成的用途(The isolation of lactococcal promoters and their use ininvestigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis)”Gene 165(1):9-15)。启动子的另一个例子是usp45启动子。其他有用的启动子述于Steidler等的美国专利8,759,088，以及VandenBroucke等的美国专利申请号2014/0105863中，其公开内容通过引用其全部内容纳入本文。
一种或多种核酸构建体可包含分泌信号序列。因此，在一些实施方式中，编码融合蛋白的核酸可以提供多肽的分泌，例如通过将编码信号序列的核酸序列与编码多肽的核酸序列适当地偶联。含核酸细菌分泌抗原的能力可以在维持生物体活力的培养条件下体外测试。示例性的分泌信号序列包括在革兰氏阳性生物体(如芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和乳杆菌(Lactobacillus))中具有活性的那些中任一个。这些序列可包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquetaciens)的α-淀粉酶分泌前导序列或由一些葡萄球菌(Staphylococcus)菌株分泌的葡萄球菌激酶的分泌前导序列，已知其在革兰氏阳性和革兰氏阴性宿主中起作用(参见“使用芽孢杆菌的基因表达(Gene Expression UsingBacillus),”Rapoport(1990)Current Opinion in Biotechnology 1:21-27)，或来自许多其他芽孢杆菌酶或S-层蛋白质的前导序列(参见Harwood和Cutting，芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)，John Wiley&Co.1990的第341-344页)。在一个实施方式中，所述分泌信号源自usp45(Van Asseldonk等,Mol.Gen.Genet.1993,240:428-434)。在一些实施方式中，组成型分泌融合蛋白。
制剂和方案
在本公开的方法中，可由相同或不同的微生物表达多种治疗性多肽。例如，(a)PAL和氨基酸脱羧酶；(b)T1D特异性抗原，如PINS和Treg活化的细胞因子，如IL-2或IL-10，(c)谷蛋白抗原和IL-2或IL-10等。如果在不同的生物体中表达，一种或优选的两种细菌将表达黏蛋白和/或细胞结合因子。当两种多肽由不同的微生物表达时，它们可以以相同(例如，组合)的制剂施用于对象，或者可以以分开的(例如，不同的)制剂施用。可以在相同时间或在不同时间点施用单独的制剂。例如，在它们各自的制剂中产生第一和第二治疗性多肽的微生物可以同时给予对象，或者可以依次给予，例如，在给药之间休息一段时间。
在一些实施方式中，同时给予产生第一和第二治疗性多肽的微生物。在一些实例中，根据这些实施方式，将第一治疗性多肽微生物和第二治疗性多肽微生物包含在相同的药物制剂中，或者包含在同时服用的一种以上的药物制剂中。在一些实施方式中，使用产生IL-2和T1D特异性抗原的微生物将两种生物活性多肽递送至对象。
在一些实施方式中，微生物将每天施用一次，两次，三次，四次，五次或六次，例如，使用口服制剂。在一些实施方式中，每天，每隔一天，每周一次，每周两次，每周三次或每周四次给予微生物。在其他实施方式中，治疗每两周进行一次。在其他实施方式中，治疗每三周进行一次。在其他实施方式中，治疗每月进行一次。
该方法的治疗周期的持续时间是，例如，7天至对象的一生，如治疗或逆转疾病所需，或防止复发所需。在一些实施方式中，治疗周期可持续约30天至约2年。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至1.5年的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至1年的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至11个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至10个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至9个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至8个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至7个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至6个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至5个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至4个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至3个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象将具有持续30天至2个月的治疗周期。
可以在对象中临床需要的时间内给予每日维持剂量，例如从1天到几年(例如持续对象的整个剩余寿命)；例如约(2，3或5天，1或2周，或1个月)向上和/或例如最长达大约(5年，1年，6个月，1个月，1周，或3或5天)。通常给予每日维持剂量持续约3至约5天或持续约1周至约1年。可以每天两次至每两周一次给予单位剂量，直至观察到治疗效果。
产生第一和第二治疗性多肽的微生物可以单一或组合疗法递送以治疗疾病。在一些实施方式中，本公开的组合物包含其他治疗活性剂。在一些实施方式中，本公开的组合物和对象的治疗不涉及其他活性成分，例如，不涉及额外的免疫调节物质，如抗体(例如，抗CD3用于治疗T1D)。因此，在一些实例中，本公开的药物组合物基本上由如本文所述的微生物(表达治疗性IL-2和抗原多肽)和药学上可接受的载体组成。
药物组合物和运载体
微生物(例如，如本文所述的细菌或酵母)可以以纯的形式给予、与其他活性成分组合给予、和/或与药学上可接受的(即，无毒的)赋形剂或运载体组合给予。术语“药学上可接受的”在本文中根据其本领域公认的含义使用，并且是指与药物组合物的其他成分相容并且对其受体无害的运载体。
本发明的组合物可以任何已知的或有效的剂量或产品形式制备，适合用于系统递送微生物(例如，细菌)至粘膜，其可以包括药物组合物和剂型以及营养产品形式。
在一些实施方式中，制剂是口服制剂或药物组合物。在根据该实施方式的一些实例中，制剂或药物组合物包含干粉形式(例如，冷冻干燥形式)的非病原性微生物或其压实形式，任选地与其他干燥载体组合。口服制剂通常包括惰性稀释剂运载体或可食用运载体。
在一些实例中，口服制剂包含包衣或利用包封策略，其促进制剂递送到肠道中，和/或允许微生物在肠道(例如，回肠，小肠，或结肠)中释放和水合。一旦微生物从制剂中释放并充分水合，它就开始表达生物活性多肽，其随后释放到周围环境中，或在微生物表面上表达。这种包衣和包封策略(即延迟释放策略)是本领域技术人员已知的。参见例如，U.S.5,972,685；WO 2000/18377；和WO 2000/22909，其各自公开内容通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，其可包含冻干或冷冻干燥形式的微生物(例如，非病原性细菌)，任选地结合其他组分，如葡聚糖，谷氨酸钠和多元醇。示例性的冷冻干燥的组合物述于例如Corveleyn等的美国专利申请号2012/0039853中，其公开内容通过引用其全部内容纳入本文。示例性的制剂包含冷冻干燥的细菌(例如，治疗有效量的细菌)和药学上可接受的运载体。冷冻干燥的细菌可以胶囊，片剂，颗粒和粉末的形式制备，其各自可以口服给药。或者，可以在合适的培养基中将冷冻干燥的细菌制备成水性或油性悬浮液，或者可以在使用前将冻干的细菌悬浮在合适的培养基例如饮品中。
对于口服给药，制剂可以是胃耐受的口服剂型。例如，口服剂型(例如，胶囊，片剂，丸剂，微丸，颗粒等)用抵抗在胃中溶解或破坏但不抵抗在肠中溶解或破坏的赋形剂薄层(通常是聚合物，纤维素衍生物和/或亲脂性物质)包衣，从而允许转移通过胃，有利于在肠(例如，小肠或结肠)中崩解、溶解和吸收。在一些实例中，口服制剂可包括提供微生物的受控释放，持续释放或延长释放的化合物，从而提供其中编码的所需蛋白质的受控释放。这些剂型(例如片剂或胶囊剂)通常含有常规和众所周知的赋形剂，例如亲脂性、聚合性、纤维素、不溶性、可溶胀赋形剂。控释制剂也可用于任何其他递送部位，包括肠，结肠，生物粘附或舌下递送(即，牙粘膜递送)和支气管递送。当发明的组合物是待给予直肠或阴道时，药物制剂可包括栓剂和乳膏。在这种情况下，宿主细胞悬浮在也包括脂质的常见赋形剂的混合物中。上述制剂中的每一种都是本领域熟知的，并且例如在以下参考文献中描述：Hansel等，(1990,药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical dosage forms and drug deliverysystems),第5版，William和Wilkins)；Chien 1992,新型药物递送系统(Novel drugdelivery system),第2版,M.Dekker)；Prescott等，(1989,新型药物递送(Novel drugdelivery,J.Wiley&Sons)；Gazzaniga等.,(1994,用于结肠特异性递送的口服缓释系统(Oral delayed release system for colonic specific delivery),Int.J.Pharm.108:77-83)。
在一些实施方式中，口服制剂包括可增强微生物表达的生物活性多肽的粘膜递送和/或粘膜摄取的化合物。在其他实例中，制剂包括增强制剂内和/或释放后微生物活力的化合物。
本发明的细菌可以悬浮在药物制剂中，用于给予患有待治疗疾病的人或动物。此类药物制剂包括但不限于活的革兰氏阳性细菌和适于给药的培养基。细菌可以在常见赋形剂存在的情况下经冻干，所述赋形剂例如乳糖，其他糖，碱和/或碱土金属硬脂酸盐，碳酸盐和/或硫酸盐(例如硬脂酸镁，碳酸钠和硫酸钠)，高岭土，二氧化硅，芳香剂和香料。如此冻干的细菌可以胶囊，片剂，颗粒和粉末(例如漱口水粉末)的形式制备，各种形式可以通过口服途径给药。或者，可以在合适的培养基中将革兰氏阳性细菌制备为水性悬浮液，或者可以在使用前将冻干的细菌悬浮在合适的培养基中，这种培养基包括本文提及的赋形剂和其他赋形剂，例如葡萄糖、甘氨酸和糖精钠。
在一些实例中，使用任何合适的方法将微生物局部递送至对象的胃肠道。例如，可以使用微球递送系统来增强向肠道的递送。微球递送系统包括具有包衣的微粒，所述包衣提供局部释放到对象的胃肠道中(例如，控释制剂，例如肠溶包衣制剂和结肠制剂)。
对于口服给药，可以配制胃肠道口服剂型，该剂型还可以包括提供受控释放革兰氏阳性细菌的化合物，从而提供其中编码的所需蛋白质(例如IL-2)的受控释放。例如，口服剂型(包括胶囊，片剂，丸剂，颗粒，粉末)可以用抵抗在胃中溶解或破坏但不抵抗在肠中溶解或破坏的赋形剂薄层(例如，聚合物，纤维素衍生物和/或亲脂性物质)包衣，因而允许转移通过胃，有利于在肠中崩解、溶解和吸收。
口服剂型可以设计成允许革兰氏阳性细菌和产生的外源蛋白质的缓慢释放，例如受控释放，持续释放，延长释放，持续作用片剂或胶囊。这些剂型通常含有常规和众所周知的赋形剂，例如亲脂性、聚合性、纤维素、不溶性、可溶胀赋形剂。本领域熟知这类制剂，并且述于例如下述参考文献中：Hansel等,药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical dosageforms and drug delivery systems),第5版,William和Wilkins,1990；Chien 1992,新型药物递送系统(Novel drug delivery system),第2版,M.Dekker；Prescott等,新型药物递送(Novel drug delivery),J.Wiley&Sons,1989；和Gazzaniga等,Int.J.Pharm.108:77-83(1994)。
药物剂型(例如，胶囊)用pH依赖性Eudragit聚合物包衣以获得胃液抗性和在回肠末端和结肠处的预期递送，其中聚合物在pH6.5溶解。通过使用其他Eudragit聚合物或通过聚合物之间的不同比例，可以调节延迟释放曲线，以释放细菌，例如在十二指肠或空肠中。
药物组合物含有至少一种药学上可接受的运载体。合适的赋形剂、稀释剂和运载体的非限制性实例包括：防腐剂，无机盐，酸，碱，缓冲剂，营养素，维生素，填充剂和增量剂，例如淀粉，糖，甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物，藻酸盐，明胶和聚乙烯吡咯烷酮；保湿剂如甘油/崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；用于延缓溶解的试剂，如石蜡；再吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂如乙酰醇，甘油单硬脂酸酯；吸附载体如高岭土和膨润土；载体如丙二醇和乙醇，和润滑剂如滑石，硬脂酸钙和硬脂酸镁，以及固体聚乙二醇。
可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，分散剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含液体运载体(如脂肪油)。此外，剂量单位形式可含有多种其他材料，其修饰剂量单位的物理形式，例如糖、虫胶和其他肠溶试剂的包衣。此外，除活性化合物之外，糖浆剂还可含有作为调味剂的蔗糖和其他防腐剂、染料和着色剂和调味剂。应理解，药学上可接受的载体的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、给药途径和其它众所周知的变量。所述运载体必须是“可接受的”，这意味着它与该制剂的其它成分相容，并且对受体无害。
用于给药的替代制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳液。非水性溶剂的示例是二甲基亚砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括醇和水的混合物，缓冲介质和盐水。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。这些递送方法可以有各种液体制剂，包括盐水，醇，DMSO和水基溶液。
口服含水制剂包括赋形剂，例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁和/或类似物。这些组合物采取溶液形式，例如漱口水，还包含含水载体，例如水，醇/水溶液，盐水溶液，肠胃外载剂如氯化钠，林氏葡萄糖等。
水性漱口水制剂是本领域技术人员熟知的。关于漱口水和口腔冲洗剂的制剂详见以下文献，例如美国专利6,387,352,美国专利6,348,187,美国专利6,171,611,美国专利6,165,494,美国专利6,117,417,美国专利5,993,785,美国专利5,695,746,美国专利5,470,561,美国专利4,919,918,美国专利申请2004/0076590,美国专利申请2003/0152530和美国专利申请2002/0044910，其各自通过引用说明书的该部分以及说明书的所有其他部分具体纳入本文。
其他添加剂可以存在于本公开的制剂中，例如调味剂，甜味剂或着色剂，或防腐剂。薄荷，例如来自薄荷或留兰香，肉桂，桉树，柑橘，决明子，茴香和薄荷醇，是合适的调味剂的实例。在液体组合物的情况下，味剂可以0至3％的量存在于口腔组合物中，例如，多达2％，如多达0.5％，例如，约0.2％。
甜味剂包括人造或天然甜味剂，例如糖精钠，蔗糖，葡萄糖，糖精，右旋糖，左旋糖，乳糖，甘露醇，山梨糖醇，果糖，麦芽糖，木糖醇，奇异果甜蛋白，阿斯巴甜，D-色氨酸，二氢查尔酮，乙酰磺胺酸及其任意组合，甜味剂可以口腔组合物的约0至2％，例如，多达1％w/w，如0.05至0.3％w/w的量存在。
着色剂是合适的天然或合成颜色，例如二氧化钛或CI 42090，或其混合物。在液体组合物的情况下，着色剂在组合物中的含量可以为0至3％，例如，多达0.1％，如多达0.05％，例如，约0.005-0.0005％。在一些实例中，苯甲酸钠作为防腐剂添加，例如，以基本上不足以改变组合物pH的浓度使用，否则可能需要调节缓冲剂的量以达到所需的pH。
其他任选成分包括保湿剂，表面活性剂(非离子，阳离子或两性)，增稠剂，树胶和粘合剂。保湿剂增加制剂体积并在洁齿剂组合物中保留水分。此外，保湿剂有助于防止制剂储存期间的微生物变质。它还有助于保持相稳定性，并提供配制透明或半透明洁齿剂的方法。
合适的保湿剂包括甘油，木糖醇，甘油和二醇如丙二醇，其各自可以以最高达50％w/w的量存在，但总的保湿剂例如不超过约60-80％w/w的组合物。例如，液体组合物可包含多达约30％的甘油加多达约5％或约2％w/w的木糖醇。在一些实例中，表面活性剂不是阴离子的，并且可以包括聚山梨醇酯20或椰油酰胺基甜菜碱等，用量高达组合物的约6％，或约1.5至3％w/w。
在一些实例中，当本发明的口腔组合物为液体形式时，其是可以多达口腔组合物的约3％w/w的成膜剂，如在口腔组合物的0至0.1％的范围内，或约0.001至0.01％，如约0.005％w/w。合适的成膜剂包括(除透明质酸钠外)以商品名Gantrez销售的那些。
用于口服或肠内给药的液体营养制剂可包含一种或多种营养素，例如脂肪，碳水化合物，蛋白质，维生素和矿物质。许多不同来源和类型的碳水化合物，脂质，蛋白质，矿物质和维生素是已知的并且可以用于本发明所述的营养液实施方案中，只要这些营养素与所选制剂中的添加成分相容，对于它们的指定用途是安全有效的，不得以其他方式过度损害产品性能。
这些营养液可以配制成具有足够的粘度，流动或其他物理或化学特性，以在饮用或施用营养液时提供更有效和舒缓的粘膜涂层。这些营养实施方案还可以代表适合于满足个体的唯一，主要或补充营养需求的平衡营养源。
合适的营养液的非限制性实例述于美国专利5,700,782(Hwang等)；美国专利5,869,118(Morris等)；和美国专利5,223,285(DeMichele等)，通过引用将其说明书纳入本文。
适用于本文的营养蛋白质可以是水解的，部分水解的或非水解的，并且可以衍生自任何已知的或其他合适的来源，例如奶(例如酪蛋白，乳清)，动物(例如肉，鱼)，谷类(例如，大米，玉米)，蔬菜(例如大豆)或其组合。
适用于营养液的脂肪或脂质包括但不限于椰子油，大豆油，玉米油，橄榄油，红花油，高油酸红花油，MCT油(中链甘油三酯)，葵花籽油，高油酸葵花籽油，结构化甘油三酯，棕榈和棕榈仁油，棕榈油精，菜籽油，海洋油，棉籽油及其组合。适用于营养液的碳水化合物可以是简单的或复合的，含乳糖的或不含乳糖的，或其组合。合适的碳水化合物的非限制性实例包括：水解玉米淀粉，麦芽糖糊精，葡萄糖聚合物，蔗糖，玉米糖浆，玉米糖浆固体，稻衍生的碳水化合物，葡萄糖，果糖，乳糖，高果糖玉米糖浆和难消化的低聚糖如低聚果糖(FOS)及其组合。
营养液可以进一步包含多种维生素中的任何一种，其非限制性实例包括：维生素A，维生素D，维生素E，维生素K，硫胺素，核黄素，吡哆醇，维生素B12，烟酸，叶酸，泛酸，生物素，维生素C，胆碱，肌醇，其盐和衍生物以及其组合。
营养液可以进一步包含已知的任意多种矿物质或以其他方式适合于具有患T1D风险或患有T1D的患者的任意多种矿物质，其非限制性实例包括：钙，磷，镁铁，硒，锰，铜，碘，钠，钾，氯化物及其组合。
本发明的微生物和具体的酵母和细菌还可以配制成酏剂或溶液以便于口服或直肠给药，或者配制成适合肠胃外给药的溶液，例如通过肌肉内，皮下或静脉内途径。另外，核苷衍生物也非常适合作为持续或延长释放剂型的制剂，包括在肠道的特定部分释放或仅释放活性成分的剂型，例如，在延伸或延长的时间段内进一步提高效率。这种剂型中的包衣，包膜和保护基质可以由例如制药领域熟知的聚合物质或蜡制成。
本发明的组合物包括药物剂型，如扁囊剂(lozenge)，锭剂或软锭剂。这些通常是盘状固体，在适当调味的基质中含有活性成分。基质可以是硬糖，甘油明胶，或具有足够黏液以使其形成的糖的组合。可将锭剂置于口腔中，它们缓慢溶解，释放活性成分用于与粘膜直接接触。
例如，可以通过将水缓慢加入粉末状活性粉末，粉末状糖和树胶的混合物中直至形成柔韧物质来制备本发明的锭剂。7％的阿拉伯胶粉末可用于为物质提供足够的粘合性。将块状物展开并从扁平物料上切下锭块，或者将块体卷成圆筒并分开。将各切割或分开的片成形并使其干燥，从而形成锭剂剂型。
如果活性成分是热不稳定的，可以通过压缩将其制成扁囊剂。例如，制备中的造粒步骤以与用于任何压缩片剂的方式类似的方式进行。使用重压缩设备制备锭剂以得到比平时更硬的片剂，因为期望剂型在口中缓慢溶解或崩解。在一些实例中，选择成分以促进缓慢溶解特性。
在本发明的特定制剂中，将微生物纳入含有预胶化淀粉和交联聚(丙烯酸)的生物粘附运载体中以形成生物粘附片剂和适于口腔施用的生物粘附凝胶(即，具有延长的生物粘附和持续的药物递送)。例如，将根据本发明的非病原性和非侵入性细菌，生物粘附聚合物(通过喷雾干燥共加工的交联聚(丙烯酸)和预胶化淀粉)，硬脂酰富马酸钠(润滑剂)和二氧化硅(助流剂)的粉末混合物加工成片剂(重量：100mg；直径：7mm)。制备这些片剂的方法是本领域技术人员熟知的，并且之前已经描述了成功开发含有各种药物(咪康唑，睾酮，氟化物，环丙沙星)的生物粘附片剂(Bruschi M.L.和de Freitas O.,药物开发和工业药学(Drug Development and Industrial Pharmacy),2005 31:293-310)所有赋形剂材料在药品级是市售可得的。
为了优化配方，改变片剂中的药物负荷和淀粉与聚(丙烯酸)之间的比例。基于先前的研究，共处理的生物粘附载体中的最大药物载量为约60％(w/w)，淀粉/聚(丙烯酸)比率可在75/25和95/5(w/w)之间变化。在优化研究期间，片剂的生物粘附性质和片剂中的药物释放是主要评价参数，标准片剂性质(硬度，脆性)作为次要评价标准。
将细菌纳入预胶化淀粉和交联聚(丙烯酸)的水分散体中。使用高剪切混合器通过标准程序制备该聚合物分散体。
与片剂类似，可能需要优化凝胶的药物负荷和淀粉/聚(丙烯酸)比例，以获得对食道粘膜具有最佳附着性的凝胶。对于凝胶，分散体中聚合物的浓度是另外的变量，因为它决定了凝胶的粘度，因此它具有粘膜粘附性能。
Batchelor等已详细描述了筛选聚合物分散体对食道粘膜的生物粘附性质的模型(Int.J.Pharm.,238:123-132,2002)。
其他途径和给药形式包括含有活微生物的食品制备物。在一些实例中，可以将表达生物活性多肽的微生物包含在乳制品中。
本发明的药物组合物可以通过任何已知的或有效的方法制备，以配制或制造所选择的剂型。例如，微生物可以与常见的，例如药学上可接受的载体(例如赋形剂和稀释剂)一起配制，形成口服片剂，胶囊，喷雾剂，锭剂，处理过的基质(例如用本发明所述的组合物处理过的口服或局部拭子，垫，或一次性不可消化的基质)；口服液体(例如悬浮液，溶液，乳液)，粉末，栓剂或任何其它合适的剂型。在一些实施方案中，本公开提供了制备药物组合物的方法。示例性的方法包括：将微生物(例如，非病原性细菌)与药学上可接受的运载体接触，从而形成药物组合物。在一些实例中，该方法还包括：使微生物在培养基中生长。该方法可以还包括干燥(例如，冷冻干燥)含有微生物的液体，其中液体任选地包括药学上可接受的运载体。
单位剂型
本公开还提供单位剂型，其包含一定量的本公开的微生物(例如，细菌)，任选地，与食品级或药学上可接受的运载体组合物组合。示例性的单位剂型包含约1×103至约1×1014菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。其它示例性的单位剂型包含约1×104至约1×1013菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)，或约1×104至约1×1012菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×105至约1×1012菌落形成单位(cfu)，或约1×106至约1×1012菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×108至约1×1012菌落形成单位(cfu)，或约1×109至约1×1012菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×109至约1×1011菌落形成单位(cfu)，或约1×109至约1×1010菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×107至约1×1011菌落形成单位(cfu)，约1×108至约1×1010菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。
在其它实施方式中，单位剂型包含约1×109至约1×1010菌落形成单位(cfu)，约1×109至约100×1010菌落形成单位(cfu)的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)。
单位剂型可具有任何物理形式或形状。在一些实施方案中，单位剂型适合口服给药。在根据这些实施方案的一些实例中，单位剂型是胶囊，片剂或颗粒的形式。示例性胶囊包括填充有微粒的胶囊。在一些实施方案中，剂型中含有的非病原性微生物(例如，非病原性革兰氏阳性细菌)是干粉形式。例如，微生物是冷冻干燥的粉末形式，其任选地被压实和涂覆。
通过参照下述实施例可以更好的理解本发明，但是本领域技术人员将理解的是，它们仅仅是对本发明的说明，如下述权利要求将更全面地描述。此外，通过本申请，引用了多份出版物。因而将这些出版物的公开通过引用其全部内容纳入本申请以更加完整地描述本发明所属领域的状态。
实施例
实施例1
产生在细菌表面表达CmbA的乳酸乳球菌菌株
(a)附加型表达CmbA
