JP7439148B2 - 粘膜付着性微生物 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／３９４，０２４号の
出願日の利益を主張する。
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、この配列表は、参照
することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年９月１１日に作成された
前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０５３５０＿００３１＿００＿ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名
称であり、１２２，６４３バイトの大きさである。
粘膜組織に治療用分子を送達するために、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）が
使用されてきた。例えば、Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-
789; Robert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11; Braat
et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2006, 4(6):754-759; およびSteidler et al.
, Science 2000, 289(5483):1352-1355を参照。
改善された薬物動態および薬力学特性を有する微生物（例えば、細菌）株の必要性、お
よびそのような遺伝子改変された細菌を用いて治療できる様々な疾患を治療するための有
効な、標的化された、かつ制御された方法の必要性が当該技術分野において存在する。本
開示はこれらの必要性に応えるものである。
本開示は、増進した細胞付着および／またはムチン結合特性を有する微生物（例えば、
細菌または酵母）を提供する。例えば、本開示は、Ｃａｃｏ－２細胞への増加したｉｎ
ｖｉｔｒｏ結合性、およびムチンへの増加したｉｎ ｖｉｔｒｏ結合性を呈する細菌を提
供する。そのような微生物（例えば、細菌）を使用して、例えば、哺乳動物対象の胃腸管
に生物活性ポリペプチドを送達することができ、記載された遺伝子改変は、微生物（例え
ば、細菌）の胃腸内保持および通過時間のモジュレーションを可能とする。記載された技
術は、微生物（例えば、細菌）によって発現される生物活性ポリペプチドの薬物動態およ
び薬力学特性のモジュレーションを可能とする。例えば、ラクトコッカス・ラクチス（La
ctococcus lactis）などの乳酸菌（ＬＡＢ）の細胞壁におけるトレフォイル因子（ＴＦＦ
）および細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡなど）（例えば、Jensen et al., Microbiolog
y 2014, 160(4):671-681を参照）を含有する融合タンパク質（例えば、ＴＦＦ３－Ｃｍｂ
Ａ）の発現、分泌およびアンカーは、腸上皮細胞への細菌の付着を可能とし、かつムチン
への細菌の結合をさらに可能とする。
組成物
一部の態様では、本開示は、細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする
外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、本開示
は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）で
あって、融合タンパク質をコードする外因性核酸が細胞付着ポリペプチドをコードする配
列を含有する、微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、細胞付着
ポリペプチドは、細胞および粘液結合プロテインＡ（cell and mucus-binding protein A
）（ＣｍｂＡ）（例えば、Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681を参照）
、粘液結合タンパク質（mucus binding protein）またはｍｕｂドメインタンパク質（Ｍ
ｕｂ）（例えば、Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280を参照）、粘
液付着促進タンパク質（mucus adhesion promoting protein）（ＭａｐＡ）（例えば、Mi
yoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7):1622-8を参照）、ラクトコ
ッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（lactococcal mucin binding protein）（
ＭｂｐＬ）（例えば、Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-80
00を参照）からなる群から選択される。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococc
us aureus）プロテインＡアンカー断片（ＳｐａＸ）などの細胞壁アンカー性ペプチドを
加えてもよい（例えば、Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342
-5を参照）。一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微
生物（例えば、細菌または酵母）であって、融合タンパク質がＣｍｂＡポリペプチドを含
む、微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、ＣｍｂＡポリペプチ
ドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである。例えば
、上掲のJensen et al.に開示される例えばＡＴＣＣ ＰＴＡ６４７４を参照。上記実施
形態のいずれかによる一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、配列番号１に対して少な
くとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９
７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣｍｂＡ
ポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、細胞付着ポリペプチド
は、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の外
因性核酸配列によってコードされるＣｍｂＡポリペプチドである。
上記実施形態のいずれかによる他の例では、融合タンパク質は、トレフォイル因子（Ｔ
ＦＦ）ポリペプチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）またはＭｕｃＢＰ
ポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドを含む（例えば、Lukic et al, Appl. Envir
on. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000を参照）。したがって、一部の例では、本開示
は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）で
あって、融合タンパク質が細胞付着ポリペプチド（例えば、ＣｍｂＡポリペプチド）およ
びムチン結合ポリペプチド（例えば、ＴＦＦポリペプチド）を含有する、微生物（例えば
、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ヒトＴＦＦポリ
ペプチド（例えば、ｈＴＦＦ１、ｈＴＦＦ２、またはｈＴＦＦ３）である。上記実施形態
のいずれかによる一部の例では、ムチン結合ポリペプチドは、配列番号３に対して少なく
とも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７
％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ
３ポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、ムチン結合ポリペプ
チドは、配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、
少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一
の外因性核酸配列によってコードされるヒトＴＦＦ３ポリペプチドである。一部の例では
、ＴＦＦポリペプチドは、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、またはウマのＴＦＦなどの
、哺乳動物のＴＦＦポリペプチドである。さらなる例では、ＴＦＦは両生動物のＴＦＦで
ある。例示的なＴＦＦポリペプチドは、例えば、Conlon et al., Peptides 2015, 72:44-
49およびその参照文献（これらの開示のそれぞれは、参照することによりその全体が本明
細書に組み込まれる）に開示されている。他の例では、ＴＦＦポリペプチドはトレフォイ
ル様ドメインである。この実施形態による例示的なポリペプチドはFujita et al., Mol.
Reprod. Dev. 2006, 75(7):1217-1228（その開示は、参照することによりその全体が本明
細書に組み込まれる）に開示されている。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、本開示は、（１）ＴＦＦポリペプチド（
例えば、ヒトＴＦＦ１、ヒトＴＦＦ２、またはヒトＴＦＦ３）およびＭｕｃＢＰポリペプ
チドから選択されるムチン結合ポリペプチド、および（２）ＣｍｂＡポリペプチド、Ｍｕ
ｂポリペプチド、ＭａｐＡポリペプチド、ＭｂｐＬポリペプチド、およびＳｐａＸポリペ
プチドから選択される細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性核
酸を含む細菌（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの乳酸菌
）を提供する。この実施形態による一部の例では、融合タンパク質は、ＣｍｂＡポリペプ
チド（例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡ）およ
びＴＦＦポリペプチド（例えば、ヒトＴＦＦ１、ヒトＴＦＦ２、またはヒトＴＦＦ３）を
含有する。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸
は、微生物の染色体、例えば細菌の染色体に組み込まれている。一部の例では、融合タン
パク質をコードする外因性核酸は、微生物（例えば、細菌）中で構成的に発現される。他
の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、プラスミド上に位置する。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質は、微生物（例えば、細
菌）によって発現される。他の例では、融合タンパク質は、微生物（例えば、細菌）の細
胞壁にアンカーされる。例えば、融合タンパク質は、微生物（例えば、細菌）の表面（す
なわち、外膜）に提示される。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸
は、分泌シグナルペプチドをコードする分泌リーダー配列をさらに含む。一部の例では、
分泌リーダー配列は、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）の分泌リーダーを
コードするヌクレオチド配列を含有する。そのような分泌リーダー配列またはペプチドは
、本明細書ではＳＳｕｓｐ４５と称される。一部の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、配列番号
５に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％
、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を
有する。他の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、配列番号６または配列番号７に対して少なくと
も９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％
、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列によってコードされる。グ
ラム陽性菌に由来する任意の分泌リーダー配列、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lact
ococcus lactis）に由来する任意の分泌リーダー配列は、上記実施形態の文脈で有用であ
る。上記実施形態のいずれかによるさらなる例では、分泌シグナルペプチド（例えば、Ｓ
Ｓｕｓｐ４５）は、ＴＦＦポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドに結合している。
この実施形態による一部の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、ヒトＴＦＦポリペプチドに結合し
ている。例えば、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも９０％、少なくとも
９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、融合タンパク質は
、配列番号９に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なく
とも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列
を含有する外因性核酸配列によってコードされ得る。
他の例では、微生物（例えば、細菌）は、ＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプ
チドを含有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含み、分泌シグナルペプチドが
ＴＦＦポリペプチド（例えば、ＳＳｕｓｐ４５）に結合している。例えば、融合タンパク
質は、配列番号１０に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、
少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一
のアミノ酸配列を含み得る（またはそれからなり得る）。他の例では、融合タンパク質は
、配列番号１１に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少な
くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配
列を含有する（またはそれからなる）外因性核酸配列によってコードされ得る。
一部の例では、分泌シグナルペプチドは、リンカーペプチドを含む。一部の例では、分
泌シグナルペプチドは、例えば、融合タンパク質が微生物（例えば、細菌）の細胞壁にア
ンカーされている時に、該融合タンパク質から切断される。
一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、微生物（例えば、細菌）に
内因性のプロモーターによって転写調節される（例えば、その制御下に置かれる）。他の
例では、融合タンパク質の発現は、外因性プロモーターによって制御される。一部の例で
は、プロモーターは、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（Ｐ
ｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーターから選択される。一部の例では、融合タンパク
質をコードする核酸は、ＰｔｈｙＡプロモーターによって転写調節される。他の例では、
融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ＰｈｌｌＡプロモーターによって転写調節さ
れる。他のプロモーターとしては、遺伝子ｈｏｌＡ、ｓｏｄａ、ｅｎｏＡ、ｔｕｆａ、ｆ
ｂａＡ、ａｃｐＡ、ｐｓ４３１、ｍａｌＧ、ｐｔｓＨ、ｄｐｓＡ、ｐｇｋ、ａｈｐＣ、ｐ
ｄｈＤ、ｐｔｓ＿ＩＩ、ｐｆｋ、ｔｒｅＰＰ、ｐｔｎＤ、ｐｇｉＡ、ｕｓｐ４５に先行す
るものが挙げられる。他の好適なプロモーターは、例えば、米国特許出願公開第２０１４
／０１０５８６３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み
込まれる）に記載されている。
本開示は、（例えば、微生物、例えば細菌の細胞壁にアンカーされた）融合タンパク質
を含む微生物（例えば、細菌）であって、融合タンパク質がＴＦＦポリペプチドおよびＣ
ｍｂＡポリペプチドを含む、微生物（例えば、細菌）をさらに提供する。一部の例では、
微生物（例えば、細菌）は、分泌リーダー配列、ＴＦＦポリペプチドをコードする配列、
およびＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含む外因性核酸を含む。一部の例では、
分泌リーダー配列は、分泌シグナルペプチドをコードし、分泌シグナルペプチドは、例え
ば、融合タンパク質が微生物（例えば、細菌）の細胞膜を通過する（例えば、細胞壁にア
ンカーされる）時に、該融合タンパク質から切断される。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物は細菌である。上記実施形態のい
ずれかによる他の例では、そのような細菌は、グラム陽性菌、例えば非病原性グラム陽性
菌である。上記実施形態のいずれかによる他の例では、細菌は乳酸菌（ＬＡＢ）である。
例示的な乳酸菌は本明細書に開示されており、これらのそれぞれは、これらの実施形態の
文脈において使用することができる。一部の実施形態では、ＬＡＢは、ラクトコッカス（
Lactococcus）種細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム
（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、およびエン
テロコッカス（Enterococcus）種細菌からなる群から選択される。一部の例では、ＬＡＢ
はラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。他の例では、ＬＡＢは、ラ
クトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラク
トコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、および
ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）から選択
される。一部の例では、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）は、ラクトコ
ッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３などのラクトコッカス・ラクチ
ス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）である。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、ＴＦＦポリ
ペプチドおよび細胞付着ポリペプチド（例えば、ＣｍｂＡ）を含む融合タンパク質をコー
ドする外因性核酸を含む。この実施形態による一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、Ｔ
ＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３から選択される。この実施形態による他の例では、Ｔ
ＦＦポリペプチドは、ヒトＴＦＦ、マウスＴＦＦ、ブタＴＦＦ、イヌＴＦＦ、ネコＴＦＦ
、ウシＴＦＦ、およびヒツジＴＦＦから選択される。一部の例では、ＴＦＦポリペプチド
はヒトＴＦＦである。他の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ヒトＴＦＦ１、ヒトＴＦＦ２
、およびヒトＴＦＦ３から選択される。さらに他の例では、ＴＦＦポリペプチドはヒトＴ
ＦＦ３である。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９
０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、ま
たは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。他の例では、ＴＦＦポリペプチドは
、ＴＦＦバリアントポリペプチド、例えば、対応する野生型ＴＦＦポリペプチドと比べた
時に増進したムチン結合能力を有するＴＦＦバリアントポリペプチドである。他の例では
、ＴＦＦポリペプチドは、両生動物または魚のＴＦＦポリペプチドである。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、少なくとも
１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含有する。一部の例では、治
療用ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）などのサイトカインである。サイトカイ
ンの選択は、どの宿主応答を活性化または抑制しようとするかに基づいて為される。一部
の例では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２２である。他の例で
は、治療用ポリペプチドは抗原である。他の例では、治療用ポリペプチドは、抗原および
インターロイキン（ＩＬ－２、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２２など）である。これらの実
施形態のいずれかによる一部の例では、抗原は、自家抗原、例えばＴ１Ｄ特異的抗原であ
る。例示的なＴ１Ｄ特異的抗原としては、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、膵島
特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）
、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイ
ドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク
質（ＧＲＰ）、およびこれらの組合せが挙げられる。上記Ｔ１Ｄ特異的抗原の例示的なア
ミノ酸配列および核酸配列は、例えば、国際特許出願公開第２０１７／１２２１８０号パ
ンフレット（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開
示されている。他の例では、抗原は、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉
アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲ
ン、またはこれらの組合せなどのアレルゲンである。一部の例では、アレルゲンは、雑草
花粉アレルゲン、例えばブタクサ花粉アレルゲンである。他の例では、アレルゲンは、カ
バノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなどの樹木花粉アレルゲンである。さら
に他の例では、アレルゲンは、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グ
ルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、またはこれらの組合せなどの食物アレルゲ
ンである。
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、抗体またはその断片である。例えば、抗体は
、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物またはサメ抗体）またはナノボディである。
例示的な抗体としては、ＩＬ－４に対する抗体、ＩＬ－５に対する抗体、ＩＬ－７に対す
る抗体、ＩＬ－１３に対する抗体、ＩＬ－１５に対する抗体の他に、免疫グロブリンＥ（
ＩｇＥ）に対する抗ＴＮＦα抗体、および任意のこれらの断片などのサイトカイン中和抗
体が挙げられる。一部の例では、治療用ポリペプチドは融合タンパク質である。例えば、
治療用ポリペプチドは、ＴＮＦ受容体（例えば、可溶性ＴＮＦ受容体２）などの可溶性受
容体、および抗体または抗体断片（抗体のＦｃ領域など）を含む。これらの実施形態によ
る一部の例では、治療用ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、ヒト
ＩｇＧ１ Ｆｃ）を含有する。一部の例では、治療用ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ Ｆ
ｃに融合した可溶性ＴＮＦ受容体２を含む。一部の例では、治療用ポリペプチドはエタネ
ルセプトである。
さらに他の例では、治療用ポリペプチドは、酵素またはその断片（例えば、機能的断片
）、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラ
ーゼ、またはこれらの組合せである。一例では、治療用ポリペプチドは、ＰＡＬ、または
その機能的断片である。
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）、グ
ルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）、グルカゴン、エキセンジン－４、または任意のこ
れらの組合せである。他の例では、治療用ポリペプチドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（例
えば、ヒトＥＧＦまたはブタＥＧＦ）などの成長因子である。さらに他の例では、治療用
ポリペプチドは、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３、またはこれらの組合せなどのＴＦＦで
ある。
治療用ポリペプチドは、上記の治療用ポリペプチドのいずれかの組合せであってもよい
。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、少なくとも１つの治療用ポリペプチドを
コードする外因性核酸は、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｔｈｙＡプロモーター
（ＰｔｈｙＡ）、およびｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）から選択されるプロモータ
ーによって転写調節される。一部の例では、少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコー
ドする外因性核酸は、ｇａｐＢプロモーターによって転写調節される（例えば、その制御
下にある）。他のプロモーターとしては、遺伝子ｈｏｌＡ、ｓｏｄａ、ｅｎｏＡ、ｔｕｆ
ａ、ｆｂａＡ、ａｃｐＡ、ｐｓ４３１、ｍａｌＧ、ｐｔｓＨ、ｄｐｓＡ、ｐｇｋ、ａｈｐ
Ｃ、ｐｄｈＤ、ｐｔｓ＿ＩＩ、ｐｆｋ、ｔｒｅＰＰ、ｐｔｎＤ、ｐｇｉＡ、ｕｓｐ４５に
先行するものが挙げられる。他の好適なプロモーターは、例えば、米国特許出願公開第２
０１４／０１０５８６３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書
に組み込まれる）に記載されている。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、トレハロ
ースの蓄積を促進し、胆汁塩および乾燥に対するＬＡＢの生存能力を増進させる、変異お
よび挿入の組合せをさらに含む。例えば、これらは、
（ｉ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０
４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ト
ランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（ｉｉ）トレハロース－６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺
伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース－６
－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、
（ｉｉｉ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース－６－リン酸
ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、ならびに
（ｉｖ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ
：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３
０）
であり得る。
例えば、トレハロース－６－リン酸ホスファターゼ、例えば、大腸菌（Escherichia co
li）ｏｔｓＢなどのｏｔｓＢをコードする外因性核酸。これらの実施形態による一部の例
では、トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸は、染色体に組
み込まれている。一部の例では、トレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする
外因性核酸は、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５）の３’において染
色体に組み込まれている。この実施形態による一部の例では、ＬＡＢは、ｕｓｐ４５プロ
モーター、ｕｓｐ４５遺伝子（例えば、プロモーターの３’）、およびトレハロース－６
－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸（例えば、ｕｓｐ４５遺伝子の３’）を
含む第２のポリシストロン性発現カセットを含む。一部の例では、第２のポリシストロン
性発現カセットは、ｕｓｐ４５遺伝子とトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコー
ドする外因性核酸との間の遺伝子間領域をさらに含む。一部の例では、第２のポリシスト
ロン性発現カセットは、Ｐｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞遺伝子間領域＞＞ｏｔｓＢによ
って表される。これらの実施形態による一部の例では、遺伝子間領域は、本明細書に上記
されるｒｐｍＤ（例えば、配列番号８または配列番号９を有する）である。したがって、
第２のポリシストロン性発現カセットは、Ｐｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞ｒｐｍＤ＞＞
ｏｔｓＢによって表され得る。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、トレハロース－６－リン酸ホスホリラー
ゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）は、微生物（例えば、ＬＡＢ）において破壊または不活性化され
ている。例えば、ｔｒｅＰＰは、ｔｒｅＰＰ遺伝子もしくはその断片を除去することによ
って不活性化されているか、または、ｔｒｅＰＰは、終止コドンを挿入することによって
破壊されている。したがって、これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、
ＬＡＢ）は、ｔｒｅＰＰ活性を欠いている。
上記実施形態のいずれかによる他の例では、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポ
ーネント遺伝子（ｐｔｃＣ）は、微生物（例えば、ＬＡＢ）において破壊または不活性化
されている。例えば、ｐｔｃＣは、終止コドンを挿入することによって破壊されているか
、または、ｐｔｃＣは、ｐｔｃＣもしくはその断片を除去することによって不活性化され
ている。したがって、これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）
は、ｐｔｃＣ活性を欠いている。
上記実施形態のいずれかによる他の例では、ＬＡＢは、１つまたは複数のトレハロース
トランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。一部の例では、１
つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、
ＬＡＢに内因性である。一部の例では、ＬＡＢは、１つまたは複数のトレハローストラン
スポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を過剰発現する。これらの実施形態によ
る一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまた
は複数の遺伝子は、外因性プロモーター、例えばｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の
３’に位置する。例えば、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする
１つまたは複数の遺伝子は、ＰｈｌｌＡによって転写調節される。これらの実施形態によ
る一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまた
は複数の遺伝子は、ｌｌｍｇ＿０４５３、ｌｌｍｇ＿０４５４、および任意のこれらの組
合せから選択される。一部の例では、ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４は、
ＰｈｌｌＡによって転写調節される。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランス
ポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、２つまたはそれより多くのトレハロー
ストランスポーターをコードする２つの遺伝子を含み、遺伝子間領域が該２つの遺伝子の
間に配置されている。一部の例では、遺伝子間領域は、例えば配列番号８または配列番号
９を有する、ｒｐｍＤである。一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、２つの異な
るトレハローストランスポーターをコードする２つの核酸配列（例えば、遺伝子）（トラ
ンスポーター１およびトランスポーター２の配列）および該２つの異なるトレハロースト
ランスポーターをコードする２つの核酸の間の遺伝子間領域を含むポリシストロン性発現
カセットを含む。そのような発現カセットは、ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞遺
伝子間領域＞＞トランスポーター２によって表され得る。これらの実施形態による一部の
例では、遺伝子間領域は、本明細書に上記されるｒｐｍＤ（例えば、配列番号８または配
列番号９を有する）である。したがって、ポリシストロン性発現カセットは、ＰｈｌｌＡ
＞＞トランスポーター１＞＞ｒｐｍＤ＞＞トランスポーター２によって表され得る。
したがって、一部の実施形態では、ＬＡＢは、単一株において、いくつもの有用な特色
を含む。一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）染色体に組み込まれたプロモーター＞＞分泌シグナル＞＞ムチンおよび細胞付着融
合タンパク質、
（Ｂ）１つまたは複数の染色体に組み込まれたプロモーター＞＞分泌シグナル＞＞治療用
タンパク質、
（Ｃ）トレハロースの蓄積を促進し、胆汁塩および乾燥に対するＬＡＢの生存能力を増進
させる、変異および挿入の組合せ
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。該変異は、
（ｉ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０
４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ト
ランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（ｉｉ）トレハロース－６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺
伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース－６
－リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、
（ｉｉｉ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース－６－リン酸
ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、および
（ｉｖ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ
：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３
０）
から選択される。
ＬＡＢはまた、ｔｈｙＡなどの、生物学的封じ込めのための栄養要求性変異を含有して
もよい。これらの機能（すなわち、ムチンおよび細胞付着、治療用タンパク質、トレハロ
ース蓄積）の１つまたは複数は、ポリシストロン性オペロン中にあってよく、ポリシスト
ロン性オペロンでは各遺伝子は遺伝子間領域によって隔てられていてもよい。
一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）生物学的封じ込めのための、ｔｈｙＡの変異、
（Ｂ）粘液および細胞結合融合タンパク質を細胞壁に輸送し、連結させるための、染色体
に組み込まれたＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ｃｍｂＡ、
（Ｃ）ＬＡＢから成熟ＰＡＬを分泌させるための、染色体に組み込まれたＰｇａｐＢ＞＞
ｇａｐＢ＞＞遺伝子間領域（ｒｐｍＤなど）＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｐａｌ、
（Ｄ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０
４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ト
ランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（Ｅ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース－６－リン酸ホス
ホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、
（Ｆ）トレハロース－６－リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺伝
子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース－６－
リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、および
（Ｇ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ：
４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３０
）
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、記載された
遺伝子改変を含まない、すなわち、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含まな
いまたは前記融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増
加した胃腸（ＧＩ）通過時間を有する。一部の例では、ＧＩ通過時間は、少なくとも約１
０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくと
も約１００％（約２倍）増加している。他の例では、ＧＩ通過時間は、少なくとも約１０
％から約５００％、少なくとも約２０％から約４００％、少なくとも約２０％から約３０
０％、少なくとも約２０％から約３００％、または少なくとも約３０％から約３００％増
加している。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、本明細書に
記載されるように遺伝子改変されていない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因
性核酸を含まないまたは融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比
べた時に増加したｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力を呈する。一部の例では、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏムチン結合能力は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０
％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０
％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％（約２倍）増加している。他の例で
は、ムチン結合能力は、少なくとも約１０％から約５００％、少なくとも約１０％から約
４００％、少なくとも約１０％から約３００％、少なくとも約１０％から約２００％、少
なくとも約２０％から約２００％、少なくとも約２０％から約３００％、または少なくと
も約２０％から約５００％増加している。
ムチン結合能力は、任意の当該技術分野で認識される方法、例えば本明細書に記載され
る方法にしたがって、測定することができる。一部の例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結
合能力は、固定化されたムチン（例えば、ブタ胃からのムチン）に微生物（例えば、細菌
）を接触および結合させ、例えば、適切な波長、例えば４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０
５）を検出するか、または結合した微生物細胞（例えば、結合した細菌細胞）を色素（例
えば、クリスタルバイオレット）で染色した後に、用いた色素にとって適切な波長で吸光
度を検出することによって、ムチンに結合した微生物細胞（例えば、細菌細胞）の数を測
定することによって測定される。例えば、ムチンに結合した細菌細胞を染色するためにク
リスタルバイオレットが使用される場合、５９５ｎｍで吸光度を測定することができる（
ＯＤ５９５）。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、記載された
遺伝子改変を有しない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含まないま
たは融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増加したｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２細胞結合能力を呈する。一部の例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃａｃｏ－２結合能力は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３
０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８
０％、少なくとも約１００％（約２倍）、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％
、または少なくとも約４００％（約５倍）増加している。他の例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃａｃｏ－２結合能力は、少なくとも約１０％から約２００％、少なくとも約１０％か
ら約３００％、少なくとも約１０％から約４００％、または少なくとも約１０％から約５
００％増加している。Ｃａｃｏ－２細胞結合能力は、本明細書に開示される方法などの任
意の当該技術分野で認識される方法にしたがって測定することができる。例えば、Ｃａｃ
ｏ－２結合能力は、（ｉ）微生物（例えば、細菌）、例えば、微生物（例えば、細菌）の
培養物をＣａｃｏ－２細胞と接触させること、（ｉｉ）Ｃａｃｏ－２細胞を洗浄して未結
合の微生物（例えば、細菌細胞）を除去すること、（ｉｉｉ）Ｃａｃｏ－２細胞に結合し
た微生物細胞（例えば、細菌細胞）を脱着すること、および（ｉｖ）例えば本明細書に記
載されるように、脱着した細菌細胞の数を決定すること（すなわち、脱着した細胞を滴定
すること）によって測定される。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、記載された
遺伝子改変を有しない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含まないま
たは融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増加した腸
粘膜への付着を呈する。一部の例では、腸粘膜への微生物（例えば、細菌）の付着は、少
なくとも約１０％から約１００％（約２倍）、少なくとも約１０％から約２００％、少な
くとも約１０％から約４００％、または少なくとも約１０％から約５００％増加している
。
本開示は、本開示の微生物（例えば、細菌）、例えば、上記実施形態のいずれかに記載
された微生物（例えば、細菌）を含む組成物をさらに提供する。例えば、本開示は、（例
えば、微生物、例えば細菌の細胞壁にアンカーされた）融合タンパク質を含む微生物（例
えば、細菌）を含む組成物であって、融合タンパク質がＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂ
Ａポリペプチドを含む組成物を提供する。一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、分
泌リーダー配列（例えば、ＳＳｕｓｐ４５）、ＴＦＦポリペプチドをコードする配列、お
よびＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含む外因性核酸を含む。一部の例では、分
泌リーダー配列は、分泌シグナルペプチドをコードし、該分泌シグナルペプチドは、例え
ば、融合タンパク質が細菌の細胞膜を通過している時に、融合タンパク質から切断される
。
本開示は、本開示の微生物（例えば、細菌）および薬学的に許容される担体を含む医薬
組成物をさらに提供する。例えば、医薬組成物は、上記実施形態のいずれかに記載された
微生物（例えば、細菌）を含有する。
本開示は、疾患の治療において使用するための本開示の微生物（例えば、細菌）、また
は本開示の組成物（例えば、医薬組成物）をさらに提供する。本開示は、疾患の予防また
は治療のための医薬の調製において使用するための微生物（例えば、細菌）または組成物
（例えば、医薬組成物）をさらに提供する。これらの実施形態のいずれかによる一部の例
では、疾患は、自己免疫疾患、アレルギー、栄養性または代謝性疾患、胃腸疾患、および
遺伝的障害から選択される。本開示の微生物（例えば、細菌）および組成物を使用して治
療できるさらなる疾患が本明細書に記載される。
本開示は、融合タンパク質をコードする単離された核酸であって、（ｉ）ＴＦＦポリペ
プチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）またはＭｕｃＢＰポリペプチド
などのムチン結合ポリペプチドをコードする配列、および（ｉｉ）ＣｍｂＡポリペプチド
、Ｍｕｂポリペプチド、ＭａｐＡポリペプチド、またはＭｂｐＬポリペプチドなどの細胞
付着ポリペプチドをコードする配列を含む、核酸をさらに提供する。これらの実施形態に
よる一部の例では、細胞付着ポリペプチドはＣｍｂＡポリペプチドである。したがって、
本開示は、融合タンパク質をコードする単離された核酸であって、（ｉ）ＴＦＦ１（例え
ば、ヒトＴＦＦ１）、ＴＦＦ２（例えば、ヒトＴＦＦ２）、またはＴＦＦ３（例えば、ヒ
トＴＦＦ３）などのＴＦＦポリペプチドをコードする配列、および（ｉｉ）ＣｍｂＡポリ
ペプチドをコードする配列を含有する、核酸を提供する。
本開示は、本開示の単離された核酸、例えば上記実施形態のいずれかによる単離された
核酸を含むプラスミドをさらに提供する。
本開示は、本開示の単離された核酸または本開示のプラスミドを含む微生物（例えば、
細菌）宿主細胞をさらに提供する。
本開示は、（１）本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位
剤形、および（２）微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位剤形を、
動物またはヒトの対象または患者などの哺乳動物に投与するための説明書を含むキットを
さらに提供する。
方法
本開示は、それを必要とする対象において疾患を治療する方法をさらに提供する。例示
的な方法は、対象に治療有効量の本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、または医薬
組成物を投与することを含む。これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、
細菌）は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。本
開示のそのような微生物（例えば、細菌）および組成物を使用して治療できる例示的な疾
患が本明細書に記載される。一部の例では、疾患は、自己免疫疾患、アレルギー、栄養性
もしくは代謝性疾患、胃腸疾患、遺伝的障害、または任意のこれらの組合せである。上記
実施形態のいずれかによる一部の例では、疾患は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）などの自己免疫
疾患である。他の例では、疾患は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）などの代謝性疾患であ
る。他の例では、疾患は、セリアック病、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸疾患
、例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎である。さらなる例では、疾患は成長遅延で
ある。
一部の実施形態では、疾患はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。この実施形態によ
る一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、ポリペプチド（例えば、例えば微生物を投
与されている対象によってＰｈｅが吸収される前に、例えばＧＩ管において、フェニルア
ラニン（Ｐｈｅ）を分解できる酵素）をコードする外因性核酸を含む。これらの実施形態
による一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、Ｐｈｅをケイ皮酸に変換する酵素であ
るフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする外因性核酸を含む。した
がって、本開示は、それを必要とする対象においてＰＫＵを治療する方法を提供する。例
示的な方法は、対象に治療有効量の本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、または医
薬組成物を投与することを含み、微生物（例えば、細菌）は、ＰＡＬをコードする外因性
核酸を含む。Ｐｈｅ吸収の阻害およびＰＫＵの治療は、例えば、（ｅｎｕ２／２）マウス
を利用するマウスＰＫＵモデルを使用して（例えば、Sarkissian, C. N. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 2339-2344を参照）、またはラットモデルを使用して（
例えば、Chang et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1995, 23(
1):1-21を参照）解析することができる。
本開示は、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）を調製する方法をさらに提供する
。例示的な方法は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を微生物（例えば、細菌）と
接触させることを含み、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ＣｍｂＡポリペプチ
ド、Ｍｕｂポリペプチド、ＭａｐＡポリペプチド、またはＭｂｐＬポリペプチドなどの細
胞付着ポリペプチドをコードする配列を含む。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、
ＣｍｂＡ、例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡで
ある。一部の例では、上記方法を実行すること（すなわち、微生物を外因性核酸と接触さ
せること）は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する微生物（例えば、細菌
）を結果としてもたらす。他の例では、微生物（例えば、細菌）を外因性核酸と接触させ
ることは、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有し、それによって外因性核酸に
よってコードされる融合タンパク質を発現する微生物（例えば、細菌）を結果としてもた
らす。一部の例では、方法は、微生物（例えば、細菌）を培養することおよび微生物（例
えば、細菌）中で融合タンパク質を発現させることをさらに含む。一部の例では、接触さ
せることは、前記細菌が外因性核酸を内在化させるために充分な条件下で行われる。これ
らの実施形態のいずれかによる一部の例では、外因性核酸は、プラスミド上に位置する。
これらの実施形態による一部の例では、外因性核酸は、細菌の染色体に組み込まれる。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸
は、トレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドまたはＭｕｃＢＰポリペプチドなどのムチ
ン結合ポリペプチドをコードする配列をさらに含む。一部の例では、融合タンパク質をコ
ードする外因性核酸は、ＣｍｂＡをコードする配列およびＴＦＦポリペプチドをコードす
る配列を含む。したがって、本開示は、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）を調製
する方法であって、融合タンパク質をコードする外因性核酸を微生物（例えば、細菌）と
接触させることを含み、融合タンパク質をコードする外因性核酸が、（ｉ）ＴＦＦポリペ
プチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）をコードする配列および（ｉｉ
）ＣｍｂＡをコードする配列を含む、方法を提供する。これらの実施形態のいずれかによ
る一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、例えば相同組換えを使用す
ることによって、染色体に組み込まれる（例えば、細菌の染色体に組み込まれる）。この
実施形態によれば、方法は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含むプラスミド（
すなわち、組込みプラスミド）を形成することをさらに含み得る。
上記実施形態のいずれかによる一例では、方法は、例えば、微生物（例えば、細菌）を
、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させる前にまたはその後に、微生物（例
えば、細菌）を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることをさらに
含む。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、上記方法によって調製された遺伝子改変
された微生物（例えば、細菌）は、本方法にしたがって改変されていない、すなわち、融
合タンパク質をコードする外因性核酸を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べ
た時に本明細書に記載される増加した粘膜および／または細胞付着特性を呈する。
関連する実施形態では、粘液および／または細胞への付着は、粘液および／または細胞
の種類に特異的である。特定の細胞または粘液に見られる特定の受容体への優先的な結合
の結果として、細菌は、特定の部位に局在化され得る。そのようにして、特定の分子の送
達が最も効果的な部位への細菌の局在性を確実にすることができる。一部の実施形態では
、その場所は、粘膜（腸、口腔、目、耳、泌尿生殖器）であり得る。一部の実施形態では
、その場所は小腸であり得、一部の実施形態では、その場所は小腸上部であり得る。
一部の例では、方法は、遺伝子改変された細菌の培養物を少なくとも１つの凍結保存剤
と合わせて細菌混合物を形成することをさらに含む。方法は、細菌混合物を乾燥（例えば
、凍結乾燥または噴霧乾燥）させて乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を形成することをさ
らに含み得る。方法は、遺伝子改変された細菌、または乾燥組成物（例えば、凍結乾燥組
成物）を薬学的に許容される担体と合わせて医薬組成物を形成することをさらに含んでも
よい。方法は、遺伝子改変された細菌、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物、または医薬組
成物を、錠剤、カプセル剤、または顆粒剤などの医薬単位剤形に配合することをさらに含
んでもよい。
本開示は、本開示の少なくとも１つの微生物（例えば、細菌）、組成物、または医薬組
成物を含む単位剤形をさらに提供する。一部の例では、そのような単位剤形は経口剤形で
ある。これらの実施形態による他の例では、単位剤形は、カプセル剤（例えば、粉末を含
有するか、またはマイクロペレットもしくはマイクロ顆粒を含有するカプセル剤）、錠剤
、顆粒剤、サシェ剤、または包装された液剤、例えば懸濁剤である。他の実施形態では、
単位剤形は、定量のエアロゾル用量、または坐剤である。
一部の実施形態では、剤形中に含有される微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）は
、その乾燥粉末形態または圧縮形態である。
本開示は、約１×１０４～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の本開示の微生
物、例えば非病原性微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む単位剤形をさらに提
供する。一部の実施形態では、単位剤形は、約１×１０６～約１×１０１２コロニー形成
単位（ｃｆｕ）の微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。他の実施形態では、
単位剤形は、約１×１０９～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物（例え
ば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
上記方法のいずれかにおける一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、対象に
経口投与される。例えば、微生物（例えば、細菌）は、微生物（例えば、細菌）および薬
学的に許容される担体を含む経口投与用の医薬組成物の形態（例えば、カプセル剤、錠剤
、顆粒剤、懸濁剤、または液剤）で対象に投与される。他の例では、微生物（例えば、細
菌）は、食品の形態で対象に投与され、または食品（例えば、飲料）に加えられる。他の
例では、微生物（例えば、細菌）は、栄養補助食品の形態で対象に投与される。さらに他
の例では、微生物（例えば、細菌）は、坐剤製品の形態で対象に投与される。一部の例で
は、本開示の組成物は、微生物（例えば、細菌）によって発現されるポリペプチドの粘膜
送達のために適当である。例えば、組成物は、対象の腸管中での治療用ポリペプチドの効
率的な放出のために配合され得る。
本開示は、上記実施形態のいずれかによる方法によって調製された遺伝子改変された細
菌、組成物、医薬組成物、または単位剤形をさらに提供する。
本開示は、哺乳動物において成長を増進させる方法をさらに提供する。例示的な方法は
、哺乳動物に有効量の本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単
位剤形を投与することを含む。一部の例では、哺乳動物は、ヒト、農用動物（例えば、ブ
タ、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、イヌ、ネコ、または他の家畜動物である。一部の例で
は、微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位剤形は、哺乳動物への投
与のために配合され、例えば、経口投与のために配合される。一部の例では、この方法に
おいて用いられる微生物（例えば、細菌）は、成長因子または成長ホルモンをコードする
外因性核酸を含有する。この実施形態による一部の例では、成長因子または成長ホルモン
は、微生物（例えば、細菌）中で構成的に発現される。一部の例では、成長因子はＥＧＦ
である。他の例では、哺乳動物はブタであり、かつＥＧＦはブタＥＧＦである。
本開示は、（例えば、ムチン調製物へのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合による測定で）腸粘膜へ
の微生物（例えば、細菌）の結合を増加させる方法をさらに提供する。例示的な方法は、
微生物（例えば、細菌）を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させることで
あって、融合タンパク質をコードする外因性核酸が、ＣｍｂＡポリペプチドをコードする
配列を含む、接触させること、および融合タンパク質をコードする外因性核酸を微生物（
例えば、細菌）中で発現させることを含む。一部の例では、融合タンパク質をコードする
外因性核酸は、ＴＦＦポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドをコードする配列をさ
らに含む。一部の例では、微生物（例えば、細菌）による融合タンパク質をコードする外
因性核酸の発現は、ＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含む融合タンパク
質を産生する。
上記の組成物および方法のいずれかによる一部の例では、微生物は、非病原性微生物、
例えば、哺乳動物対象による摂取のために安全な任意の微生物である。一部の実施形態で
は、上記組成物および方法における微生物は酵母である。酵母は、サッカロミセス（Sacc
haromyces）種、ハンセヌラ（Hansenula）種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種、
シゾサッカロミセス（Schizzosaccharomyces）種、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomy
ces）種、ピキア（Pichia）種、モナスカス（Monascus）種、ゲオトリクム（Geothchum）
種、およびヤロウィア（Yarrowia）種から選択され得る。一部の例では、酵母はサッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
上記組成物および方法における他の実施形態では、非病原性微生物は非病原性細菌であ
る。この実施形態による一部の例では、非病原性細菌はグラム陽性菌である。他の例では
、グラム陽性菌は乳酸発酵細菌（ＬＡＢ）であり、例えば、ラクトコッカス（Lactococcu
s）種（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））、ラクトバチルス
（Lactobacillus）種、およびビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種から選択され
る。他の例では、非病原性細菌は、ストレプトコッカス（Streptococcus）種またはエン
テロコッカス（Enterococcus）種である。追加の細菌種が本明細書に開示される。
ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ＣｍｂＡ発現／ｔｈｙＡ組込みベクターｐＡＧＸ２００５のプラスミドマップである。略語：ｔｈｙＡ５’、ＭＧ１３６３のチミジン合成酵素Ａ（ｔｈｙＡ）遺伝子の５’隣接領域；ＰｔｈｙＡ、ＭＧ１３６３のｔｈｙＡプロモーター；ＳＳｕｐｓ４５、ＭＧ１３６３タンパク質ｕｓｐ４５の分泌シグナルをコードする遺伝子；ｈＴＦＦ３、Ｌ．ラクチス（L. lactis）のために最適化されたコドン用法を有するヒトトレフォイル因子３をコードする遺伝子；ＣｍｂＡ、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＡＴＣＣ ＰＴＡ６４７４の細胞および粘液結合プロテインＡをコードする遺伝子；ｔｈｙＡ３’、ＭＧ１３６３のｔｈｙＡ遺伝子の３’隣接領域；ＯＲＩ、プラスミドｐＯＲＩ１９の複製起点；Ｅｍ、エリスロマイシン耐性マーカー。 図２Ａ～図２Ｂは、ムチンへの細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した結合を実証するグラフであり、ムチン結合性はＯＤ４０５（図２Ａ）またはクリスタルバイオレット染色（図２Ｂ）を使用して測定される。ｐＡＧＸ１４１７：エンプティプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ１８９４：細菌表面でのｈＴＦＦ１－ＳｐａＸの発現のためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面でのｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡの発現のためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８。ムチンＩＩ型＝ブタ胃からのムチン、シアル酸に結合、約１％；ムチンＩＩＩ型＝ブタ胃からのムチン、シアル酸に結合（０．５～１．５％）。 Ｃａｃｏ－２細胞への細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した付着を実証する図である。ｐＡＧＸ１４１７：エンプティプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ１８９４：細菌表面にｈＴＦＦ１－ｓｐａＸを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８。 例示的なＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３構築物を説明する図である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号８および配列番号９）。 あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。 あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。 あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。 あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。 Ｃａｃｏ－２細胞への細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した付着を説明するグラフであり、該細胞は、例示的な細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡ）または例示的な融合タンパク質（ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ）をエピソームによりまたは構成的に発現する。回収％＝コロニー形成単位数による決定で、適用された全Ｌ．ラクチス（L. lactis）細胞と比べた洗浄後にムチンをコーティングしたウェルから回収されたＬ．ラクチス（L. lactis）細胞の％。ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｓＡＧＸ０６１８：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面にＣｍｂＡ（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ｃｍｂＡ）を構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３；ｓＡＧＸ６４４：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座の内因性ｔｈｙＡプロモーターによって転写調節される（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｍｂＡ）；ｓＡＧＸ６６０：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座のｈｌｌＡプロモーターによって転写調節される（ｔｈｙＡ－；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ）。 ムチンへの細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した結合を示すグラフであり、該細胞は、例示的な細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡ）または例示的な融合タンパク質（ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ）をエピソームによりまたは構成的に発現し、かつムチン結合性は、例えば実施例６において本明細書に記載されるようにＯＤ４０５（図７Ａ）またはクリスタルバイオレット染色（図７Ｂ）を使用して測定される。ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｓＡＧＸ０６１８：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面にＣｍｂＡ（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ｃｍｂＡ）を構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３；ｓＡＧＸ６４４：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座の内因性ｔｈｙＡプロモーター（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ）によって転写調節される；ｓＡＧＸ６６０：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈｔｆｆ３－ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座のｈｌｌＡプロモーター（ｔｈｙＡ－；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ）によって転写調節される。 ムチンへの細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した結合を示すグラフであり、該細胞は、例示的な細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡ）または例示的な融合タンパク質（ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ）をエピソームによりまたは構成的に発現し、かつムチン結合性は、例えば実施例６において本明細書に記載されるようにＯＤ４０５（図７Ａ）またはクリスタルバイオレット染色（図７Ｂ）を使用して測定される。ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｓＡＧＸ０６１８：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面にＣｍｂＡ（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ｃｍｂＡ）を構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３；ｓＡＧＸ６４４：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座の内因性ｔｈｙＡプロモーター（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ）によって転写調節される；ｓＡＧＸ６６０：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈｔｆｆ３－ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座のｈｌｌＡプロモーター（ｔｈｙＡ－；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ）によって転写調節される。 粘膜付着ポリペプチドを発現しない（ｓＡＧＸ０５９９）、細菌表面に例示的な細胞付着ポリペプチドＣｍｂＡ（ｓＡＧＸ０６１８）、または細菌表面に例示的な融合タンパク質ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ（ｓＡＧＸ０６４４（ｔｈｙＡ－；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ）およびｓＡＧＸ０６６０（ｔｈｙＡ－；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３－ｃｍｂＡ））を発現する細菌細胞による例示的な治療用ポリペプチド（ＰＡＬ）の産生を説明するグラフである。１０９細胞あたりのＰＡＬ産生のμｇはＰＡＬ産生株にわたって類似していた。 ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＋ＴＦＦ３－ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３－ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ～Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ～Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。 ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＋ＴＦＦ３－ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３－ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ～Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ～Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。 ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＋ＴＦＦ３－ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３－ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ～Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ～Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。 ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）－ＰＡＬ＋ＴＦＦ３－ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３－ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ～Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ～Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。
本開示は、ムチンへの増進したｉｎ ｖｉｔｒｏ結合性および細胞への増進したｉｎ
ｖｉｔｒｏ結合性（例えば、Ｃａｃｏ－２細胞への付着）を呈する微生物（例えば、ラク
トコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの乳酸菌）を提供する。一部の実施形
態では、そのような微生物は、増加したＧＩ通過時間を有する。例えば、そのような微生
物は、治療用ポリペプチドを追加的に発現し得る。一部の例では、哺乳動物対象にそのよ
うな細菌を経口投与すると、ＧＩ管の異なる部分における細菌の滞留時間が増加し、対象
はより長い期間にわたってＧＩ管中の治療用ポリペプチドに曝露される。例えば、細菌が
放出されると、例えば、十二指腸において保護コーティングされたカプセルから放出され
ると、空腸および回腸における細菌の滞留時間は、腸粘膜に結合するまたはそれと相互作
用する粘膜および細胞付着性タンパク質の表面提示／発現によって延長される。結果とし
て、細菌用量を低減することができ、より低い発現プロファイルを有する微生物が治療有
効用量を投与するために許容されるものとなり、より小さい単位剤形を開発することがで
き、かつより低頻度の投与を伴うレジメンを用いることができる（例えば、患者のコンプ
ライアンスを増加させる）。
例えば、本開示は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の表面にラクト
バチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の細胞および粘液結合プロテインＡ（Ｃ
ｍｂＡ）とのヒトトレフォイル因子３（ｈＴＦＦ３）の融合タンパク質をコードする外因
性核酸を含有する微生物を提供する。例示的な融合タンパク質は、ｈＴＦＦ３（例えば、
Tomasetto et al., Gastroenterology 2000, 118(1):70-80を参照）およびラクトバチル
ス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡ（例えば、その分泌シグナルを有し
ない）に融合した、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のタンパク質ｕｓ
ｐ４５の分泌シグナル（例えば、Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:4
28-434を参照）から構成される。ＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質
は、ｕｓｐ４５分泌シグナルによって分泌され、分泌シグナルペプチドは、ｈＴＦＦ３－
ＣｍｂＡ融合タンパク質がラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の細胞膜を
通過した時に切断される。ＣｍｂＡの外側部分は腸上皮細胞に結合することができる。ｈ
ＴＦＦ３をＣｍｂＡタンパク質に融合させることによって、追加の粘液結合ユニットが追
加される。ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡの発現および表面提示は、腸粘膜への増加した付着を可
能とし、改変されたラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）細胞のより遅いＧ
Ｉ通過時間を結果としてもたらした。
定義
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、文脈が明らかにそうでないこ
とを規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数への言及を包含
する。例えば、「細胞」（a cell）という用語は、その混合物などの、複数の細胞を包含
する。同様に、本明細書に記載される治療または医薬の調製のための「化合物」（a comp
ound）の使用は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、そのような治療また
は調製のために１つまたは複数の本発明の化合物を使用することを想定する。
参照数値に関する「約」という用語、およびその文法的同等物は、本明細書で使用され
る場合、参照数値それ自体およびその参照数値からプラスまたはマイナス１０％の値の範
囲を包含できる。例えば、「約１０」という用語は、１０、および９～１１を含めて９～
１１からの任意の値を包含する。一部の場合には、参照数値に関する「約」という用語は
、その参照数値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％
、３％、２％、または１％の値の範囲も包含し得る。一部の実施形態では、特定の方法に
よって測定された数または範囲と関連する「約」は、所与の数値がその方法のばらつきに
よって決定される値を包含することを指し示す。
本明細書で使用される場合、「～を含む」（comprising）という用語は、組成物および
方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しない意味であることを意図する。組成
物および方法を定義するために使用される場合、「～から本質的になる」は、組合せに対
して何らかの本質的な意義を持つ他の要素を除外することを意味する。したがって、本明
細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の汚染
物、および、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない
。「～からなる」は、他の成分の微量元素、および本発明の組成物を投与する実体的な方
法ステップを超えるものを除外することを意味する。これらの移行句（transition terms
）のそれぞれによって定義される実施形態は本発明の範囲内にある。
ポリペプチド配列の同一性パーセンテージは、参照配列をクエリ配列と比較する市販の
アルゴリズムを使用して算出することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、
（例えば、ＢＬＡＳＴＰもしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他のアライメントソフトウェア
による測定で）デフォルトのパラメーターを使用して、参照ポリペプチド、またはその断
片に対して７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも
８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９２％、少なくとも９
２％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８
％、９９％、または少なくとも９９％または１００％同一である。同様に、核酸はまた、
出発核酸を参照して記載することもでき、例えば、核酸は、（例えば、デフォルトのパラ
メーターを使用するＢＬＡＳＴＮもしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他のアライメントソフ
トウェアによる測定で）参照核酸またはその断片に対して５０％、少なくとも５０％、６
０％、少なくとも６０％、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０
％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％
、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、
少なくとも９９％、または１００％同一であり得る。ある分子がより大きい分子とある特
定のパーセンテージの配列同一性を有すると言われる場合、それは、２つの分子が最適に
アライメントされた時に、２つの分子が最適にアライメントされた順序にしたがってより
小さい分子中の該パーセンテージの残基がより大きい分子中の残基とマッチし、「％」（
パーセント）同一性がより小さい分子の長さにしたがって算出されることを意味する。
細菌中の外来タンパク質の発現は典型的に改変を必要とすることが理解されるべきであ
る。これらとしては、イントロンおよび細菌によって認識されない他の真核性核酸モチー
フを除去する核酸の改変、および宿主にコドン用法を最適化する核酸の改変が挙げられる
。
同様に、タンパク質は、天然宿主において適切なプロセシングのために必要であるが、
細菌宿主によって認識されないモチーフ（真核生物からまたは細菌の他の種からの分泌シ
グナルなど）を除去するように改変される。したがって、細菌中で発現される外来タンパ
ク質について言及する場合、それは成熟形態について言及していることを当業者は理解す
るであろう。例えば、ヒトＩＬ－１０は、ヒト細胞中で分泌リーダー配列を有して翻訳さ
れ、分泌リーダー配列は細胞から分泌される成熟ＩＬ－１０には存在しない。真核性分泌
リーダー配列は細菌中で機能しない。したがって、Ｌ．ラクチス（L. lactis）は「ＩＬ
－１０」を発現する核酸をさらに含み、それは成熟ＩＬ－１０タンパク質を含有する。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはポリペプチドを「発現する」、またはポリペ
プチド（例えば、ＰＡＬ、ＩＬ－２ポリペプチドまたはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド）
を「産生する」という用語は、それぞれ、「発現できる」および「産生できる」ことを包
含する意味である。例えば、外因性核酸を含有する微生物は、充分な条件下（例えば、充
分な含水および／または栄養分の存在下）で、外因性核酸によってコードされたポリペプ
チドを産生することができる。しかしながら、微生物は、コードされたポリペプチドを必
ずしも活動的に産生しなくてもよい。微生物（例えば、細菌）は、乾燥（例えば、凍結乾
燥）されていてもよく、その状態では休眠している（すなわち、ポリペプチドを活動的に
産生していない）と考えることができる。しかしながら、微生物が充分な条件に供される
と、例えば、対象に投与されて（例えば、対象の胃腸管中で）放出されると、微生物はポ
リペプチドの産生を開始することがある。したがって、本開示の遺伝子またはポリペプチ
ドを「発現し」、またはポリペプチドを「産生する」微生物は、その「休眠」状態の微生
物を包含する。
本明細書で使用される場合、プロモーターの文脈での（または遺伝子発現もしくはポリ
ペプチドの分泌に関するものに拡張された）「構成的」という用語は、それが関連する遺
伝子の絶え間ない転写を可能とするプロモーターを指す。
「染色体に組み込まれた」もしくは「染色体中に組み込まれた」という用語またはその
任意の変形は、核酸配列（例えば、遺伝子；オープンリーディングフレーム；ポリペプチ
ドをコードする外因性核酸；プロモーター；発現カセットなど）が、微生物（例えば、細
菌）の染色体上に位置すること（該染色体中に組み込まれていること）、すなわち、プラ
スミドなどのエピソームベクター上には位置しないことを意味する。核酸配列が染色体に
組み込まれる一部の実施形態では、そのような染色体に組み込まれた核酸によってコード
されたポリペプチドは、構成的に発現される。
「分泌リーダー配列」、「分泌リーダー」および「分泌シグナル配列」という用語は、
本明細書において交換可能に使用される。該用語は、それらの当該技術分野で認識される
意味にしたがって使用され、一般に、「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチ
ド」をコードする核酸配列であって、微生物によって発現され、シグナルペプチドを含む
ポリペプチドが微生物によって分泌されることを引き起こす、すなわち、該ポリペプチド
が細胞内空間を離れ、例えば、周囲媒体中に分泌される、または細胞壁にアンカーされ、
該ポリペプチドの少なくとも一部分が周囲媒体、例えば微生物の表面に露出されることを
引き起こす核酸配列を指す。
治療用ポリペプチド
「治療用ポリペプチド」という用語は、（例えば、哺乳動物対象において）治療的、予
防的、または他の生物学的活性を有し、または生物学的活性を誘発する潜在能力を有する
任意のポリペプチドを包含する。例としては、公知の生物学的製剤（認可されたものおよ
び治験されているもの）、および、ホルモンおよびサイトカインなどの任意のシグナルポ
リペプチド、ならびにそれらの受容体、アゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。
「治療用ポリペプチド」は、対応する野生型ポリペプチドから改変されていてもよい。一
部の例では、治療用ポリペプチドはサイトカインであり、例えば、インターロイキン（Ｉ
Ｌ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、
ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５
、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１またはＩ
Ｌ－２２などのＩＬである。
他の例では、治療用ポリペプチドは抗原である。この実施形態による一部の例では、抗
原は「自家抗原」または自己抗原である。「自己抗原」または「自家抗原」という用語は
、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、自己抗原または自家抗原の
当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書において使用され、一般に、対象自
身の身体に起因する（対象自身の身体によって産生された）ポリペプチド／タンパク質を
指し、該抗原は、対象自身の免疫系によって認識され、そのような抗原に対する抗体を典
型的に産生する。自己免疫疾患は、一般に、ある特定の疾患特異的な自己抗原に関連する
。例えば、Ｔ１Ｄにおいて、対象の免疫系は、ベータ細胞破壊プロセスに関連する少なく
とも１つの抗原に対する抗体を産生することがある。一部の例では、自家抗原はＴ１Ｄ特
異的抗原である。例示的なＴ１Ｄ特異的抗原としては、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ
－２）、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質
（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、および任意のこれらの組合せが挙
げられる。臨床的なＴ１Ｄは、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプ
チド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、およびシトルリン化グルコース調節タンパク質（
ＧＲＰ）、ならびに任意のこれらの組合せなどの、ベータ細胞によって発現される追加の
候補標的分子にさらに関連し得る。上記Ｔ１Ｄ特異的抗原の例示的なアミノ酸配列および
核酸配列は、例えば、仮特許出願第６２／３５０，４７２号明細書（出願日：２０１６年
６月１５日）（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に
開示されている。一部の例では、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、野生型ヒトＰＩＮＳなどのＰＩＮ
Ｓである。例えば、受託番号ＮＭ＿０００２０７．２に含有されるＣＤＳ、または、その
ような野生型ヒトＰＩＮＳと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８
０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９
７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性である配列を参照。
追加の例示的なＰＩＮＳヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ８９９３０４（完全
なＣＤＳ、選択的にスプライスされる）；ＮＭ＿０００２０７（転写物バリアント１）；
ＮＭ＿００１１８５０９７（転写物バリアント２）；ＮＭ＿００１１８５０９８（転写物
バリアント３）；ＮＭ＿００１２９１８９７（転写物バリアント４）のコーディング配列
、およびこれらの部分配列によって表される。例示的なＰＩＮＳアミノ酸配列としては、
上記ＰＩＮＳ核酸配列のいずれか１つによってコードされる配列が挙げられる。
他の例では、抗原は、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、
食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、またはこ
れらの組合せなどのアレルゲンである。一部の例では、アレルゲンは、雑草花粉アレルゲ
ン、例えばブタクサ花粉アレルゲンである。他の例では、アレルゲンは、カバノキ花粉ア
レルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなどの樹木花粉アレルゲンである。さらに他の例では
、アレルゲンは、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレル
ゲン（グリアジンエピトープ）、またはこれらの組合せなどの食物アレルゲンである。他
の例では、治療用ポリペプチドは、抗原、および、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、またはＩＬ－
２２などのインターロイキンである。
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、抗体またはその断片である。例えば、抗体は
、単一ドメイン抗体またはナノボディである。例示的な抗体としては、ＩＬ－４に対する
抗体、ＩＬ－５に対する抗体、ＩＬ－７に対する抗体、ＩＬ－１３に対する抗体、ＩＬ－
１５に対する抗体の他に、抗ＴＮＦα抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体、
抗Ｐ４０、および任意のこれらの断片などのサイトカイン中和抗体が挙げられる。
さらに他の例では、治療用ポリペプチドは、酵素またはその断片（例えば、機能的断片
）、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラ
ーゼ、またはこれらの組合せである。一例では、治療用ポリペプチドは、ＰＡＬ、または
その機能的断片である。この実施形態のために有用な例示的なＰＡＬ配列は、例えば、国
際特許出願公開第２０１４／０６６９４５号パンフレット（その開示は、参照することに
よりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＰＡＬはフェニルアラニン
を代謝し、それによって、腸から血中に吸収されるＰｈｅのレベルを低減させることがで
き、したがって、フェニルケトン尿症を治療するために使用することができる。フェニル
アラニンデカルボキシラーゼなどの芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼなどの他の酵素も
またＰｈｅを分解するために使用することができる。一部の実施形態では、対象は、ＰＡ
Ｌおよび第２のフェニルアラニン分解酵素を発現しかつ分泌する細菌を投与される。別の
実施形態では、対象は、ＰＡＬを発現しかつ分泌する細菌、および第２のフェニルアラニ
ン分解酵素を発現しかつ分泌する別の細菌を投与される。
さらなる例では、細菌は、Ｐｈｅ摂取および細胞内での利用を増進させるように操作さ
れる。そのような細菌の投与は、患者によって吸収されるＰｈｅの量をさらに低減させる
ことができる。
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）、グ
ルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）、グルカゴン、エキセンジン－４、または任意のこ
れらの組合せである。他の例では、治療用ポリペプチドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（例
えば、ヒトＥＧＦまたはブタＥＧＦ）などの成長因子である。さらに他の例では、治療用
ポリペプチドは、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３、またはこれらの組合せなどのＴＦＦで
ある。
一部の例では、治療用ポリペプチドは免疫調節化合物である。「免疫調節化合物」また
は免疫モジュレーター」という用語は、それらの当該技術分野で認識される意味にしたが
って本明細書で使用される。免疫調節化合物は、当業者に公知の任意の免疫調節化合物で
あり得る。一部の実施形態では、免疫調節化合物は、寛容誘導化合物である。寛容誘導は
、例えば、制御性Ｔ細胞を誘導することによって、または非直接的な方法、例えば、寛容
樹状細胞への未熟樹状細胞の活性化および／または成熟樹状細胞上の「共刺激」因子の発
現を誘導するＴｈ２免疫反応の阻害によって、得ることができる。免疫調節化合物および
免疫抑制化合物は当業者に公知であり、スペルグアリンなどの細菌代謝物、タクロリムス
またはシクロスポリンなどの真菌およびストレプトミセス（Streptomyces）属細菌代謝物
、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＦＮα、ＴＧＦβ（制御性Ｔ細胞の選択的なアジュバントと
して）Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰおよびＲａｎｋ－Ｌ（選択的な寛容原性ＤＣの誘導剤として
）などの免疫抑制性サイトカイン、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、
抗ＣＤ３などの抗体および／またはアンタゴニスト（例えば、抗体）、ＣＴＬ－４１ ｇ
またはＣＴＬＡ－４アゴニスト融合タンパク質などのタンパク質、ペプチドまたは融合タ
ンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、免疫調節化合物は
、免疫抑制化合物である。他の実施形態では、免疫抑制化合物は、免疫抑制性サイトカイ
ンまたは抗体である。他の実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、寛容増強性サイト
カインまたは抗体である。「免疫調節化合物」という用語はまた、これらの機能的なホモ
ログも含むことが当業者によって理解されるであろう。機能的なホモログは、意図する目
的のために本質的に同じまたは類似の機能を有する分子であるが、構造的に異なることが
ある。一部の例では、免疫調節化合物は、抗ＣＤ３抗体、またはその機能的なホモログで
ある。
本開示の微生物は、１つより多くの、または少なくとも１つの治療用ポリペプチドを発
現し得る。治療用ポリペプチドは、上記の治療用ポリペプチドのいずれかの組合せであり
得る。
疾患
本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物および方法を使用して任意の疾患、例えば、
粘膜、例えば胃腸粘膜の部位で活性な生物活性ポリペプチドによって治療できる疾患を治
療または予防することができる。本開示の方法を使用して治療または予防できる例示的な
疾患としては、自己免疫疾患、アレルギー、栄養性もしくは代謝性疾患、胃腸疾患、およ
び遺伝性障害、または任意のこれらの組合せが挙げられる。
「栄養性疾患」という用語は、食品または栄養分の処理が不十分であることに関連し、
例えば、栄養不良、低体重、または他の二次的状態（膨満感など）を結果としてもたらし
得る任意の疾患を包含する。「栄養性疾患」は、脂質および炭水化物などの食品または食
品成分を処理するある特定の酵素（リパーゼ、プロテアーゼ、または糖分解酵素など）の
不十分な産生に関連することがある。「栄養性疾患」という用語は、確定的な状態または
疾患が存在しない場合でさえも増進されることがある生物中の任意の代謝プロセス（「代
謝増進」）を包含し、例えば、ブタ、ウシ、トリ、またはヒツジなどのある特定の農用動
物は、より速く成長しまたはより大きい体重を蓄積するように治療されることがある。一
部の例では、「栄養性疾患」は、乳糖不耐症などの、ある特定の食品または食品成分の不
十分または異常な代謝に基づくそのような食品または食品成分への不耐症である。「栄養
性疾患」という用語は、本明細書において交換可能に使用される「代謝性疾患」または「
代謝障害」に関係する。「代謝性疾患」という用語は、その当該技術分野で認識される意
味にしたがって本明細書で使用され、一般に、身体中の異常な化学反応が正常な代謝プロ
セスを変化させる任意の状態を指す。一部の例では、代謝性疾患は遺伝的欠陥によって引
き起こされ、遺伝性であり得る。代謝障害の例としては、酸と塩基の不均衡、代謝性脳疾
患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復不全障害、グルコース代謝障害、高乳酸塩血症、鉄
代謝障害、および脂質代謝障害が挙げられる。
栄養性または代謝性疾患の他の例としては、グルコースおよび／またはガラクトース吸
収不良、レッシュ・ナイハン症候群、メンケス症候群、肥満症、膵臓がん、プラダー・ウ
ィリ症候群、ポルフィリン症、レフサム病、タンジール病、ウィルソン病、ハーラー症候
群（例えば、異常な骨構造および成長遅延によって特徴付けられる）、ニーマン・ピック
病（例えば、乳児が肝肥大、栄養摂取困難、および神経損傷を発症する）、テイ・サック
ス病（例えば、幼児における進行性虚弱によって特徴付けられ、重篤な神経損傷に進行す
る）、ゴーシェ病（例えば、骨疼痛、肝肥大、および低血小板数によって特徴付けられる
）；ファブリー病（例えば、小児期においては手足の痛み、成人期においては腎臓および
心臓の疾患および発作によって特徴付けられる）、クラッベ病（例えば、幼児における進
行性の神経損傷、成長遅延によって特徴付けられる）；ガラクトース血症（例えば、糖ガ
ラクトース分解の障害によって特徴付けられ、新生児による授乳または栄養処方後に黄疸
、嘔吐、および肝肥大に繋がることがある）；メープルシロップ尿症（例えば、酵素ＢＣ
ＫＤの欠損によって特徴付けられ、身体中のアミノ酸の蓄積を引き起こす）；フェニルケ
トン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン貯蔵病（例えば、低血糖レベル、筋肉疼痛、および虚
弱によって特徴付けられる）；ミトコンドリア障害、フリードライヒ運動失調症（例えば
、タンパク質フラタキシンに関係する問題によって特徴付けられ、神経損傷、心臓の問題
、歩行困難を引き起こすことがある）、およびペルオキシソーム障害（例えば、ペルオキ
シソーム内の不良な酵素機能によって特徴付けられ、毒性代謝物の蓄積に繋がることがあ
る）が挙げられる。例示的なペルオキシソーム障害としては、例えば、ツェルウェーガー
症候群（例えば、乳児における異常な顏の特徴、肝肥大、および神経損傷によって特徴付
けられる）、および副腎白質ジストロフィー（例えば、小児期または成人早期における神
経損傷の症状によって特徴付けられる）が挙げられる。他の栄養または代謝障害としては
、金属代謝障害（例えば、タンパク質機能不良および身体中の金属の毒性の蓄積によって
特徴付けられる）が挙げられる。例としては、例えば、ウィルソン病（例えば、肝臓、脳
、および他の器官における毒性の銅レベルの蓄積によって特徴付けられる）、およびヘモ
クロマトーシス（例えば、遺伝性ヘモクロマトーシス）が挙げられ、ヘモクロマトーシス
では例えば、腸が過剰な鉄を吸収し、それが肝臓、膵臓、関節、および心臓に蓄積して損
傷を引き起こす。栄養または代謝障害のさらなる例としては、有機酸血症（メチルマロン
酸血症およびプロピオン酸血症（propionic academia）など）、尿素サイクル障害（オル
ニチントランスカルバミラーゼ欠損症およびシトルリン血症など）が挙げられる。一部の
例では、栄養性または代謝性疾患はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。他の例では、
栄養性または代謝性疾患は、エネルギー調節異常に関係する代謝障害（例えば、非アルコ
ール性脂肪性肝炎）である。
一部の例では、疾患は自己免疫疾患である。例示的な自己免疫疾患としては、心筋炎、
心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、抗糸球体基底
膜腎炎、間質性膀胱炎、ループス腎炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）
、原発性硬化性胆管炎、抗合成酵素症候群、円形脱毛症、自己免疫性血管性浮腫、自己免
疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、疱疹
状皮膚炎、円板状エリテマトーデス、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、
化膿性汗腺炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、斑状強皮症、尋常性天
疱瘡、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ムッハ・ハーベルマン病、乾癬、全身性強皮症、白斑、
アジソン病、多腺性自己免疫症候群（ＡＰＳ）１型、多腺性自己免疫症候群（ＡＰＳ）２
型、多腺性自己免疫症候群（ＡＰＳ）３型、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、１型糖尿病、自
己免疫性甲状腺炎、オルド甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性卵巣炎、子宮内膜症、自
己免疫性睾丸炎、シェーグレン症候群、自己免疫性腸疾患、セリアック病、クローン病、
顕微鏡的大腸炎、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ、ＡＰＬＳ）、再生不良性貧
血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性好中球減少症、
自己免疫性血小板減少性紫斑病、寒冷凝集素病、本態性混合寒冷グロブリン血症、エバン
ス症候群、夜間発作、ヘモグロビン尿症、悪性貧血、赤芽球癆、血小板減少症、有痛性脂
肪症、成人発症スチル病、強直性脊椎炎、ＣＲＥＳＴ症候群、薬物誘発性ループス、骨付
着部炎関連関節炎、好酸性筋膜炎、フェルティ症候群、ＩｇＧ４関連疾患、若年性関節炎
、ライム病（慢性）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、回帰性リウマチ、パリー・ロンベ
ルク症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、乾癬性関節炎、反応性関節炎、再発性多発
軟骨炎、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュニッツラー
症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、皮膚筋炎
、線維筋痛症、封入体筋炎、筋炎、重症筋無力症、神経性筋強直症、腫瘍随伴性小脳変性
症、多発性筋炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性運動性軸索型ニューロパチー、
抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（抗ＮＭＤＡ）受容体脳炎、バロー同心円性硬化症、
ビッカースタッフ脳炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、
橋本脳症、突発性炎症性脱髄疾患、ランバート・イートン筋無力症候群、多発性硬化症（
ＭＳ）、パターンＩＩ、オシュトラン症候群（Oshtoran syndrome）、レンサ球菌感染性
小児自己免疫神経精神障害（ＰＡＮＤＡＳ）、進行性炎症性ニューロパチー、レストレス
レッグ症候群、スティッフパーソン症候群、シデナム舞踏病、横断性脊髄炎、自己免疫性
網膜症、自己免疫性ぶどう膜炎、コーガン症候群、グレーヴス眼病、中間部ぶどう膜炎、
木質性結膜炎、モーレン潰瘍、視神経脊髄炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群
、視神経炎、強膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、トロサ・ハント症候群、自己免疫性
内耳疾患（ＡＩＥＤ）、メニエール病、ベーチェット病、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症
（ＥＧＰＡ）、巨細胞動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、ＩｇＡ血管炎（ＩｇＡ
Ｖ）、川崎病、白血球破砕性血管炎、ループス血管炎、リウマチ性血管炎、顕微鏡的多発
血管炎（ＭＰＡ）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発筋痛症、蕁麻疹様血
管炎、血管炎、および原発性免疫不全が挙げられる。一部の例では、自己免疫疾患は１型
糖尿病（Ｔ１Ｄ）である。
他の例では、疾患は、短腸症候群、セリアック病、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例
えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）などの胃腸疾患である。
一部の例では、疾患は炎症性疾患（例えば、Ｔｈ２および／またはＩｇＥ誘発性炎症）
である。例示的な炎症性疾患としては、尋常性ざ瘡、喘息、自己炎症性疾患、慢性前立腺
炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、リウ
マチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶、移植片対宿主病、血管炎、化膿性
汗腺炎（hydradenitis suppurativa）、憩室炎、間質性膀胱炎が挙げられる。自己炎症性
疾患の例としては、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、周期性発熱を伴う高免疫グロブリンＤ血
症（ＨＩＤＳ）、メバロン酸尿症、メバロン酸キナーゼ欠損症、ＴＮＦ受容体関連周期性
症候群（ＴＲＡＰＳ）、マックル・ウェルズ症候群（蕁麻疹・難聴・アミロイドーシス（
urticaria deafness amyloidosis））、家族性寒冷蕁麻疹、新生児期発症多臓器系炎症性
疾患（ＮＯＭＩＤ）、周期性発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎および腺炎（ＰＦＡＰＡ症候
群）、ブロー症候群、化膿性無菌性関節炎、壊疽性膿皮症、ざ瘡（ＰＡＰＡ）、インター
ロイキン１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）が挙げられる。
さらなる例では、疾患は成長遅延である。他の例では、疾患は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）
、肥満症、または疼痛（例えば、神経障害性疼痛）である。
他の例では、疾患は、アレルギー、例えば、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン
、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑
アレルゲン、またはこれらの組合せから選択されるアレルゲンに対するアレルギーである
。一部の例では、疾患は、雑草花粉アレルゲン、例えばブタクサ花粉アレルゲンに対する
アレルギーである。他の例では、疾患は、カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレル
ゲンなどの樹木花粉アレルゲンに対するアレルギーである。さらに他の例では、疾患は、
ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジン
エピトープ）、またはこれらの組合せなどの食物アレルゲンに対するアレルギーである。
フェニルケトン尿症
一部の例では、本開示は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療する方法を提供する。
「フェニルケトン尿症」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって
本明細書で使用される。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、アミノ酸代謝の最も流行する
障害の１つである。遺伝的欠損（酵素ＰＡＨの欠損）が高レベルの血中フェニルアラニン
（Ｐｈｅ）を結果としてもたらし、これが、人生の早期に認識されて治療されなければ、
重篤な精神遅滞に繋がることがある。食事の順守の下であっても、ＰＫＵ患者は青年期以
降の認知障害のリスクがある。
プロモーター
「プロモーター」は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始させる、核酸
分子上、例えばＤＮＡ分子上の領域を意味する。プロモーターは、例えば、プロモーター
が転写を制御する配列の上流、すなわち５’に位置する。プロモーターは、追加の天然調
節配列または領域、例えばオペレーターに関連してもよいことを当業者は理解するであろ
う。発現のために必要とされる調節領域の精密な性質は生物ごとに異なることがあるが、
一般に、原核生物において、（ＲＮＡ転写の開始を導く）プロモーターの他に、ＲＮＡに
転写された時に、タンパク質合成の開始のシグナルを送るＤＮＡ配列の両方を含有するプ
ロモーター領域を含む。そのような領域は、通常、プリブノーボックス（ＴＡＴＡボック
スを参照）、シャイン・ダルガノ配列などの、転写および翻訳の開始に関与する５’－非
コーディング配列を含む。
「作動可能に連結された」という用語は、記載された複数のコンポーネントが、意図し
た様式で機能することを可能とする関係性で並置されていることを指す。コーディング配
列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合性の条件下でコーディング配
列の発現が達成されるようにライゲートされている。例えば、プロモーターは、連結また
は接続が遺伝子の転写を可能としまたはもたらす場合に、前記遺伝子、オープンリーディ
ングフレームまたはコーディング配列に作動可能に連結されていると言われる。さらなる
例では、５’および３’の遺伝子、シストロン、オープンリーディングフレームまたはコ
ーディング配列は、連結または接続が少なくとも３’の遺伝子の翻訳を可能としまたはも
たらす場合に、ポリシストロン性発現ユニット中で作動可能に連結されていると言われる
。例えば、例えばプロモーターおよびオープンリーディングフレームなどのＤＮＡ配列は
、配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を結果としてもたらさない、
（２）オープンリーディングフレームの転写を導くプロモーターの能力に干渉しない、ま
たは２５（３）オープンリーディングフレームがプロモーター領域配列によって転写され
る能力に干渉しない場合に、作動可能に連結されていると言われる。
発現カセット
「発現カセット」または「発現ユニット」という用語は、当該技術分野において一般に
認められる意味にしたがって使用され、１つまたは複数の遺伝子および該１つまたは複数
の遺伝子の発現を制御する配列を含有する核酸を指す。例示的な発現カセットは、少なく
とも１つのプロモーター配列および少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含
有する。
ポリシストロン性発現カセット
「ポリシストロン性発現カセット」、「ポリシストロン性発現ユニット」または「ポリ
シストロン性発現システム」という用語は、当該技術分野において一般に認められる意味
にしたがって本明細書において交換可能に使用される。それらは、２つまたはそれより多
くの遺伝子の発現が、プロモーター、オペレーターなどの共通の調節機構によって調節さ
れる核酸配列を指す。本明細書で使用されるポリシストロン性発現ユニットという用語は
、マルチシストロン性発現ユニットと同義である。ポリシストロン性発現ユニットの例は
、２シストロン性、３シストロン性、４シストロン性の発現ユニットであるが、これらに
限定されない。タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの個々の発現産物
をコードする、２つまたはそれより多く（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ
、９つ、１０、またはそれより多く）のオープンリーディングフレームまたはコーディン
グ領域を含む任意のｍＲＮＡは、ポリシストロン性という用語に包含される。ポリシスト
ロン性発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター、および該プロモーターによって
制御された少なくとも２つのオープンリーディングフレームを含み、該２つのオープンリ
ーディングフレームの間に遺伝子間領域が配置されてもよい。
一部の例では、「ポリシストロン性発現カセット」は、微生物（例えば、ＬＡＢ）に内
因性のプロモーターによって転写制御される１つまたは複数の内因性遺伝子および１つま
たは複数の外因性遺伝子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるポリシストロ
ン性発現ユニットまたはシステムは、微生物（例えば、ＬＡＢ）に外因性のプロモーター
によって転写制御される。さらなる実施形態では、本明細書に記載される翻訳上または転
写上連結された１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、
前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然プロモーターによって転写制御され
る。別の実施形態では、ポリシストロン性発現ユニットは、前記ポリシストロン性発現ユ
ニットに含まれる前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然プロモーターによ
って転写制御される。別の実施形態では、ポリシストロン性発現ユニットは、グラム陽性
内因性プロモーターに作動可能に連結されている。例示的な実施形態では、プロモーター
は、それが作動可能に連結されるオープンリーディングフレームの上流、すなわち、５’
に位置し得る。さらなる実施形態では、プロモーターは、ポリシストロン性発現ユニット
中の内因性遺伝子の最も５’、すなわち最も上流の天然プロモーターである。したがって
、一部の例では、ポリシストロン性発現ユニットは、前記１つまたは複数の内因性遺伝子
の３’末端に転写上連結された内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含有
し、例えば、前記１つまたは複数の外因性遺伝子は、ポリシストロン性発現ユニットの最
も３’の遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「翻訳上連結された」（translationally coupled）とい
う用語は、「翻訳上連結された」（translationally linked）または「翻訳上接続された
」と同義である。これらの用語は、本質的に、ポリシストロン性発現カセットまたはユニ
ットに関する。２つまたはそれより多くの遺伝子、オープンリーディングフレームまたは
コーディング配列は、共通の調節エレメント（特に、共通のプロモーター中にあるものな
ど）が、前記２つまたはそれより多くの遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコ
ーディング配列をコードする１つのｍＲＮＡとして前記２つまたはそれより多くの遺伝子
の転写をもたらし、それをその後に２つまたはそれより多くの個々のポリペプチド配列に
翻訳できる時に、翻訳上連結されていると言われる。細菌オペロンは、２つまたはそれよ
り多くの遺伝子が翻訳上または転写上連結された天然に存在するポリシストロン性発現シ
ステムまたはユニットであることを当業者は理解するであろう。
遺伝子間領域
本明細書で使用される場合、「遺伝子間領域」という用語は、「遺伝子間リンカー」ま
たは「遺伝子間スペーサー」と同義である。遺伝子間領域は、隣接する（すなわち、同じ
ポリ核酸配列上に位置する）遺伝子、オープンリーディングフレーム、シストロンまたは
コーディング配列の間のポリ核酸配列として定義される。拡張により、遺伝子間領域は、
前記遺伝子間領域によって連結された５’の遺伝子の終止コドンおよび／または３’の遺
伝子の開始コドンを含み得る。本明細書で定義される通り、遺伝子間領域という用語は、
ポリシストロン性発現ユニット中の隣接する遺伝子間の遺伝子間領域に特に関する。例え
ば、本明細書で定義される遺伝子間領域は、オペロン中の隣接する遺伝子間に見出すこと
ができる。したがって、一実施形態では、本明細書で定義される遺伝子間領域は、オペロ
ンの遺伝子間領域である。
一部の例では、遺伝子間領域、リンカーまたはスペーサーは、グラム陽性菌のｒｐｌＷ
、ｒｐｌ Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥまたはｒｐｌＮに先行する、す
なわち５’の、より具体的にはすぐ５’の、遺伝子間領域から選択される。一部の実施形
態では、グラム陽性菌は、乳酸菌、例えばラクトコッカス（Lactococcus）種、例えば、
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、および任意のその亜種または株であ
る。一実施形態では、前記遺伝子間領域は、ｒｐｌＷ、ｒｐｌ Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ
、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐｌＮの開始コドンおよび／または先行する、すなわち
５’の、遺伝子の終止コドンを包含する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記
載されるグラム陽性菌または組換え核酸に関し、内因性遺伝子および１つまたは複数の外
因性遺伝子は、グラム陽性菌中で活性の遺伝子間領域（単数または複数）によって転写上
連結されており、例えば、遺伝子間領域（単数または複数）は前記グラム陽性菌に対して
内因性であり、例えば、内因性遺伝子間領域は、ｒｐｌＷ、ｒｐｌ Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐ
ｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、またはｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥ、およびｒｐｌＦに先
行する遺伝子間領域から選択される。
遺伝子間領域が５’の終止コドンおよび／または３’の開始コドンを包含する場合、正
しい翻訳の開始および／または終結に影響することがある二重の開始および／または終止
コドンを回避するために、これらの各々のコドンは、一部の場合には、前記遺伝子間領域
によって連結された遺伝子中に存在しないことを当業者は理解するであろう。遺伝子間領
域を同定する方法は当該技術分野において公知である。さらなるガイダンスによって、遺
伝子間領域は、例えば、ソフトウェアが当該技術分野において公知かつ利用可能な、オペ
ロン、および関連するプロモーターおよびオープンリーディングフレームの予測に基づい
て同定することができる。例示的な遺伝子間領域は、国際特許出願公開第２０１２／１６
４０８３号パンフレット（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込
まれる）に記載されている。
対象
「対象」は、例えば本開示の方法にしたがって、本開示の組成物を投与されることから
利益を得る可能性がある生物である。対象は、哺乳動物（「哺乳動物対象」）であり得る