CmbA编码基因(参见，SEQ ID NO:11中CmbA的编码区域和SEQ ID NO:2，图5A-D)的密码子针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的DNA序列是合成的。使用覆盖PCR组装(overlayPCR assembly)，将PthyA>>SSusp45(usp45分泌信号)和cmbA融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSusp45-cmbA表达单元位于乳酸乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。将所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSusp45-cmbA>>3’thyA亚克隆到质粒pORI19(参见例如，Law等,J.Bacteriol.1995,177(24):7011-7018)中以生成质粒pAGX1893。将质粒pAGX1893转化到乳酸乳球菌菌株LL108中，产生菌株LL108[pAGX1893]。
(b)染色体整合(组成型表达CmbA)
将整合载体pAGX1893电穿孔到包含双顺反子表达盒的两种不同的乳酸乳球菌菌株中，所述双顺反子表达盒包含编码治疗性多肽PAL的异源性核酸序列(gapB>>rpmD>>pal)(SEQ ID NO:24和25)。这两种菌株是sAGX0599和sAGX0585(海藻糖累积菌株)。通过同源重组(双交叉(double-crossover))将SSusp45-cmbA插入thyA基因座通过PCR和Sanger DNA测序确定。所得菌株分别被称为sAGX0618和sAGX0619。
实施例2
产生在细菌表面表达MbpL的乳酸乳球菌菌株
(a)附加型表达MbpL(使用天然信号肽)
构建[PthyA>>mbpL]thyA整合/表达载体pAGX1903：MbpL编码基因(具有信号肽；SSmbpL)的密码子针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的DNA序列是合成的。使用覆盖PCR组装，将PthyA和mbpL融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSmbpL>>mbpL表达单元(SEQID NO:17)位于乳酸乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。将所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSmbpL>>mbpL>>3’thyA亚克隆到质粒pORI19中以生成质粒pAGX1903，将该质粒转化到乳酸乳球菌LL108中，产生菌株LL108[pAGX1903]。
(b)附加型表达MbpL(使用SSusp45)
纳入mbpL的另一构建体可以包含分泌前导序列SSusp45，而不是MbpL自身的信号肽。可以根据实施例1中所列过程制备[PthyA>>SSusp45-mbpL]thyA整合/表达载体，其中编码cmbA的核酸可以替换为编码MbpL多肽的核酸序列，所述MbpL多肽不具有其自身信号肽。MbpL编码基因(不具有信号肽)可以针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的DNA序列可以是合成的。使用覆盖PCR组装，PthyA>>SSusp45和mbpL可以融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSusp45-mbpL表达单元(SEQ ID NO:15)可以位于乳酸乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSusp45-mbpL>>3’thyA可以亚克隆到，例如，质粒pORI19中以生成另一质粒，可以将其转化到乳酸乳球菌中，例如，菌株LL108。
实施例3
产生在细菌表面表达MapA的乳酸乳球菌菌株
(a)附加型表达MapA(使用天然信号肽)
构建[PthyA>>mapA]thyA整合/表达载体pAGX1946：MapA编码基因(具有信号肽)可以针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的DNA序列是合成的。使用覆盖PCR组装，将PthyA和mapA融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSmapA>>mapA表达单元(SEQ ID NO:21)位于乳酸乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。将所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSmapA>>mapA>>3’thyA亚克隆到质粒pORI19中以生成质粒pAGX1946，将该质粒转化到乳酸乳球菌LL108中，产生菌株LL108[pAGX1946]。
(b)附加型表达MapA(使用SSusp45)
纳入mapA的另一构建体可以包含分泌前导序列SSusp45，而不是MapA自身的信号肽。例如，可以根据实施例1中所列过程制备[PthyA>>SSusp45>>mapA]thyA整合/表达载体，其中编码cmbA的核酸可以替换为编码MapA多肽的核酸序列但不具有其信号肽。MapA编码基因可以针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的DNA序列可以是合成的。使用覆盖PCR组装，PthyA>>SSusp45和mapA(不具有信号肽)可以融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSusp45-mapA表达单元(SEQ ID NO:19)可以位于乳酸乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSusp45-mapA>>3’thyA可以亚克隆到，例如，质粒pORI19中以生成另一质粒，可以将其转化到乳酸乳球菌菌株，例如，LL108。
实施例4
在细胞表面表达hTFF3-CmbA融合蛋白的乳酸乳球菌菌株
(a)表达hTFF3
图4显示了示例性的SSusp45-htff3构建体(氨基酸和核酸序列)，其可以用作融合蛋白的N-末端部分，具有C-末端附着多肽。可以通过PCR融合或更多的传统连接添加C-末端附着多肽。
(b)附加型表达hTFF3-CmbA
构建[PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA]thyA整合/表达载体。hTFF3和CmbA编码基因(具有信号肽)的密码子针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的htff3和cmbA DNA序列可以是合成的。使用覆盖PCR组装，将PthyA>>SSusp45、hTFF3和cmbA融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA表达单元(SEQ ID NO:11和图5A-D)可以位于乳酸乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。将所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA>>3’thyA亚克隆到质粒pORI19(Law等,1995，同上)中，以生成质粒pAGX2005(参见图1)，将该质粒转化到乳酸乳球菌LL108中，产生菌株LL108[pAGX2005]。
(b)染色体整合(组成型表达hTFF3-cmbA；thyA启动子)
将整合载体pAGX2005(参见上述和图1)电穿孔到两种不同的thyA-野生型乳酸乳球菌菌株——乳酸乳球菌sAGX0599和sAGX0585(海藻糖累积菌株)，其包含编码治疗性多肽PAL(gapB>>rpmD>>pal)的双顺反子表达盒。通过同源重组(双交叉)将SSusp45-hTFF3-CmbA(参见，例如，SEQ ID NO:11和图5A-D)插入thyA基因座通过PCR和Sanger DNA测序确定。所得菌株分别被称为sAGX0644和sAGX0645。
(c)染色体整合(组成型表达hTFF3-cmbA；PhllA启动子)
将启动子替换载体pAGX2041(PthyA->PhllA)电穿孔到乳酸乳球菌菌株sAGX0644(参见上述)中，其包含编码治疗性多肽PAL(gapB>>rpmD>>pal)和PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA的双顺反子表达盒。通过同源重组(双交叉)将PthyA替换为PhllA通过PCR和SangerDNA测序确定。所得菌株被称为sAGX0660。
实施例5
在细菌表面表达hTFF1-SpaX的乳酸乳球菌菌株
(a)附加型表达hTFF1-spaX
构建[PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX](SEQ ID NO:22和23)thyA整合/表达载体pAGX1894：hTFF1编码基因的密码子针对乳酸乳球菌MG1363优化。产生的DNA序列是合成的。使用覆盖PCR组装，将PthyA>>SSusp45、hTFF1和编码金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白质A细胞壁锚固物(anchor)(SpaX，Steidler等,1998)的基因融合以形成一个PCR片段。通过PCR，PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX表达单元位于乳球菌菌株MG1363的5’thyA和3’thyA区域之间。将所得PCR片段：5’thyA>>PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX>>3’thyA亚克隆到质粒pORI19中以生成质粒pAGX1894，将其转化到乳酸乳球菌LL108，产生菌株LL108[pAGX1894]。
实施例6
附加型表达黏蛋白结合多肽和细胞结合多肽的乳酸乳球菌菌株
如本文所述制备下述质粒和乳酸乳球菌菌株，并测试它们的黏蛋白结合和细胞结合(Caco-2、IEC-18和HT29-MTX细胞)能力。将下表1中所列质粒电穿孔到乳酸乳球菌LL108中。
表1
附加型表达黏蛋白结合多肽和细胞结合多肽的乳酸乳球菌菌株
(+)：；(++)：；(+++)；介于0和12％之间的细胞回收(基于各种实验指示相对总体表现)，使用各种细胞(Caco-2、IEC-18、HT29-MTX)和底物(II&III型黏蛋白)。
(a)乳酸乳球菌LL108[pAGX2005]与黏蛋白的结合
实验方案：将50mM碳酸盐缓冲液中的500μg/ml黏蛋白(西格玛II型(Sigma typeII)，目录号M2378-100G，来自猪胃的黏蛋白，和西格玛III型(Sigma type III)，目录号M1778-10G，来自猪胃的黏蛋白，结合的唾液酸(0.5-1.5％)，部分纯化)涂覆于Nunc平板。用PBS洗涤平板3次，用PBS+吐温20封闭，并用PBS洗涤3次。将过夜饱和的乳酸乳球菌培养物在PBS中稀释至OD600＝1。用PBS+0.05％吐温20洗涤培养物，并重悬于1体积PBS+0.05％吐温20中。在各孔上施用100μl细菌悬浮液。将平板于4℃孵育16小时，用PBS+0.05％吐温20洗涤3次。将平板在55℃干燥1小时。(A)在405nm测量OD。(B)添加100μl/孔结晶紫(1mg/ml)，并在室温孵育45分钟。随后，在595nm测量OD。
结果：
图2显示了当使用两种不同的读数方法测量时，通过使用金黄色葡萄球菌蛋白A锚固片段SpaX(Steidler等,1998，同上)在其表面表达人三叶因子1(hTFF1)的菌株LL108[pAGX1894]和在其表面表达hTFF3-CmbA的菌株LL108[pAGX2005]以相当的强度结合黏蛋白(西格玛II型和III型)。相反，对于两种读数方法，含有空对照载体的对照菌株LL108[pAGX1417]并未显示出对黏蛋白的任何结合。
(b)乳酸乳球菌LL108[pAGX2005]与Caco-2细胞的附着
实验方案：将Caco-2细胞以5×104细胞/cm2接种到12孔平板中。细胞生长17天至分化。将过夜饱和的乳酸乳球菌培养物在DMEM中稀释1/1000，并用DMEM洗涤3次。最终将乳酸乳球菌细胞重悬于DMEM中。将1ml的细菌悬浮液施用于12孔平板中的细胞，并于37℃孵育1小时。用DMEM洗涤细胞3次。通过用曲通-X100的裂解收获细胞(将1ml 0.1％曲通-X100的PBS施用于细胞，孵育5至10分钟，直到完全分离细胞)。将收获的细胞悬浮液适当地稀释，并在GM17E平板上铺板。孵育24小时后，于30℃对平板上的细菌计数进行测量。如下确定回收百分比：回收自收获的细胞悬浮液铺板的乳酸乳球菌细胞除以最初向Caco-2细胞施用的细胞数量。
图3显示了在其表面表达CmbA的菌株LL108[pAGX1893]和在其表面表达hTFF3-CmbA的菌株LL108[pAGX2005]展现出对Caco-2细胞相当的粘附。相反，对照菌株LL108[pAGX1417](对照)和在其表面表达hTFF1-SpaX的菌株LL108[pAGX1894]并不展现出对Caco-2细胞增强的附着。
结论：
与不表达hTFF3-CmbA融合多肽的相应菌株相比，在其表面上表达hTFF3-CmbA融合多肽的乳酸乳球菌展现出对黏蛋白的体外结合增强和对Caco-2细胞的附着增强。
实施例7
构建包含双顺反子表达单元的整合质粒
如本文所述使用纳入基因间区域(例如，rplN前的基因间区域)的构建体制备下表2中所列的整合质粒，并且可以如本文所述测试其黏蛋白结合和细胞结合能力。可以将表2中所列质粒电穿孔到宿主细胞中，如乳酸乳球菌LL108中，以生成表达(例如，组成型表达)由这些构建体编码的多肽的细菌。
表2
包含双顺反子表达单元的整合质粒
实施例8
包含染色体整合的表达单元的乳酸乳球菌
如本文所述制备下述质粒和乳酸乳球菌菌株，并如实施例6所述测试它们的黏蛋白结合和细胞结合能力。结果如图6和7所示。将下表3中所列质粒整合到乳酸乳球菌宿主菌株中，所述乳酸乳球菌宿主菌株包含染色体整合的PAL表达单元(PgapB>>gapB>>rpmD>>pal)。一些宿主菌株还包含遗传修饰，进而导致细胞内海藻糖累积(*)。示例性的海藻糖累积菌株(i)缺乏功能性海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(ΔtrePP)并且缺乏功能性纤维二糖特异性PTS系统IIc成分(ΔptcC)基因；(ii)表达大肠杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(大肠杆菌otsB)，和(iii)表达海藻糖转运体基因(PTS基因)。参见例如，美国专利号9,200,249和美国专利申请公开号2014/0234371，其各自公开内容通过引用其全部内容纳入本文。
还测试选择的菌株的PAL表达。结果(总结于图8中)显示，细胞附着和粘膜粘附性多肽的表达并不对各细胞表达的PAL的量(μg/109细胞)存在显著的影响。
表3
组成型表达黏蛋白结合多肽和细胞结合多肽的乳酸乳球菌菌株
(*)PhllA>>PTS；ΔtrePP；ΔptcC；usp45>>otsB。
wt：野生型(无海藻糖累积)
(+)；(++)；(+++)；使用各种细胞(Caco-2、IEC-18、HT29-MTX)和底物(II&III型黏蛋白)介于0和12％之间的细胞回收(基于各种实验指示相对总体表现)。
实施例9
构建包含染色体整合的表达单元的乳酸乳球菌
如本文所述使用适当的构建体制备下表4中所列的乳酸乳球菌菌株，并且可以如本文所述测试其黏蛋白结合和细胞结合能力。
可以评估在其表面表达黏蛋白结合多肽和细胞附着多肽的这些菌株中的每一个(例如，在其表面表达hTFF3-CmbA融合蛋白的乳酸乳球菌)的胃肠(GI)-通过时间，并且可以与不表达黏蛋白结合和细胞附着多肽的相应菌株(例如，不表达hTFF3-CmbA融合多肽的相应菌株)比较。
例如，可以向个体(人或动物)给予细菌细胞数量相等(例如，基于cfu)的细菌菌株，其表达hTFF3-CmbA，或不表达融合蛋白。非游离型菌株+/-hTFF3-CmbA可以具有抗生素选择标志物(例如，pT1NX，赋予红霉素抗性)。还可以基于其Em抗性选择游离型菌株。胃肠通过时间可以通过下述方法中的任一种测量：
表4
组成型表达黏蛋白结合多肽和细胞结合多肽的乳酸乳球菌菌株
(*)PhllA>>PTS；ΔtrePP；ΔptcC；usp45>>otsB。
wt：野生型(无海藻糖累积)
(1)以规律(例如，1h)间隔，可以收集所有粪便，并且可以确定各菌株回收的cfu的数量，例如，通过Q-PCR或稀释接种于含有红霉素的固体凝胶。这将获得各菌株的回收动力学，其可以显示收集的时间点，该时间点回收的cfu数量是最大值。观察到的是，超过该最大值的时间点，对hTFF3-CmbA+菌株回收更多的cfu。
(2)以规律(例如，1h)间隔，可以处死测试动物(例如，小鼠)，并且通过稀释接种于含有红霉素的固体凝胶可以确定回收自这些动物的细菌数量cfu。这显示出，随着时间的进展，对hTFF3-CmbA+菌株回收更多的cfu。
实施例10
治疗PKU-使用本公开的遗传修饰细菌表达的PAL在胃肠道中降解苯丙氨酸
苯丙氨酸脱氨酶(PAL)将Phe转化成苯丙烯酸并且不需要辅因子，这种酶已经用于治疗苯丙酮尿(PKU)。参见例如，Sarkissian,C.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2008,105:20894-20899。PAL在胃肠(GI)道内快速降解，所有难以实现口服递送。概念验证研究显示，在PKU(enu2/2)小鼠中口服给予由遗传工程改造的大肠杆菌表达的PAL导致血浆Phe水平的显著降低。参见例如，Sarkissian,C.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96:2339-2344。然而，给予大肠杆菌相关的安全性考量阻碍了该策略在人中的应用。已经生成了表达PAL的乳酸乳球菌，并且在PKU小鼠模型中评估。口服给予重组细菌导致氘代Phe吸收降低。参见例如，国际专利申请公开号WO 2014066945。
为了向人PKU患者给予表达PAL的遗传修饰的细菌，发明人制备了“临床级”菌株，其组成型表达PAL酶，并且经进一步修饰以显示延长的GI通过时间，GI条件下更强的稳定性，和自身容纳性(self-containment)。染色体整合生物活性多肽是重要的，因为附加型表达涉及安全性考量。例如，在胃肠系统中附加体可以容易地转移至其他细菌。此外，附加型维持可以导致制造的障碍。此外，产PAL的已知菌株在胃肠道附近被快速摧毁。并且，存在这样的担心，产PAL的已知细菌可能将存活并在体外繁殖。
产生了具有一个或多个下述改善的特征的多个乳酸乳球菌菌株，例如，如本文上述实施例8中所述：1)PAL表达盒，其被整合到细菌染色体中并受组成型启动子驱动，用于改善安全性和易制性；2)促进海藻糖累积的修饰，其改善胃肠道中乳酸乳球菌的存活(参见例如，Termont,S.等,Appl.Environ.Microbiol.2006,72:7694-7700)；3)引入对胸苷的营养缺陷型依赖性以防止在人体外的存活(参见例如，Steidler,L.等,Nat.Biotechnol.2003,21:785-789)；和4)遗传修饰以表达粘膜粘附性表面蛋白，以改善在胃肠道附近的潴留和延长Phe降解(参见例如，Caluwaerts,S.等,Oral.Oncol.2010,46:564-570)。评估菌株的PAL表达和其各自的细胞附着和粘膜粘附特性，如实施例6和8所述。粘附蛋白的表面表达使Caco-2单层上的细菌潴留改善大约8倍。对II型和III型黏蛋白的粘附相似地增强。重要地是，改善胃肠道内存活的海藻糖修饰以及粘附分子的表达不改变细菌表达的PAL水平。
在enu2/2“PKU”小鼠模型中测试选定的细菌菌株的效力，例如乳酸乳球菌菌株(例如，组成型表达PAL的菌株；例如，sAGX0599、sAGX0644、aAGX0585和sAGX0645)，以鉴定适合人临床试验的菌株。
在第一个研究中，在PKU小鼠中测试sAGX0599和sAGX0645，所述PKU小鼠通过管饲同时接受氘化的Phe和109cfu乳酸乳球菌的剂量。以15分钟的间隔进行1小时的血液采样，并分析氘化的Phe。阳性对照动物接受已知的附加型重组菌株，例如，国际专利申请公开号WO 2014066945中所述的那些。阴性对照动物不接受细菌。如图9所示，小鼠的总Phe吸收在饲喂sAGX0599(分泌PAL)和sAGX0645(PAL和TFF3-CmbA)小鼠中最低，并且优于阳性对照。有趣的是，Phe的最终水平在饲喂sAGX0645(PAL和TFF3-CmbA)的小鼠中最低，但是Phe的C最大较高。这反映了相较于没有粘附融合蛋白的乳酸乳球菌，sAGX0645在小肠向Phe摄取的特定位点较慢地下移。可以通过在饲喂前给予Phe降解细菌来获得较低的C最大和AUC。还可以通过定期与餐食一起给予细菌，使减少来自一餐食的Phe的远端Phe降解细菌已经存在于之前的餐食中，从而获得较低的C最大和AUC。
应当注意的是，饲喂Phe是PKU的人工模型。单氨基酸被非常高效地吸收。在典型情景中，当蛋白质穿过肠道时，蛋白质被破碎，从而使能够被吸收的游离氨基酸主要出现在更远端的部分，而不是小肠上部。因此，相比实验所指示的直接给予Phe，位于肠道更远端部分的分泌PAL的细菌能够更好的阻断从食物吸收Phe。
此外，可以用不同的细胞和黏蛋白粘附分子修饰乳酸乳球菌，以将PAL的递送定位于肠道的一个或多个最佳部分。
第二个研究可以评估选定细菌菌株(例如，乳酸乳球菌菌株)的药效学。可以在给予氘化Phe之前多至6小时时给予细菌。可如上所述分析血液。所得数据可以为后续研究的安排提供信息，并提供与临床应用相关的信息。例如，人可以将包含细菌的一个单位剂型(例如，胶囊)与各餐食一起服用。
第三个研究评估了细菌在降低Phe血液水平中的长期效力。动物可以灌服选定的细菌菌株(例如，乳酸乳球菌菌株)，例如，来自第一个研究的优选菌株，然后，可以饲喂标准饲料。例如，每天进行两次乳酸乳球菌相关的饲喂，每次喂养的持续时间由第二次饲喂的结果决定。可以定期评估血液Phe水平，例如，半周一次持续三周。对照可以是在第一个研究中采用的那些，并且还可以包括低Phe饲料组。注：该研究可不使用氘化Phe。阳性结果可以是Phe血液水平统计学上显著的改善，例如，足以有可能产生临床疗效。其他研究可以将细菌疗法(例如，乳酸乳球菌疗法)与饮食干预组合。
各研究可以利用5只小鼠一组以提供足够能力进行统计分析，并且小鼠可以在清除(washout)后重复使用。Phe可以通过串联质谱测试，其既敏感又特异并且需要最少量的血液。
实施例11
治疗口腔黏膜炎
口腔粘膜炎破坏口腔粘膜并且是癌症治疗的常见并发症，尤其是治疗头颈癌。TFF1在胃肠道上部分泌，并且与粘膜表面保护和治愈相关。TFF1有希望作为口腔粘膜炎的治疗方法。为了增强TFF1在口腔粘膜的递送，乳酸乳球菌经工程改造以表达hTFF1-CmbA融合物以及“游离的”hTFF1，二者均在染色体上。如果这是逐步完成的，那么存在一个htff1基因与染色体上的另一个htff1基因重组的风险。为了将这种风险最小化，可以多顺反子式(polycistronically)构建hTFF1-cmbA和htff1，并且因此能够一步转化并整合到染色体中。此外，可以改变一个tff1序列中各密码子的第三个碱基，从而其核酸序列将不同于其他tff1序列，但是翻译的hTFF1是相同的。例如，存在下述频率的6个丙氨酸密码子：UCU(18.6)、UCC(4.0)、UCA(20.6)、UCG(3.9)、AGU(16.7)和AGC(7.3)。因此，UCC和UCG可以互换。UCU、UCA以及较少程度的AGU可以互换。
修饰密码子频率后，通过PCR构建Ph11A>>SSusp45>>hTFF1>>rpmD>>SSusp45>>hTFF1-CmbA，并且将其克隆到源自pORI19的条件复制载体质粒的5’thyA和3’thyA之间。如本文他处所述转化到乳酸乳球菌中并进行选择，这将导致整合到染色体thyA基因座中。
所得菌株显示出分泌TFF1并表达TFF-CmbA融合物，相较于单独表达TFF1的菌株，该所得菌株介导对口腔粘膜的增强结合。在粘膜炎模型中测试菌株，并且TFF-CmbA的存在增强在口腔中的持续性并且增强治疗性TFF1的递送，从而使给药的频率降低。
实施例12
治疗糖尿病
如上所述分泌hTFF3-CmbA的乳酸乳球菌菌株经修饰表达人胰岛素原PINS和人IL10。例如，hPINS表达的构建体可以是具有SSUsp45分泌前导物的hPINS，受控于强gapB启动子，并且位于gapB基因和rpmD间隔子后(即,PgapB>>gapB>>rpmD>>usp45>>PINS)。对于hIL-10，构建体可以是PhllA>>SSusp45>>hil-10。
因为hTFF3-CmbA已经插入thyA基因座，PINS和IL-10可以插入其他基因组位点，如ptcC或trePP。PtcC和trePP突变与海藻糖累积相关。测试所得菌株的hIL-10、PINS和hTFF3-CmbA表达。然后在NOD小鼠(1型糖尿病的动物模型)中针对缺少hTFF3-CmbA的菌株测试上述菌株。缺少hTFF3-CmbA的菌株之前已经显示出产生对PINS的Treg响应，逆转对胰腺β细胞的自身免疫应答，进而治疗糖尿病。该治疗在新近发作的疾病中特别有效。hTFF-CmbA的存在可以增强肠定殖和持久性，产生更强烈的Treg响应。
虽然本文已经示出并描述了一些实施方式，但是这些实施方式仅作为示例提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。示例性实施方式
1.一种包含编码融合蛋白的外源性核酸的细菌，其中所述融合蛋白包含细胞附着多肽。
2.如实施方式1所述的细菌，其中所述细胞附着多肽选自：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，黏液结合蛋白(Mub)，黏液黏附促进蛋白(MapA)，乳酸乳球菌(lactococcal)黏蛋白结合蛋白(MbpL)和其任何组合。
3.如实施方式2所述的细菌，其中所述细胞附着多肽是CmbA。
4.如实施方式3所述的细菌，其中所述CmbA是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CmbA。
5.如前述实施方式中任一项所述的细菌，其中所述融合蛋白还包含黏蛋白结合多肽。
6.如实施方式5所述的细菌，其中所述黏蛋白结合多肽是三叶因子(TFF)多肽。
7.如实施方式6所述的细菌，其中所述融合蛋白包含CmbA和TFF。
8.如实施方式1-7中任一项所述的细菌，其中所述编码融合蛋白的外源核酸被整合到所述细菌的染色体中。