。例示的な哺乳動物対象としては、ヒト、農用動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギな
ど）、愛玩動物（イヌ、ネコ、およびウサギなど）、および、マウス、ラット、および霊
長目動物などの他の動物が挙げられる。一部の例では、哺乳動物対象は、ヒト患者である
。
粘膜
「粘膜」（mucosa）または「粘膜」（mucous membrane）という用語は、その当該技術
分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。「粘膜」は、口腔粘膜、直腸
粘膜、胃粘膜、腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、気管支または肺粘膜、およ
び鼻または嗅覚粘膜などの、身体中に見られる任意の粘膜であり得る。粘膜は、体表粘膜
、例えば、魚および両生動物に見られる体表粘膜を指すこともある。
本明細書で使用される「粘膜送達」という用語は、その当該技術分野で認識される意味
にしたがって使用され、すなわち、例えば、粘膜との本開示の組成物の接触を介した、粘
膜への送達である。口腔粘膜送達としては、頬側、舌下および歯肉経路の送達が挙げられ
る。したがって、一部の実施形態では、「粘膜送達」としては、経胃送達、経腸送達、経
直腸送達、経頬送達、経肺送達、経眼送達、経鼻送達、経膣送達および経口送達が挙げら
れる。経口送達は胃腸管の遠位部分への送達に影響し得ることを当業者は理解するであろ
う。
「粘膜寛容」という用語は、哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）が粘膜経路を介して抗
原に曝露された後の、該対象における抗原への特異的免疫反応性の阻害を指す。一部の場
合には、粘膜寛容は、全身寛容である。低用量経口寛容は、低用量の抗原によって誘導さ
れる経口寛容であり、ナイーブ宿主に寛容を与えることができるシクロホスファミド感受
性制御性Ｔ細胞によって媒介される活性の免疫抑制によって特徴付けられる。高用量経口
寛容は、高用量の抗原によって誘導される経口寛容であり、シクロホスファミド治療に対
して非感受性であり、かつ抗原特異的Ｔ細胞のアネルギーおよび／または欠失を介してＴ
細胞低応答性の誘導に進む。シクロホスファミドへの感受性の違いを使用して、低用量寛
容と高用量寛容とを区別することができる（Strobel et al., 1983）。一部の場合には、
経口寛容は、Mayer and Shao (2004)によって記載される低用量経口寛容である。
ムチン
「ムチン」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で
使用される。ムチンは、ヒトおよび動物において上皮組織によって製造される高分子量の
グリコシル化されたタンパク質（複合糖質）のファミリーである。ムチンは、ゲルを形成
する能力を有し、ゲル状分泌物の鍵となる成分である。一部のムチンは、疎水性膜貫通ド
メインの存在により膜に結合している。ほとんどのムチンは、粘膜によって粘液の主要成
分として分泌され、または、分泌されて唾液の成分となる。ムチン遺伝子としては、ＭＵ
Ｃ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵ
Ｃ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ
１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、およびＭＵＣ２１が挙げられる。ＭＵＣ２はほとんどが
腸において分泌されるが、気道においても分泌される。成熟ムチンは２つの別個の領域か
ら構成され、アミノ末端領域およびカルボキシ末端領域は若干グリコシル化されているが
、システインに富む。システイン残基は、ムチン単量体内およびムチン単量体間のジスル
フィド結合の確立に参加する。大きい中心領域が、１０～８０残基の配列の複数の縦列反
復配列から形成され、そのアミノ酸の半分までがセリンまたはスレオニンである。この区
画は、ほぼＯ結合型オリゴサッカリドで飽和する。ムチンタンパク質（例えば、ＭＵＣ１
）の過剰発現は多くの種類のがんに関連する。本開示の文脈において、「ムチン」はまた
、「ムチン調製物」または「ムチンを含有する粘液または他の調製物」も意味し得る。
治療
本明細書で使用される「治療」、「治療する」などの用語は、疾患または状態、例えば
ＰＫＵまたはＴ１Ｄの特徴的な症状または外徴を改善しまたは軽減することを意味する。
例えば、Ｔ１Ｄの治療は、対象において抗原特異的免疫寛容の回復または誘導を結果とし
てもたらし得る。他の例では、治療は、自己免疫糖尿病を阻止すること、または自己免疫
糖尿病を後退させることを意味する。本明細書で使用される場合、これらの用語はまた、
疾患もしくは状態または疾患もしくは状態に関連する症状の発症を予防しまたは遅延させ
ることを包含し、これには、疾患もしくは状態の重篤度または前記疾患もしくは状態に罹
患する前にそれに関連する症状を低減させることが含まれる。罹患前のそのような予防ま
たは低減は、投与の時点で疾患または状態に罹患していない患者に本開示の微生物（例え
ば、細菌）または組成物を投与することを指す。「予防する」はまた、例えば、改善期間
後の、疾患もしくは状態またはそれに関連する症状の再発を予防することまたはぶり返し
の防止を包含する。
「それを必要とする」対象の治療は、対象が疾患または状態を有し、本発明の治療方法
が特定の疾患または状態を治療する意図的な目的で行われることを表す。
治療有効量
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、望ましい治療レジメンにし
たがって投与された時に所望の治療効果または反応を誘発する本開示の非病原微生物また
は組成物の量を指す。一部の例では、化合物または組成物は、１日あたり１回または複数
回投与された時に治療有効量と同等の活性成分の量を含有する単位剤形、例えば錠剤また
はカプセル剤として提供される。
所望の治療効果（例えば、Ｔ１Ｄの効果的な治療のため）を達成するために必要とされ
る組換え微生物の治療有効量は、例えば、微生物によって発現されるポリペプチドの性質
、投与経路、ならびにレシピエントの年齢、体重、および他の特徴に応じて変化すること
を当業者は理解するであろう。
分泌されるポリペプチドの量は、Ｑ－ＰＣＲなどの先端的な方法によって、またはＥＬ
ＩＳＡを使用することによって、ｃｆｕに基づいて決定することができる。例えば、特定
の微生物は、１０９ｃｆｕあたり少なくとも約１ｎｇ～約１μｇの活性ポリペプチドを分
泌し得る。それに基づいて、当業者は、他のｃｆｕ用量で分泌される抗原ポリペプチドの
範囲を算出することができる。
治療有効量は、本明細書に記載される任意の投薬レジメンとの関連で投与することがで
きる。活性ポリペプチドの１日の用量は、１日全体を通じて１、２、３、４、５、または
６の部分で投与されてもよい。さらに、１日の用量は、投与期間の間の任意の回数の休息
期間と共に、任意の日数にわたって投与されてもよい。例えば、約０．０１～約３．０Ｍ
ＩＵ／日／対象の活性剤（例えば、インターロイキン）の用量を計６週にわたって１日
毎に投与することができる。他の例では、ＰＡＬは、１日あたり０．１～１０００ｍｇに
及ぶ用量、例えば各食事時に１～１００ｍｇの用量で、投与される。
Ｔ１Ｄ特異的抗原
一部の実施形態では、上記組成物および方法のいずれかにおいて、Ｔ１Ｄ特異的抗原は
、Ｔ１Ｄで実行される公知の自家抗原から選択され、プロインスリン（ＰＩＮＳ）；イン
スリン（ＩＮＳ）；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（例えば、ＧＡＤ６５、
ＧＡＤ６７、またはＧＡＤ２）；インスリノーマ関連タンパク質２（膵島抗原－２；ＩＡ
－２）（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体型Ｎ（ＰＴＰＲＮ）、チロシンホスフ
ァターゼ様タンパク質、またはＩＣＡ５１２とも称される）、（例えば、Long et al., D
iabetes 2013, 62 (6), 2067-2071を参照）；膵島特異的グルコース－６－ホスファター
ゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８
）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペ
リフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（例えば、ＧＲＰ７８）（例えば、
Rondas et al., Diabetes 2015; 64(2):573-586、およびYe et al., Diabetes 2010, 59(
1):6-16を参照）、およびこれらの抗原の２つまたはそれより多くの組合せが挙げられる
。他の実施形態では、上記組成物および方法において、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、ＰＩＮＳ、
ＧＡＤ６５、またはＩＡ－２である。他の実施形態では、上記組成物および方法において
、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、ＰＩＮＳである。様々な実施形態では、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、全
長（例えば、野生型）遺伝子より短いバリアント核酸配列によってコードされ、そのため
、「切除」型は、多くの場合に、使用される微生物（例えば、ラクトコッカス・ラクチス
（Lactococcus lactis））によってより効率的に発現および／または分泌される。分泌は
より効率的であるが、多くの「切除」型は、それらの生物学的活性の全て（または実質的
部分）を保持し、例えば、充分なＴｒｅｇ刺激および／または寛容誘導能力を保持する。
微生物
本明細書に提示する実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物は非病原性微生物
、例えば、非病原性および非浸潤性細菌である。他の実施形態では、微生物は、非病原性
かつ非浸潤性の酵母である。
一部の実施形態では、微生物は、サッカロミセス（Saccharomyces）種、ハンセヌラ（H
ansenula）種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種、シゾサッカロミセス（Schizzosa
ccharomyces）種、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種、ピキア（Pichia）種、
モナスカス（Monascus）種、ゲオトリクム（Geothchum）種およびヤロウィア（Yarrowia
）種からなる群から選択される酵母株である。一部の実施形態では、酵母は、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。他の実施形態では、Ｓ．セレビ
シエ（S. cerevisiae）は、亜種ブラウディ（boulardii）である。本発明の一実施形態で
は、組換え酵母宿主ベクター系は、生物学的に封じ込められた系である。生物学的封じ込
めは当業者に公知であり、例えば、ｔｈｙＡ変異などの自殺性の栄養要求性変異、または
その同等物といった、栄養要求性変異の導入により実現することができる。あるいは、例
えば、数世代後に失われる不安定なエピソーム構築物を使用することなどによって、ポリ
ペプチドをコードする遺伝子を持つプラスミドのレベルで生物学的封じ込めを実現するこ
とができる。所望の場合、プラスミドの不安定性および栄養要求性などのいくつものレベ
ルの封じ込めを組み合わせて、高レベルの封じ込めを確実にすることができる。
本発明の他の実施形態では、微生物は、非病原性細菌（例えば、食品グレードの細菌株
）などの細菌である。一部の例では、非病原性細菌は、グラム陽性菌、例えば、グラム陽
性の食品グレードの細菌株である。一部の実施形態では、グラム陽性の食品グレードの細
菌株は、乳酸発酵性の細菌株（すなわち、乳酸菌（ＬＡＢ））またはビフィドバクテリウ
ム（Bifidobacterium）である。
一部の実施形態では、乳酸発酵性の細菌株は、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラク
トバチルス（Lactobacillus）またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の種であ
る。本明細書で使用される場合、ラクトコッカス（Lactococcus）またはラクトバチルス
（Lactobacillus）は、特定の種または亜種に限定されないが、ラクトコッカス（Lactoco
ccus）またはラクトバチルス（Lactobacillus）の種または亜種のいずれかを含むことを
意図する。例示的なラクトコッカス（Lactococcus）種としては、ラクトコッカス・ガル
ビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラ
クトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（L
actococcus plantarum）、およびラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raff
inolactis）が挙げられる。一部の例では、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lac
tis）は、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremo
ris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordnia
e）、またはラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lacti
s）である。
例示的なラクトバチルス（Lactobacillus）種としては、ラクトバチルス・アセトトレ
ランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobaci
llus acidophilus）、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチ
ルス・アルジダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lac
tobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミロリチカス（Lactobacillus amyloly
ticus）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチ
ルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lact
obacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラ
クトバチルス・アビアリウス亜種ラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffi
nosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius su
bsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリカス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバ
チルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、
ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニ
ス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラク
トバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラク
トバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス
・カゼイ亜種シュードプランタラム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、
ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラ
クトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラク
トバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロ
ビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacill
us collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバ
チルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフ
ォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、
ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis sub
sp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクト
バチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種ク
ルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜
種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デル
ブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種
ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デ
ルブルエッキー亜種デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subs
p. lactis）、ラクトバチルス・ジベルゲンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチ
ルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・フェルメンタム
（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus forni
calis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクト
バチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナラム（L
actobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラク
トバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス
（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamste
ri）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・
ヘテロヒオキー（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルジー（Lac
tobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキー（Lactobacillus homohiochii
）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスチ
ナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニー（Lactobacillu
s jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバ
チルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobac
illus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofa
ciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバ
チルス・クンキー（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacill
us lactis）、ラクトバチルス・ライヒマンニー（Lactobacillus leichmannii）、ラクト
バチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレフェルメンタ
ンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）
、ラクトバチルス・マルタロミカス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・
マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・ミノル（Lactob
acillus minor）、ラクトバチルス・ミヌタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチル
ス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus m
urinus）、ラクトバチルス・ナゲリー（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オ
リス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラク
トバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼ
イ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactoba
cillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（L
actobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobac
illus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paraliment
arius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクト
バチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lact
obacillus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラ
クトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス
（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラ
クトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lac
tobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバ
チルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus
sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus
）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクト
バチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス
亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・
サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラク
トバチルス・サンフランシスセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチ
ルス・シャルペエ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobac
illus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクト
バチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Lactoba
cillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、
ラクトバチルス・ビリデスセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビ
ツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus x
ylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラク
トバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）
、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashie
nsis subsp. yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフ
ィドバクテリウム・アドレスセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバク
テリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフ
ィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium
breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビ
フィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、およびビフィドバクテリウ
ム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）が挙げられる。一部の例では、ＬＡＢ
は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）である。
さらなる例では、細菌は、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis
）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカ
ス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium
）、エンテロコッカス・カッカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリ
エ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus can
intestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・
カセリフラバス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Entero
coccus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテ
ロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラ
ムメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパル（Enterococcus
dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス
・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enter
ococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテ
ロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルバス（E
nterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemopero
xidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エン
テロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリカス（Entero
coccus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコ
ッカス・レマニー（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラタス（Entero
coccus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis
）、エンテロコッカス・ムンドチー（Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・オリ
バエ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）
、エンテロコッカス・フォエニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エンテロコ
ッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウ
ム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus q
uebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテ
ロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボラム（Enteroco
ccus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロコッカス
・サッカロリチカス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアカ
ス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus soli
tarius）、エンテロコッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッ
カス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランジカス（Ent
erococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチカス（Enterococcus ureasit
icus）、エンテロコッカス・ウレイリチカス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコ
ッカス・ビーキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロラム（
Enterococcus villorum）、およびエンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococ
cus xiangfangensis）からなる群から選択される。
さらなる例では、細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalac
tiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプト
コッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococc
us canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ス
トレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカ
ス・エクイナス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococc
us iniae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、
ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス
（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、
ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサ
ングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Strepto
coccus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、
ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、スト
レプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッテ
ィ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus saliv
arius）、ストレプトコッカス・チグリナス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコ
ッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サング
イニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus
sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカ
ス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Strept
ococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）
、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）から
なる群から選択される。
本発明の特定の態様では、グラム陽性の食品グレードの細菌株は、ラクトコッカス・ラ
クチス（Lactococcus lactis）、または、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（La
ctococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lact
ococcus lactis subsp. hordniae）、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（La
ctococcus lactis subsp. lactis）などのその亜種のいずれかである。本発明の別の態様
では、組換えグラム陽性菌株は、乳中での正常な増殖および酸産生の能力を喪失した、プ
ラスミドなしのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３などの
、生物学的に封じ込められた系（Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154:1-9）；また
はスレオニンおよびピリミジン栄養要求株誘導Ｌ．ラクチス（L. lactis）株（Sorensen
et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258、Glenting et al. (2002) 68:
5051-5056）である。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、細菌は大腸菌（E. coli）ではない。
本発明の一実施形態では、組換え細菌宿主ベクター系は、生物学的に封じ込められた系
である。生物学的封じ込めは当業者に公知であり、栄養要求性変異、例えばｔｈｙＡ変異
などの自殺性の栄養要求性変異、またはその同等物の導入によって実現することができる
。あるいは、生物学的封じ込めは、例えば、数世代後に失われる不安定なエピソーム構築
物を使用することなどによって、ポリペプチドをコードする遺伝子を持つプラスミドのレ
ベルで実現することができる。所望の場合、プラスミドの不安定性および栄養要求性など
のいくつものレベルの封じ込めを組み合わせて、高レベルの封じ込めを確実にすることが
できる。
結合および付着分子
「結合」および「付着」という用語は、本明細書において概ね同義である。結合／付着
は、哺乳動物細胞および／または生物学的表面（粘液、フィブロネクチン、コラーゲンな
ど）もしくは他の非生物表面を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを通じて、および、例えば
、定着、残存の測定を通じて、または生物学的効果によって暗示されるようにｉｎ ｖｉ
ｖｏで、評価することができる。
そのような結合／付着は、典型的に、標的とする分子、細胞、または部位に特異的であ
る。生物は、他の細胞、非生物の物体、および粘液などの細胞産物への結合および付着を
促進する多様な分子（多くの場合、ポリペプチド、糖タンパク質および炭水化物）を産生
し得る。結合および付着を促進するそのような分子は、標的分子（典型的には、別のタン
パク質、糖タンパク質または炭水化物）への様々な程度の特異性を有する。異なる結合分
子の発現は、異なる生物学的表面への優先的な結合に繋がる。例えば、ＧＩ管の異なる細
胞は異なる表面分子を発現し、特定の表面分子の頻度はＧＩ管に沿って異なることがある
。したがって、細菌細胞は、特定の宿主細胞、またはＧＩ管の特定の領域に優先的に結合
することができる。結合は、増加した定着、標的部位での標的タンパク質の送達、増加し
たＧＩ通過時間などに関連し得る。反対に、ＧＩ管の１つの部位への結合は、ＧＩの別の
部位への低減した結合に関連し得る。
細菌結合タンパク質の天然のバリエーションは、変異によって、および、他の生物由来
のものなどの他の結合分子からのモチーフを発現させる組換えによって、補足することが
できる。そのような組換え結合タンパク質は、単独で、または単一分子において複数の結
合特異性を提供する融合タンパク質として、発現させることができる。
タンパク質が細菌を生物学的表面に結合させるために、結合ポリペプチドは典型的に細
胞質から輸送され、細菌の表面にアンカーされる。ラクトコッカス（Lactococcus）など
のグラム陽性菌では、付着分子は典型的に、（ａ）細胞膜を通じた分泌を導くＮ末端分泌
シグナル、および（ｂ）ポリペプチドを細胞壁にアンカーさせるＣ末端アンカー性ドメイ
ン（すなわち、「細胞壁アンカー性ドメイン」）を有して発現される。アンカー性ドメイ
ンが無い場合、ポリペプチドは細胞外環境に放出される。
例えば、トレフォイル因子（ＴＦＦ）は、動物細胞によって分泌され、粘液に結合し、
粘液膜の治癒などのいくつかの生物学的効果を有する。細菌性分泌シグナルをＴＦＦに組
換えによって加えることによって、ＴＦＦを細胞外環境に分泌させて粘液膜の治癒を促進
するように細菌を操作することができる。細菌はまた、分泌シグナルおよびアンカーシグ
ナルの両方をＴＦＦに加えることによって、粘液結合特性を有するように操作することも
できる。
細胞付着ポリペプチド
本開示の一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、細胞付着ポリペプチドを含
有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する。細胞付着特性、例えば、腸細
胞またはその細胞株（例えば、Ｃａｃｏ－２、ＩＥＣ－１８、またはＨＴ２９－ＭＴＸ細
胞）への結合性を呈する任意のポリペプチドが本開示の文脈において有用である。細胞付
着能力は、本明細書に開示されるものなどの当該技術分野で認識される方法を使用して測
定することができる。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、細胞および粘液結合プロ
テインＡ（ＣｍｂＡ）（例えば、Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681を
参照）、粘液結合タンパク質またはｍｕｂドメインタンパク質（Ｍｕｂ）（例えば、Boek
horst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280を参照）、粘液付着促進タンパク質
（ＭａｐＡ）（例えば、Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7):1
622-8を参照）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｐｂＬ）（例
えば、Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000を参照）から
選択される。一部の例では、融合タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Stap
hylococcus aureus）プロテインＡアンカー断片（ＳｐａＸ）（例えば、Steidler et al.
, Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342-5を参照）などの細胞壁アンカーペプチ
ドを含み得る。上記開示の全ては、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれ
る。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillu
s reuteri）のＣｍｂＡなどのＣｍｂＡポリペプチドである。例えば、上掲のJensen et a
l.に開示されるＡＴＣＣ ＰＴＡ６４７４を参照。
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、配列番号１に
対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少
なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有す
るＣｍｂＡポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、細胞付着ポ
リペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９
５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９
％同一の外因性核酸配列によってコードされるＣｍｂＡポリペプチドである。
ムチン結合ポリペプチド
本開示の一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、ムチン結合ポリペプチドを
含有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する。ムチン結合特性、例えば、
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのムチン調製物への結合性を呈する任意のポリペプチドが本開示の文
脈において有用である。ムチン結合能力は、本明細書に開示されるものなどの当該技術分
野で認識される方法を使用して測定することができる。例示的なムチン結合ポリペプチド
としては、トレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ま
たはＴＦＦ３）（例えば、Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570を参
照）およびＭｕｃＢＰポリペプチド（例えば、Lukic et al, Appl. Environ. Microbiol.
2012, 78(22):7993-8000を参照）が挙げられる。一部の例では、本開示は、融合タンパ
ク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌）であって、融合タンパク質が
細胞付着ポリペプチド（例えば、ＣｍｂＡポリペプチド）およびムチン結合ポリペプチド
（例えば、ＴＦＦポリペプチド）を含有する、微生物（例えば、細菌）を提供する。一部
の例では、ＴＦＦポリペプチドはヒトＴＦＦポリペプチド（例えば、ｈＴＦＦ１、ｈＴＦ
Ｆ２、またはｈＴＦＦ３）である。上記実施形態のいずれかによる他の例では、ムチン結
合ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも
９９％同一のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ３ポリペプチドである。上記実施形態のい
ずれかによる他の例では、ムチン結合ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９
０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少
なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の外因性核酸配列によってコードされるヒ
トＴＦＦ３ポリペプチドである。一部の例では、ムチン結合ポリペプチドは、魚のＴＦＦ
ポリペプチド、または両生動物のＴＦＦポリペプチドである。さらに他の例では、ムチン
結合ポリペプチドは、Fujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7):1217-1228に開示
されるものなどの、トレフォイル様ドメインを含む（またはそれからなる）。
構築物
一部の実施形態では、微生物（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lact
is）などの細菌）は、融合タンパク質および任意選択で治療用ポリペプチドを発現できる
発現ベクターを含む。例えば、融合タンパク質は、粘膜、例えば胃腸管中の粘膜に存在す
る条件下で細胞表面に露出される。微生物（例えば、細菌）は、所望のＧＩ保持を提供す
るために充分な程度で融合タンパク質が細胞表面に露出されるように融合タンパク質を発
現できる発現ベクターを含み得る。当業者は、対象に提供される微生物（例えば、細菌）
の量を調整して、所望の量の治療用ポリペプチドを送達することができる。
通常、発現システムは、例えば、宿主微生物中での配列の発現を導くことができるプロ
モーターに作動可能に連結された、少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なく
とも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。好適には、発現される融合タン
パク質は、宿主の好ましいコドン用法に適した核酸配列によってコードされ得る。構築物
は、当業者に公知なように、選択された宿主中で作動可能な、エンハンサー、転写開始配
列、シグナル配列、レポーター遺伝子、転写終結配列などの（全ての）他の好適なエレメ
ントをさらに含有してもよい。
一部の例では、構築物は、ベクター、プラスミドまたはミニ染色体などの、宿主の形質
転換のために好適な形態、および／または、宿主中で安定的に維持され得る形態である。
微生物（例えば、細菌）中に導入するための核酸を含む好適なベクターは、プロモーター
配列、ターミネーター断片、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含
む、適切な調節配列を含有するものを選択または構築することができる。ベクターは、適
宜、プラスミド、ウイルス（例えば、ファージまたはファージミド）であり得る。さらな
る詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, S
ambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press（その関連する開示は、
参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。
例えば、核酸構築物の調製、変異生成、シークエンシング、細胞中へのＤＮＡの導入お
よび遺伝子発現、およびタンパク質の解析における、核酸のマニピュレーションのための
多くの公知の技術およびプロトコールはShort Protocols in Molecular Biology, Second
Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992（その関連する開示は、参
照することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。一実施形態では、
融合タンパク質のためのコーディング配列はオペロン、すなわち、ポリシストロン性発現
用の核酸構築物中に含有される。オペロンにおいて、プロモーターからの転写は、１つよ
り多くのコーディング配列を含むｍＲＮＡを結果としてもたらし、各コーディング配列は
上流にそれ自体の好適に位置したリボソーム結合部位を有する。したがって、１つより多
くのポリペプチドを単一のｍＲＮＡから翻訳することができる。オペロンの使用は、融合
タンパク質および治療用ポリペプチドの発現が調和することを可能とする。細菌宿主細胞
におけるポリシストロン性発現システムは、例えば、Vanden-Broucke et al.の米国特許
出願第２０１４／０１０５８６３号明細書（参照することによりその全体が本明細書に組
み込まれる）に記載されている。
一実施形態では、本発明は、安定的にトランスフェクトされた微生物（例えば、細菌）
に関する。一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸が宿主細胞
の染色体に組み込まれた微生物（例えば、細菌）を提供する。安定的にトランスフェクト
された微生物を確立するための技術は当該技術分野において公知である。例えば、融合タ
ンパク質をコードする核酸を相同組換えを介して宿主の染色体中にクローニングすること
ができる。一部の例では、宿主の必須遺伝子は、遺伝子の欠失などの相同組換え事象、必
須遺伝子によってコードされたタンパク質の不活性型を生じるか、または必須遺伝子によ
ってコードされたタンパク質の切断型を結果としてもたらすフレームシフト変異を生じる
１つまたは複数のアミノ酸置換によって破壊される。一実施形態では、必須遺伝子は、ｔ
ｈｙＡ遺伝子である。例示的な技術は、例えば、国際公開第０２／０９０５５１号パンフ
レット（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。形
質転換用プラスミドは、破壊される必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子を補完できないも
のである限り、任意のプラスミドであってよい。プラスミドは自己複製性であってよく、
１つまたは複数の目的の遺伝子を持ってよく、かつ１つまたは複数の耐性マーカーを持っ
てよい。一部の例では、プラスミドは組込み型プラスミド（すなわち、組込みプラスミド
）である。そのような組込みプラスミドを使用して、必須遺伝子の遺伝子座、例えばｔｈ
ｙＡ部位での組込みを引き起こし、それによって必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子の機
能を破壊することによって、必須遺伝子を破壊することができる。一部の例では、ｔｈｙ
Ａ遺伝子などの必須遺伝子は、ｔｈｙＡ標的部位などの必須遺伝子への挿入を標的化する
標的化配列が隣接した、目的の遺伝子（単数または複数）を含むカセットによる二重相同
組換えによって置換される。これらの標的化配列は、標的部位中への目的の遺伝子の組込
みを可能とするために充分に長くかつ充分に相同的であることが理解されるであろう。
融合タンパク質をコードする遺伝子構築物は、宿主細胞中の染色体外に存在して、例え
ば、自身の複製起点を使用して自律的に複製してもよく、または、微生物のゲノムＤＮＡ
、例えば、細菌または酵母の染色体、例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）の染色体
に組み込まれていてもよい。後者の場合、核酸の単一コピーまたは複数コピーを組み込む
ことができ、組込みは、染色体のランダムな部位において、または、上記の通り、その予
め定められた部位、ラクトコッカス（Lactococcus）（例えば、ラクトコッカス・ラクチ
ス（Lactococcus lactis））のｔｈｙＡ遺伝子座中などで起こり得る。
それ故、一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする遺伝子構築物は、宿主細胞
の染色体への遺伝子構築物の挿入をもたらすように構成された配列をさらに含み得る。一
部の例では、微生物ゲノム、例えば宿主細胞の染色体内の特定の部位への遺伝子構築物の
挿入は、相同組換えによって促進され得る。例えば、本開示の遺伝子構築物は、宿主細胞
の染色体内の組込みの部位に相同な１つまたは複数の領域を含み得る。染色体の部位の配
列は、天然のもの、すなわち、天然に存在するものであってもよいし、または、先行する
遺伝子操作によって導入された外因性配列であってもよい。
一部の例では、相同性の領域は、少なくとも５０塩基対（ｂｐ）、１００ｂｐ、２００
ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ ７００ｂｐ、８００ｂｐ、９
００ｂｐ、１０００ｂｐ、またはそれより大きいものであり得る。
一例では、遺伝子構築物中に存在する関連する発現ユニットのそれぞれの端部に隣接し
た、相同な２つの領域を含めることができる。そのような構成は、有利なことに、関連配
列を宿主細胞に挿入し得る。特に細菌宿主中における相同組換え、および組換え体を選択
する方法は、当該技術分野において一般に公知である。
例えばプロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションなどの、微生物の形質転
換法は当業者に公知である。
高度な発現は、相同的発現および／または微生物、例えばラクトコッカス・ラクチス（
Lactococcus lactis）中に存在する発現ベクター上の分泌シグナルを使用することによっ
て達成することができる。発現シグナルは当業者に明らかであろう。発現ベクターは、そ
れが組み込まれる微生物に応じて発現について最適化することができる。例えば、ラクト
コッカス（Lactococcus）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、カゼ
イ（casei）およびプランタルム（plantarum）において充分なレベルの発現を与えた特定
の発現ベクターが公知である。さらに、非病原性、非定着性、非浸潤性の食品グレードの
細菌ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）における異種抗原の発現用に開発
されたシステムが公知である（英国特許第２２７８３５８号明細書（参照することにより
本明細書に組み込まれる）を参照）。一部の例では、本開示の構築物は、融合タンパク質
をコードするヌクレオチド配列が組み込まれた、ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（国際公
開第９６／３２４８７号パンフレット）に記載された複数コピーの発現ベクターを含む。
そのような構築物は、高レベルの発現での乳酸菌、特にラクトバチルス（Lactobacillus
）における所望のポリペプチドの発現のために特に好適であり、そしてまた、発現産物を
細菌細胞の表面に導くためにも使用することができる。（例えば、ＰＣＴ／ＮＬ９５／０
０１３５の）構築物は、融合タンパク質をコードする核酸配列に先行して、リボソーム認
識およびＲＮＡ安定化のために必要とされる最小配列を少なくとも含む５’非翻訳核酸配
列が存在することを特徴とし得る。これに翻訳開始コドンが後続することができ、該翻訳
開始コドンに（直ちに）、乳酸菌の遺伝子の翻訳される核酸配列の５’末端部分の少なく
とも５つのコドンの断片または該断片の構造的もしくは機能的同等物が後続してもよい。
断片はまた、プロモーターによって制御されてもよい。ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（
それに開示された様々な実施形態を含む）および本明細書で言及された全ての他の文献の
内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の一態様は、宿主における
異種遺伝子の高レベルの調節された発現および発現の分泌への連結を可能とする方法を提
供する。別の実施形態では、国際公開第９３／１７１１７号パンフレット（参照すること
により本明細書に組み込まれる）にしたがって強力な発現システムを開発するためにＴ７
バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼおよびその同族プロモーターが使用される。一実
施形態では、発現プラスミドは、ｐＴ１ ＮＸに由来する。
一部の実施形態では、本開示にしたがって用いられるプロモーターは、細菌中で構成的
に発現される。構成的プロモーターの使用は、発現を起こすために誘導剤または他の調節
シグナルを供給する必要性を回避する。例えば、プロモーターは、たとえ増殖が維持され
なくても、細菌宿主細胞が生存可能なままである、すなわち、一部の代謝活性を保持する
レベルでの発現を導く。有利なことに、そのような発現は低いレベルであってもよい。例
えば、発現産物が細胞内に蓄積する場合、発現のレベルは、細胞内タンパク質の約１０％
未満、または約５％もしくは約５％未満、例えば約１～３％での発現産物の蓄積に繋がり
得る。プロモーターは、用いられる細菌に同属的、すなわち、天然でその細菌中に見られ
るものであり得る。例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）のプロモーターをラクトコ
ッカス（Lactococcus）において使用することができる。ラクトコッカス・ラクチス（Lac
tococcus lactis）（または他のラクトコッカス（Lactococcus）属細菌）において使用す
るための例示的なプロモーターは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の
染色体に由来する「Ｐ１」である（Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W, et
al. (1995). “The isolation of lactococcal promoters and their use in investigat
ing bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis” Gene 165(1):9-15）。
プロモーターの別の例は、ｕｓｐ４５プロモーターである。他の有用なプロモーターは、
Ｓｔｅｉｄｌｅｒらの米国特許第８，７５９，０８８号明細書、およびＶａｎｄｅｎｂｒ
ｏｕｃｋｅらの米国特許出願第２０１４／０１０５８６３号明細書（これらの開示は、参
照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
核酸構築物（単数または複数）は、分泌シグナル配列を含み得る。したがって、一部の
実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、シグナル配列をコードする
核酸配列をポリペプチドをコードする核酸配列に適切に連結することによって、ポリペプ
チドの分泌を提供し得る。抗原を分泌するための核酸を宿す細菌の能力は、該生物の生存
能力を維持する培養条件においてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。例示的な分
泌シグナル配列としては、バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）お
よびラクトバチルス（Lactobacillus）などのグラム陽性生物中で活性を有する任意の分
泌シグナル配列が挙げられる。そのような配列は、バチルス・アミロリケファシエンス（
Bacillus amyloliquefaciens）のα－アミラーゼ分泌リーダー、またはスタフィロコッカ
ス（Staphylococcus）の一部の株によって分泌され、グラム陽性およびグラム陰性の両方
の宿主において機能することが公知のスタフィロキナーゼ酵素の分泌リーダー（“Gene E
xpression Using Bacillus,” Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1:2
1-27を参照）、あるいは多数の他のバチルス（Bacillus）酵素またはＳ層タンパク質から
のリーダー配列（pp 341-344 of Harwood and Cutting, “Molecular Biological Method
s for Bacillus,” John Wiley & Co. 1990を参照）を含み得る。一実施形態では、前記
分泌シグナルは、ｕｓｐ４５に由来する（Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 199
3, 240:428-434）。一部の実施形態では、融合タンパク質は、構成的に分泌される。
配合物およびレジメン
本開示の方法では、複数の治療用ポリペプチドが同じまたは異なる微生物によって発現
され得る。例えば、（ａ）ＰＡＬおよびアミノ酸デカルボキシラーゼ；（ｂ）ＰＩＮＳな
どのＴ１Ｄ特異的抗原およびＩＬ－２またはＩＬ－１０などのＴｒｅｇ活性化サイトカイ
ン、（ｃ）グルテン抗原およびＩＬ－２またはＩＬ－１０、などである。別の生物中で発
現される場合、一方または好ましくは両方の細菌は、ムチンおよび／または細胞結合因子
を発現する。２つのポリペプチドが異なる微生物によって発現される場合、それらは同じ
（例えば、合わせた）配合物中で対象に投与されてもよいし、または、別の（例えば、異
なる）配合物中で対象に投与されもよい。別の配合物は同時にまたは異なる時点に投与す
ることができる。例えば、各々の配合物中での第１および第２の治療用ポリペプチド産生
微生物の使用は、同時に対象に施されてもよいし、または、逐次的に、例えば、両者の間
の休息期間と共に、施されてもよい。
一部の実施形態では、第１および第２の治療用ポリペプチド産生微生物は同時に投与さ
れる。これらの実施形態による一部の例では、第１の治療用ポリペプチドの微生物、およ
び第２の治療用ポリペプチドの微生物は、同じ医薬配合物中に含まれ、または同時に用い
られる１つより多くの医薬配合物中に含まれる。一部の実施形態では、２つの生物活性ポ
リペプチドは、ＩＬ－２およびＴ１Ｄ特異的抗原の両方を産生する微生物を使用して対象
に送達される。
一部の実施形態では、微生物は、例えば経口配合物を使用して、１日１回、２回、３回
、４回、５回、または６回投与される。一部の実施形態では、微生物は、毎日、２日毎、
週に１回、週に２回、週に３回、または週に４回投与される。他の実施形態では、治療は
、２週毎に１回行われる。他の実施形態では、治療は、３週毎に１回行われる。他の実施
形態では、治療は、月に１回行われる。
方法の治療サイクルの継続時間は、例えば、疾患の治療もしくは後退、または再発の予
防のための必要に応じて、７日から対象の生涯までである。一部の実施形態では、治療サ
イクルは、約３０日から約２年にわたって続く。他の実施形態では、対象は、３０日から
１．５年続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１年続く治
療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１１カ月続く治療サイクル
を有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１０カ月続く治療サイクルを有する。
他の実施形態では、対象は、３０日から９カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態
では、対象は、３０日から８カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は
、３０日から７カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から
６カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から５カ月続く治
療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から４カ月続く治療サイクルを
有する。他の実施形態では、対象は、３０日から３カ月続く治療サイクルを有する。他の
実施形態では、対象は、３０日から２カ月続く治療サイクルを有する。
連日の維持投与を対象において臨床的に望ましい期間にわたって与えてもよく、該期間
は、例えば、１日から数年まで（例えば、対象の残りの生涯全体にわたって）、例えば約
（２、３もしくは５日、１もしくは２週、または１カ月）以上かつ／または例えば約（５
年、１年、６カ月、１カ月、１週、または３もしくは５日）までである。約３日～約５日
または約１週～約１年にわたる連日の維持用量の投与が典型的である。治療効果が観察さ
れるまで、単位用量を例えば１日２回から２週毎に１回まで投与することができる。
第１および第２の治療用ポリペプチドを産生する微生物は、疾患の治療のために単剤療
法または併用療法で送達され得る。一部の実施形態では、本開示の組成物は、追加の治療
活性剤を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物、および対象の治療は、他の活性成
分を伴わず、例えば、抗体（例えば、Ｔ１Ｄの治療用の抗ＣＤ３）などの追加の免疫調節
物質を伴わない。したがって、一部の例では、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載さ
れる微生物（治療的なＩＬ－２および抗原ポリペプチドを発現する）、および薬学的に許
容される担体から本質的になる。
医薬組成物および担体
微生物（例えば、本明細書に記載される細菌または酵母）は、純粋形態、他の活性成分
との組合せ、および／または薬学的に許容される（すなわち、非毒性の）添加剤または担
体との組合せで投与することができる。「薬学的に許容される」という用語は、その当該
技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用され、医薬組成物の他の成分と適
合し、かつそのレシピエントにとって有害でない担体を指す。
本発明の組成物は、粘膜への微生物（例えば、細菌）の全身性送達の提供における使用
のために好適な任意の公知またはその他の効果的な投与量または製品形態に調製すること
ができ、該製品形態には医薬組成物および剤形の他に栄養製品形態が含まれる。
一部の実施形態では、配合物は、経口配合物または医薬組成物である。この実施形態に
よる一部の例では、配合物または医薬組成物は、任意選択で他の乾燥担体と組み合わせて
、乾燥粉末形態（例えば、凍結乾燥形態）またはその圧縮形態で非病原微生物を含む。経
口配合物は、通常、不活性希釈担体または食用担体を含む。
一部の例では、経口配合物は、コーティングを含むか、またはカプセル化戦略を利用し
、これは腸管中への配合物の送達を促進し、かつ／または微生物が腸管（例えば、回腸、
小腸、または結腸）中で放出および含水されることを可能とする。微生物が配合物から放
出され、充分に含水すると、微生物は、生物活性ポリペプチドの発現を開始し、それはそ
の後に周囲環境中に放出されるか、または微生物の表面上に発現される。そのようなコー
ティングおよびカプセル化戦略（すなわち、遅延放出戦略）は当業者に公知である。例え
ば、米国特許第５，９７２，６８５号明細書、国際公開第２０００／１８３７７号パンフ
レット、および国際公開第２０００／２２９０９号パンフレット（これらの開示は、参照
することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
一部の実施形態では、本開示は、デキストラン、グルタミン酸ナトリウム、およびポリ
オールなどの他の成分との組合せであってもよい、凍結乾燥（lyophilized）または凍結
乾燥（freeze dried）形態の微生物（例えば、非病原性細菌）を含む医薬組成物を提供す
る。例示的な凍結乾燥組成物は、例えば、Ｃｏｒｖｅｌｅｙｎらの米国特許出願第２０１
２／００３９８５３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組
み込まれる）に記載されている。例示的な配合物は、凍結乾燥された細菌（例えば、治療
有効量の細菌）および薬学的に許容される担体を含む。凍結乾燥された細菌は、カプセル
剤、錠剤、顆粒剤および散剤の形態に調製することができ、これらのそれぞれは経口的に
投与され得る。あるいは、凍結乾燥された細菌は、好適な媒体中の水性または油性懸濁液
として調製されてもよいし、または凍結乾燥された細菌は、使用の直前に飲料などの好適
な媒体中に懸濁されてもよい。
経口投与の場合、配合物は、胃耐性経口剤形であり得る。例えば、経口剤形（例えば、
カプセル剤、錠剤、ペレット、マイクロペレット、顆粒剤など）は、胃での溶解または破
壊に耐性であるが腸内では耐性でないことによって、胃を通過して腸（例えば、小腸また
は結腸）での分解、溶解および吸収に有利に働くことを可能とする添加剤（通常、ポリマ
ー、セルロース誘導体および／または親油性材料）の薄層でコーティングすることができ
る。一部の例では、経口配合物は、微生物の制御放出、持続放出、または長期放出を提供
することによって、微生物中でコードされた所望のタンパク質の制御放出を提供する化合
物を含み得る。これらの剤形（例えば、錠剤またはカプセル剤）は、典型的に、親油性、
ポリマー性、セルロース系、不溶性、膨潤性の添加剤などの、従来周知の添加剤を含有す
る。制御放出性配合物はまた、腸、結腸などの任意の他の送達部位、生体接着または舌下
送達（すなわち、歯科粘膜送達）および気管支送達のために使用することもできる。本発
明の組成物が直腸内または経膣的に投与される場合、医薬配合物は、坐剤およびクリーム
を含み得る。この場合、宿主細胞は、脂質も含む一般的な添加剤の混合物中に懸濁される
。上述の配合物のそれぞれは当該技術分野において周知であり、例えば以下の参照文献に
記載されている：Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delive
ry systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, (Novel drug delivery
system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J.
Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic
specific delivery, Int. J. Pharm. 108:77-83)。
一部の実施形態では、経口配合物は、微生物によって発現される生物活性ポリペプチド
の粘膜送達および／または粘膜吸収を増進できる化合物を含む。他の例では、配合物は、
配合物内、かつ／または放出されてからの微生物の生存能力を増進させる化合物を含む。
本発明の細菌は、治療すべき疾患を有するヒトまたは動物に投与するための医薬配合物
中に懸濁することができる。そのような医薬配合物は、生きたグラム陽性菌および投与の
ために好適な媒体を含むがこれらに限定されない。細菌は、ラクトース、他の糖、ステア
リン酸、炭酸および／または硫酸のアルカリおよび／またはアルカリ土類塩（例えば、ス
テアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、
香料および芳香剤などの一般的な添加剤の存在下で凍結乾燥することができる。そのよう
に凍結乾燥された細菌は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤および散剤（例えば、マウスウォッ
シュ粉末）の形態に調製することができ、これらのそれぞれを経口経路で投与することが
できる。あるいは、一部のグラム陽性菌は、好適な媒体中の水性懸濁液として調製されて
もよいし、または凍結乾燥された細菌は、本明細書で言及される添加剤およびグルコース
、グリシンおよびサッカリン酸ナトリウムなどの他の添加剤を含む媒体などの、好適な媒
体中に使用の直前に懸濁されてもよい。
一部の例では、微生物は、任意の好適な方法を使用して対象の胃腸管に局所的に送達さ
れる。例えば、ミクロスフェア送達システムを用いて腸への送達を増進させることができ
る。ミクロスフェア送達システムは、対象の胃腸管での局所放出を提供するコーティング
を有するマイクロ粒子を含む（例えば、腸溶性コーティング配合物および結腸用配合物な
どの制御放出性配合物）。
経口投与の場合、胃耐性経口剤形を配合することができ、該剤形はまた、グラム陽性菌
の制御放出を提供することによって該細菌中でコードされた所望のタンパク質（例えば、
ＩＬ－２）の制御放出を提供する化合物も含むことができる。例えば、経口剤形（カプセ
ル剤、錠剤、ペレット、顆粒剤、散剤など）は、胃での溶解または破壊に耐性であるが腸
内では耐性でないことによって、胃を通過して腸での分解、溶解および吸収に有利に働く
ことを可能とする添加剤（例えば、ポリマー、セルロース誘導体および／または親油性材
料）の薄層でコーティングすることができる。
経口剤形は、グラム陽性菌および産生される外因性タンパク質の徐放を可能とするよう
に、例えば、制御放出、持続放出、長期放出、持効性の錠剤またはカプセル剤として設計
することができる。これらの剤形は、通常、親油性、ポリマー性、セルロース系、不溶性
、膨潤性の添加剤などの、従来周知の添加剤を含有する。そのような配合物は当該技術分
野において周知であり、例えば以下の参照文献に記載されている：Hansel et al., Pharm
aceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilki
ns, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker; Presco
tt et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; and Gazzaniga et al., Int.
J. Pharm. 108: 77-83 (1994)。
医薬剤形（例えば、カプセル剤）は、胃液耐性を得るためならびに回腸終末部および結
腸での意図する送達（そこでポリマーはｐＨ ６．５で溶解する）のために、ｐＨ依存性
のオイドラギットポリマーでコーティングされる。他のオイドラギットポリマーまたはポ
リマー間の異なる比を使用することによって、遅延放出プロファイルを調整し、例えば十
二指腸または空腸で細菌を放出することができる。
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含有する。好適な添加剤、
希釈剤、および担体の非限定的な例としては、防腐剤、無機塩、酸、塩基、緩衝剤、栄養
分、ビタミン、デンプン、糖、マンニトール、およびケイ酸誘導体などの充填剤および増
量剤；カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチ
ン、およびポリビニルピロリドン（polyvinyl pyrolidone）などの結合剤；グリセロール
などの保湿剤／炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの
溶解遅延剤；第４級アンモニウム化合物などの再吸収促進剤；アセチルアルコール、モノ
ステアリン酸グリセロールなどの表面活性剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着性
担体；プロピレングリコールおよびエチルアルコールなどの担体、ならびにタルク、カル
シウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および固体ポリエチルグリコール
が挙げられる。
薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含め
ることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、
または類似の性質の化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカント
ゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの添加剤、アルギン酸
、プリモゲル、またはコーンスターチなどの分散剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑
沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；
あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジの香味物質などの香味剤。投
薬単位形態がカプセル剤である場合、投薬単位形態は、上記種類の材料に加えて、脂肪油
などの液体担体を含有することができる。加えて、投薬単位形態は、投薬単位の物理形態
を修飾する様々な他の材料、例えば、糖衣、シェラック、または腸溶剤を含有することが
できる。さらに、シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてスクロースおよびあ
る特定の防腐剤、色素、着色剤、および香味物質を含有してもよい。薬学的に許容される
担体の形態および特徴は、それと組み合わせる活性成分の量、投与経路および他の周知の
変数によって定められることが理解されるであろう。担体は、配合物の他の成分と適合し
、かつそのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容される」ものでなければ
ならない。
投与用の代替的な調製物としては、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液、および
エマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、アルコール、プ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン
酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、アルコールと水との混合
物、緩衝化媒体、および食塩水が挙げられる。静脈内賦形剤としては、リンゲルのデキス
トロースに基づくものなどの、液体および栄養補充液、電解質補充液が挙げられる。例え
ば、抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在
することができる。食塩水、アルコール、ＤＭＳＯ、および水性溶液などの様々な液体配
合物がこれらの送達方法のために可能である。
経口水性配合物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリ
ン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（sodium saccharine）、セルロース、および
／または炭酸マグネシウムなどの添加剤を含む。これらの組成物は、マウスウォッシュお
よびマウスリンスなどの溶液の形態をとり、例えば、水、アルコール／水溶液、食塩水溶
液、塩化ナトリウム、リンゲルのデキストロースなどの非経口賦形剤などの水性担体をさ
らに含む。
水性マウスウォッシュ配合物は当業者に周知である。マウスウォッシュおよび経口リン
スに関する配合物は、例えば、米国特許第６，３８７，３５２号明細書、米国特許第６，
３４８，１８７号明細書、米国特許第６，１７１，６１１号明細書、米国特許第６，１６
５，４９４号明細書、米国特許第６，１１７，４１７号明細書、米国特許第５，９９３，
７８５号明細書、米国特許第５，６９５，７４６号明細書、米国特許第５，４７０，５６
１号明細書、米国特許第４，９１９，９１８号明細書、米国特許出願第２００４／００７
６５９０号明細書、米国特許出願第２００３／０１５２５３０号明細書、および米国特許
出願第２００２／００４４９１０号明細書（これらのそれぞれは、参照することにより本
明細書のこのセクションおよび本明細書の全ての他のセクションに具体的に組み込まれる
）に詳細に論じられている。
香味物質、甘味剤もしくは着色剤、または防腐剤などの他の添加物が本開示の配合物中
に存在してもよい。ペパーミントまたはミドリハッカなどのミント、シナモン、ユーカリ
、柑橘類、カシア、アニスおよびメントールは好適な香味剤の例である。香味剤は、０～
３％の範囲、例えば、最大２％、最大０．５％など、例えば液体組成物の場合に約０．２
％といった量で、経口組成物中に存在することができる。
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、スクロース、グルコース、サッカリン、デキ
ストロース、レブロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マ
ルトース、キシリトール、ソーマチン、アスパルテーム、Ｄ－トリプトファン、ジヒドロ
カルコン、アセスルファム、および任意のこれらの組合せなどの人工または天然甘味剤が
挙げられ、これらは、経口組成物の約０～２％の範囲、例えば、最大１％ｗ／ｗ、０．０
５～０．３％ｗ／ｗなどの量で存在することができる。
着色剤は、二酸化チタンもしくはＣＩ ４２０９０、またはこれらの混合物などの、好
適な天然または合成色素である。着色剤は、好ましくは、０～３％の範囲、例えば最大０
．１％、最大０．０５％など、例えば液体組成物の場合に約０．００５～０．０００５％
の量で組成物中に存在することができる。一部の例では、安息香酸ナトリウムが、例えば
、組成物のｐＨを変化させるために実質的に不十分な濃度で、防腐剤として加えられ、そ
うでなければ所望のｐＨに到達するために緩衝剤の量の調整が必要なことがある。
他の任意選択の成分としては、保湿剤、界面活性剤（非イオン性、陽イオン性または両
性）、増粘剤、ゴムおよび結合剤が挙げられる。保湿剤は配合物に形を与え、歯磨き剤組
成物中の水分を保持する。加えて、保湿剤は、配合物の貯蔵の間の微生物の劣化の防止を
助ける。保湿剤はまた、相安定性の維持を補助し、かつ透明または半透明の歯磨き剤を配
合する方法を提供する。
好適な保湿剤としては、グリセリン、キシリトール、グリセロール、およびプロピレン
グリコールなどのグリコールが挙げられ、これらは、それぞれ最大５０％ｗ／ｗの量で存
在することができるが、例えば、保湿剤全体は組成物の約６０～８０％ｗ／ｗより多くな
い。例えば、液体組成物は、最大約３０％のグリセリンおよび最大約５％、または約２％
ｗ／ｗのキシリトールを含み得る。一部の例では界面活性剤は、陰イオン性でなく、組成
物の最大約６％、または約１．５～３％ｗ／ｗの量でポリソルベート２０またはココアミ
ドベタインなどを含み得る。
一部の例では、本発明の経口組成物が液体形態である場合、それは、経口組成物の最大
約３％ｗ／ｗ、例えば、０～０．１％、または約０．００１～０．０１％などの範囲内、
経口組成物の約０．００５％ｗ／ｗなどであり得る膜形成剤。好適な膜形成剤としては、
（ヒアルロン酸ナトリウムに加えて）Ｇａｎｔｒｅｚという商標名の下で販売されている
ものが挙げられる。
経口または経腸投与用の液体栄養配合物は、脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン、
および鉱物などの１つまたは複数の栄養分を含み得る。多くの異なる供給源および種類の
炭水化物、脂質、タンパク質、鉱物およびビタミンが公知であり、そのような栄養分が選
択された配合物中に加えられる成分と適合性であり、安全かつ意図する使用に効果的であ
り、かつ製品の性能を過度に損なわない限り、本発明の栄養液の実施形態において使用す
ることができる。
これらの栄養液は、充分な粘性、流動性、または他の物理的もしくは化学的特徴を有す
るように配合されて、栄養液の飲用または投与の間の粘膜のより効果的かつ鎮静的なコー
ティングを提供することができる。これらの栄養分の実施形態はまた、個体の単独の、主
要な、または補助的な栄養分の必要性を満たすために好適な均衡の取れた栄養供給源とな
り得る。
好適な栄養液の非限定的な例は、米国特許第５，７００，７８２号明細書（Ｈｗａｎｇ
ら）、米国特許第５，８６９，１１８号明細書（Ｍｏｒｒｉｓら）、および米国特許第５
，２２３，２８５号明細書（ＤｅＭｉｃｈｅｌｅら）（これらの記載は、参照することに
より本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書での使用のために好適な栄養タンパク質は、加水分解されていてもよいし、部
分的に加水分解されていてもよいし、または加水分解されていなくてもよく、乳汁（例え
ば、カゼイン、乳清）、動物（例えば、肉、魚）、穀物（例えば、米、麦）、野菜（例え
ば、大豆）、またはこれらの組合せなどの任意の公知またはその他の好適な供給源に由来
し得る。
栄養液において使用するために好適な脂肪または脂質としては、ココナッツ油、大豆油
、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレイン酸サフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖ト
リグリセリド）、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、構造化トリグリセリド、パーム
油およびパーム核油、パームオレイン、キャノーラ油、海洋油、綿実油、およびこれらの
組合せが挙げられるがこれらに限定されない。栄養液において使用するために好適な炭水
化物は、単純または複合、ラクトース含有またはラクトース非含有、またはこれらの組合
せであってよい。好適な炭水化物の非限定的な例としては、加水分解されたコーンスター
チ、マルトデキストリン、グルコースポリマー、スクロース、コーンシロップ、コーンシ
ロップ固形物、米由来炭水化物、グルコース、フルクトース、ラクトース、高フルクトー
スコーンシロップ、およびフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）などの難消化性オリゴサッカリド
、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
栄養液は、様々なビタミンのいずれかをさらに含んでよく、その非限定的な例としては
、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリド
キシン、ビタミンＢ１２、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コ
リン、イノシトール、その塩および誘導体、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
栄養液は、Ｔ１ＤのリスクがあるまたはＴ１Ｄを患った患者における使用（us）のため
の公知またはそれ以外に好適な様々な鉱物のいずれかをさらに含んでよく、その非限定的
な例としては、カルシウム、リン、マグネシウム 鉄、セレニウム、マンガン、銅、ヨウ
素、ナトリウム、カリウム、塩化物、およびこれらの組合せが挙げられる。
本発明の微生物、特に酵母および細菌はまた、簡便な経口または直腸投与用のエリキシ
ルまたは溶液として、あるいは非経口投与、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路によ
る非経口投与のために適切な溶液として配合されてもよい。さらに、ヌクレオシド誘導体
はまた、活性成分のみを放出し、または、腸管の特定の部分において、例えば持続的また
は長期間にわたって、放出して効果をさらに増進させる剤形などの、持続または長期放出
剤形としての配合物のために特によく適する。そのような剤形におけるコーティング、エ
ンベロープ、および保護マトリックスは、例えば、製薬の技術分野において周知のポリマ
ー物質またはワックスから作ることができる。
本発明の組成物は、ロゼンジ剤、トローチ剤またはパステル剤などの医薬剤形を含む。
これらは、通常、好適な香味の基剤中に活性成分を含有する円盤形状の固体である。基剤
は、硬質の氷砂糖、グリセリンゼラチン、または形態を与える充分な粘質物との砂糖の組
合せであってよい。トローチ剤は口の中に入れられるとゆっくりと分解し、粘膜との直接
的な接触のために活性成分を解放する。
本発明のトローチ剤の実施形態は、例えば、柔軟な塊が形成されるまで粉末状の活性物
質、粉末状の砂糖、およびゴムの混合物に水をゆっくり加えることによって調製すること
ができる。７％のアカシア粉末を使用して塊に充分な粘着性を提供することができる。塊
を転がし、トローチ片を扁平状の塊から切り出し、または塊を転がして円柱状にし、分割
することができる。切り出されまたは分割された各片を成形し、乾燥させることによって
トローチ剤形を形成する。
活性成分が熱に不安定な場合、圧縮によってロゼンジ剤調製物にしてもよい。例えば、
調製中の造粒ステップは、任意の圧縮錠剤のために使用される方法と類似の方法で行われ
る。ロゼンジ剤は、剤形が口中でゆっくり溶けまたは崩壊するのに望ましくなるように通
常よりも硬い錠剤を与えるために、強い圧縮の設備を使用して作られる。一部の例では、
成分は、遅延溶解性の特徴を促進するように選択される。
本発明の特定の配合物では、微生物は、アルファデンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸
）を含有する生体接着性担体中に組み込まれて、頬側塗布のために好適（すなわち、長期
の生体接着および持続的な薬物送達を有する）な生体接着性の錠剤および生体接着性のゲ
ルを形成する。例えば、本発明による非病原性かつ非浸潤性の細菌の粉末混合物、生体接
着性ポリマー（噴霧乾燥を介して一緒に加工されたアルファデンプンおよび架橋ポリ（ア
クリル酸））、フマル酸ステアリルナトリウム（滑沢剤）、および二酸化ケイ素（滑剤）
を加工して錠剤（重量：１００ｍｇ；直径：７ｍｍ）にする。これらの錠剤の製造方法は
当業者に周知であり、様々な薬物（ミコナゾール、テストステロン、フッ化物、シプロフ
ロキサシン）を含有する生体接着性の錠剤の開発の成功について以前に記載されている（
Bruschi M. L. and de Freitas O., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005
31:293-310）。全ての添加剤材料は医薬品グレードで市販されている。
配合物を最適化するために、錠剤中の薬物含有量およびデンプンとポリ（アクリル酸）
との比は様々である。先行する研究に基づいて、一緒に加工された生体接着性担体中の最
大の薬物含有量は約６０％（ｗ／ｗ）であり、デンプン／ポリ（アクリル酸）の比は７５
／２５から９５／５（ｗ／ｗ）の間で変化させることができる。最適化の研究において、
錠剤の生体接着特性および錠剤からの薬物放出が主要な評価パラメーターであり、標準的
な錠剤特性（硬度、破砕性）が二次的な評価基準である。
細菌は、アルファデンプンおよび架橋されたポリ（アクリル酸）の水性分散液中に組み
込まれる。このポリマー分散液は、高せん断ミキサーを使用して標準的な手順を介して調
製される。
錠剤と同様に、食道粘膜への最適な接着を有するゲルを得るために、ゲルの薬物含有量
およびデンプン／ポリ（アクリル酸）の比を最適化する必要がある。ゲルの場合、分散液
中のポリマーの濃度は、ゲルの粘度、したがってその粘膜付着特性を決定するので、追加
の変数である。
食道の粘膜へのポリマー分散液の生体接着特性をスクリーニングするモデルは、Batche
lor et al. (Int. J. Pharm., 238:123- 132, 2002)によって詳細に記載されている。
投与の他の経路および形態としては、生きた微生物を含有する食品調製物が挙げられる
。一部の例では、生物活性ポリペプチド発現微生物は、乳製品中に含めることができる。
本発明の医薬組成物は、選択された剤形を配合または製造するための任意の公知または
その他の効果的な方法によって調製することができる。例えば、微生物を、添加剤および
希釈剤などの、一般的な、例えば、薬学的に許容される担体と共に配合し、経口の錠剤、
カプセル剤、噴霧剤、ロゼンジ剤、処理された基材（例えば、経口または外用スワブ、パ
ッド、または本発明の組成物で処理された使い捨ての非消化性の基材）；経口液（例えば
、懸濁液、溶液、エマルション）、粉末、坐剤、または任意の他の好適な剤形を形成する
ことができる。一部の実施形態では、本開示は、医薬組成物を製造する方法を提供する。
例示的な方法は、微生物（例えば、非病原性細菌）を薬学的に許容される担体と接触させ
、それによって医薬組成物を形成することを含む。一部の例では、方法は、培地中で微生
物を増殖させることをさらに含む。方法は、微生物を含有する液体を乾燥（例えば、凍結
乾燥）することをさらに含んでもよく、該液体は、薬学的に許容される担体を含む。
単位剤形
本開示は、食品グレードのまたは薬学的に許容される担体との組合せであってもよいあ
る特定の量の本開示の微生物（例えば、細菌）を含む単位剤形をさらに提供する。例示的
な単位剤形は、約１×１０３～約１×１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生
物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含有する。他の例示的な単位剤形は、約１×１０
４～約１×１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラ
ム陽性菌）、または約１×１０４～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原
微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含有する。他の実施形態では、単位剤形は、
約１×１０５～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０６～約１
×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌
）を含む。他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０８～約１×１０１２コロニー形成
単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９～約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非
病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。さらに他の実施形態では、単位剤
形は、約１×１０９～約１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９
～約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム
陽性菌）を含む。さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０７～約１×１０１１
コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０８～約１×１０１０コロニー形成単位（
ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０９～約１×１０１０コロニー形成単
位（ｃｆｕ）、または約１×１０９～約１００×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非
病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
単位剤形は、任意の物理形態または形状を有し得る。一部の実施形態では、単位剤形は
、経口投与のために適当である。これらの実施形態による一部の例では、単位剤形は、カ
プセル剤、錠剤、または顆粒剤の形態である。例示的なカプセル剤としては、マイクロ顆
粒を充填したカプセル剤が挙げられる。一部の実施形態では、剤形中に含有される非病原
微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）は、乾燥粉末形態である。例えば、微生物は、
凍結乾燥粉末形態であり、これは圧縮およびコーティングされていてもよい。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるが、これらは、後
述の特許請求の範囲により完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを当業者は容易
に理解するであろう。さらに、本出願の全体を通じて、様々な刊行物が参照される。これ
らの刊行物の開示は、参照することにより、本発明が関連する技術分野の現状をより充分
に説明するためにその全体が本出願に組み込まれる。
[実施例１]
細菌表面にＣｍｂＡを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の生
成
（ａ）ＣｍｂＡのエピソーム発現
ＣｍｂＡをコードする遺伝子（配列番号２および配列番号１１におけるＣｍｂＡのコー
ディング領域を参照、図５Ａ～Ｄ）のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３
６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイ
ＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５（ｕｓｐ４５分泌シグナ
ル）およびｃｍｂＡを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕ
ｓｐ４５－ｃｍｂＡ発現ユニットをＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１
３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰ
ＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｃｍｂＡ＞＞３’ｔｈｙＡ
をプラスミドｐＯＲＩ１９（例えば、Law et al., J. Bacteriol. 1995, 177(24):7011-7
018を参照）にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１８９３を生成させた。プラス
ミドｐＡＧＸ１８９３でラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＬＬ１０８
を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９３］を結果として得た。
（ｂ）染色体への組込み（ＣｍｂＡの構成的発現）
治療用ポリペプチドＰＡＬをコードする異種核酸配列（ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａ
ｌ）を含有する２シストロン性発現カセット（配列番号２４および２５）を含有する２つ
の異なるＬ．ラクチス（L. lactis）株に組込みベクターｐＡＧＸ１８９３をエレクトロ
ポレートした。これらの２つの株はｓＡＧＸ０５９９およびｓＡＧＸ０５８５（トレハロ
ース蓄積株）であった。ｔｈｙＡ遺伝子座における相同組換え（ダブルクロスオーバー）
によるＳＳｕｓｐ４５－ｃｍｂＡの挿入をＰＣＲおよびサンガーＤＮＡシークエンシング
によって確認した。結果として得られた株をそれぞれｓＡＧＸ０６１８およびｓＡＧＸ０
６１９と称した。
[実施例２]
細菌表面にＭｂｐＬを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の生
成
（ａ）ＭｂｐＬのエピソーム発現（天然のシグナルペプチドを使用）
［ＰｔｈｙＡ＞＞ｍｂｐＬ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターｐＡＧＸ１９０３の構築：Ｍ
ｂｐＬをコードする遺伝子（シグナルペプチドあり；ＳＳｍｂｐＬ）のコドン用法をＬ．
ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合
成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡおよびｍｂ
ｐＬを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍｂｐＬ＞＞ｍｂ
ｐＬ発現ユニット（配列番号１７）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ
１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られた
ＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍｂｐＬ＞＞ｍｂｐＬ＞＞３’ｔｈｙ
ＡをプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１９０３を生成
させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐ
ＡＧＸ１９０３］を結果として得た。
（ｂ）ＭｂｐＬのエピソーム発現（ＳＳｕｓｐ４５を使用）
ｍｂｐＬを組み込んだ別の構築物は、ＭｂｐＬ自体のシグナルペプチドの代わりに分泌
リーダー配列ＳＳｕｓｐ４５を含み得る。［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｍｂｐＬ］
ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターは実施例１に概説した手順にしたがって調製することがで
き、ｃｍｂＡをコードする核酸配列は、それ自体のシグナルペプチドを含まないＭｂｐＬ
ポリペプチドをコードする核酸配列と置換することができる。ＭｂｐＬをコードする遺伝
子（シグナルペプチドを含まない）をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化
することができる。結果として得られるＤＮＡ配列を合成により作製することができる。
オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５およびｍｂ
ｐＬを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させることができる。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓ
ｐ４５－ｍｂｐＬ発現ユニット（配列番号１５）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lac
tis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置することがで
きる。結果として得られるＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５
－ｍｂｐＬ＞＞３’ｔｈｙＡを例えばプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングして別
のプラスミドを生成させることができ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）、例えば株Ｌ
Ｌ１０８を形質転換することができる。
[実施例３]
細菌表面にＭａｐＡを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の生
成
（ａ）ＭａｐＡのエピソーム発現（天然のシグナルペプチドを使用）
［ＰｔｈｙＡ＞＞ｍａｐＡ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターｐＡＧＸ１９４６の構築：ｍ
ａｐＡをコードする遺伝子（シグナルペプチドを含む）をＬ．ラクチス（L. lactis）Ｍ
Ｇ１３６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバ
ーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡおよびｍａｐＡを融合させ、１つのＰ
ＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍａｐＡ＞＞ｍａｐＡ発現ユニット（配列番
号２１）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領
域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ
＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍａｐＡ＞＞ｍａｐＡ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１
９にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１９４６を生成させ、これでＬ．ラクチス
（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１９４６］を結果と
して得た。
（ｂ）ＭａｐＡのエピソーム発現（ＳＳｕｓｐ４５を使用）
ｍａｐＡを組み込んだ別の構築物は、ＭａｐＡ自体のシグナルペプチドの代わりに分泌
リーダー配列ＳＳｕｓｐ４５を含み得る。［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｍａｐＡ
］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターは例えば実施例１の手順にしたがって調製することがで
き、ｃｍｂＡをコードする核酸配列は、そのシグナルペプチドを含まないＭａｐＡポリペ
プチドをコードする核酸配列と置換することができる。ｍａｐＡをコードする遺伝子をＬ
．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化することができる。結果として得られる
ＤＮＡ配列を合成により作製することができる。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用
して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５およびｍａｐＡ（シグナルペプチドを含まない）を
融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させることができる。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５
－ｍａｐＡ発現ユニット（配列番号１９）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）
株の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置することができる。結果として得
られるＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｍａｐＡ＞＞３’
ｔｈｙＡを例えばプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングして別のプラスミドを生成
させることができ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株、例えばＬＬ１０８を形質転換
することができる。
[実施例４]
細菌表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するラクトコッカス・ラクチス（
Lactococcus lactis）株
（ａ）ｈＴＦＦ３の発現
図４は、Ｃ末端付着ポリペプチドと共に、融合タンパク質のＮ末端部分として使用でき
る例示的なＳＳｕｓｐ４５－ｈｔｆｆ３構築物（アミノ酸および核酸配列）を説明する。
Ｃ末端付着ポリペプチドは、ＰＣＲ融合またはより伝統的なライゲーションを通じて付加
することができる。
（ｂ）ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡのエピソーム発現
［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ｃｍｂＡ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベク
ターを構築した。ｈＴＦＦ３およびＣｍｂＡ（シグナルペプチドを含まない）をコードす
る遺伝子のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果と
して得られたｈｔｆｆ３およびｃｍｂＡのＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレ
イＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５、ｈＴＦＦ３およびｃ
ｍｂＡを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈ
ＴＦＦ３－ＣｍｂＡ発現ユニット（配列番号１１および図５Ａ～Ｄを参照）をＰＣＲによ
ってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域
との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞Ｓ
Ｓｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ｃｍｂＡ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９（Law
et al., 1995、上掲）にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ２００５（図１を参照
）を生成させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１
０８［ｐＡＧＸ２００５］を結果として得た。
（ｂ）染色体への組込み（ｈＴＦＦ３－ｃｍｂＡの構成的発現；ｔｈｙＡプロモーター）
治療用ポリペプチドＰＡＬをコードする２シストロン性発現カセット（ｇａｐＢ＞＞ｒ
ｐｍＤ＞＞ｐａｌ）を含有する２つの異なるｔｈｙＡ－野生型ラクトコッカス・ラクチス
（Lactococcus lactis）株、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ｓＡＧＸ０５９９およびｓＡＧ
Ｘ０５８５（トレハロース蓄積株）に組込みベクターｐＡＧＸ２００５（上記および図１
を参照）をエレクトロポレートした。ｔｈｙＡ遺伝子座における相同組換え（ダブルクロ
スオーバー）によるＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ（例えば、配列番号１１およ
び図５Ａ～Ｄを参照）の挿入をＰＣＲおよびサンガーＤＮＡシークエンシングによって確
認した。結果として得られた株をｓＡＧＸ０６４４およびｓＡＧＸ０６４５と称した。
（ｃ）染色体への組込み（ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡの構成的発現；ＰｈｌｌＡプロモーター
）
治療用ポリペプチドＰＡＬ（ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａｌ）およびＰｔｈｙＡ＞＞
ＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ３－ｃｍｂＡをコードする２シストロン性発現カセットを含有
するＬ．ラクチス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０６４４（上記を参照）にプロモーター置換
ベクターｐＡＧＸ２０４１（ＰｔｈｙＡ－＞ＰｈｌｌＡ）をエレクトロポレートした。相
同組換え（ダブルクロスオーバー）によるＰｔｈｙＡのＰｈｌｌＡによる置換をＰＣＲお
よびサンガーＤＮＡシークエンシングによって確認した。結果として得られた株をｓＡＧ
Ｘ０６６０と称した。
[実施例５]