9.如实施方式1-7中任一项所述的细菌，其中所述编码融合蛋白的外源核酸位于质粒。
10.如前述实施方式中任一项所述的细菌，其中所述融合蛋白由所述细菌表达。
11.如实施方式10所述的细菌，其中所述融合蛋白锚固于所述细菌的细胞壁中。
12.如前述实施方式中任一项的细菌，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸还包含编码分泌信号肽的分泌前导序列。
13.如实施方式12所述的细菌，其中所述分泌前导序列是Ssusp45。
14.如实施方式13所述的细菌，其中所述分泌前导序列编码具有与SEQ ID NO:5至少90％相同的氨基酸序列的分泌信号肽。
15.如实施方式12-14中任一项所述的细菌，其中所述分泌信号肽与所述黏蛋白结合多肽结合。
16.如实施方式12-15中任一项所述的细菌，其中所述分泌信号肽与接头结合。
17.如实施方式12-16中任一项所述的细菌，其中所述分泌信号肽切割自所述融合蛋白。
18.如实施方式17所述的细菌，其中当所述融合蛋白锚固于所述细菌的细胞壁中时，所述分泌信号肽切割自所述融合蛋白。
19.如实施方式1-18中任一项所述的细菌，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸由选自下述的启动子转录性调节：thyA启动子(PthyA)、hlla启动子(PhllA)和gapB启动子。
20.如实施方式19所述的细菌，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸受PhllA转录性调节。
21.如实施方式19所述的细菌，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸受PhllA转录性调节。
22.一种细菌，所述细菌包含锚固于所述细菌的细胞壁中的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含TFF多肽和CmbA多肽。
23.如实施方式1-22中任一项所述的细菌，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。
24.如实施方式23所述的细菌，其中所述革兰氏阳性细菌是非病原性的。
25.如实施方式1-24中任一项所述的细菌，其中所述细菌是乳酸细菌(LAB)。
26.如实施方式25所述的细菌，其中所述LAB选自：乳球菌(Lactococcus sp.)，乳杆菌(Lactobacillus sp.)，双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)，链球菌(Streptococcussp.)和肠球菌(Enterococcus sp.)。
27.如实施方式25所述的细菌，其中所述LAB选自：格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鱼类乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、活泼乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviarius subsp.Araffinosus)、鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.Aviaries)、白鲑乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、倍发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卡尼乳杆菌(Lactobacillus carnis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌不发酵乳糖亚种(Lactobacillus casei subsp.Alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.Casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus caseisubsp.Pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus caseisubsp.Rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus casei subsp.Tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯乳杆菌(Lactobacillus confuses)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.Coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.Torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种(Lactobacillus curvatussubsp.Curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacillus curvatussubsp.Melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)、广布乳杆菌(Lactobacillus divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacilluspanis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.Tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.Camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakeisubsp.Sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.Salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius subsp.Salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、阿尔氏肠球菌(Enterococcusalcedinis)、阿桂氏肠球菌(Enterococcus aquimarinus)、亚洲肠球菌(Enterococcusasini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、卡氏肠球菌(Enterococcus caccae)、山茶肠球菌(Enterococcus camelliae)、坎氏肠球菌(Enterococcus canintestini)、犬肠球菌(Enterococcus canis)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、鸽肠球菌(Enterococcus columbae)、多样肠球菌(Enterococcus devriesei)、迪埃丝肠球菌(Enterococcus diestrammenae)、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚韧肠球菌(Enterococcus durans)、埃肯肠球菌(Enterococcuseurekensis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、浅黄肠球菌(Enterococcus gilvus)、溶过氧化肠球菌(Enterococcus haemoperoxidus)、荷曼氏肠球菌(Enterococcus hermanniensis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、乐玛尼肠球菌(Enterococcus lemanii)、病臭肠球菌(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、橄榄肠球菌(Enterococcus olivae)、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcusrotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcussilesiacus)、孤立肠球菌(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcussulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcusthailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcusureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcusvillorum)、香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、咽峡炎(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马蹄足链球菌(Streptococcus equines)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
28.如实施方式27所述的细菌，其中所述细菌是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。
29.如实施方式28所述的细菌，其中所述乳酸乳球菌选自：乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)，乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactissubsp.hordniae)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。
30.如实施方式6-29中任一项所述的细菌，其中所述TFF多肽选自TFF1、TFF2和TFF3。
31.如实施方式6-29中任一项所述的细菌，其中所述TFF多肽选自人TFF，小鼠TFF，猪TFF，狗TFF，猫TFF，牛TFF、羊TFF、鱼TFF和两栖类动物TFF。
32.如实施方式31所述的细菌，其中所述TFF多肽是人TFF。
33.如实施方式33所述的细菌，其中所述人TFF是人TFF3。
34.如实施方式6-29中任一项所述的细菌，其中所述TFF多肽具有与SEQ ID NO:3至少80％相同的氨基酸序列。
35.如实施方式6-29中任一项所述的细菌，其中所述TFF多肽是TFF变体多肽。
36.如实施方式35所述的细菌，其中所述TFF变体多肽相较于野生型TFF多肽的黏蛋白结合能力增强。
37.如实施方式1-36中任一项所述的细菌，其中所述CmbA多肽具有与SEQ IDNO:1至少80％相同的氨基酸序列。
38.如实施方式1-37中任一项所述的细菌，其还包含编码至少一种治疗性多肽的外源性核酸。
39.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是细胞因子。
40.如实施方式38或39所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是白介素(IL)。
41.如实施方式40所述的细菌，其中所述白介素选自：IL-2，IL-10，IL-18和其任何组合。
42.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是抗原。
43.如实施方式42所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是抗原和白介素。
44.如实施方式43所述的细菌，其中所述白介素是IL-2或IL-10。
45.如实施方式42-44中任一项所述的细菌，其中所述抗原是自体抗原。
46.如实施方式45所述的细菌，其中所述自体抗原是1型糖尿病(T1D)特异性抗原。
47.如实施方式46所述的细菌，其中所述T1D-特异性抗原选自：胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)，锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样多肽(ppIAPP)，外周蛋白，瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)和其任何组合。
48.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是抗体或其片段。
49.如实施方式48所述的细菌，其中所述抗体是单结构域抗体或纳米抗体。
50.如实施方式48或49所述的细菌，其中所述抗体选自：抗TNFα抗体，对IL-4的抗体，对IL-5的抗体，对IL-13的抗体，对IL-15的抗体，对免疫球蛋白E(IgE)的抗体或其任何组合。
51.如实施方式48或49所述的细菌，其中所述抗体是包含可溶性TNF受体和抗体Fc区域的融合蛋白。
52.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是酶或其片段。
53.如实施方式52所述的细菌，其中所述酶或其片段是功能性的。
54.如实施方式52或53所述的细菌，其中所述酶或其片段选自：苯丙氨酸脱氨酶(PAL)、氨基酸脱羧酶和其任何组合。
55.如实施方式54所述的细菌，其中所述酶或其片段是PAL。
56.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽选自：胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)和其任何组合。
57.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是生长因子。
58.如实施方式57所述的细菌，其中所述生长因子是表皮生长因子(EGF)。
59.如实施方式58所述的细菌，其中所述EGF是人EGF或猪EGF。
60.如实施方式38所述的细菌，其中所述至少一种治疗性多肽是TFF。
61.如实施方式60所述的细菌，其中所述TFF选自：TFF1、TFF2、TFF3和其任何组合。
62.如实施方式38-61中任一项所述的细菌，其中所述治疗性多肽是人多肽。
63.如实施方式42-44中任一项所述的细菌，其中所述抗原是过敏原。
64.如实施方式63所述的细菌，其中所述过敏原选自：树花粉过敏原，杂草花粉过敏原，草花粉过敏原，食物过敏原，尘螨过敏原，霉菌过敏原，动物皮屑过敏原和其任何组合。
65.如实施方式64所述的细菌，其中所述过敏原是杂草花粉过敏原。
66.如实施方式65所述的细菌，其中所述杂草花粉过敏原是豚草花粉过敏原。
67.如实施方式64所述的细菌，其中所述过敏原是树花粉过敏原。
68.如实施方式67所述的细菌，其中所述树花粉过敏原是桦树花粉过敏原或日本柳杉花粉过敏原。
69.如实施方式64所述的细菌，其中所述过敏原是食物过敏原。
70.如实施方式69所述的细菌，其中所述食物过敏原选自：花生过敏原，奶过敏原，蛋过敏原，谷蛋白过敏原(麦醇溶蛋白表位)和其任何组合。
71.如实施方式38-70中任一项所述的细菌，其中所述编码至少一种治疗性多肽的外源性核酸受gapB启动子转录性调节。
72.如实施方式1-71中任一项所述的细菌，其中所述细菌相较于不含所述外源性核酸或不含所述融合蛋白的相应细菌的胃肠(GI)通过时间延长。
73.如实施方式72所述的细菌，其中所述GI停留时间延长至少约10％。
74.如实施方式73所述的细菌，其中所述GI停留时间延长至少约30％。
75.如实施方式72所述的细菌，其中所述GI停留时间延长至少约10％至约50％。
76.如实施方式1-75中任一项所述的细菌，所述细菌相较于不含所述外源性核酸或不含所述融合蛋白的相应细菌的体外黏蛋白结合能力增强。
77.如实施方式76所述的细菌，其中所述体外黏蛋白结合能力增强至少约30％。
78.如实施方式77所述的细菌，其中所述体外黏蛋白结合能力增强至少约50％。
79.如实施方式78所述的细菌，其中所述体外黏蛋白结合能力增强至少约100％(约2倍)。
80.如实施方式76所述的细菌，其中所述体外黏蛋白结合能力增强至少约20％至约500％。
81.如实施方式76-80中任一项所述的细菌，其中测量所述体外黏蛋白结合能力通过：将所述细菌与来自猪胃的黏蛋白结合，然后：
(a)测量405nm(OD405)处的吸光率；或
(b)用结晶紫对所述细菌进行染色，随后检测595nm(OD595)处的吸光率。
82.如实施方式1-81中任一项所述的细菌，其中所述细菌相较于不含所述外源性核酸或不含所述融合蛋白的相应细菌的体外Caco-2细胞结合能力增强。
83.如实施方式82所述的细菌，其中所述体外Caco-2细胞结合能力增强至少约10％。
84.如实施方式83所述的细菌，其中所述体外Caco-2细胞结合能力增强至少约100％(约2倍)。
85.如实施方式84所述的细菌，其中所述体外Caco-2细胞结合能力增强至少约400％(约5倍)。
86.如实施方式82所述的细菌，其中所述体外Caco-2细胞结合能力增强至少约10％至约500％。
87.如实施方式82-86中任一项所述的细菌，其中所述体外Caco-2结合能力如下测量：
(a)将所述细菌的培养物与Caco-2细胞接触；
(b)洗涤所述Caco-2细胞以去除未结合的细菌细胞；
(c)将与所述Caco-2细胞结合的细菌细胞分离，从而形成分离的细菌细胞；和
(d)对所述分离的细菌细胞进行滴定。
88.如实施方式1-87中任一项所述的细菌，其中所述细菌相较于不含所述外源性核酸或不含所述融合蛋白的相应细菌显示出对肠粘膜的附着增强。
89.如实施方式88所述的细菌，其中所述对肠粘膜的附着增强至少约10％至约500％。
90.一种组合物，其包含实施方式1-89中任一项所述的细菌。
91.一种药物组合物，其包含实施方式1-89中任一项所述的细菌和药学上可接受运载体。
92.实施方式1-89中任一项所述的细菌、实施方式90所述组合物或实施方式91所述的药物组合物，用于治疗或预防选自下述的疾病：自身免疫疾病、过敏、代谢疾病和胃肠疾病。
93.实施方式1-89中任一项所述的细菌，实施方式90所述的组合物或实施方式91所述的药物组合物，用于制备用于治疗或预防疾病的药物。
94.如实施方式93所述的细菌、组合物或药物组合物，其中所述疾病选自：自身免疫疾病，过敏，营养疾病，胃肠疾病和营养缺陷。
95.一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予治疗有效量的实施方式1-89中任一项所述的细菌，实施方式90所述的组合物或实施方式91所述的药物组合物。
96.如实施方式95所述的方法，其中所述疾病选自：自身免疫疾病，过敏，代谢疾病，胃肠疾病和其任何组合。
97.如实施方式96所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病。
98.如实施方式97所述的方法，其中所述自身免疫疾病是1型糖尿病(T1D)。
99.如实施方式96所述的方法，其中所述疾病是代谢疾病。
100.如实施方式99所述的方法，其中所述代谢疾病是苯丙酮尿(PKU)。
101.如实施方式96所述的方法，其中所述疾病是胃肠疾病。
102.如实施方式101所述的方法，其中所述胃肠疾病是乳糜泄。
103.如实施方式101所述的方法，其中所述胃肠疾病是炎性肠病(IBD)。
104.如实施方式103所述的方法，其中所述IBD是克罗恩病或溃疡性结肠炎。
105.一种用于制备遗传修饰的细菌的方法，所述方法包括将细菌与编码融合蛋白的外源性核酸接触，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸包含编码细胞附着多肽的序列。
106.如实施方式105所述的方法，其中所述接触发生在足以使所述细菌将所述外源性核酸内化的条件下。
107.如实施方式105或106所述的方法，其中所述外源性核酸位于质粒。
108.如实施方式106或107所述的方法，其中所述外源性核酸被整合到所述细菌的染色体中。
109.如实施方式105-108中任一项所述的方法，其还包括培养所述细菌并在所述细菌中表达所述融合蛋白。
110.如实施方式105-109中任一项所述的方法，其中所述细胞附着多肽选自：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，Mub，MapA，MbpL和其任何组合。
111.如实施方式110所述的方法，其中所述细胞附着多肽是CmbA。
112.如实施方式111所述的方法，其中所述CmbA是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CmbA。
113.如实施方式105-112中任一项所述的方法，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸还包含编码黏蛋白结合多肽的序列。
114.如实施方式113所述的方法，其中所述黏蛋白结合多肽是三叶因子(TFF)多肽。
115.如实施方式114所述的方法，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸包含编码CmbA的序列和编码TFF多肽的序列。
116.如实施方式105-115中任一项所述的方法，其中所述编码融合蛋白的外源核酸被整合到所述细菌的染色体中。
117.如实施方式116所述的方法，其中使用同源重组将所述外源性核酸整合到所述细菌的染色体中。
118.如实施方式105-117中任一项所述的方法，还包括将所述细菌与编码治疗性多肽的外源性核酸接触。
119.如实施方式118所述的方法，其中所述将所述细菌与编码治疗性多肽的外源性核酸接触发生在所述将所述细菌与编码融合蛋白的外源性核酸接触之前。
120.如实施方式118所述的方法，其中所述将所述细菌与编码治疗性多肽的外源性核酸接触发生在所述将所述细菌与编码融合蛋白的外源性核酸接触之后。
121.如实施方式105-120中任一项所述的方法，其中与不含所述编码融合蛋白的外源性核酸的相应细菌相比，所述遗传修饰的细菌显示出黏液粘附和细胞粘附特性增强。
122.如实施方式105-121中任一项所述的方法，还包括将所述遗传修饰的细菌的培养物与至少一种冷冻保存剂合并以形成细菌混合物。
123.如实施方式122所述的方法，还包括冷冻干燥所述细菌混合物以形成冷冻干燥的组合物。
124.如实施方式105-121或实施方式123中任一项所述的方法，还包括将所述遗传修饰的细菌，或所述冷冻干燥的组合物与药学上可接受的运载体合并以形成药物组合物。
125.如实施方式123或124所述的方法，其还包括将所述冷冻干燥的组合物或所述药物组合物配制成药学剂型。
126.一种通过实施方式105-125中任一项所述的方法制备的遗传修饰的细菌。
127.一种单位剂型，包含实施方式1-89中任一项所述的细菌，实施方式90所述的组合物或实施方式91所述的药物组合物。
128.如实施方式127所述的单位剂型，其中，所述单位剂型是口服剂型。
129.如实施方式128所述的单位剂型，其中，所述口服剂型选自：片剂，胶囊，小药囊和包装的液体。
130.一种用于在哺乳动物中增强生长的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的实施方式1-89中任一项所述的细菌，实施方式90所述的组合物，实施方式91所述的药物组合物或实施方式127-129中任一项所述的单位剂型。
131.如实施方式130所述的方法，其中，所述哺乳动物选自：人、猪、牛和羊。
132.如实施方式130或131所述的方法，其中所述细菌、所述组合物、所述药物组合物或所述单位剂型经配制用于给予所述哺乳动物。
133.如实施方式130-132中任一项所述的方法，其中所述细菌包含编码生长因子的外源性核酸。
134.如实施方式133所述的方法，其中所述生长因子在所述细菌中组成型表达。
135.如实施方式133或134所述的方法，其中所述生长因子是EGF。
136.如实施方式135所述的方法，其中所述哺乳动物是猪并且所述EGF是猪EGF。
137.一种增加细菌与肠粘膜结合的方法，所述方法包括：
(a)将所述微生物与编码融合蛋白的外源性核酸接触，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸包含编码CmbA多肽的序列；和
(b)在所述细菌中表达所述编码融合蛋白的外源性核酸。
138.如实施方式137所述的方法，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸还包含编码TFF多肽的序列。
139.如实施方式138所述的方法，其中所述编码融合蛋白的外源性核酸的表达产生含有所述TFF和所述CmbA的融合蛋白。
140.一种试剂盒，包括(1)根据实施方式1-89中任一项所述的细菌，根据实施方式90所述的组合物，根据实施方式91所述的药物组合物，根据实施方式127-129中任一项所述的单位剂型，和(2)用于向哺乳动物给予所述细菌、所述组合物、所述药物组合物或所述单位剂型的说明书。
141.如实施方式140所述的试剂盒，其中，所述哺乳动物是人。
142.一种编码融合蛋白的核酸，所述核酸包含：
(i)编码选自以下的细胞附着多肽的序列：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，Mub，MapA，MbpL和其任何组合；和
(ii)编码选自以下黏蛋白结合多肽的序列：TFF多肽，MubBP和其组合。
143.如实施方式142所述的核酸，其中所述黏蛋白结合多肽是TFF多肽。
144.如实施方式143所述的核酸，其中所述TFF多肽是TFF3。
145.如实施方式142-144中任一项所述的核酸，其中所述细胞附着多肽是CmbA。
146.一种质粒，包含实施方式142-145中任一项所述的核酸。
147.一种细菌宿主细胞，包含实施方式146所述的质粒。
序列表
<110> 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司(INTREXON ACTOBIOTICS N.V.)