細菌表面にｈＴＦＦ１－ＳｐａＸを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus la
ctis）株
（ａ）ｈＴＦＦ１－ｓｐａＸのエピソーム発現
［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ１－ｓｐａＸ］（配列番号２２および２３）
ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターｐＡＧＸ１８９４の構築：ｈＴＦＦ１をコードする遺伝子
のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得ら
れたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、Ｐ
ｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５、ｈＴＦＦ１、および、スタフィロコッカス・アウレウス（
Staphylococcus aureus）のプロテインＡの細胞壁アンカーをコードする遺伝子（Ｓｐａ
Ｘ、Steidler et al., 1998）を融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ
＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈＴＦＦ１－ｓｐａＸ発現ユニットをＰＣＲによってＬ．ラクチス
（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した
。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５－ｈ
ＴＦＦ１－ｓｐａＸ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングして
プラスミドｐＡＧＸ１８９４を生成させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０
８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９４］を結果として得た。
[実施例６]
ムチン結合および細胞結合ポリペプチドをエピソームにより発現するラクトコッカス・ラ
クチス（Lactococcus lactis）株
以下のプラスミドおよびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を本明細
書に記載される通りに調製し、ムチンおよび細胞結合（Ｃａｃｏ－２、ＩＥＣ－１８、お
よびＨＴ２９－ＭＴＸ細胞）能力について試験した。下記の表１に列挙したプラスミドを
Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８にエレクトロポレートした。
（ａ）ムチンへのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＬＬ１０８［ｐＡＧ
Ｘ２００５］の結合
実験手順：ムチン（Ｓｉｇｍａ ＩＩ型、製品番号Ｍ２３７８－１００Ｇ、ブタ胃から
（form）のムチン、およびＳｉｇｍａ ＩＩＩ型、製品番号Ｍ１７７８－１０Ｇ、ブタ胃
からのムチン、シアル酸（０．５～１．５％）に結合、部分精製）をＮｕｎｃ Ｍａｘｉ
Ｓｏｒｐ（登録商標）プレートに５０ｍＭ炭酸緩衝液中５００μｇ／ｍｌでコーティング
した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングし、ＰＢ
Ｓで３回洗浄した。終夜飽和させたＬ．ラクチス（L. lactis）培養物をＰＢＳでＯＤ６
００＝１に希釈した。培養物をＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、１ボリュ
ームのＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁した。１００μｌの細菌懸濁液を各
ウェルに適用した。プレートを４℃で１６時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。プレートを５５℃で１時間乾燥させた。（
Ａ）ＯＤを４０５ｎｍで測定した。（Ｂ）ウェルあたり１００μｌのクリスタルバイオレ
ット（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で４５分間インキュベートした。その後にＯＤを５９
５ｎｍで測定した。
結果：
図２は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡア
ンカー断片ＳｐａＸ（Steidler et al., 1998、上掲）の使用によってその表面にヒトト
レフォイル因子１（ｈＴＦＦ１）を発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９４］、および
その表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］が、２つ
の異なる計測方法を使用して測定した時に同等の強度でムチン（Ｓｉｇｍａ ＩＩ型およ
びＩＩＩ型）に結合することを示す。対照的に、エンプティ対照ベクターを含有する対照
株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１４１７］は、２つの計測方法についてムチンへのいかなる結合
も示さなかった。
（ｂ）Ｃａｃｏ－２細胞へのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＬＬ１０
８［ｐＡＧＸ２００５］の付着
実験手順：Ｃａｃｏ－２細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２で１２ウェルプレートに播種し
た。細胞を１７日間生育して分化させた。終夜飽和させたＬ．ラクチス（L. lactis）培
養物をＤＭＥＭで１／１０００に希釈し、ＤＭＥＭで３回洗浄した。そしてＬ．ラクチス
（L. lactis）細胞をＤＭＥＭに再懸濁した。１ｍｌの細菌懸濁液を１２ウェルプレート
中の細胞に適用し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭで３回洗浄した
。細胞をＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００での溶解により回収した（ＰＢＳ中の１ｍｌの０．１％
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を細胞に適用し、細胞が完全に脱着するまで５～１０分間イン
キュベートした）。回収した細胞懸濁液を適宜希釈し、ＧＭ１７Ｅプレートにプレートし
た。３０℃での２４時間のインキュベーション後にプレート上の細菌数を測定した。回収
した細胞懸濁液のプレーティングから回収されたＬ．ラクチス（L. lactis）細胞をＣａ
ｃｏ－２細胞に最初に適用された細胞数で割ることによって回収パーセントを決定した。
図３は、その表面にＣｍｂＡを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９３］およびその
表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］がＣａｃｏ－
２細胞への同等の付着を呈することを示す。対照的に、対照株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１４
１７］（対照）およびその表面にｈＴＦＦ１－ＳｐａＸを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧ
Ｘ１８９４］はＣａｃｏ－２細胞への増進した付着を呈しなかった。
結論：
それらの表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合ポリペプチドを発現するＬ．ラクチス（L. l
actis）株は、ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合ポリペプチドを発現しない対応する株と比べた
時にムチンへの増進したｉｎ ｖｉｔｒｏ結合性およびＣａｃｏ－２細胞への増進した付
着を呈する。
[実施例７]
２シストロン性発現ユニットを含有する組込みプラスミドの構築
遺伝子間領域（例えば、ｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域）を組み込んだ構築物を使用
して本明細書に記載される通りに下記の表２に列挙される組込みプラスミドを調製し、そ
れらのムチンおよび細胞結合能力を本明細書に記載される通りに試験することができる。
表２に列挙されるプラスミドをＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８などの宿主細胞
にエレクトロポレートして、これらの構築物によってコードされるポリペプチドを発現す
る（例えば、構成的に発現する）細菌を生成することができる。
[実施例８]
染色体に組み込まれた発現ユニットを含有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus
lactis）株
以下のプラスミドおよびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を本明細
書に記載される通りに調製し、実施例６に記載される通りにそれらのムチンおよび細胞結
合能力について試験した。結果を図６および図７に説明する。染色体に組み込まれたＰＡ
Ｌ発現ユニット（ＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａｌ）を含有するＬ．ラク
チス（L. lactis）宿主株に下記の表３に列挙されるプラスミドを組み込んだ。宿主株の
一部は、細胞内のトレハロース蓄積（＊）に繋がる遺伝子改変をさらに含んだ。例示的な
トレハロース蓄積株は、（ｉ）機能的なトレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ（Δｔ
ｒｅＰＰ）を欠いており、かつ機能的なセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネン
ト（ΔｐｔｃＣ）遺伝子を欠いており；（ｉｉ）大腸菌（E. coli）トレハロース－６－
リン酸ホスファターゼ（E. coli otsB）を発現し、かつ（ｉｉｉ）トレハローストランス
ポーター遺伝子（ＰＴＳ遺伝子）を発現する。例えば、米国特許第９，２００，２４９号
明細書および米国特許出願公開第２０１４／０２３４３７１号明細書（これらの開示は、
全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
選択された株はＰＡＬ発現についても試験した。結果（図８に要約される）は、細胞付
着および粘膜付着ポリペプチドの発現は細胞あたりの発現されるＰＡＬの量（μｇ／１０
９細胞）に有意な影響を有しなかったことを指し示す。
[実施例９]
染色体に組み込まれた発現ユニットを含有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus
lactis）株の構築
適切な構築物を使用して本明細書に記載される通りに下記の表４に列挙されるラクトコ
ッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を調製することができ、本明細書に記載され
る通りにそれらのムチンおよび細胞結合能力について試験することができる。
それらの表面にムチン結合および細胞付着ポリペプチドを発現するこれらの細菌株のそ
れぞれ（例えば、それらの表面にｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するラクト
コッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株）を胃腸（ＧＩ）通過時間について評価す
ることができ、またムチン結合および細胞付着ポリペプチドを発現しない対応する株（例
えば、ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ融合ポリペプチドを発現しない対応する株）と比較すること
ができる。
例えば、ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを発現するか、または融合タンパク質を発現しない、細
菌株の同数の細菌細胞（例えば、ｃｆｕに基づく）を個体（ヒトまたは動物）に投与する
ことができる。非エピソーム株＋／－ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡは抗生物質選択マーカー（例
えば、エリスロマイシン耐性を与えるｐＴ１ＮＸ）を備え得る。Ｅｍ耐性に基づいてエピ
ソーム株をさらに選択することができる。以下の方法の１つによってＧＩ通過時間を測定
することができる：
（１）一定（例えば、１ｈ）の間隔で、全糞便を回収し、例えば、Ｑ－ＰＣＲまたはエ
リスロマイシンを含有する固形寒天への希釈プレーティングにより、各株について回収さ
れたｃｆｕ数を決定することができる。これはあらゆる株についての回収の動態をもたら
し、回収されるｃｆｕ数が最大となる収集時点を示し得る。この最大を超える時点におい
て、より多くのｃｆｕがｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ＋株について回収されることが観察される
。
（２）一定（例えば、１ｈ）の間隔で、試験動物（例えば、マウス）を屠殺し、それら
の動物から回収された細菌のｃｆｕ数を、エリスロマイシンを含有する固形寒天への希釈
プレーティングによって決定することができる。これは、時間の進行と共により多くのｃ
ｆｕがｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡ＋株について回収されることを示す。
[実施例１０]
ＰＫＵの治療－本開示の遺伝子改変された細菌によって発現されたＰＡＬを使用するフェ
ニルアラニンの胃腸での分解
Ｐｈｅをケイ皮酸に変換しかつ共因子を必要としない酵素フェニルアラニンアンモニア
リアーゼ（ＰＡＬ）はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するために使用されてきた。
例えば、Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105: 20894-20
899を参照。ＰＡＬは胃腸（ＧＩ）管で迅速に分解されるので、経口送達の達成は困難で
ある。概念実証研究は、ＰＫＵ（ｅｎｕ２／２）マウス中で遺伝子操作された大腸菌（E.
coli）によって発現されたＰＡＬの経口投与は血漿Ｐｈｅレベルの有意な低減を結果と
してもたらすことを示した。例えば、Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 1999, 96:2339-2344を参照。しかしながら、大腸菌（E. coli）の投与に関連する
安全上の懸念がヒトでのこの戦略の使用を妨げる。ＰＡＬを発現するラクトコッカス・ラ
クチス（Lactococcus lactis）株が生成され、ＰＫＵマウスモデルにおいて評価されてい
る。組換え細菌の経口投与は、重水素化Ｐｈｅの吸収の低減を結果としてもたらした。例
えば、国際特許出願公開第２０１４０６６９４５号パンフレットを参照。
ヒトＰＫＵ患者へのＰＡＬを発現する遺伝子改変された細菌の投与を可能とするために
、本発明者らは、ＰＡＬ酵素を構成的に発現し、かつ増加したＧＩ通過時間、ＧＩ条件下
でのより大きな安定性、および自己封じ込め（自制）を呈するようにさらに改変された「
臨床グレード」株を調製した。エピソーム発現は安全性の懸念に関連するので、生物活性
ポリペプチドの染色体への組込みは重要である。例えば、エピソームは胃腸システム中で
他の細菌に容易に伝染し得る。さらに、エピソームの維持は製造にとっての障害を提供す
ることがある。さらに、公知のＰＡＬ産生株は、近位ＧＩ管で迅速に破壊される。さらに
、公知のＰＡＬ産生細菌は身体外で生存し、増殖する懸念がある。
例えば実施例８において本明細書に上記される通りに、以下の改善された特徴の１つま
たは複数を有する複数のＬ．ラクチス（L. lactis）株を生成した：１）安全性を改善し
かつ製造を容易にするために細菌染色体に組み込まれ、構成的プロモーターによって駆動
されるＰＡＬ発現カセット；２）ＧＩ管でのＬ．ラクチス（L. lactis）の生存を改善す
るトレハロース蓄積を促進する改変（例えば、Termont, S. et al., Appl. Environ. Mic
robiol. 2006, 72: 7694-7700を参照）；３）ヒト身体外での生存を防止するためにチミ
ジンに対する栄養要求依存性の組込み（例えば、Steidler, L. et al., Nat. Biotechnol
. 2003, 21: 785-789を参照）；および４）近位ＧＩ管での保持を向上させ、Ｐｈｅ分解
を長期化させるために粘膜付着表面タンパク質を発現させるための遺伝子改変（例えば、
Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570を参照）。実施例６および実施
例８に記載される通りに、ＰＡＬ発現および各々の細胞付着および粘膜付着特性について
株を評価した。付着タンパク質の表面発現は、Ｃａｃｏ－２単層上の細菌保持を約８倍向
上させた。ＩＩ型およびＩＩＩ型の両方のムチンへの付着が同様に増進した。重要なこと
に、ＧＩ管での生存の改善のためのトレハロース修飾および付着分子の発現は、細菌によ
って発現されるＰＡＬレベルを変化させなかった。
選択された細菌株、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株（例え
ば、ＰＡＬを構成的に発現する株；例えば、ｓＡＧＸ０５９９、ｓＡＧＸ０６４４、ａＡ
ＧＸ０５８５、およびｓＡＧＸ０６４５）をｅｎｕ２／２ 「ＰＫＵ」マウスモデルにお
ける有効性について試験してヒトでの臨床試験のために好適な株を同定することができる
。
第１の研究では、胃管栄養を介して１０９ｃｆｕのＬ．ラクチス（L. lactis）と同時
に重水素化Ｐｈｅの投与を与えたＰＫＵマウスにおいてｓＡＧＸ０５９９、およびｓＡＧ
Ｘ０６４５を試験した。血液を１５分間隔で１時間にわたって採取し、重水素化Ｐｈｅに
ついてアッセイを行った。陽性対照動物には、例えば国際特許出願公開第２０１４０６６
９４５号パンフレットに記載される、公知のエピソーム組換え株を与えた。陰性対照動物
には細菌を与えなかった。図９に示すように、マウスによって吸収された全Ｐｈｅは、ｓ
ＡＧＸ０５９９（ＰＡＬを分泌する）およびｓＡＧＸ０６４５（ＰＡＬおよびＴＦＦ３－
ＣｍｂＡ）を与えたマウスにおいて最低であり、陽性対照よりも優れていた。興味深いこ
とに、Ｐｈｅの最終レベルは、ｓＡＧＸ０６４５（ＰＡＬおよびＴＦＦ３－ＣｍｂＡ）を
与えたマウスで最低であったが、ＰｈｅのＣｍａｘはより高かった。これは、付着融合タ
ンパク質を有しないＬ．ラクチス（L. lactis）と比べてｓＡＧＸ０６４５がＰｈｅ摂取
の特定の部位まで小腸をゆっくり降りていくことを反映している可能性がある。より低い
ＣｍａｘおよびＡＵＣは、給餌前のＰｈｅ分解細菌の投与によって得られ得る。より低い
ＣｍａｘおよびＡＵＣはまた、食餌と共に細菌を定期的に投与して、ある食餌からＰｈｅ
を低減させるための遠位のＰｈｅ分解細菌が、先行する食餌から既に存在するようにする
ことによっても得られ得る。
Ｐｈｅの供給はＰＫＵの人工的モデルであることに留意すべきである。単一のアミノ酸
は非常に効率的に吸収される。典型的な状況では、タンパク質は腸を通過する間に分解さ
れ、吸収のために利用可能な遊離アミノ酸は小腸上部よりもより遠位の部分において主に
生じる。したがって、腸のより遠位の部分に位置するＰＡＬ分泌細菌はまた、直接的にＰ
ｈｅを投与する実験によって示唆されるよりも食品からのＰｈｅ摂取をより良好に阻害で
きる可能性がある。
さらに、Ｌ．ラクチス（L. lactis）を異なる細胞および粘液付着分子で改変して、腸
の最適な区分へのＰＡＬの送達を局在化させることができる。
第２の研究では、選択された細菌株、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus
lactis）株の薬力学を評価し得る。重水素化Ｐｈｅの最大６時間前に細菌を投与すること
ができる。血液を上記の通りにアッセイすることができる。結果として得られるデータは
、その後の研究のスケジュール設定のための情報を与え、かつ臨床応用に関連する情報を
提供することができる。例えば、ヒトは、各食事と共に細菌を含有する１つの単位剤形（
例えば、カプセル剤）を服用することができる。
第３の研究は、Ｐｈｅ血中レベルの低下における細菌の長期的有効性を評価し得る。選
択された細菌株（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株）、例え
ば第１の研究からの最適な株を胃管栄養法により動物に与えることができ、次いで標準飼
料の食餌を与えることができる。例えば、２回目からの転帰によって決定される各食餌に
ついての継続時間での、それぞれの日の２回のＬ．ラクチス（L. lactis）関連の食餌な
どである。血中Ｐｈｅレベルは定期的に、例えば、３週にわたって週に２回、評価するこ
とができる。対照は、第１の研究において用いられたものであってよく、また、低Ｐｈｅ
の食餌コホートを含むこともできる。注記：この研究は重水素化Ｐｈｅを使用しなくても
よい。転帰良好は、Ｐｈｅ血中レベルの統計的に有意な改善、例えば、臨床的有効性を結
果としてもたらす可能性が充分な改善であり得る。他の研究は、食餌への介入と細菌療法
（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis）療法）を組み合わせ得る。
各研究は、統計解析のために充分となるように５匹のマウスのコホートを利用すること
ができ、マウスは洗い出し後に再使用することができる。Ｐｈｅはタンデム質量分析によ
ってアッセイすることができ、これは高感度かつ特異的で、最小量の血液を必要とする。
[実施例１１]
口腔粘膜炎の治療
口腔粘膜炎は口腔粘膜の破壊であり、がん治療、特に頭頸部がんの治療によく見られる
合併症である。ＴＦＦ１はＧＩ管上部で分泌され、粘膜表面の保護および治癒に関連する
。ＴＦＦ１は、口腔粘膜炎の治療の見込みを示す。口腔粘膜のＴＦＦ１の送達を増加させ
るために、両方の染色体上で、「遊離」ｈＴＦＦ１と共にｈＴＦＦ１－ＣｍｂＡ融合物の
両方を発現するようにＬ．ラクチス（L. lactis）を操作する。これを段階的に行った場
合、１つのｈｔｆｆ１遺伝子が染色体上の別のｈｔｆｆ１遺伝子と組換えを起こすリスク
がある。このリスクを最小化するために、ｈＴＦＦ１－ｃｍｂＡおよびｈｔｆｆ１をポリ
シストロン性に構築することができ、したがって、１ステップで形質転換および染色体へ
の組込みを行うことができる。さらに、各コドンの第３の塩基を１つのｔｆｆ１配列にお
いて変化させて、そのヌクレオチド配列が他のｔｆｆ１配列と異なるが、翻訳されたｈＴ
ＦＦ１が同じであるようにすることができる。例えば、６つのアラニンコドンが以下の頻
度で存在する：ＵＣＵ（１８．６）、ＵＣＣ（４．０）、ＵＣＡ（２０．６）、ＵＣＧ（
３．９）、ＡＧＵ（１６．７）、およびＡＧＣ（７．３）。したがって、ＵＣＣおよびＵ
ＣＧは交換可能であり得る。ＵＣＵ、ＵＣＡ、およびより低い程度でＡＧＵは交換可能で
あり得る。
コドン頻度の改変後に、ＰＣＲを通じてＰｈ１１Ａ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈＴＦＦ１
＞＞ｒｐｍＤ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈＴＦＦ１－ＣｍｂＡを構築し、ｐＯＲＩ１９に由
来する条件複製型キャリアープラスミドの５’ｔｈｙＡと３’ｔｈｙＡとの間にクローニ
ングする。本明細書の別の箇所に記載される通りのＬ．ラクチス（L. lactis）の形質転
換および選択は、染色体のｔｈｙＡ遺伝子座への組込みに繋がる。
結果として得られる株は、ＴＦＦ１を分泌し、かつＴＦＦ１を単独で発現する株と比べ
て口腔粘液への増加した結合を媒介するＴＦＦ－ＣｍｂＡ融合物を発現することが示され
る。株を粘膜炎のモデルにおいて試験し、ＴＦＦ－ＣｍｂＡの存在は口腔での持続を増加
させ、治療的なＴＦＦ１の送達を増加させ、それにより投薬の頻度を減少させることがで
きる。
[実施例１２]
糖尿病の治療
上記されるｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus
lactis）株をヒトプロインスリンＰＩＮＳおよびヒトＩＬ１０を発現するように改変する
。例えば、ｈＰＩＮＳ発現用の構築物は、強いｇａｐＢプロモーターの制御下、およびｇ
ａｐＢ遺伝子およびｒｐｍＤスペーサーの後にＳＳＵｓｐ４５分泌リーダーを有するｈＰ
ＩＮＳであり得る（すなわち、ＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｓｐ４５＞＞
ＰＩＮＳ）。ｈＩＬ－１０について、構築物はＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈｉｌ
－１０であり得る。
ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡがｔｈｙＡ遺伝子座に既に挿入されているので、ＰＩＮＳおよび
ＩＬ－１０はｐｔｃＣまたはｔｒｅＰＰなどの別の遺伝子部位に挿入することができる。
ＰｔｃＣおよびｔｒｅＰＰの変異はトレハロース蓄積に関連する。結果として得られる株
をｈＩＬ－１０、ＰＩＮＳおよびｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡの発現について試験する。次いで
、該株を、ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを欠いた株に対して、１型糖尿病の動物モデルであるＮ
ＯＤマウスにおいて試験する。ｈＴＦＦ３－ＣｍｂＡを欠いた株は、ＰＩＮＳに対するＴ
ｒｅｇ応答を生成し、膵臓のベータ細胞に対する自己免疫反応を後退させ、それによって
糖尿病を治療することが以前に示されている。該治療は発症直後の疾患に特に有効である
。ｈＴＦＦ－ＣｍｂＡの存在は、腸での定着および持続を増加させ、より強いＴｒｅｇ応
答を結果としてもたらし得る。
一部の実施形態を本明細書に示して記載したが、そのような実施形態は単に例として与えるものである。本発明から離れることなく、多数の変形、変更、および置換が当業者にここで想起されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態に対して様々な代替手段が本発明の実施において用いられることが理解されるべきである。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
（Ａ）Ｎ末端のムチン結合ポリペプチドおよび（Ｂ）細胞壁アンカー性ドメインを含むＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む乳酸菌（ＬＡＢ）。
［２］
前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の菌。
［３］
前記細胞付着ポリペプチドが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡなどのＣｍｂＡである、請求項２に記載の菌。
［４］
前記ＣｍｂＡポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の菌。
［５］
前記ムチン結合ポリペプチドが、トレフォイル因子（ＴＦＦ）１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３から選択されるＴＦＦである、請求項１に記載の菌。
［６］
前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の菌。
［７］
前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびＴＦＦを含む、請求項１に記載の菌。
［８］
前記融合タンパク質が、ＳＳｕｓｐ４５などの分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の菌。
［９］
融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）からなる群から選択されるプロモーターによって転写調節される、請求項１に記載の菌。
［１０］
ａ．サイトカイン、
ｂ．インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８などの、ＩＬ、
ｃ．抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ－４に対する抗体、ＩＬ－５に対する抗体、ＩＬ－１３に対する抗体、ＩＬ－１５に対する抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体などの、抗体またはその断片、
ｄ．プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、樹木花粉アレルゲン（カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなど）、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン（ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲンなどの、抗原、
ｅ．グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）、グルカゴン、エキセンジン－４、上皮成長因子および成長ホルモンなどの、ホルモン、ｆ．ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３などの、ＴＦＦ、
ｇ．フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラーゼなどの、酵素、ならびに
ｈ．任意のこれらの組合せ
から選択される少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１に記載の菌。
［１１］
少なくとも１つの治療用ポリペプチドがＰＡＬである、請求項１０に記載の菌。
［１２］
少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする前記外因性核酸がｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）によって転写調節される、請求項１０に記載の菌。
［１３］
ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種細菌、およびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス（Lactococcus）種細菌からなる群から選択される、請求項１に記載のＬＡＢ。
［１４］
融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む前記菌が、前記融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含まない対応する菌と比べた時に、
ａ．少なくとも１０％増加した胃腸（ＧＩ）通過時間、および／または
ｂ．少なくとも１０％増加した腸粘膜への付着、および／または
ｃ．少なくとも２０％増加したｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力、および／または
ｄ．少なくとも１０％増加したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２細胞結合能力
を有する、請求項１に記載の菌。
［１５］
ａ．大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢの挿入、
ｂ．ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５、およびトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース－６－リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域を含むポリシストロン性発現カセットの挿入、
ｃ．ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、トレハローストランスポーターｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含むポリシストロン性発現カセットの挿入、
ｄ．ｔｒｅＰＰの不活性化、
ｅ．ｐｔｃＣの不活性化、ならびに
ｆ．（ａ）～（ｅ）のいずれかの組合せ
から選択される、トレハロース蓄積を増加させる少なくとも１つの変異または挿入をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の菌。
［１６］
先行請求項１のいずれか１項に記載の菌、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［１７］
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、および胃腸疾患からなる群から選択される疾患の治療または予防における、請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
［１８］
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および栄養欠陥からなる群から選択される疾患の治療または予防のための医薬の調製のための、請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
［１９］
それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の組成物を投与することを含み、前記疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、セリアック病、炎症性腸疾患、およびフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）から選択される、方法。
［２０］
ａ．細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、ＭｂｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される細胞付着ポリペプチドをコードする配列、ならびに
ｂ．ＴＦＦポリペプチド、ＭｕｂＢＰ、およびこれらの組合せから選択されるムチン結合ポリペプチドをコードする配列
を含む、融合タンパク質をコードする核酸。

例示的な実施形態
１．融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む細菌であって、前記融合タンパク質が
細胞付着ポリペプチドを含む、細菌。
２．前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液
結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）、ラクトコッカス（La
ctococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）、および任意のこれらの組合せからなる
群から選択される、実施形態１の細菌。
３．前記細胞付着ポリペプチドがＣｍｂＡである、実施形態２の細菌。
４．前記ＣｍｂＡがラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡで
ある、実施形態３の細菌。
５．前記融合タンパク質がムチン結合ポリペプチドをさらに含む、先行する実施形態のい
ずれか１つの細菌。
６．前記ムチン結合ポリペプチドがトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドである、実
施形態５の細菌。
７．前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびＴＦＦを含む、実施形態６に記載の細菌。
８．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている
、実施形態１～７のいずれか１つの細菌。
９．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がプラスミド上に位置する、実施形態１
～７のいずれか１つの細菌。
１０．前記融合タンパク質が前記細菌によって発現される、先行する実施形態のいずれか
１つの細菌。
１１．前記融合タンパク質が前記細菌の細胞壁にアンカーされている、実施形態１０の細
菌。
１２．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、分泌シグナルペプチドをコードす
る分泌リーダー配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの細菌。
１３．前記分泌リーダー配列がＳＳｕｓｐ４５である、実施形態１２の細菌。
１４．前記分泌リーダー配列が、配列番号５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配
列を有する分泌シグナルペプチドをコードする、実施形態１３の細菌。
１５．前記分泌シグナルペプチドが前記ムチン結合ポリペプチドに結合している、実施形
態１２～１４のいずれか１つの細菌。
１６．前記分泌シグナルペプチドがリンカーに結合している、実施形態１２～１５のいず
れか１つの細菌。
１７．前記分泌シグナルペプチドが前記融合タンパク質から切断されている、実施形態１
２～１６のいずれか１つの細菌。
１８．前記分泌シグナルペプチドが、前記融合タンパク質が前記細菌の細胞壁にアンカー
されている時に前記融合タンパク質から切断される、実施形態１７の細菌。
１９．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（Ｐｔｈｙ
Ａ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーターからなる群か
ら選択されるプロモーターによって転写調節される、実施形態１～１８のいずれか１つの
細菌。
２０．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がＰｔｈｙＡによって転写調節される
、実施形態１９の細菌。
２１．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がＰｈｌｌＡによって転写調節される
、実施形態１９の細菌。
２２．前記細菌の細胞壁にアンカーされた融合タンパク質を含む細菌であって、前記融合
タンパク質がＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含む、細菌。
２３．グラム陽性菌である、実施形態１～２２のいずれか１つの細菌。
２４．前記グラム陽性菌が非病原性である、実施形態２３の細菌。
２５．乳酸菌（ＬＡＢ）である、実施形態１～２４のいずれか１つの細菌。
２６．前記ＬＡＢが、ラクトコッカス（Lactococcus）種細菌、ラクトバチルス（Lactoba
cillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカ
ス（Streptococcus）種細菌、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種細菌からなる
群から選択される、実施形態２５の細菌。
２７．前記ＬＡＢが、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッ
カス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus pi
scium）、ラクトコッカス・プランタルム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・
ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）、ラクトバチルス・アセトトレランス
（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus a
cidophilus）、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・
アルジダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobaci
llus alimentarius）、ラクトバチルス・アミロリチカス（Lactobacillus amylolyticus
）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス
・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobac
illus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラクト
バチルス・アビアリウス亜種ラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffinosu
s）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius subsp.