<120> 黏膜黏附性微生物
<130> 205350-0031-00-WO
<140>
<141>
<150> 62/394,024
<151> 2016-09-13
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 838
<212> PRT
<213> 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> 信号序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(838)
<223> 成熟蛋白
<400> 1
Met Leu Ser Arg Lys Asn Tyr Lys Glu Thr Ile Arg Lys Gln Thr Pro
1 5 10 15
Thr Lys Gln Tyr Tyr Thr Ile Lys Lys Leu Thr Val Gly Val Thr Ser
20 25 30
Val Leu Ile Gly Leu Ser Phe Met Gly Glu Leu Glu Gly Asp Ser Val
35 40 45
His Ala Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr Ser Val Thr Ser
50 55 60
Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ser Thr
85 90 95
Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val Gln Val Lys Ser
100 105 110
Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala Lys Gly Glu Asn
115 120 125
Lys Phe Ala Arg Ser Ala Val Lys Asp Ser Val Thr Asp Gly Lys Thr
130 135 140
Ser Thr Ala Glu Ile Asn Pro Ala Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ile
145 150 155 160
Thr Gln Leu Asn Gln Ser Leu Ala Lys Ser Ser Thr Ser Asp Ala Ala
165 170 175
Lys Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ile Lys Ala Thr Asp Pro Thr Asn Tyr
180 185 190
Pro Asn Cys Gly Asp Val Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Leu Asp Ala Ser
195 200 205
Gly Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Val Ile Ser Leu Lys Asp Met Tyr
210 215 220
Ile Phe Gln Ile Leu Lys Leu Val Asn Thr Lys Asp Ser Asp Phe Gln
225 230 235 240
Tyr Val Ile Leu Thr Met Asn Arg Lys Asp Thr Ala Asp Arg Ser Val
245 250 255
Tyr Leu Phe Val Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Asn Ala Val Val Val Lys
260 265 270
Val Lys Pro Asn Asp Thr Tyr Glu Leu Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Val
275 280 285
Thr Tyr Thr Glu Pro Thr Thr Ile Asn Gly His Tyr Val Asp Gly Thr
290 295 300
Phe Tyr Val Thr Gly Ser Thr Tyr Asp Asp Gly Phe Ile Met Pro Asp
305 310 315 320
Trp Gln Leu Gln His Leu Gln Ile Ile Tyr Ser Leu Gly Asn Tyr Asp
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Asp Ala Thr Ser Val Cys Glu Ile Met Pro Ser Tyr
340 345 350
Glu Lys Val Pro Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Pro Ser Asn Ile Ser
355 360 365
Gln Pro Lys Val Tyr Ile Thr Gly Phe Thr Gly Gln Glu Phe Asn Val
370 375 380
Thr Asp Ile Ile Asn Asn Tyr Lys Lys Val Phe Lys Gly Tyr Tyr Leu
385 390 395 400
Gln Asn Pro Asn Val Ala Ser Met Gly Thr Leu Ser Gln Phe Glu Asn
405 410 415
Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asp Gly Asn Val Asp
420 425 430
Phe Lys Gly Leu Tyr His Gln Ile Asp Asp Gln Gly Thr Met Ser Val
435 440 445
Ser Val Leu Asn Ala Asp Asn Lys Thr Ile Val Gly Pro Glu Asn Ile
450 455 460
Leu Ala Gly Lys Ser His Asn Phe Asn Phe Asn Gly His Asn Trp Ile
465 470 475 480
Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu Val Ile Leu Lys
485 490 495
Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu Asn Gly Asn Lys
500 505 510
Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp Asp Ala Ser Lys
515 520 525
Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp Gly Tyr Val Ala
530 535 540
Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn Leu Ser Ser Asp
545 550 555 560
Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr Tyr Ser Gly Ser
565 570 575
Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe Glu Pro Thr Thr
580 585 590
Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser Thr Leu Thr Ser
595 600 605
Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala Pro Thr Asp Ala
610 615 620
Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu Ala Ala Leu Arg
625 630 635 640
Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser Gly Ser Tyr Thr
645 650 655
Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn Tyr Lys Gly Tyr
660 665 670
Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile Asn Pro Gly Lys
675 680 685
Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu Lys Met Pro Thr
690 695 700
Trp Ser Ile Asp Asp Phe Ala Trp Glu Thr Ala Asp Gly Leu Ala Pro
705 710 715 720
Thr Ala Val Gly Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Thr Asp Ala Gly Lys Ala
725 730 735
Ala Leu Lys Lys Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Ser Ser Ile Thr Gly
740 745 750
Val Phe Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Ala Gln Thr Pro Glu Ile Leu Gly
755 760 765
Gln Thr Pro Glu Gln Gln Pro Gly Gln Asn Thr Asn Gln Ser Gly Ala
770 775 780
Glu Asn Gly Phe Gly Ser Ser Thr Arg Pro Asn Ala Ser Thr Asn Ser
785 790 795 800
Asn Leu Asn Gln Leu Pro Gln Thr Gly Asn Glu His Ser Asn Thr Ala
805 810 815
Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Met Leu Gly Leu Gly
820 825 830
Lys Lys Arg Lys His Asp
835
<210> 2
<211> 2517
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(150)
<223> 信号序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (151)..(2514)
<223> 成熟蛋白
<220>
<221> misc_feature
<222> (2515)..(2517)
<223> 终止密码子
<400> 2
atgctatcaa gaaaaaatta taaggaaact atacgaaaac agacacctac aaaacagtac 60
tatactatta agaaattaac tgttggggtt acttcggtat taattggtct atcctttatg 120
ggagaactag aaggggatag cgttcatgcg gacacgatga cagcaagcag tgagtcaaca 180
agtgttacgt cgacgactgc tcaggatggt ttaaaaaaat ctccacaact ctatttgcaa 240
gttactgata caaataaccc aagtacacca ttaagtgctt catccacagg gactagtaag 300
aatgttacct catcagctgc ggtacaagtg aagtccgcta gtgatgaaga agatagtgat 360
tctacactag ctaagggaga aaataaattt gctcggtcag cagtaaaaga ttcagtcact 420
gatgggaaaa caagtacagc agaaattaat ccggcaaaat taagcagtcc tgctttaata 480
acgcaactca accaatcctt agctaagagc agtacgagtg atgcagcaaa agctaatgat 540
gagttagaaa ttaaagcaac agatccgact aattatccaa actgtggcga tgtgtatggg 600
ccattatttg aattggatgc tagcggacag cttgttaata aagatgaagt tatatctctt 660
aaagatatgt atattttcca aatattgaaa ttagtaaata caaaagatag tgactttcaa 720
tatgtaatat taacaatgaa tcgtaaagat actgcagata ggtctgtata tctttttgta 780
actggaagca attatagtaa tgctgttgtt gttaaagtaa agccaaatga tacttatgaa 840
ttaagtaaaa ctggatatag tgttacttat acagaaccaa caactataaa tggacattat 900
gttgatggaa ctttttatgt tacaggaagt acttacgatg atggttttat aatgccagat 960
tggcaactgc agcaccttca gattatatat agtttaggaa attatgatcc aagcaatact 1020
gacgcaacat cagtttgtga aataatgcca agttatgaaa aggtaccggt aattaaatat 1080
agtggagtac cttcaaatat tagccaacct aaggtttaca ttaccgggtt tacgggtcaa 1140
gagtttaacg ttacagatat tattaacaat tataagaaag tttttaaggg ctactatctt 1200
caaaatccta atgtggcgtc catgggaact ctttcccaat ttgagaatgg tggttattac 1260
ttaaagacat attatgataa tgatggtaat gttgacttta agggcttgta tcatcaaatt 1320
gatgatcagg gaacaatgag tgtgagtgtt cttaatgcag ataataaaac aattgttgga 1380
cctgaaaata ttcttgctgg taaatcgcat aactttaact ttaatggtca taactggatt 1440
gcgcggaatc cttatgtcac tagttcagct cacgaagtca tattaaagta tgctaagtta 1500
ggttcagtta ttcctgttga tgaaaacgga aataaaataa acgatggatg gcaatatgtt 1560
aatgatccag atgatgcttc caaagccact agcccatatg aaaaagcgcc agttatcgat 1620
ggttatgtag ctgtaaatcc agatgaaacg atcgttcttc ctcataactt aagtagtgac 1680
acaaagattt attaccgaaa gaggattaaa gttacctata gtggtagtga cagcaagacc 1740
tacgatggta acccagctaa cttcgagcca acgacagttc agtggagtgg cttgaaagga 1800
ctgaacactt caaccttaac gtccgctgac ttcacgtgga atactgcgga taagaaggca 1860
ccaacggatg ccggtaagta cacacttagt ttgaatacga ccggagaagc agccttacgt 1920
aaggctaacc cgaactatga tctcaagaca attagcggta gttacaccta cacgattaat 1980
ccactaggga ttgtgactgt aaattacaag ggctatgata agaaagtcta tgatggtcaa 2040
cctggaacga ttaatccggg taaattaacg tggagtaagt tgccagatgg tacttcattg 2100
aagatgccaa catggagtat agatgatttc gcttgggaaa cagctgatgg cttagcacca 2160
acggcagtag gaacttatcg gattatcttg acggatgctg gtaaggctgc actaaagaag 2220
attaatccaa attatgactt aagcagtatt actggtgtct ttacttatga aattaagcca 2280
gcacagacac cagaaatctt aggccaaaca cctgagcaac aaccaggcca aaatactaat 2340
caatcaggag ctgaaaacgg ctttggttct tctacaaggc ctaatgcatc aactaactcc 2400
aatcttaatc aacttccaca gactggtaat gagcattcta atactgcact tgctggtcta 2460
gcattggctt tcttgactgc tatgcttggt ttgggcaaga agcgtaaaca tgattaa 2517
<210> 3
<211> 59
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Glu Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys
1 5 10 15
Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn
20 25 30
Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys
35 40 45
Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe
50 55
<210> 4
<211> 180
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
gaagaatacg ttggtctttc agctaaccaa tgtgctgttc cagctaaaga tcgtgttgat 60
tgtggttacc cacacgttac tccaaaagaa tgtaacaacc gtggttgttg ttttgattca 120
cgtatcccag gtgttccatg gtgttttaaa ccacttcaag aagctgaatg tactttttaa 180
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> （乳酸乳球菌）Lactococcus lactis
<400> 5
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala
20 25
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> （乳酸乳球菌）Lactococcus lactis
<400> 6
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc c 81
<210> 7
<211> 81
<212> DNA
<213> （乳酸乳球菌）Lactococcus lactis
<400> 7
atgaagaaga aaatcattag tgccatctta atgtctacag tgattctttc agctgcagct 60
cctttatcag gcgtttatgc a 81
<210> 8
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(27)
<223> SSusp45
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(86)
<223> hTFF3
<400> 8
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
Glu Ala Glu Cys Thr Phe
85
<210> 9
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(258)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(81)
<223> SSusp45
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(258)
<223> hTFF3
<220>
<221> misc_feature
<222> (259)..(261)
<223> 终止密码子
<400> 9
atg aaa aaa aag att atc tca gct att tta atg tct aca gtg ata ctt 48
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt tac gcc gaa gaa tac gtt ggt 96
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
ctt tca gct aac caa tgt gct gtt cca gct aaa gat cgt gtt gat tgt 144
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
ggt tac cca cac gtt act cca aaa gaa tgt aac aac cgt ggt tgt tgt 192
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
ttt gat tca cgt atc cca ggt gtt cca tgg tgt ttt aaa cca ctt caa 240
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
gaa gct gaa tgt act ttt taa 261
Glu Ala Glu Cys Thr Phe
85
<210> 10
<211> 874
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(27)
<223> SSusp45
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(86)
<223> hTFF3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (87)..(874)
<223> CmbA
<400> 10
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
Glu Ala Glu Cys Thr Phe Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr
85 90 95
Ser Val Thr Ser Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln
100 105 110
Leu Tyr Leu Gln Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser
115 120 125
Ala Ser Ser Thr Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val
130 135 140
Gln Val Lys Ser Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala
145 150 155 160
Lys Gly Glu Asn Lys Phe Ala Arg Ser Ala Val Lys Asp Ser Val Thr
165 170 175
Asp Gly Lys Thr Ser Thr Ala Glu Ile Asn Pro Ala Lys Leu Ser Ser
180 185 190
Pro Ala Leu Ile Thr Gln Leu Asn Gln Ser Leu Ala Lys Ser Ser Thr
195 200 205
Ser Asp Ala Ala Lys Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ile Lys Ala Thr Asp
210 215 220
Pro Thr Asn Tyr Pro Asn Cys Gly Asp Val Tyr Gly Pro Leu Phe Glu
225 230 235 240
Leu Asp Ala Ser Gly Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Val Ile Ser Leu
245 250 255
Lys Asp Met Tyr Ile Phe Gln Ile Leu Lys Leu Val Asn Thr Lys Asp
260 265 270
Ser Asp Phe Gln Tyr Val Ile Leu Thr Met Asn Arg Lys Asp Thr Ala
275 280 285
Asp Arg Ser Val Tyr Leu Phe Val Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Asn Ala
290 295 300
Val Val Val Lys Val Lys Pro Asn Asp Thr Tyr Glu Leu Ser Lys Thr
305 310 315 320
Gly Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Glu Pro Thr Thr Ile Asn Gly His Tyr
325 330 335
Val Asp Gly Thr Phe Tyr Val Thr Gly Ser Thr Tyr Asp Asp Gly Phe
340 345 350
Ile Met Pro Asp Trp Gln Leu Gln His Leu Gln Ile Ile Tyr Ser Leu
355 360 365
Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Asn Thr Asp Ala Thr Ser Val Cys Glu Ile
370 375 380
Met Pro Ser Tyr Glu Lys Val Pro Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Pro
385 390 395 400
Ser Asn Ile Ser Gln Pro Lys Val Tyr Ile Thr Gly Phe Thr Gly Gln
405 410 415
Glu Phe Asn Val Thr Asp Ile Ile Asn Asn Tyr Lys Lys Val Phe Lys
420 425 430
Gly Tyr Tyr Leu Gln Asn Pro Asn Val Ala Ser Met Gly Thr Leu Ser
435 440 445
Gln Phe Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asp
450 455 460
Gly Asn Val Asp Phe Lys Gly Leu Tyr His Gln Ile Asp Asp Gln Gly
465 470 475 480
Thr Met Ser Val Ser Val Leu Asn Ala Asp Asn Lys Thr Ile Val Gly
485 490 495
Pro Glu Asn Ile Leu Ala Gly Lys Ser His Asn Phe Asn Phe Asn Gly
500 505 510
His Asn Trp Ile Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu
515 520 525
Val Ile Leu Lys Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu
530 535 540
Asn Gly Asn Lys Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp
545 550 555 560
Asp Ala Ser Lys Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp
565 570 575
Gly Tyr Val Ala Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn
580 585 590
Leu Ser Ser Asp Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr
595 600 605
Tyr Ser Gly Ser Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe
610 615 620
Glu Pro Thr Thr Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser
625 630 635 640
Thr Leu Thr Ser Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala
645 650 655
Pro Thr Asp Ala Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu
660 665 670
Ala Ala Leu Arg Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser
675 680 685
Gly Ser Tyr Thr Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn
690 695 700
Tyr Lys Gly Tyr Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile
705 710 715 720
Asn Pro Gly Lys Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu
725 730 735
Lys Met Pro Thr Trp Ser Ile Asp Asp Phe Ala Trp Glu Thr Ala Asp
740 745 750
Gly Leu Ala Pro Thr Ala Val Gly Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Thr Asp
755 760 765
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Lys Lys Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Ser
770 775 780
Ser Ile Thr Gly Val Phe Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Ala Gln Thr Pro
785 790 795 800
Glu Ile Leu Gly Gln Thr Pro Glu Gln Gln Pro Gly Gln Asn Thr Asn
805 810 815
Gln Ser Gly Ala Glu Asn Gly Phe Gly Ser Ser Thr Arg Pro Asn Ala
820 825 830
Ser Thr Asn Ser Asn Leu Asn Gln Leu Pro Gln Thr Gly Asn Glu His
835 840 845
Ser Asn Thr Ala Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Met
850 855 860
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Arg Lys His Asp
865 870
<210> 11
<211> 2625
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2622)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(81)
<223> SSusp45
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(258)
<223> hTFF3
<220>
<221> misc_feature
<222> (259)..(2622)
<223> CmbA
<220>
<221> misc_feature
<222> (2623)..(2625)
<223> 终止密码子
<400> 11
atg aaa aaa aag att atc tca gct att tta atg tct aca gtg ata ctt 48
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt tac gcc gaa gaa tac gtt ggt 96
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
ctt tca gct aac caa tgt gct gtt cca gct aaa gat cgt gtt gat tgt 144
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
ggt tac cca cac gtt act cca aaa gaa tgt aac aac cgt ggt tgt tgt 192
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
ttt gat tca cgt atc cca ggt gtt cca tgg tgt ttt aaa cca ctt caa 240
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
gaa gct gaa tgt act ttt gac acg atg aca gca agc agt gag tca aca 288
Glu Ala Glu Cys Thr Phe Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr
85 90 95
agt gtt acg tcg acg act gct cag gat ggt tta aaa aaa tct cca caa 336
Ser Val Thr Ser Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln
100 105 110
ctc tat ttg caa gtt act gat aca aat aac cca agt aca cca tta agt 384
Leu Tyr Leu Gln Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser
115 120 125
gct tca tcc aca ggg act agt aag aat gtt acc tca tca gct gcg gta 432
Ala Ser Ser Thr Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val
130 135 140
caa gtg aag tcc gct agt gat gaa gaa gat agt gat tct aca cta gct 480
Gln Val Lys Ser Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala
145 150 155 160
aag gga gaa aat aaa ttt gct cgg tca gca gta aaa gat tca gtc act 528
Lys Gly Glu Asn Lys Phe Ala Arg Ser Ala Val Lys Asp Ser Val Thr
165 170 175
gat ggg aaa aca agt aca gca gaa att aat ccg gca aaa tta agc agt 576
Asp Gly Lys Thr Ser Thr Ala Glu Ile Asn Pro Ala Lys Leu Ser Ser
180 185 190
cct gct tta ata acg caa ctc aac caa tcc tta gct aag agc agt acg 624
Pro Ala Leu Ile Thr Gln Leu Asn Gln Ser Leu Ala Lys Ser Ser Thr
195 200 205
agt gat gca gca aaa gct aat gat gag tta gaa att aaa gca aca gat 672
Ser Asp Ala Ala Lys Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ile Lys Ala Thr Asp
210 215 220
ccg act aat tat cca aac tgt ggc gat gtg tat ggg cca tta ttt gaa 720
Pro Thr Asn Tyr Pro Asn Cys Gly Asp Val Tyr Gly Pro Leu Phe Glu
225 230 235 240
ttg gat gct agc gga cag ctt gtt aat aaa gat gaa gtt ata tct ctt 768
Leu Asp Ala Ser Gly Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Val Ile Ser Leu
245 250 255
aaa gat atg tat att ttc caa ata ttg aaa tta gta aat aca aaa gat 816
Lys Asp Met Tyr Ile Phe Gln Ile Leu Lys Leu Val Asn Thr Lys Asp
260 265 270
agt gac ttt caa tat gta ata tta aca atg aat cgt aaa gat act gca 864
Ser Asp Phe Gln Tyr Val Ile Leu Thr Met Asn Arg Lys Asp Thr Ala
275 280 285
gat agg tct gta tat ctt ttt gta act gga agc aat tat agt aat gct 912
Asp Arg Ser Val Tyr Leu Phe Val Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Asn Ala
290 295 300
gtt gtt gtt aaa gta aag cca aat gat act tat gaa tta agt aaa act 960
Val Val Val Lys Val Lys Pro Asn Asp Thr Tyr Glu Leu Ser Lys Thr
305 310 315 320
gga tat agt gtt act tat aca gaa cca aca act ata aat gga cat tat 1008
Gly Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Glu Pro Thr Thr Ile Asn Gly His Tyr
325 330 335
gtt gat gga act ttt tat gtt aca gga agt act tac gat gat ggt ttt 1056
Val Asp Gly Thr Phe Tyr Val Thr Gly Ser Thr Tyr Asp Asp Gly Phe
340 345 350
ata atg cca gat tgg caa ctg cag cac ctt cag att ata tat agt tta 1104
Ile Met Pro Asp Trp Gln Leu Gln His Leu Gln Ile Ile Tyr Ser Leu
355 360 365
gga aat tat gat cca agc aat act gac gca aca tca gtt tgt gaa ata 1152
Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Asn Thr Asp Ala Thr Ser Val Cys Glu Ile
370 375 380
atg cca agt tat gaa aag gta ccg gta att aaa tat agt gga gta cct 1200
Met Pro Ser Tyr Glu Lys Val Pro Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Pro
385 390 395 400
tca aat att agc caa cct aag gtt tac att acc ggg ttt acg ggt caa 1248
Ser Asn Ile Ser Gln Pro Lys Val Tyr Ile Thr Gly Phe Thr Gly Gln
405 410 415
gag ttt aac gtt aca gat att att aac aat tat aag aaa gtt ttt aag 1296
Glu Phe Asn Val Thr Asp Ile Ile Asn Asn Tyr Lys Lys Val Phe Lys
420 425 430
ggc tac tat ctt caa aat cct aat gtg gcg tcc atg gga act ctt tcc 1344
Gly Tyr Tyr Leu Gln Asn Pro Asn Val Ala Ser Met Gly Thr Leu Ser
435 440 445
caa ttt gag aat ggt ggt tat tac tta aag aca tat tat gat aat gat 1392
Gln Phe Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asp
450 455 460
ggt aat gtt gac ttt aag ggc ttg tat cat caa att gat gat cag gga 1440
Gly Asn Val Asp Phe Lys Gly Leu Tyr His Gln Ile Asp Asp Gln Gly
465 470 475 480
aca atg agt gtg agt gtt ctt aat gca gat aat aaa aca att gtt gga 1488
Thr Met Ser Val Ser Val Leu Asn Ala Asp Asn Lys Thr Ile Val Gly
485 490 495
cct gaa aat att ctt gct ggt aaa tcg cat aac ttt aac ttt aat ggt 1536
Pro Glu Asn Ile Leu Ala Gly Lys Ser His Asn Phe Asn Phe Asn Gly
500 505 510
cat aac tgg att gcg cgg aat cct tat gtc act agt tca gct cac gaa 1584
His Asn Trp Ile Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu
515 520 525
gtc ata tta aag tat gct aag tta ggt tca gtt att cct gtt gat gaa 1632
Val Ile Leu Lys Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu
530 535 540
aac gga aat aaa ata aac gat gga tgg caa tat gtt aat gat cca gat 1680
Asn Gly Asn Lys Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp
545 550 555 560
gat gct tcc aaa gcc act agc cca tat gaa aaa gcg cca gtt atc gat 1728
Asp Ala Ser Lys Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp
565 570 575
ggt tat gta gct gta aat cca gat gaa acg atc gtt ctt cct cat aac 1776
Gly Tyr Val Ala Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn
580 585 590
tta agt agt gac aca aag att tat tac cga aag agg att aaa gtt acc 1824
Leu Ser Ser Asp Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr
595 600 605
tat agt ggt agt gac agc aag acc tac gat ggt aac cca gct aac ttc 1872
Tyr Ser Gly Ser Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe
610 615 620
gag cca acg aca gtt cag tgg agt ggc ttg aaa gga ctg aac act tca 1920
Glu Pro Thr Thr Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser
625 630 635 640
acc tta acg tcc gct gac ttc acg tgg aat act gcg gat aag aag gca 1968
Thr Leu Thr Ser Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala
645 650 655
cca acg gat gcc ggt aag tac aca ctt agt ttg aat acg acc gga gaa 2016
Pro Thr Asp Ala Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu
660 665 670
gca gcc tta cgt aag gct aac ccg aac tat gat ctc aag aca att agc 2064
Ala Ala Leu Arg Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser
675 680 685
ggt agt tac acc tac acg att aat cca cta ggg att gtg act gta aat 2112
Gly Ser Tyr Thr Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn
690 695 700
tac aag ggc tat gat aag aaa gtc tat gat ggt caa cct gga acg att 2160
Tyr Lys Gly Tyr Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile
705 710 715 720
aat ccg ggt aaa tta acg tgg agt aag ttg cca gat ggt act tca ttg 2208
Asn Pro Gly Lys Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu
725 730 735
aag atg cca aca tgg agt ata gat gat ttc gct tgg gaa aca gct gat 2256
Lys Met Pro Thr Trp Ser Ile Asp Asp Phe Ala Trp Glu Thr Ala Asp
740 745 750
ggc tta gca cca acg gca gta gga act tat cgg att atc ttg acg gat 2304
Gly Leu Ala Pro Thr Ala Val Gly Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Thr Asp
755 760 765
gct ggt aag gct gca cta aag aag att aat cca aat tat gac tta agc 2352
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Lys Lys Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Ser
770 775 780
agt att act ggt gtc ttt act tat gaa att aag cca gca cag aca cca 2400
Ser Ile Thr Gly Val Phe Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Ala Gln Thr Pro
785 790 795 800
gaa atc tta ggc caa aca cct gag caa caa cca ggc caa aat act aat 2448
Glu Ile Leu Gly Gln Thr Pro Glu Gln Gln Pro Gly Gln Asn Thr Asn
805 810 815
caa tca gga gct gaa aac ggc ttt ggt tct tct aca agg cct aat gca 2496
Gln Ser Gly Ala Glu Asn Gly Phe Gly Ser Ser Thr Arg Pro Asn Ala
820 825 830
tca act aac tcc aat ctt aat caa ctt cca cag act ggt aat gag cat 2544
Ser Thr Asn Ser Asn Leu Asn Gln Leu Pro Gln Thr Gly Asn Glu His
835 840 845
tct aat act gca ctt gct ggt cta gca ttg gct ttc ttg act gct atg 2592
Ser Asn Thr Ala Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Met
850 855 860
ctt ggt ttg ggc aag aag cgt aaa cat gat taa 2625
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Arg Lys His Asp
865 870
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：rpmD序列
<400> 12
taaggaggaa aaaatg 16
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：rpmD序列
<400> 13
ggaggaaaaa 10
<210> 14
<211> 985
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 14
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Phe Asn Gly Ala Val
20 25 30
Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val Val Val Thr Thr
35 40 45
Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser
50 55 60
Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys
85 90 95
Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ala Asp
165 170 175
Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ser Asp Ser Ser Leu
180 185 190
Val Lys Gly Arg Val Tyr Ala Ser Thr Tyr Leu Glu Ser Asn Lys Asn
195 200 205
Tyr Tyr Thr Asp Pro Ala Ile Ser Arg Gly Phe Leu Asp Ser Pro Ile
210 215 220
Ser Lys Glu Leu Leu Gly Asp Gln Asn Trp Asn Met Phe Gln Val Ala
225 230 235 240
Val Ser Lys Asn Leu Val Ser Tyr Asn Pro Gly Met Thr Phe Asn Gln
245 250 255
Tyr Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Ser Pro Glu Asp Asn Phe Ile Val Tyr
260 265 270
Pro Arg Leu Thr Asn Gln Ile Val Arg Leu Lys Ser Gly Ala Tyr Leu
275 280 285
Asn Ala Asn Pro Asn Pro Lys Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile
290 295 300
Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Gly Pro Thr Asp Asp Arg Gly Ala Tyr
305 310 315 320
Trp Gly Asp Lys Glu Leu Glu Asp Pro Val Leu Phe Ser Arg Leu Thr
325 330 335
Val Gly Glu Leu Pro Ser Ala Ser Glu Gly Thr Leu Gly Leu Phe Asn
340 345 350
Ser Gly Thr Tyr Leu Phe Pro Thr Gln Ile Gly Tyr Gly Glu Asn Ala
355 360 365
Thr Val Asn Asp Tyr Met Leu Thr Pro Gly Asn Asp Phe Ile Ile Pro
370 375 380
Thr Arg Phe Asn Thr Ile Arg Asn Asp Val Tyr Leu Thr Met Arg Ser
385 390 395 400
Arg Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Leu Gln Gly Ala Gln Ala Ser Leu Thr
405 410 415
Ala Thr Ser Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys
420 425 430
Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Phe
435 440 445
Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro Phe Val Tyr Thr
450 455 460
Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp Lys Phe Ser Ala
465 470 475 480
Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys Ser Gly Ala Asn
485 490 495
Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu Ser Gly Phe Asn
500 505 510
Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ser Asp Arg
515 520 525
Glu Asn Asp Ala Leu Lys Asn Thr Asp Val Asn Phe Tyr Met Tyr Thr
530 535 540
Lys Gly Asn Thr Glu Thr Asn Val Thr Thr Pro Leu Ala Pro Asn Gly
545 550 555 560
Tyr His Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser Glu Phe Lys Ile Gln Thr Thr
565 570 575
Arg Pro Tyr Phe Ser Trp Thr Gly Asp Ile Ser Asn Ala Ile Lys Ile
580 585 590
Ser Glu Ala Asn Ala Asp Phe Asp Asp Leu Leu Gly Ser Asn Ser Leu
595 600 605
Gln Val Thr Asp Asn Gly Val Asp Ser Asp Gly Thr Pro Ile Ser Val
610 615 620
Asp Leu Asn Arg Val Arg Ile Arg Ile Ser Glu Asp Gly Gly Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys Ala Leu Leu Thr
645 650 655
Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala Tyr Thr Tyr Ser
660 665 670
Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu Pro Ser Glu Ile
675 680 685
Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr Arg Thr Leu Thr
690 695 700
Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val Lys Tyr Ile Asp
705 710 715 720
Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys Ala Gly Asn Val
725 730 735
Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe
740 745 750
Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln
755 760 765
Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Gly Ser Val
770 775 780
Thr Ala Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val
785 790 795 800
Val Lys Thr Gly Asn Ile Gly Asp Thr Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Thr
805 810 815
Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Glu Val Gln Gly Ser Val Ser Gly Gln
820 825 830
Phe Thr Asn Gln Glu Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro
835 840 845
Val Ala Gly Ala His Ile Ile Ala Lys Tyr Val Asp Glu Asn Gly Asn
850 855 860
Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile Gly Asp Ser Tyr
865 870 875 880
Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln
885 890 895
Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr
900 905 910
Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu Thr Pro Thr Pro
915 920 925
Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr Ile Ser Ser Ser
930 935 940
Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr Leu Phe Gly Met
945 950 955 960
Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu Ser Leu Phe Phe
965 970 975
Asn Ser Lys Arg Lys Arg Lys Ser Lys
980 985
<210> 15
<211> 3180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (208)..(3162)
<400> 15
agctttagaa gaagaaaaag cagctgttga attagagggt tcagaaactg cctgatggat 60
attttttata aatctggttt gaacaaatta tattgacatc tctttttcta tcctgataat 120
tctgagaggt tattttggga aatactattg aaccatatcg aggtggtgtg gtataatgaa 180
gggaattaaa aaagatagga aaatttc atg aaa aaa aag att atc tca gct att 234
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile
1 5
tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt 282
Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val
10 15 20 25
tac gct ttc aat gga gcg gtc gtg cac gcg gat aca ccg agc aat gac 330
Tyr Ala Phe Asn Gly Ala Val Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp
30 35 40
aaa cct gtg gtt gta aca acc att gcg tca aac tca tct gcc gtt gaa 378
Lys Pro Val Val Val Thr Thr Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu
45 50 55
gct gag act gcc agc agt tct tca tca agt gcc gta aaa gcg gaa acg 426
Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr
60 65 70
acc agc gcc tct tct tca agt gct gta aaa gct gag aca gcc tct agc 474
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser
75 80 85
agt tca agc tca gcc gta aag gca gaa act acg agt gca tca tct tca 522
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser
90 95 100 105
tca gcg gta aag gcg gag acc gct agc tct tct tct agt agt gct gtg 570
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val
110 115 120
aaa gcc gag acg acg agc gca tct tca tct tct gct gtt aag gcg gaa 618
Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu
125 130 135
aca aca agc gct tct agc tca agc gcc gtc aaa gca gaa aca gcg agt 666
Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser
140 145 150
tca tct tct agt agt gca gtt aaa gcc gaa act acc tct gcc agc tca 714
Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser
155 160 165
tct tca gca gca aag gcg gat acc acc agc gca gct agt tca tct gcg 762
Ser Ser Ala Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala
170 175 180 185
gca aag agc gac agt tca ctt gtg aaa ggg cgt gtt tat gcc tct acg 810
Ala Lys Ser Asp Ser Ser Leu Val Lys Gly Arg Val Tyr Ala Ser Thr
190 195 200
tat tta gag tca aac aag aac tat tat acc gat ccg gct atc agt cgt 858
Tyr Leu Glu Ser Asn Lys Asn Tyr Tyr Thr Asp Pro Ala Ile Ser Arg
205 210 215
ggc ttt tta gac agt ccg ata tct aaa gag tta ctt ggt gat caa aat 906
Gly Phe Leu Asp Ser Pro Ile Ser Lys Glu Leu Leu Gly Asp Gln Asn
220 225 230
tgg aat atg ttt caa gtt gct gtc agc aag aac ctt gtc tca tat aat 954
Trp Asn Met Phe Gln Val Ala Val Ser Lys Asn Leu Val Ser Tyr Asn
235 240 245
cca gga atg acg ttt aac caa tat tac ttg gcg aat aat atc tca cca 1002
Pro Gly Met Thr Phe Asn Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Ser Pro
250 255 260 265
gaa gat aat ttc atc gtt tat cct cgt tta acc aat caa ata gta aga 1050
Glu Asp Asn Phe Ile Val Tyr Pro Arg Leu Thr Asn Gln Ile Val Arg
270 275 280
tta aag agt gga gcc tat ttg aac gcg aac cct aac cct aag ggg gcg 1098
Leu Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Pro Asn Pro Lys Gly Ala
285 290 295
aaa gac gat agt ggc aac ata gtc gac tac ata act tat gtt ggc cct 1146
Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Gly Pro
300 305 310
acg gac gat cgt ggt gcg tac tgg ggg gac aaa gag ctt gaa gat ccg 1194
Thr Asp Asp Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Asp Lys Glu Leu Glu Asp Pro
315 320 325
gtg ctt ttc tct cga ctt act gtg ggt gag ttg ccg agt gct tct gag 1242
Val Leu Phe Ser Arg Leu Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Ala Ser Glu
330 335 340 345
ggc acg ctt ggc ttg ttt aac agt gga aca tat ctt ttc cct aca caa 1290
Gly Thr Leu Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Leu Phe Pro Thr Gln
350 355 360
ata ggc tac ggt gaa aac gcc aca gtt aac gat tac atg ctt acc cct 1338
Ile Gly Tyr Gly Glu Asn Ala Thr Val Asn Asp Tyr Met Leu Thr Pro
365 370 375
ggt aat gac ttc atc ata cca act cga ttt aat acg atc cgt aat gac 1386
Gly Asn Asp Phe Ile Ile Pro Thr Arg Phe Asn Thr Ile Arg Asn Asp
380 385 390
gtg tac tta acg atg cga tct cgt gca tac ttc ggg gct gga tta caa 1434
Val Tyr Leu Thr Met Arg Ser Arg Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Leu Gln
395 400 405
ggg gca cag gca agt tta acc gca acc tct aat gga aaa ccg gta gtg 1482
Gly Ala Gln Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser Asn Gly Lys Pro Val Val
410 415 420 425
ggg tca tca gag aac agc aaa ttt tac ata gac aca gac agt aat gtc 1530
Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val
430 435 440
tat ctt aca aaa cag ggg ttt gat caa ctt ggt aac ttt ggt aaa ata 1578
Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile
445 450 455
atg gct cca ttc gtt tat acg agc gct tca aac gat ttg aag aag gtc 1626
Met Ala Pro Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val
460 465 470
gga ata gac aaa ttc tca gcc atg atg aac caa ggg ttg agt agc ata 1674
Gly Ile Asp Lys Phe Ser Ala Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile
475 480 485
caa agc aag tct ggg gca aac acc atc gta tca ggg aac ggc ggc cag 1722
Gln Ser Lys Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln
490 495 500 505
att caa ttg agc ggt ttc aat aga gaa aca gac ttg gat gga gca ttc 1770
Ile Gln Leu Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe
510 515 520
tca tct tca ata agc gat cgt gag aac gat gca tta aag aat aca gat 1818
Ser Ser Ser Ile Ser Asp Arg Glu Asn Asp Ala Leu Lys Asn Thr Asp
525 530 535
gtc aac ttc tat atg tat acg aaa ggc aac aca gaa act aat gtg acg 1866
Val Asn Phe Tyr Met Tyr Thr Lys Gly Asn Thr Glu Thr Asn Val Thr
540 545 550
acg ccg ttg gcc ccg aat ggg tac cac ctt tac tca cca aac gta tct 1914
Thr Pro Leu Ala Pro Asn Gly Tyr His Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser
555 560 565
gaa ttc aag ata cag act acc aga cct tac ttc tca tgg acg gga gac 1962
Glu Phe Lys Ile Gln Thr Thr Arg Pro Tyr Phe Ser Trp Thr Gly Asp
570 575 580 585
ata agt aat gct ata aaa att tct gaa gcc aat gcg gat ttc gat gat 2010
Ile Ser Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Ala Asn Ala Asp Phe Asp Asp
590 595 600
tta ctt ggt agt aac tca tta cag gtt act gat aat ggg gtg gac agc 2058
Leu Leu Gly Ser Asn Ser Leu Gln Val Thr Asp Asn Gly Val Asp Ser
605 610 615
gac ggt acc cct ata tct gtc gac ctt aat cgt gtc aga ata aga ata 2106
Asp Gly Thr Pro Ile Ser Val Asp Leu Asn Arg Val Arg Ile Arg Ile
620 625 630
tct gag gac gga ggg agt aca tat tct aac gat tct tat acg ctt aat 2154
Ser Glu Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn
635 640 645
gac tta aaa gcc tta ttg acc agc gga aac atc act gtc cct aag ata 2202
Asp Leu Lys Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile
650 655 660 665
gtt atc gct tat acc tac tct gcg act gat tca aaa act gat aac atc 2250
Val Ile Ala Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile
670 675 680
ggt aag tta ccg tct gaa att gac gac aac aca ggc gcg tac gcc gtt 2298
Gly Lys Leu Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val
685 690 695
ccg ttc aca cgt acg ttg acg aat gac att cca gat aaa aaa agt aac 2346
Pro Phe Thr Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn
700 705 710
att acg gtc aag tat atc gat atc tct ggt aat acc ata tct gat aac 2394
Ile Thr Val Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn
715 720 725
ata gtt aaa gcc ggt aat gtt ggc gat tca tat aca aca gaa caa aaa 2442
Ile Val Lys Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys
730 735 740 745
gca ata ccg gga tac acc ttc aaa gcc gta caa ggt aat cca acc ggt 2490
Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly
750 755 760
caa ttc acg tct gat gct caa aca gtg acg tac gtt tac acg aag gat 2538
Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp
765 770 775
cca gtg gca ggc ggc agc gtc acc gct aag tat gtc gat acc agt ggg 2586
Pro Val Ala Gly Gly Ser Val Thr Ala Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly
780 785 790
aac gcc atc tct gat aac gtt gtt aaa acc ggt aac atc ggc gat acc 2634
Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Thr Gly Asn Ile Gly Asp Thr
795 800 805
tac agt act aag cag aag acc ata ccg gga tat act ttc aaa gag gtt 2682
Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Thr Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Glu Val
810 815 820 825
caa gga tct gtt agc gga caa ttt acc aat cag gaa caa acg gtc act 2730
Gln Gly Ser Val Ser Gly Gln Phe Thr Asn Gln Glu Gln Thr Val Thr
830 835 840
tat gta tac act aaa gat ccg gtc gct ggt gcc cat atc ata gca aaa 2778
Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Ala His Ile Ile Ala Lys
845 850 855
tac gta gac gag aat ggt aac acg ata tca gac aac gtt gtg aag tca 2826
Tyr Val Asp Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser
860 865 870
ggt aac att ggg gat tct tac act act gag caa aag gca att cct gga 2874
Gly Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly
875 880 885
tac act ttt aaa gct gtt cag gga aac cca acg gga caa ttc acc agt 2922
Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser
890 895 900 905
gac gcc cag acg gtg acc tac ata tac act aaa gtg aaa aca tct ggt 2970
Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly
910 915 920
ggg agc gaa acc cca acg ccg tca aaa acg att gca acc aag tca agt 3018
Gly Ser Glu Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser
925 930 935
aca aac aca atc tct agt tct aca ctt ccg aag acg ggc gat agt caa 3066
Thr Asn Thr Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln
940 945 950
gtg tct act tta ttc ggc atg gtg gtg ggg ttc ttc ata ttt ggg gcg 3114
Val Ser Thr Leu Phe Gly Met Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala
955 960 965
gga acc ttg agc tta ttt ttt aac agt aag cga aaa aga aag tca aag 3162
Gly Thr Leu Ser Leu Phe Phe Asn Ser Lys Arg Lys Arg Lys Ser Lys
970 975 980 985
taaattaatc tataagtt 3180
<210> 16
<211> 998
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 16
Met Val Ser Lys Asn Asn Val Gln Phe Tyr Asp Lys Lys Asn Asp Asn
1 5 10 15
Gln Gln Arg Trp Gly Leu Arg Lys Thr Ser Phe Gly Leu Ala Ser Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Thr Ser Phe Val Leu Phe Asn Gly Ala Val Val His Ala
35 40 45
Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val Val Val Thr Thr Ile Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys
85 90 95
Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr
100 105 110
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu
165 170 175
Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ser Asp Ser Ser Leu Val Lys Gly
195 200 205
Arg Val Tyr Ala Ser Thr Tyr Leu Glu Ser Asn Lys Asn Tyr Tyr Thr
210 215 220
Asp Pro Ala Ile Ser Arg Gly Phe Leu Asp Ser Pro Ile Ser Lys Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Asp Gln Asn Trp Asn Met Phe Gln Val Ala Val Ser Lys
245 250 255
Asn Leu Val Ser Tyr Asn Pro Gly Met Thr Phe Asn Gln Tyr Tyr Leu
260 265 270
Ala Asn Asn Ile Ser Pro Glu Asp Asn Phe Ile Val Tyr Pro Arg Leu
275 280 285
Thr Asn Gln Ile Val Arg Leu Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Asn
290 295 300
Pro Asn Pro Lys Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile Val Asp Tyr
305 310 315 320
Ile Thr Tyr Val Gly Pro Thr Asp Asp Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Asp
325 330 335
Lys Glu Leu Glu Asp Pro Val Leu Phe Ser Arg Leu Thr Val Gly Glu
340 345 350
Leu Pro Ser Ala Ser Glu Gly Thr Leu Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr
355 360 365
Tyr Leu Phe Pro Thr Gln Ile Gly Tyr Gly Glu Asn Ala Thr Val Asn
370 375 380
Asp Tyr Met Leu Thr Pro Gly Asn Asp Phe Ile Ile Pro Thr Arg Phe
385 390 395 400
Asn Thr Ile Arg Asn Asp Val Tyr Leu Thr Met Arg Ser Arg Ala Tyr
405 410 415
Phe Gly Ala Gly Leu Gln Gly Ala Gln Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser
420 425 430
Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile
435 440 445
Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu
450 455 460
Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser
465 470 475 480
Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp Lys Phe Ser Ala Met Met Asn
485 490 495
Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val
500 505 510
Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr
515 520 525
Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ser Asp Arg Glu Asn Asp
530 535 540
Ala Leu Lys Asn Thr Asp Val Asn Phe Tyr Met Tyr Thr Lys Gly Asn
545 550 555 560
Thr Glu Thr Asn Val Thr Thr Pro Leu Ala Pro Asn Gly Tyr His Leu
565 570 575
Tyr Ser Pro Asn Val Ser Glu Phe Lys Ile Gln Thr Thr Arg Pro Tyr
580 585 590
Phe Ser Trp Thr Gly Asp Ile Ser Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Ala
595 600 605
Asn Ala Asp Phe Asp Asp Leu Leu Gly Ser Asn Ser Leu Gln Val Thr
610 615 620
Asp Asn Gly Val Asp Ser Asp Gly Thr Pro Ile Ser Val Asp Leu Asn
625 630 635 640
Arg Val Arg Ile Arg Ile Ser Glu Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn
645 650 655
Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn
660 665 670
Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp
675 680 685
Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn
690 695 700
Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile
705 710 715 720
Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly
725 730 735
Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser
740 745 750
Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val
755 760 765
Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr
770 775 780
Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Gly Ser Val Thr Ala Lys
785 790 795 800
Tyr Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Thr
805 810 815
Gly Asn Ile Gly Asp Thr Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Thr Ile Pro Gly
820 825 830
Tyr Thr Phe Lys Glu Val Gln Gly Ser Val Ser Gly Gln Phe Thr Asn
835 840 845
Gln Glu Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly
850 855 860
Ala His Ile Ile Ala Lys Tyr Val Asp Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser
865 870 875 880
Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu
885 890 895
Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro
900 905 910
Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr
915 920 925
Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr
930 935 940
Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro
945 950 955 960
Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr Leu Phe Gly Met Val Val Gly
965 970 975
Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu Ser Leu Phe Phe Asn Ser Lys
980 985 990
Arg Lys Arg Lys Ser Lys
995
<210> 17
<211> 3240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (208)..(3201)
<400> 17
agctttagaa gaagaaaaag cagctgttga attagagggt tcagaaactg cctgatggat 60
attttttata aatctggttt gaacaaatta tattgacatc tctttttcta tcctgataat 120
tctgagaggt tattttggga aatactattg aaccatatcg aggtggtgtg gtataatgaa 180
gggaattaaa aaagatagga aaatttc atg gtg tca aag aat aac gtg cag ttt 234
Met Val Ser Lys Asn Asn Val Gln Phe
1 5
tac gac aag aaa aat gat aat caa cag cga tgg ggc ttg aga aaa act 282
Tyr Asp Lys Lys Asn Asp Asn Gln Gln Arg Trp Gly Leu Arg Lys Thr
10 15 20 25
tca ttt ggt tta gcg agc ctt ttg ctt ggc acg tct ttc gtt tta ttc 330
Ser Phe Gly Leu Ala Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ser Phe Val Leu Phe
30 35 40
aat gga gcg gtc gtg cac gcg gat aca ccg agc aat gac aaa cct gtg 378
Asn Gly Ala Val Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val
45 50 55
gtt gta aca acc att gcg tca aac tca tct gcc gtt gaa gct gag act 426
Val Val Thr Thr Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr
60 65 70
gcc agc agt tct tca tca agt gcc gta aaa gcg gaa acg acc agc gcc 474
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala
75 80 85
tct tct tca agt gct gta aaa gct gag aca gcc tct agc agt tca agc 522
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser
90 95 100 105
tca gcc gta aag gca gaa act acg agt gca tca tct tca tca gcg gta 570
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val
110 115 120
aag gcg gag acc gct agc tct tct tct agt agt gct gtg aaa gcc gag 618
Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu
125 130 135
acg acg agc gca tct tca tct tct gct gtt aag gcg gaa aca aca agc 666
Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser
140 145 150
gct tct agc tca agc gcc gtc aaa gca gaa aca gcg agt tca tct tct 714
Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
155 160 165
agt agt gca gtt aaa gcc gaa act acc tct gcc agc tca tct tca gca 762
Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala
170 175 180 185
gca aag gcg gat acc acc agc gca gct agt tca tct gcg gca aag agc 810
Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ser
190 195 200
gac agt tca ctt gtg aaa ggg cgt gtt tat gcc tct acg tat tta gag 858
Asp Ser Ser Leu Val Lys Gly Arg Val Tyr Ala Ser Thr Tyr Leu Glu
205 210 215
tca aac aag aac tat tat acc gat ccg gct atc agt cgt ggc ttt tta 906
Ser Asn Lys Asn Tyr Tyr Thr Asp Pro Ala Ile Ser Arg Gly Phe Leu
220 225 230
gac agt ccg ata tct aaa gag tta ctt ggt gat caa aat tgg aat atg 954
Asp Ser Pro Ile Ser Lys Glu Leu Leu Gly Asp Gln Asn Trp Asn Met
235 240 245
ttt caa gtt gct gtc agc aag aac ctt gtc tca tat aat cca gga atg 1002
Phe Gln Val Ala Val Ser Lys Asn Leu Val Ser Tyr Asn Pro Gly Met
250 255 260 265
acg ttt aac caa tat tac ttg gcg aat aat atc tca cca gaa gat aat 1050
Thr Phe Asn Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Ser Pro Glu Asp Asn
270 275 280
ttc atc gtt tat cct cgt tta acc aat caa ata gta aga tta aag agt 1098
Phe Ile Val Tyr Pro Arg Leu Thr Asn Gln Ile Val Arg Leu Lys Ser
285 290 295
gga gcc tat ttg aac gcg aac cct aac cct aag ggg gcg aaa gac gat 1146
Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Pro Asn Pro Lys Gly Ala Lys Asp Asp
300 305 310
agt ggc aac ata gtc gac tac ata act tat gtt ggc cct acg gac gat 1194
Ser Gly Asn Ile Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Gly Pro Thr Asp Asp
315 320 325
cgt ggt gcg tac tgg ggg gac aaa gag ctt gaa gat ccg gtg ctt ttc 1242
Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Asp Lys Glu Leu Glu Asp Pro Val Leu Phe
330 335 340 345
tct cga ctt act gtg ggt gag ttg ccg agt gct tct gag ggc acg ctt 1290
Ser Arg Leu Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Ala Ser Glu Gly Thr Leu
350 355 360
ggc ttg ttt aac agt gga aca tat ctt ttc cct aca caa ata ggc tac 1338
Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Leu Phe Pro Thr Gln Ile Gly Tyr
365 370 375
ggt gaa aac gcc aca gtt aac gat tac atg ctt acc cct ggt aat gac 1386
Gly Glu Asn Ala Thr Val Asn Asp Tyr Met Leu Thr Pro Gly Asn Asp
380 385 390
ttc atc ata cca act cga ttt aat acg atc cgt aat gac gtg tac tta 1434
Phe Ile Ile Pro Thr Arg Phe Asn Thr Ile Arg Asn Asp Val Tyr Leu
395 400 405
acg atg cga tct cgt gca tac ttc ggg gct gga tta caa ggg gca cag 1482
Thr Met Arg Ser Arg Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Leu Gln Gly Ala Gln
410 415 420 425
gca agt tta acc gca acc tct aat gga aaa ccg gta gtg ggg tca tca 1530
Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser
430 435 440
gag aac agc aaa ttt tac ata gac aca gac agt aat gtc tat ctt aca 1578
Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr
445 450 455
aaa cag ggg ttt gat caa ctt ggt aac ttt ggt aaa ata atg gct cca 1626
Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro
460 465 470
ttc gtt tat acg agc gct tca aac gat ttg aag aag gtc gga ata gac 1674
Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp
475 480 485
aaa ttc tca gcc atg atg aac caa ggg ttg agt agc ata caa agc aag 1722
Lys Phe Ser Ala Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys
490 495 500 505
tct ggg gca aac acc atc gta tca ggg aac ggc ggc cag att caa ttg 1770
Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu
510 515 520
agc ggt ttc aat aga gaa aca gac ttg gat gga gca ttc tca tct tca 1818
Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser
525 530 535
ata agc gat cgt gag aac gat gca tta aag aat aca gat gtc aac ttc 1866
Ile Ser Asp Arg Glu Asn Asp Ala Leu Lys Asn Thr Asp Val Asn Phe
540 545 550
tat atg tat acg aaa ggc aac aca gaa act aat gtg acg acg ccg ttg 1914
Tyr Met Tyr Thr Lys Gly Asn Thr Glu Thr Asn Val Thr Thr Pro Leu
555 560 565
gcc ccg aat ggg tac cac ctt tac tca cca aac gta tct gaa ttc aag 1962
Ala Pro Asn Gly Tyr His Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser Glu Phe Lys
570 575 580 585
ata cag act acc aga cct tac ttc tca tgg acg gga gac ata agt aat 2010
Ile Gln Thr Thr Arg Pro Tyr Phe Ser Trp Thr Gly Asp Ile Ser Asn
590 595 600
gct ata aaa att tct gaa gcc aat gcg gat ttc gat gat tta ctt ggt 2058
Ala Ile Lys Ile Ser Glu Ala Asn Ala Asp Phe Asp Asp Leu Leu Gly
605 610 615
agt aac tca tta cag gtt act gat aat ggg gtg gac agc gac ggt acc 2106
Ser Asn Ser Leu Gln Val Thr Asp Asn Gly Val Asp Ser Asp Gly Thr
620 625 630
cct ata tct gtc gac ctt aat cgt gtc aga ata aga ata tct gag gac 2154
Pro Ile Ser Val Asp Leu Asn Arg Val Arg Ile Arg Ile Ser Glu Asp
635 640 645
gga ggg agt aca tat tct aac gat tct tat acg ctt aat gac tta aaa 2202
Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys
650 655 660 665
gcc tta ttg acc agc gga aac atc act gtc cct aag ata gtt atc gct 2250
Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala
670 675 680
tat acc tac tct gcg act gat tca aaa act gat aac atc ggt aag tta 2298
Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu
685 690 695
ccg tct gaa att gac gac aac aca ggc gcg tac gcc gtt ccg ttc aca 2346
Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr
700 705 710
cgt acg ttg acg aat gac att cca gat aaa aaa agt aac att acg gtc 2394
Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val
715 720 725
aag tat atc gat atc tct ggt aat acc ata tct gat aac ata gtt aaa 2442
Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys
730 735 740 745
gcc ggt aat gtt ggc gat tca tat aca aca gaa caa aaa gca ata ccg 2490
Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro
750 755 760
gga tac acc ttc aaa gcc gta caa ggt aat cca acc ggt caa ttc acg 2538
Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr
765 770 775
tct gat gct caa aca gtg acg tac gtt tac acg aag gat cca gtg gca 2586
Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala
780 785 790
ggc ggc agc gtc acc gct aag tat gtc gat acc agt ggg aac gcc atc 2634
Gly Gly Ser Val Thr Ala Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Ile
795 800 805
tct gat aac gtt gtt aaa acc ggt aac atc ggc gat acc tac agt act 2682
Ser Asp Asn Val Val Lys Thr Gly Asn Ile Gly Asp Thr Tyr Ser Thr
810 815 820 825
aag cag aag acc ata ccg gga tat act ttc aaa gag gtt caa gga tct 2730
Lys Gln Lys Thr Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Glu Val Gln Gly Ser
830 835 840
gtt agc gga caa ttt acc aat cag gaa caa acg gtc act tat gta tac 2778
Val Ser Gly Gln Phe Thr Asn Gln Glu Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr
845 850 855
act aaa gat ccg gtc gct ggt gcc cat atc ata gca aaa tac gta gac 2826
Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Ala His Ile Ile Ala Lys Tyr Val Asp
860 865 870
gag aat ggt aac acg ata tca gac aac gtt gtg aag tca ggt aac att 2874
Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile
875 880 885
ggg gat tct tac act act gag caa aag gca att cct gga tac act ttt 2922
Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe
890 895 900 905
aaa gct gtt cag gga aac cca acg gga caa ttc acc agt gac gcc cag 2970
Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln
910 915 920
acg gtg acc tac ata tac act aaa gtg aaa aca tct ggt ggg agc gaa 3018
Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu
925 930 935
acc cca acg ccg tca aaa acg att gca acc aag tca agt aca aac aca 3066
Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr
940 945 950
atc tct agt tct aca ctt ccg aag acg ggc gat agt caa gtg tct act 3114
Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr
955 960 965
tta ttc ggc atg gtg gtg ggg ttc ttc ata ttt ggg gcg gga acc ttg 3162
Leu Phe Gly Met Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu
970 975 980 985
agc tta ttt ttt aac agt aag cga aaa aga aag tca aag taaattaatc 3211
Ser Leu Phe Phe Asn Ser Lys Arg Lys Arg Lys Ser Lys
990 995
tataagttac tgacaaaact gtcagtaac 3240
<210> 18
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 18
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ser Ser Ala Val Asn
20 25 30
Ser Glu Leu Val His Lys Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr
35 40 45
Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu
50 55 60
Val Asp Leu Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn
65 70 75 80
Phe Val Pro Thr Lys Trp Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly
85 90 95
Lys Phe Asp Val Val Met Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala
100 105 110
Lys Gln Tyr Asn Phe Ser Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu
115 120 125
Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly
130 135 140
Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu
165 170 175
Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu
180 185 190
Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met
195 200 205
Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe
210 215 220
Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys
225 230 235 240
Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe
245 250 255
Gly Ala Asp Ile Thr Glu
260
<210> 19
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (153)..(938)
<400> 19
tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60
ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120
atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa aaa aag att atc tca 173
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser
1 5
gct att tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca 221
Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser
10 15 20
ggt gtt tac gct tca tca gct gtt aat tca gaa tta gtt cat aag gga 269
Gly Val Tyr Ala Ser Ser Ala Val Asn Ser Glu Leu Val His Lys Gly
25 30 35
gaa tta aca att ggt ctt gag gga acg tac tct ccg tac tct tat cgt 317
Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Arg
40 45 50 55
aaa aat aac aaa tta act ggc ttt gaa gta gat ctt ggt aaa gca gtt 365
Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala Val
60 65 70
gct aaa aag atg ggc tta aaa gct aac ttt gta cca act aaa tgg gat 413
Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp Asp
75 80 85
tcg cta att gcc ggt ctt ggt tca ggt aag ttt gat gta gta atg aac 461
Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly Lys Phe Asp Val Val Met Asn
90 95 100
aac att aca cag aca cct gaa cgg gcc aag caa tat aat ttc tct acc 509
Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser Thr
105 110 115
cca tat atc aag tcc cgg ttt gca tta att gtt cct act gat agt aac 557
Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn
120 125 130 135
atc aaa agc ttg aag aat att aaa ggc aag aag att att gct ggt acg 605
Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr
140 145 150
gga act aat aat gcg aat gtg gta aaa aaa tat aag ggt aac ctt aca 653
Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr
155 160 165
cca aat ggc gat ttt gct agt tcc tta gat atg atc aag caa ggt cgg 701
Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg
170 175 180
gct gcc ggg aca att aac tcc cgt gaa gct tgg tac gct tac agc aag 749
Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys
185 190 195
aag aac agt act aag ggt ctc aag atg att gat gtt tct agt gaa caa 797
Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln
200 205 210 215
gat cca gct aag att tca gca ctt ttt aac aag aaa gat act gct att 845
Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile
220 225 230
caa tct tcc tac aac aag gca ctt aag gaa ctt caa caa gac gga aca 893
Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr
235 240 245
gtc aag aag cta tct gaa aag tac ttc ggt gca gat att act gaa 938
Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu
250 255 260
taaattaatc tataagtta 957
<210> 20
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 20
Met Lys Phe Trp Lys Lys Ala Leu Leu Thr Ile Val Ala Leu Thr Val
1 5 10 15
Gly Thr Pro Ala Gly Ile Thr Ser Val Ser Ala Ala Ser Ser Ala Val
20 25 30
Asn Ser Glu Leu Val His Lys Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly
35 40 45
Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe
50 55 60
Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala
65 70 75 80
Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser
85 90 95
Gly Lys Phe Asp Val Val Met Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg
100 105 110
Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala
115 120 125
Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys
130 135 140
Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val
145 150 155 160
Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser
165 170 175
Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys
195 200 205
Met Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu
210 215 220
Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr
245 250 255
Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu
260
<210> 21
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (153)..(941)
<400> 21
tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60
ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120
atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa ttt tgg aag aaa gca 173
Met Lys Phe Trp Lys Lys Ala
1 5
cta tta aca att gta gcc tta acg gtc ggt acc cct gca gga atc aca 221
Leu Leu Thr Ile Val Ala Leu Thr Val Gly Thr Pro Ala Gly Ile Thr
10 15 20
agt gtt tct gct gct tca tca gct gtt aat tca gaa tta gtt cat aag 269
Ser Val Ser Ala Ala Ser Ser Ala Val Asn Ser Glu Leu Val His Lys
25 30 35
gga gaa tta aca att ggt ctt gag gga acg tac tct ccg tac tct tat 317
Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr
40 45 50 55
cgt aaa aat aac aaa tta act ggc ttt gaa gta gat ctt ggt aaa gca 365
Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala
60 65 70
gtt gct aaa aag atg ggc tta aaa gct aac ttt gta cca act aaa tgg 413
Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp
75 80 85
gat tcg cta att gcc ggt ctt ggt tca ggt aag ttt gat gta gta atg 461
Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly Lys Phe Asp Val Val Met
90 95 100
aac aac att aca cag aca cct gaa cgg gcc aag caa tat aat ttc tct 509
Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser
105 110 115
acc cca tat atc aag tcc cgg ttt gca tta att gtt cct act gat agt 557
Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser
120 125 130 135
aac atc aaa agc ttg aag aat att aaa ggc aag aag att att gct ggt 605
Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly
140 145 150
acg gga act aat aat gcg aat gtg gta aaa aaa tat aag ggt aac ctt 653
Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu
155 160 165
aca cca aat ggc gat ttt gct agt tcc tta gat atg atc aag caa ggt 701
Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly
170 175 180
cgg gct gcc ggg aca att aac tcc cgt gaa gct tgg tac gct tac agc 749
Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser
185 190 195
aag aag aac agt act aag ggt ctc aag atg att gat gtt tct agt gaa 797
Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met Ile Asp Val Ser Ser Glu
200 205 210 215
caa gat cca gct aag att tca gca ctt ttt aac aag aaa gat act gct 845
Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala
220 225 230
att caa tct tcc tac aac aag gca ctt aag gaa ctt caa caa gac gga 893
Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly
235 240 245
aca gtc aag aag cta tct gaa aag tac ttc ggt gca gat att act gaa 941
Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu
250 255 260
taaattaatc tataagtta 960
<210> 22
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 22
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Ala Gln Thr Glu
20 25 30
Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly
35 40 45
Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr
50 55 60
Val Arg Gly Val Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro
65 70 75 80
Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe Asp Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys
85 90 95
Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
100 105 110
Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
115 120 125
Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
130 135 140
Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
145 150 155 160
Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly
165 170 175
Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala
180 185 190
Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp
195 200 205
Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln
210 215 220
Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr
225 230 235 240
Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser
245 250 255
Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu
260 265 270
<210> 23
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (153)..(965)
<400> 23
tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60
ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120
atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa aaa aag att atc tca 173
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser
1 5
gct att tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca 221
Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser
10 15 20
ggt gtt tac gcc gaa gct caa act gaa act tgt act gtt gct cca cgt 269
Gly Val Tyr Ala Glu Ala Gln Thr Glu Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg
25 30 35
gaa cgt caa aac tgt ggt ttt cca ggt gtt act cca tca caa tgt gct 317
Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala
40 45 50 55
aac aaa ggt tgt tgt ttt gat gat act gtt cgt ggt gtt cca tgg tgt 365
Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr Val Arg Gly Val Pro Trp Cys
60 65 70
ttt tac cca aac act atc gat gtt cca cca gaa gaa gaa tgt gaa ttt 413
Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe
75 80 85
gat cca aaa gag gaa gac aac aac aag cct ggt aaa gaa gac ggc aac 461
Asp Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn
90 95 100
aaa cct ggt aaa gaa gac ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac aac aaa 509
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys
105 110 115
aaa cct ggc aaa gaa gac ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac aac aaa 557
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys
120 125 130 135
aaa cct ggc aaa gaa gat ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac ggc aac 605
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn
140 145 150
aag cct ggt aaa gaa gat ggc aac aag cct ggt aaa gaa gat ggc aac 653
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn
155 160 165
aag cct ggt aaa gaa gac ggc aac gga gta cat gtc gtt aaa cct ggt 701
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly
170 175 180
gat aca gta aat gac att gca aaa gca aac ggc act act gct gac aaa 749
Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys
185 190 195
att gct gca gat aac aaa tta gct gat aaa aac atg atc aaa cct ggt 797
Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly
200 205 210 215
caa gaa ctt gtt gtt gat aag aag caa cca gca aac cat gca gat gct 845
Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala
220 225 230
aac aaa gct caa gca tta cca gaa act ggt gaa gaa aat cca ttc atc 893
Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile
235 240 245
ggt aca act gta ttt ggt gga tta tca tta gcg tta ggt gca gcg tta 941
Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu
250 255 260
tta gct gga cgt cgt cgc gaa cta taaaattaat ctataagtta ctgacaaaac 995
Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu
265 270
tgtcagtaac tttttttgtg ggaaa 1020
<210> 24
<211> 716
<212> PRT
<213> 欧芹（Petroselinum crispum）
<400> 24
Met Glu Asn Gly Asn Gly Ala Thr Thr Asn Gly His Val Asn Gly Asn
1 5 10 15
Gly Met Asp Phe Cys Met Lys Thr Glu Asp Pro Leu Tyr Trp Gly Ile
20 25 30
Ala Ala Glu Ala Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Lys Met
35 40 45
Val Ala Glu Tyr Arg Lys Pro Val Val Lys Leu Gly Gly Glu Thr Leu
50 55 60
Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Ala Arg Asp Gly Ser Gly Val
65 70 75 80
Thr Val Glu Leu Ser Glu Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser
85 90 95
Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val
100 105 110
Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Gln Gly Gly
115 120 125
Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly
130 135 140
Asn Gly Ser Asp Asn Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg Ala Ala Met
145 150 155 160
Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe
165 170 175
Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Asn Gln Asn Ile Thr Pro
180 185 190
Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro
195 200 205
Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys Ala
210 215 220
Val Gly Pro Thr Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Glu Ala Phe Lys Leu
225 230 235 240
Ala Gly Val Glu Gly Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu
245 250 255
Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala Ser Met Val
260 265 270
Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ala Glu Val Met Ser Ala
275 280 285
Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp His Leu
290 295 300
Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile
305 310 315 320
Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Ala Ala Gln Lys
325 330 335
Leu His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala
340 345 350
Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg
355 360 365
Ser Ser Thr Lys Met Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn
370 375 380
Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn Phe
385 390 395 400
Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile
405 410 415
Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn
420 425 430
Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly Gly Arg Asn
435 440 445
Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser
450 455 460
Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr Asn His Val
465 470 475 480
Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile
485 490 495
Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys Leu Met Ser
500 505 510
Thr Thr Phe Leu Val Gly Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu Arg His Leu
515 520 525
Glu Glu Asn Leu Lys Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Ser Ser Val Ala
530 535 540
Lys Arg Val Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His Pro Ser Arg
545 550 555 560
Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Arg Val Val Asp Arg Glu Tyr Ile Phe
565 570 575
Ala Tyr Ile Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met Gln Lys
580 585 590
Leu Arg Gln Thr Leu Val Glu His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Asn Glu
595 600 605
Arg Asn Leu Ser Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Ala Thr Phe Glu Asp
610 615 620
Glu Leu Lys Ala Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Ser Ala Arg Ala Ala
625 630 635 640
Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Pro Asn Arg Ile Glu Glu Cys Arg
645 650 655
Ser Tyr Pro Leu Tyr Lys Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly Thr Glu Tyr
660 665 670
Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr Ser Pro Gly Glu Glu Phe Glu Lys Val
675 680 685
Phe Ile Ala Met Ser Lys Gly Glu Ile Ile Asp Pro Leu Leu Glu Cys
690 695 700
Leu Glu Ser Trp Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys
705 710 715
<210> 25
<211> 3300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1091)..(3238)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1091)..(3241)
<223> PAL
<220>
<221> misc_feature
<222> (3239)..(3241)
<223> 终止密码子
<400> 25
ttgttaactt agtcaattta aaaggtttgc cttttataaa atctaatccc tataaggagg 60
aaactactaa tggtagttaa agttggtatt aacggtttcg gtcgtatcgg tcgtcttgct 120
ttccgtcgta ttcaaaatgt tgaaggtgtt gaagttgttg caatcaacga cttgacagat 180
ccagcaatgc ttgctcactt gcttaaatac gatacaactc aaggtcgttt tgatggtaaa 240
gttgaagtta aagatggtgg ttttgaagtt aacggtaaat tcgttaaagt tactgctgaa 300
tctaacccag ctaacatcaa ctgggctgaa gttggtgcag aaatcgttct tgaagcaact 360
ggtttcttcg caactaaaga aaaagctgaa caacacttgc acgctaatgg tgctaagaaa 420
gttgttatca ctgcacctgg tggatcagat gttaaaacaa tcgttttcaa cactaaccac 480
gaagtacttg atggaactga aacagtaatt tcagctggtt catgtacaac caactgtctt 540
gctccaatgg ctgatacttt gaacaaacaa ttcggtatca aagttggtac aatgactaca 600
gttcacggtt acactggtga ccaaatgact cttgatggcc cacaccgtgg tggagatttc 660
cgtcgcgcac gtgctgcagc tgaaaacatc gtacctaact caacaggtgc tgctaaagcc 720
atcggtcttg tattgccaga acttcaaggt aaacttcaag gacatgctca acgtgtacca 780
gttccaactg gttcattgac tgaacttgtt actatccttg ataaagaagt tacagttgac 840
gaaatcaacg cagctatgaa agctgcttca aatgaatcat ttggttacaa cgaagaccaa 900
atcgtttcat ctgatatcgt tggtatctca aactcttcac tctttgatgc tactcaaact 960
gaagttactt cagctaacgg agctcaactt gttaaaactg tatcttggta cgataacgaa 1020
atgtcataca cttcaaacct tgttcgtaca cttgcatact tcgctaaaat cgctaaataa 1080
ggaggaaaaa atg gaa aat ggt aat ggt gca act acg aat ggg cat gtg 1129
Met Glu Asn Gly Asn Gly Ala Thr Thr Asn Gly His Val
1 5 10
aac ggg aat gga atg gac ttc tgt atg aag aca gaa gat cct ctt tat 1177
Asn Gly Asn Gly Met Asp Phe Cys Met Lys Thr Glu Asp Pro Leu Tyr
15 20 25
tgg ggt att gca gct gaa gcg atg act ggt tca cac ttg gat gaa gta 1225
Trp Gly Ile Ala Ala Glu Ala Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val
30 35 40 45
aaa aaa atg gtc gcc gag tac aga aaa cct gtc gtt aaa tta gga gga 1273
Lys Lys Met Val Ala Glu Tyr Arg Lys Pro Val Val Lys Leu Gly Gly
50 55 60
gag aca ctt aca att agt cag gtt gct gct att agt gcg cga gat gga 1321
Glu Thr Leu Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Ala Arg Asp Gly
65 70 75
agt ggt gta act gtg gaa ctt agt gag gca gca cgc gct gga gtt aaa 1369
Ser Gly Val Thr Val Glu Leu Ser Glu Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys
80 85 90
gct tct tct gat tgg gta atg gac agt atg aat aaa gga act gat tca 1417
Ala Ser Ser Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser
95 100 105
tac ggt gta aca act ggt ttc ggc gct act tct cat cgt cgt acg aaa 1465
Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys
110 115 120 125
cag gga gga gct ctt caa aaa gaa ctt att aga ttt ctt aac gca gga 1513
Gln Gly Gly Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly
130 135 140
att ttc ggt aat ggc tca gat aat act ctt cca cat tct gca aca cga 1561
Ile Phe Gly Asn Gly Ser Asp Asn Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg
145 150 155
gct gca atg ctt gtc aga att aat act tta ctt caa gga tac tca ggc 1609
Ala Ala Met Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly
160 165 170
att cgt ttt gaa ata ctt gaa gca att aca aaa ttt ttg aac caa aat 1657
Ile Arg Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Asn Gln Asn
175 180 185
att act cct tgc tta cca ctt cgt gga aca att aca gct tca ggt gat 1705
Ile Thr Pro Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp
190 195 200 205
tta gtt cca tta tct tac att gct ggt ctt ctt act ggt cga cct aat 1753
Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn
210 215 220
agt aaa gct gta ggt cct acg ggg gtt att tta tct cca gaa gag gca 1801
Ser Lys Ala Val Gly Pro Thr Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Glu Ala
225 230 235
ttc aag tta gct ggt gtt gaa ggt ggg ttt ttc gaa ttg caa cca aag 1849
Phe Lys Leu Ala Gly Val Glu Gly Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys
240 245 250
gaa gga ctt gca ttg gtg aat ggc aca gct gtt ggc tct gga atg gct 1897
Glu Gly Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala
255 260 265
agt atg gtt tta ttt gaa gct aat att ctt gcg gta tta gct gaa gta 1945
Ser Met Val Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ala Glu Val
270 275 280 285
atg tct gca att ttt gcc gaa gtc atg caa gga aaa cca gaa ttt act 1993
Met Ser Ala Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr
290 295 300
gat cat tta act cac aaa ttg aaa cac cat cct gga caa atc gaa gca 2041
Asp His Leu Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala
305 310 315
gct gca att atg gaa cat ata tta gat ggg tca gct tat gtt aaa gct 2089
Ala Ala Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Ala
320 325 330
gct cag aaa ctt cac gaa atg gat cct tta caa aaa cct aag caa gat 2137
Ala Gln Lys Leu His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp
335 340 345
cgt tat gct ctt aga acg agt cca caa tgg ttg ggg cca caa att gag 2185
Arg Tyr Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu
350 355 360 365
gtt att cgc tca tca act aaa atg att gaa aga gaa atc aat tca gtt 2233
Val Ile Arg Ser Ser Thr Lys Met Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val
370 375 380
aat gac aat cct tta att gat gtt tca cgt aat aaa gcg att cat ggt 2281
Asn Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly
385 390 395
ggt aac ttc caa gga aca cca atc ggt gtt tca atg gat aat act aga 2329
Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg
400 405 410
tta gct att gcg gct att gga aaa ctt atg ttt gca caa ttt tct gaa 2377
Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu
415 420 425
ctt gtt aac gat ttc tat aac aac gga tta cca tca aat tta agt ggc 2425
Leu Val Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly
430 435 440 445
ggg cgc aat cca agt ttg gat tat ggt ttt aaa ggt gct gaa att gcc 2473
Gly Arg Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala
450 455 460
atg gca tct tat tgt tca gaa ctt caa ttt tta gcc aat cca gtt aca 2521
Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr
465 470 475
aac cac gta caa agt gcg gaa caa cat aat caa gat gtc aac tct ttg 2569
Asn His Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu
480 485 490
ggc ctt att tct tca cga aaa aca agt gag gcc gtc gag ata tta aaa 2617
Gly Leu Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys
495 500 505