aviarius）、ラクトバチルス・ババリカス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチル
ス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビス（
Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラク
トバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニス（
Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバ
チルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラクトバ
チルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス・カ
ゼイ亜種シュードプランタラム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、ラク
トバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクト
バチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラクトバ
チルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロビオ
サス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus c
ollinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチル
ス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォル
ミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、ラク
トバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis subsp.
torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチ
ルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種クルバ
タス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種メ
リビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デルブル
エッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ブル
ガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブ
ルエッキー亜種デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、
ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. l
actis）、ラクトバチルス・ジベルゲンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス
・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・フェルメンタム（La
ctobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus fornicali
s）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチ
ルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナラム（Lacto
bacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバ
チルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス（La
ctobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）
、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘテ
ロヒオキー（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルジー（Lactoba
cillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキー（Lactobacillus homohiochii）、
ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスチナリ
ス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニー（Lactobacillus je
nsenii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチル
ス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillu
s kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofacien
s）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバチル
ス・クンキー（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus l
actis）、ラクトバチルス・ライヒマンニー（Lactobacillus leichmannii）、ラクトバチ
ルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレフェルメンタンス
（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラ
クトバチルス・マルタロミカス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・マニ
ホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・ミノル（Lactobacil
lus minor）、ラクトバチルス・ミヌタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチルス・
ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus murin
us）、ラクトバチルス・ナゲリー（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オリス
（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバ
チルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼイ（
Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacill
us paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（Lacto
bacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobacillu
s parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paralimentariu
s）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチ
ルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lactobac
illus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラクト
バチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス（Lac
tobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバ
チルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lactobaci
llus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバチルス
・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei
）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus）、ラ
クトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクトバチル
ス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サ
リシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・サリバ
リウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラクトバチ
ルス・サンフランシスセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・
シャルペエ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus
suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクトバチル
ス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Lactobacillus
vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクト
バチルス・ビリデスセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビツリナ
ス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus xylosus
）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバチ
ルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）、ラク
トバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis s
ubsp. yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフィドバ
クテリウム・アドレスセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウ
ム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム
（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve
）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィド
バクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファ
ンチス（Bifidobacterium infantis）、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus
alcedinis）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エン
テロコッカス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enteroco
ccus avium）、エンテロコッカス・カッカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカ
ス・カメリエ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Entero
coccus canintestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロ
コッカス・カセリフラバス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラ
ム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae
）、エンテロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・
ジエストラムメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパル（En
terococcus dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテ
ロコッカス・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカ
リス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faeciu
m）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・
ギルバス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcu
s haemoperoxidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniens
is）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリカ
ス（Enterococcus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、
エンテロコッカス・レマニー（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラタ
ス（Enterococcus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus m
oraviensis）、エンテロコッカス・ムンドチー（Enterococcus mundtii）、エンテロコッ
カス・オリバエ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus
pallens）、エンテロコッカス・フォエニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エ
ンテロコッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュー
ドアビウム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Entero
coccus quebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）
、エンテロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボラム（
Enterococcus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロ
コッカス・サッカロリチカス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シ
レシアカス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococ
cus solitarius）、エンテロ
コッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッカス・テルミチス（
Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランジカス（Enterococcus thailand
icus）、エンテロコッカス・ウレアシチカス（Enterococcus ureasiticus）、エンテロコ
ッカス・ウレイリチカス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコッカス・ビーキエン
シス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロラム（Enterococcus villo
rum）、エンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococcus xiangfangensis）、ス
トレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・
アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococc
us bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカ
ス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ジスガラク
チエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エクイナス（Streptococcu
s equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカ
ス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ミレリ（S
treptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、スト
レプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（
Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus para
sanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Streptococcus peroris）、ストレプトコ
ッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・シュードニ
ューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（St
reptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッティ（Streptococcus ratti）、ス
トレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・
チグリナス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Strep
tococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguin
is）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカ
ス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus ub
eris）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ストレ
プトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）、およびストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）からなる群から選択される、実施形態
２５の細菌。
２８．ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、実施形態２７の細菌。
２９．前記ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）が、ラクトコッカス・ラク
チス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチ
ス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、およびラクトコッカス・ラ
クチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）からなる群から選択される、
実施形態２８の細菌。
３０．前記ＴＦＦポリペプチドが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３からなる群から
選択される、実施形態６～２９のいずれか１つの細菌。
３１．前記ＴＦＦポリペプチドが、ヒトＴＦＦ、マウスＴＦＦ、ブタＴＦＦ、イヌＴＦＦ
、ネコＴＦＦ、ウシＴＦＦ、ヒツジＴＦＦ、魚ＴＦＦ、および両生動物ＴＦＦからなる群
から選択される、実施形態６～２９のいずれか１つの細菌。
３２．前記ＴＦＦポリペプチドがヒトＴＦＦである、実施形態３１の細菌。
３３．前記ヒトＴＦＦがヒトＴＦＦ３である、実施形態３２の細菌。
３４．前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸
配列を有する、実施形態６～２９のいずれか１つの細菌。
３５．前記ＴＦＦポリペプチドがＴＦＦバリアントポリペプチドである、実施形態６～２
９のいずれか１つの細菌。
３６．前記ＴＦＦバリアントポリペプチドが、対応する野生型ＴＦＦポリペプチドと比べ
て増進したムチン結合能力を有する、実施形態３５の細菌。
３７．前記ＣｍｂＡポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％同一のアミノ
酸配列を有する、実施形態１～３６のいずれか１つの細菌。
３８．少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、実施
形態１～３７のいずれか１つの細菌。
３９．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドがサイトカインである、実施形態３８の
細菌。
４０．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドがインターロイキン（ＩＬ）である、実
施形態３８または３９の細菌。
４１．前記インターロイキンが、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、および任意のこれ
らの組合せからなる群から選択される、実施形態４０の細菌。
４２．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが抗原である、実施形態３８の細菌。
４３．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが抗原およびインターロイキンである、
実施形態４２の細菌。
４４．前記インターロイキンがＩＬ－２またはＩＬ－１０である、実施形態４３の細菌。
４５．前記抗原が自家抗原である、実施形態４２～４４のいずれか１つの細菌。
４６．前記自家抗原が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に特異的な抗原である、実施形態４５の細菌
。
４７．前記Ｔ１Ｄ特異的抗原が、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキ
シラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、膵島特異的グ
ルコース－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛ト
ランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペ
プチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲ
Ｐ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４６の細菌。
４８．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが抗体またはその断片である、実施形態
３８の細菌。
４９．前記抗体が単一ドメイン抗体またはナノボディである、実施形態４８の細菌。
５０．前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ－４に対する抗体、ＩＬ－５に対する抗体、Ｉ
Ｌ－１３に対する抗体、ＩＬ－１５に対する抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する
抗体、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４８または４９
の細菌。
５１．前記抗体が、可溶性ＴＮＦ受容体および抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質であ
る、実施形態４８または４９の細菌。
５２．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが酵素またはその断片である、実施形態
３８の細菌。
５３．前記酵素またはその断片が機能的である、実施形態５２の細菌。
５４．前記酵素またはその断片が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ア
ミノ酸デカルボキシラーゼ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実
施形態５２または５３の細菌。
５５．前記酵素またはその断片がＰＡＬである、実施形態５４の細菌。
５６．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－
１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）、グルカゴン、エキセンジン－４、および
任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態３８の細菌。
５７．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが成長因子である、実施形態３８の細菌
。
５８．前記成長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）である、実施形態５７の細菌。
５９．前記ＥＧＦがヒトＥＧＦまたはブタＥＧＦである、実施形態５８の細菌。
６０．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドがＴＦＦである、実施形態３８の細菌。
６１．前記ＴＦＦが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３、および任意のこれらの組合せから
なる群から選択される、実施形態６０の細菌。
６２．前記治療用ポリペプチドがヒトポリペプチドである、実施形態３８～６１のいずれ
か１つの細菌。
６３．前記抗原がアレルゲンである、実施形態４２～４４のいずれか１つの細菌。
６４．前記アレルゲンが、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン
、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、および
任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態６３の細菌。
６５．前記アレルゲンが雑草花粉アレルゲンである、実施形態６４の細菌。
６６．前記雑草花粉アレルゲンがブタクサ花粉アレルゲンである、実施形態６５の細菌。
６７．前記アレルゲンが樹木花粉アレルゲンである、実施形態６４の細菌。
６８．前記樹木花粉アレルゲンがカバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンであ
る、実施形態６７の細菌。
６９．前記アレルゲンが食物アレルゲンである、実施形態６４の細菌。
７０．前記食物アレルゲンが、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グ
ルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、および任意のこれらの組合せからなる群か
ら選択される、実施形態６９の細菌。
７１．少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする前記外因性核酸がｇａｐＢプロ
モーターによって転写調節される、実施形態３８～７０のいずれか１つの細菌。
７２．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比
べた時に増加した胃腸（ＧＩ）通過時間を有する、実施形態１～７１のいずれか１つの細
菌。
７３．前記ＧＩ通過時間が少なくとも約１０％増加している、実施形態７２の細菌。
７４．前記ＧＩ通過時間が少なくとも約３０％増加している、実施形態７３の細菌。
７５．前記ＧＩ通過時間が少なくとも約１０％から約５０％増加している、実施形態７２
の細菌。
７６．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比
べた時に増加したｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力を有する、実施形態１～７５のいずれ
か１つの細菌。
７７．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約２０％増加している、実施形
態７６の細菌。
７８．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約５０％増加している、実施形
態７７の細菌。
７９．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約１００％（約２倍）増加して
いる、実施形態７８の細菌。
８０．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約２０％から約５００％増加し
ている、実施形態７６の細菌。
８１．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力が、前記細菌をブタ胃からのムチンに結合さ
せた後、
（ａ）４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）を検出すること、または
（ｂ）前記細菌をクリスタルバイオレットで染色し、その後に５９５ｎｍでの吸光度（Ｏ
Ｄ５９５）を検出すること
によって測定されたものである、実施形態７６～８０のいずれか１つの細菌。
８２．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比
べた時に増加したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２細胞結合能力を有する、実施形態１～
８１のいずれか１つの細菌。
８３．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２結合能力が少なくとも約１０％増加している
、実施形態８２の細菌。
８４．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２結合能力が少なくとも約１００％（約２倍）
増加している、実施形態８３の細菌。
８５．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２結合能力が少なくとも約４００％（約５倍）
増加している、実施形態８４の細菌。
８６．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２結合能力が少なくとも約１０％から約５００
％増加している、実施形態８２の細菌。
８７．前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２結合能力が、
（ａ）前記細菌の培養物をＣａｃｏ－２細胞と接触させること、
（ｂ）前記Ｃａｃｏ－２細胞を洗浄して未結合の細菌細胞を除去すること、
（ｃ）前記Ｃａｃｏ－２細胞に結合した細菌細胞を脱着させ、それによって脱着した細菌
細胞を形成すること、および
（ｄ）前記脱着した細菌細胞を滴定すること
によって測定されたものである、実施形態８２～８６のいずれか１つの細菌。
８８．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比
べた時に腸粘膜への増加した付着を呈する、実施形態１～８７のいずれか１つの細菌。
８９．腸粘膜への前記付着が少なくとも約１０％から約５００％増加している、実施形態
８８の細菌。
９０．実施形態１～８９のいずれか１つの細菌を含む組成物。
９１．実施形態１～８９のいずれか１つの細菌、および薬学的に許容される担体を含む医
薬組成物。
９２．自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、および胃腸疾患からなる群から選択され
る疾患の治療または予防において使用するための、実施形態１～８９のいずれか１つの細
菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９１の医薬組成物。
９３．疾患の治療または予防のための医薬の調製において使用するための、実施形態１～
８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９１の医薬組成物。
９４．前記疾患が、自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および栄養欠陥
からなる群から選択される、実施形態９３の細菌、組成物、または医薬組成物。
９５．それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効
量の実施形態１～８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９
１の医薬組成物を投与することを含む方法。
９６．前記疾患が、自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および任意のこ
れらの組合せからなる群から選択される、実施形態９５の方法。
９７．前記疾患が自己免疫疾患である、実施形態９６の方法。
９８．前記自己免疫疾患が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である、実施形態９７の方法。
９９．前記疾患が代謝性疾患である、実施形態９６の方法。
１００．前記代謝性疾患がフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、実施形態９９の方法。
１０１．前記疾患が胃腸疾患である、実施形態９６の方法。
１０２．前記胃腸疾患がセリアック病である、実施形態１０１の方法。
１０３．前記胃腸疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、実施形態１０１の方法。
１０４．前記ＩＢＤがクローン病または潰瘍性大腸炎である、実施形態１０３の方法。
１０５．細菌を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させることを含む、遺伝
子改変された細菌を調製する方法であって、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸
が細胞付着ポリペプチドをコードする配列を含む、方法。
１０６．前記接触させることが、前記細菌が前記外因性核酸を内在化させるために充分な
条件下で行われる、実施形態１０５の方法。
１０７．前記外因性核酸がプラスミド上に位置する、実施形態１０５または１０６の方法
。
１０８．前記外因性核酸が前記細菌の染色体に組み込まれる、実施形態１０６または１０
７の方法。
１０９．前記細菌を培養することおよび前記細菌中で前記融合タンパク質を発現させるこ
とをさらに含む、実施形態１０５～１０８のいずれか１つの方法。
１１０．前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、
Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、ＭｂｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、
実施形態１０５～１０９のいずれか１つの方法。
１１１．前記細胞付着ポリペプチドがＣｍｂＡである、実施形態１１０の方法。
１１２．前記ＣｍｂＡがラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂ
Ａである、実施形態１１１の方法。
１１３．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ムチン結合ポリペプチドをコー
ドする配列をさらに含む、実施形態１０５～１１２のいずれか１つの方法。
１１４．前記ムチン結合ポリペプチドがトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドである
、実施形態１１３の方法。
１１５．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ＣｍｂＡをコードする配列およ
びＴＦＦポリペプチドをコードする配列を含む、実施形態１１４の方法。
１１６．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が前記細菌の染色体に組み込まれる
、実施形態１０５～１１５のいずれか１つの方法。
１１７．前記外因性核酸が、相同組換えを使用して前記細菌の染色体に組み込まれる、実
施形態１１６の方法。
１１８．前記細菌を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることをさ
らに含む、実施形態１０５～１１７のいずれか１つの方法。
１１９．前記細菌を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と前記接触させること
が、前記細菌を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と前記接触させることの前に行
われる、実施形態１１８の方法。
１２０．前記細菌を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と前記接触させること
が、前記細菌を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と前記接触させることの後に行
われる、実施形態１１８の方法。
１２１．前記遺伝子改変された細菌が、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含
まない対応する細菌と比べた時に増加した粘膜および細胞付着特性を呈する、実施形態１
０５～１２０のいずれか１つの方法。
１２２．前記遺伝子改変された細菌の培養物を少なくとも１つの凍結保存剤と合わせて細
菌混合物を形成することをさらに含む、実施形態１０５～１２１のいずれか１つの方法。
１２３．前記細菌混合物を凍結乾燥して凍結乾燥組成物を形成することをさらに含む、実
施形態１２２の方法。
１２４．前記遺伝子改変された細菌、または前記凍結乾燥組成物を薬学的に許容される担
体と合わせて医薬組成物を形成することをさらに含む、実施形態１０５～１２１または実
施形態１２３のいずれか１つの方法。
１２５．前記凍結乾燥組成物または前記医薬組成物を医薬剤形に配合することをさらに含
む、実施形態１２３または１２４の方法。
１２６．実施形態１０５～１２５のいずれか１つの方法によって調製された、遺伝子改変
された細菌。
１２７．実施形態１～８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形
態９１の医薬組成物を含む、単位剤形。
１２８．経口剤形である、実施形態１２７の単位剤形。
１２９．前記経口剤形が、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、および包装された液体からなる
群から選択される、実施形態１２８の単位剤形。
１３０．哺乳動物において成長を増進させる方法であって、有効量の実施形態１～８９の
いずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、実施形態９１の医薬組成物、または実施形
態１２７～１２９のいずれか１つの単位剤形を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
１３１．前記哺乳動物が、ヒト、ブタ、ウシ、およびヒツジからなる群から選択される、
実施形態１３０の方法。
１３２．前記細菌、前記組成物、前記医薬組成物、または前記単位剤形が、前記哺乳動物
への投与のために配合されている、