tta atg tca aca aca ttt ctt gtc ggc ctt tgc caa gca att gat tta 2665
Leu Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Gly Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu
510 515 520 525
cgt cat ctt gaa gaa aat tta aaa tca act gtt aaa aac aca gta tct 2713
Arg His Leu Glu Glu Asn Leu Lys Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Ser
530 535 540
tct gtt gct aaa cga gtt tta acc atg gga gtt aat ggt gaa tta cat 2761
Ser Val Ala Lys Arg Val Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His
545 550 555
cca tca cgc ttt tgt gaa aaa gat ctt tta cgc gtc gtc gat cgt gaa 2809
Pro Ser Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Arg Val Val Asp Arg Glu
560 565 570
tat att ttt gca tat att gat gac cca tgt agt gca aca tat cct tta 2857
Tyr Ile Phe Ala Tyr Ile Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu
575 580 585
atg cag aaa ctt aga caa aca tta gtt gag cat gcc ttg aag aat ggt 2905
Met Gln Lys Leu Arg Gln Thr Leu Val Glu His Ala Leu Lys Asn Gly
590 595 600 605
gat aat gag cgt aat ctt tct aca tca att ttt caa aaa att gca acc 2953
Asp Asn Glu Arg Asn Leu Ser Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Ala Thr
610 615 620
ttc gag gac gaa ctt aaa gca tta tta cct aaa gaa gtg gaa tca gct 3001
Phe Glu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Ser Ala
625 630 635
aga gcc gct ttg gaa agt gga aac cca gcc att cca aat cga att gaa 3049
Arg Ala Ala Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Pro Asn Arg Ile Glu
640 645 650
gaa tgt cgt tca tat cct ctt tat aaa ttt gtt cga aaa gag ctt ggt 3097
Glu Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Lys Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly
655 660 665
acg gaa tat ctt act ggc gaa aag gta aca tca cct ggt gaa gag ttt 3145
Thr Glu Tyr Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr Ser Pro Gly Glu Glu Phe
670 675 680 685
gaa aaa gtt ttt att gcc atg agt aaa ggt gaa att att gat cct tta 3193
Glu Lys Val Phe Ile Ala Met Ser Lys Gly Glu Ile Ile Asp Pro Leu
690 695 700
ctt gaa tgt ctt gag tca tgg aat gga gcc cct tta cct atc tgt 3238
Leu Glu Cys Leu Glu Ser Trp Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys
705 710 715
taattttccg attttaacgg tataaaaacc agtcttcggg ctggtttttt tattttataa 3298
ag 3300
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种乳酸细菌(LAB)，所述乳酸细菌包含编码融合蛋白的外源性核酸，所述融合蛋白包含(A)N-末端黏蛋白结合多肽和(B)包含细胞壁锚固结构域的C-末端细胞附着多肽，其中所述黏蛋白结合多肽是三叶因子(TFF)多肽。
2.如权利要求1所述的细菌，其中，所述细胞附着多肽选自：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，黏液结合蛋白(Mub)，黏液黏附促进蛋白(MapA)，乳球菌黏蛋白结合蛋白(MbpL)和它们的任何组合。
3.如权利要求2所述的细菌，其中所述细胞附着多肽是CmbA，如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CmbA。
4.如权利要求2所述的细菌，其中，所述CmbA多肽具有与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的细菌，其中，所述TFF多肽选自TFF1、TFF2和TFF3。
6.如权利要求1所述的细菌，其中，所述TFF多肽具有与SEQ ID NO:3至少80％相同的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的细菌，其中，所述融合蛋白包含CmbA和人TFF3多肽。
8.如权利要求1所述的细菌，其中，所述融合蛋白还包含分泌信号肽，如SSusp45。
9.如权利要求1所述的细菌，其中，所述编码融合蛋白的外源性核酸由选自以下的启动子转录性调节：thyA启动子(PthyA)、hlla启动子(PhllA)和gapB启动子(PgapB)。
10.如权利要求1中所述的细菌，还包含编码选自以下的至少一种治疗性多肽的外源性核酸：
a.细胞因子；
b.白介素(IL)，如IL-2、IL-10、IL-18；
c.抗体或其片段，如抗TNFα抗体，对IL-4的抗体，对IL-5的抗体，对IL-13的抗体，对IL-15的抗体，对免疫球蛋白E(IgE)的抗体；
d.抗原，如胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)，锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样多肽(ppIAPP)，外周蛋白，瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)，树花粉过敏原(包括桦树花粉过敏原或日本柳杉花粉过敏原)，杂草花粉过敏原，草花粉过敏原，食物过敏原(包括花生过敏原，奶过敏原，蛋过敏原，谷蛋白过敏原(麦醇溶蛋白表位)，尘螨过敏原，霉菌过敏原，动物皮屑过敏原；
e.激素，如胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4，表皮生长因子和生长激素；
f.TFF，如TFF1、TFF2和TFF3；
g.酶，如苯丙氨酸脱氨酶(PAL)，氨基酸脱羧酶；
和
h.它们的任何组合。
11.如权利要求10所述的细菌，其中，至少一种治疗性多肽是PAL。
12.如权利要求10所述的细菌，其中，所述编码至少一种治疗性多肽的外源核酸由gapB启动子(PgapB)转录性调节。
13.如权利要求1所述的LAB，选自：乳杆菌(Lactobacillus sp.)，双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)，链球菌(Streptococcus sp.)和肠球菌(Enterococcus sp.)，和乳球菌(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
14.如权利要求1所述的细菌，其中，所述包含编码融合蛋白的外源性核酸的细菌相较于不包含编码所述融合蛋白的所述外源性核酸的相应细菌：
a.胃肠(GI)通过时间延长至少10％；和/或
b.对肠粘膜的附着增强至少10％；和/或
c.体外黏蛋白结合能力增强至少20％；和/或
d.体外Caco-2细胞结合能力增强至少10％。
15.如前述权利要求中任一项所述的细菌，还包含增加海藻糖累积的选自以下的至少一种突变或插入：
a.大肠杆菌(Escherichia coli)otsB插入；
b.多顺反子表达盒插入，所述多顺反子表达盒包含usp45启动子，usp45，和编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸和位于所述usp45和所述编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸之间的任选的基因间区域如rpmD；
c.多顺反子表达盒插入，所述多顺反子表达盒包含海藻糖转运体llmg_0453和llmg_0454，位于hllA启动子(PhllA)的3’处；
d.trePP失活；
e.ptcC失活；和
f.(a)-(e)中任何的组合。
16.一种药物组合物，包含前述权利要求中任一项所述的细菌和药学上可接受的运载体。
17.权利要求1-15中任一项所述的细菌或权利要求16所述的药物组合物在治疗或预防选自以下的疾病中的用途：自身免疫疾病、过敏、代谢疾病和胃肠疾病。
18.权利要求1-15中任一项所述的细菌或权利要求16所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防选自以下的疾病：自身免疫疾病、过敏、代谢疾病、胃肠疾病和营养缺陷。
19.一种用于在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予治疗有效量的权利要求1-15中任一项所述的细菌或权利要求16所述的组合物，其中所述疾病选自1型糖尿病(T1D)、乳糜泄、炎性肠病和苯丙酮尿(PKU)。
20.一种编码融合蛋白的核酸，所述核酸包含：
a.编码选自以下的细胞附着多肽的序列：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，Mub，MapA，MbpL和它们的任何组合；和
b.编码选自以下的黏蛋白结合多肽的序列：TFF多肽，MucBP和它们的组合。

Claims (20)

1.一种乳酸细菌(LAB)，所述乳酸细菌包含编码融合蛋白的外源性核酸，所述融合蛋白包含(A)N-末端粘蛋白结合多肽和(B)包含细胞壁锚固结构域的C-末端细胞附着多肽。
2.如权利要求1所述的细菌，其中，所述细胞附着多肽选自：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，黏液结合蛋白(Mub)，黏液黏附促进蛋白(MapA)，乳球菌黏蛋白结合蛋白(MbpL)和它们的任何组合。
3.如权利要求2所述的细菌，其中所述细胞附着多肽是CmbA，如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CmbA。
4.如权利要求2所述的细菌，其中，所述CmbA多肽具有与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的细菌，其中，所述TFF多肽选自TFF1、TFF2和TFF3。
6.如权利要求1所述的细菌，其中，所述TFF多肽具有与SEQ ID NO:3至少80％相同的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的细菌，其中，所述融合蛋白包含CmbA和TFF。
8.如权利要求1所述的细菌，其中，所述融合蛋白还包含分泌信号肽，如SSusp45。
9.如权利要求1所述的细菌，其中，所述编码融合蛋白的外源性核酸由选自以下的启动子转录性调节：thyA启动子(PthyA)、hlla启动子(PhllA)和gapB启动子(PgapB)。
10.如权利要求1中所述的细菌，还包含编码选自以下的至少一种治疗性多肽的外源性核酸：
a.细胞因子；
b.白介素(IL)，如IL-2、IL-10、IL-18；
c.抗体或其片段，如抗TNFα抗体，对IL-4的抗体，对IL-5的抗体，对IL-13的抗体，对IL-15的抗体，对免疫球蛋白E(IgE)；
d.抗原，如胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)，锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样多肽(ppIAPP)，外周蛋白，瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)，树花粉过敏原(包括桦树花粉过敏原或日本柳杉花粉过敏原)，杂草花粉过敏原，草花粉过敏原，食物过敏原(包括花生过敏原，奶过敏原，蛋过敏原，谷蛋白过敏原(麦醇溶蛋白表位)，尘螨过敏原，霉菌过敏原，动物皮屑过敏原；
e.激素，如胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4，表皮生长因子和生长激素；
f.TFF，如TFF1、TFF2和TFF3；
g.酶，如苯丙氨酸脱氨酶(PAL)，氨基酸脱羧酶；
和
h.它们的任意组合。
11.如权利要求10所述的细菌，其中，至少一种治疗性多肽是PAL。
12.如权利要求10所述的细菌，其中，所述编码至少一种治疗性多肽的外源核酸由gapB启动子(PgapB)转录性调节。
13.如权利要求1所述的LAB，选自：乳杆菌(Lactobacillus sp.)，双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)，链球菌(Streptococcus sp.)和肠球菌(Enterococcus sp.)，和乳球菌(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
14.如权利要求1所述的细菌，其中，所述包含编码融合蛋白的外源性核酸的细菌相较于不包含编码所述融合蛋白的所述外源性核酸的相应细菌：
a.胃肠(GI)通过时间延长至少10％；和/或
b.对肠粘膜的附着增强至少10％；和/或
c.体外黏蛋白结合能力增强至少20％；和/或
d.体外Caco-2细胞结合增强能力至少10％。
15.如前述权利要求中任一项所述的细菌，还包含增加海藻糖累积的选自以下的至少一种突变或插入：
a.大肠杆菌(Escherichia coli)otsB插入；
b.多顺反子表达盒插入，所述多顺反子表达盒包含usp45启动子，usp45，和编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸和位于所述usp45和所述编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸之间的任选的基因间区域如rpmD；
c.多顺反子表达盒插入，所述多顺反子表达盒包含海藻糖转运体llmg_0453和llmg_0454，位于hllA启动子(PhllA)的3’处；
d.trePP失活；
e.ptcC失活；和
f.(a)-(e)中任何的组合。
16.一种药物组合物，包含前述权利要求中任一项所述的细菌和药学上可接受的运载体。
17.权利要求1-15中任一项所述的细菌或权利要求16所述的药物组合物在治疗或预防选自以下的疾病中的用途：自身免疫疾病、过敏、代谢疾病和胃肠疾病。
18.权利要求1-15中任一项所述的细菌或权利要求16所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防选自以下的疾病：自身免疫疾病、过敏、代谢疾病、胃肠疾病和营养缺陷。
19.一种用于在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予治疗有效量的权利要求1-15中任一项所述的细菌或权利要求16所述的组合物，其中所述疾病选自1型糖尿病(T1D)、乳糜泄、炎性肠病和苯丙酮尿(PKU)。
20.一种编码融合蛋白的核酸，所述核酸包含：
a.编码选自以下的细胞附着多肽的序列：细胞和黏液结合蛋白A(CmbA)，Mub，MapA，MbpL和其任何组合；和
b.编码选自以下黏蛋白结合多肽的序列：TFF多肽，MubBP和其组合。
CN201780069890.3A 2016-09-13 2017-09-11 黏膜黏附性微生物 Active CN109983028B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662394024P 2016-09-13 2016-09-13
US62/394,024 2016-09-13
PCT/IB2017/055470 WO2018051223A1 (en) 2016-09-13 2017-09-11 Mucoadhesive microorganism

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109983028A true CN109983028A (zh) 2019-07-05
CN109983028B CN109983028B (zh) 2023-10-20

Family

ID=60190901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780069890.3A Active CN109983028B (zh) 2016-09-13 2017-09-11 黏膜黏附性微生物

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10808014B2 (zh)
EP (1) EP3512872A1 (zh)
JP (2) JP7022743B2 (zh)
KR (2) KR102348734B1 (zh)
CN (1) CN109983028B (zh)
AU (2) AU2017328129B2 (zh)
CA (1) CA3035488A1 (zh)
IL (1) IL265177A (zh)
RU (2) RU2021135949A (zh)
SG (1) SG11201901928SA (zh)
WO (1) WO2018051223A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690666A (zh) * 2020-07-30 2020-09-22 江苏食品药品职业技术学院 一种重组thaumatin II结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用
CN112195210A (zh) * 2020-10-24 2021-01-08 上海加新生物科技有限公司 一种透明质酸的生产方法
CN112708577A (zh) * 2020-12-31 2021-04-27 扬州大学 一种具有高肠道粘附力和免疫调节功能的发酵乳杆菌dali02及其应用
CN113684201A (zh) * 2021-08-27 2021-11-23 日照市畜牧兽医管理服务中心 基于Caco-2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法
CN115197885A (zh) * 2022-09-13 2022-10-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 格氏乳球菌lgm15及菌剂和应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7330517B2 (ja) 2017-10-20 2023-08-22 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 異種タンパク質産生のための人工分泌ペプチド
CN110129220B (zh) * 2019-04-30 2021-06-22 石河子大学 一种保加利亚乳杆菌bsts6-4及其应用
MX2022002337A (es) * 2019-08-27 2022-06-08 Tonix Pharma Ltd Polipéptidos de tff2 modificados.
CN114761028A (zh) * 2019-09-27 2022-07-15 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 乳糜泻的治疗
US20210246176A1 (en) * 2020-02-06 2021-08-12 Codexis, Inc. Mucin-binding fusion proteins
KR102231437B1 (ko) * 2020-09-21 2021-03-24 주식회사 보삼바이오산업 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법 및 그를 이용하여 제조한 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물
JP2024511230A (ja) * 2021-02-09 2024-03-12 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 浸潤し、かつ自律的に溶解するように設計された治療用タンパク質の細胞内送達およびその使用方法
CN114377117B (zh) * 2021-12-06 2023-11-10 中国医学科学院医学生物学研究所 一种口服1型糖尿病疫苗及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002102403A1 (en) * 2001-06-14 2002-12-27 Novo Nordisk A/S Mucosal repair by tff dimer peptides
CN101044154A (zh) * 2002-02-14 2007-09-26 威廉·J·鲁特 治疗宿主中切割的嵌合分子
CN101605900A (zh) * 2007-01-12 2009-12-16 阿克图杰尼斯公司 乳球菌启动子和其用途
CN103917639A (zh) * 2011-09-23 2014-07-09 阿克托杰尼斯有限公司 经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB227835A (en) 1924-01-15 1925-04-09 Harry Odell Improvements in feeding mechanism for embossing and other printing presses
US4919918A (en) 1988-03-14 1990-04-24 Spectrum Consumer Products Co., Inc. Non-alcoholic mouthwash
US5972685A (en) 1988-07-21 1999-10-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Oral administration of coprostanol producing microorganisms to humans to decrease plasma cholesterol concentration
GB9126306D0 (en) 1991-12-11 1992-02-12 Unilever Plc Mouthwash compositions
WO1993017117A1 (en) 1992-02-27 1993-09-02 Lynxvale Limited Heterologous gene expression in lactococcus, and the expression products therefrom
US5223285A (en) 1992-03-31 1993-06-29 Abbott Laboratories Nutritional product for pulmonary patients
US5700782A (en) 1993-05-28 1997-12-23 Abbott Laboratories Enteral nutritional product
AU2149495A (en) 1995-04-11 1996-10-30 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast- Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Method for the construction of vectors for lactic acid bacte ria like lactobacillus such that the bacteria can efficientl y express, secrete and display proteins at the surface
US5695746A (en) 1995-07-28 1997-12-09 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. Liquid dentifrice with mouthwash fresh taste
WO1997026855A1 (en) 1996-01-24 1997-07-31 Warner-Lambert Company Peroxide/essential oils containing mouthwash compositions and two-part mouthwash systems
GB9611364D0 (en) 1996-05-31 1996-08-07 Smithkline Beecham Plc Composition
ATE238761T1 (de) 1996-09-18 2003-05-15 Erling Johansen Mundwasser mit kalzium- und phosphationen in einer übersättigten lösung
US5869118A (en) 1996-11-13 1999-02-09 Abbott Laboratories Gellan gum to improve physical stability of liquid nutritional products
US5897872A (en) 1997-11-12 1999-04-27 Picciano; Dante J. Iodine-containing nasal moisturizing saline solution
US6171611B1 (en) 1997-11-12 2001-01-09 Dante J. Picciano Iodine-containing nasal moisturizing saline and mouthwash solutions
US6100388A (en) 1998-03-16 2000-08-08 Biogaia Biologies Ab Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle
DE69922394T2 (de) 1998-09-28 2005-12-22 Warner-Lambert Company Llc Arzneistoffabgabe in den dünndarm und den dickdarm unter verwendung von hpmc-kapseln
AU1071200A (en) 1998-10-19 2000-05-08 Biotech Australia Pty Limited Systems for oral delivery
ATE480623T1 (de) 1999-07-05 2010-09-15 Actogenix Nv Bereitstellung von peptiden mit kleeblattstruktur
EP1383897B1 (en) 2001-05-03 2006-06-28 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Self-containing lactococcus strain
EP1536749A2 (en) 2002-07-08 2005-06-08 Joe S. Wilkins, Jr. Antibacterial formulations
ATE466023T1 (de) 2004-03-23 2010-05-15 Friesland Brands Bv Mannose-spezifische adhesinen und deren vervendung
US9200249B2 (en) 2004-08-20 2015-12-01 Actogenix N.V. Method to improve Lactococcus preservation
US9017662B2 (en) 2005-08-30 2015-04-28 Actogenix N.V. Anti-TNF alpha producing lactic acid bacteria for the treatment of chronic enterocolitis
ES2405552T3 (es) 2005-11-29 2013-05-31 Actogenix N.V. Inducción de tolerancia mucosa a antiantígenos de células beta de islotes pancreáticos
US20090311249A1 (en) 2006-06-02 2009-12-17 Luca Gianni Capecitabine Combination Therapy
CN101605559B (zh) 2007-01-25 2014-04-23 阿克图杰尼斯公司 使用遗传修饰的乳杆菌通过抗原的粘膜递送治疗免疫疾病
EP2164512A2 (en) * 2007-06-20 2010-03-24 Actogenix N.V. Methods and compositions for treating mucositis
KR101782170B1 (ko) * 2009-02-02 2017-09-26 시에이치알. 한센 에이/에스 락토바실러스 람노서스 필루스 폴리펩티드 및 그 생산방법
CA2760248C (en) 2009-04-30 2019-05-28 Actogenix Nv Cryoprotectants for freeze drying of lactic acid bacteria
WO2012164083A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Actogenix N.V. Polycistronic expression system for bacteria
JP6086614B2 (ja) 2011-06-09 2017-03-01 ノボザイムズ エー／エス 生理活性分子の融合
EP2758512B1 (en) 2011-09-23 2018-05-09 Intrexon Actobiotics NV Modified gram positive bacteria and uses thereof
WO2014066945A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 The Sydney Children's Hospital Network (Randwick & Westmead) Genetically-modified probiotic for treatment of phenylketonuria
WO2016124239A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Aurealis Oy Recombinant probiotic bacteria for use in the treatment of a skin dysfunction
WO2017122180A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 Intrexon Actobiotics N.V. Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
EP3506932A1 (en) 2016-09-02 2019-07-10 Intrexon Actobiotics NV Genetically modified bacteria stably expressing il-10 and insulin

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002102403A1 (en) * 2001-06-14 2002-12-27 Novo Nordisk A/S Mucosal repair by tff dimer peptides
CN101044154A (zh) * 2002-02-14 2007-09-26 威廉·J·鲁特 治疗宿主中切割的嵌合分子
CN101605900A (zh) * 2007-01-12 2009-12-16 阿克图杰尼斯公司 乳球菌启动子和其用途
CN103917639A (zh) * 2011-09-23 2014-07-09 阿克托杰尼斯有限公司 经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANNE JENSEN等: "Role of Lactobacillus reuteri cell and mucusbinding protein A (CmbA) in adhesion to intestinal epithelial cells and mucus in vitro", 《MICROBIOLOGY》 *
HSIANG-YUN HSUEH等: "Increase of the adhesion ability and display of a rumen fungal xylanase on the cell surface of Lactobacillus casei by using a listerial cell-wall-anchoring protein", 《J SCI FOOD AGRIC》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690666A (zh) * 2020-07-30 2020-09-22 江苏食品药品职业技术学院 一种重组thaumatin II结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用
CN111690666B (zh) * 2020-07-30 2023-05-05 江苏食品药品职业技术学院 一种重组thaumatin II结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用
CN112195210A (zh) * 2020-10-24 2021-01-08 上海加新生物科技有限公司 一种透明质酸的生产方法
CN112708577A (zh) * 2020-12-31 2021-04-27 扬州大学 一种具有高肠道粘附力和免疫调节功能的发酵乳杆菌dali02及其应用
CN112708577B (zh) * 2020-12-31 2022-04-05 扬州大学 一种具有高肠道粘附力和免疫调节功能的发酵乳杆菌dali02及其应用
CN113684201A (zh) * 2021-08-27 2021-11-23 日照市畜牧兽医管理服务中心 基于Caco-2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法
CN115197885A (zh) * 2022-09-13 2022-10-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 格氏乳球菌lgm15及菌剂和应用
CN115197885B (zh) * 2022-09-13 2022-12-09 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 格氏乳球菌lgm15及菌剂和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3035488A1 (en) 2018-03-22
US20210070815A1 (en) 2021-03-11
RU2019108553A (ru) 2020-10-15
JP7022743B2 (ja) 2022-02-18
KR102348734B1 (ko) 2022-01-07
WO2018051223A1 (en) 2018-03-22
RU2019108553A3 (zh) 2020-12-15
SG11201901928SA (en) 2019-04-29
KR20220005641A (ko) 2022-01-13
US10808014B2 (en) 2020-10-20
US20230013523A1 (en) 2023-01-19
WO2018051223A4 (en) 2018-05-03
US11384123B2 (en) 2022-07-12
EP3512872A1 (en) 2019-07-24
AU2017328129B2 (en) 2021-01-28
JP2019530446A (ja) 2019-10-24
AU2021202595A1 (en) 2021-05-27
CN109983028B (zh) 2023-10-20
US20190194267A1 (en) 2019-06-27
IL265177A (en) 2019-05-30
AU2017328129A1 (en) 2019-04-04
RU2762940C2 (ru) 2021-12-24
KR102469701B1 (ko) 2022-11-22
KR20190056387A (ko) 2019-05-24
RU2021135949A (ru) 2022-04-14
AU2021202595B2 (en) 2022-02-17
JP7439148B2 (ja) 2024-02-27
JP2022084579A (ja) 2022-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109983028A (zh) 黏膜黏附性微生物
US20130039889A1 (en) Recombinant microorganisms
AU2002220561B2 (en) Lactic acid bacteria capable of reducing an individual&#39;s tendency to develop allergic reactions
JP2012504116A (ja) 粘膜での微生物のコロニー形成の低減
ZA200307680B (en) Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy.
AU2002220561A1 (en) Lactic acid bacteria capable of reducing an individual&#39;s tendency to develop allergic reactions
US20230348918A1 (en) Genetically Modified Bacteria Stably Expressing IL-10 and Insulin
JP2017520257A (ja) 成長促進のためのビフィドバクテリウム・ブレーベｃｂｔ ｂｒ３菌株及びこれを含む成長促進用機能性食品組成物
Mroczynska et al. Beta-glucuronidase and beta-glucosidase activity of Lactobacillus and Enterococcus isolated from human feces
JP6531893B2 (ja) 濾胞性ヘルパーｔ細胞増加剤
Havenith et al. Gut-associated lactobacilli for oral immunisation
KR100457879B1 (ko) 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
CN114126715A (zh) 组合物以及解除细菌内毒素毒性的方法
JP2023546022A (ja) 腸内での繊維合成酵素の発現のための操作されたプロバイオティクス

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant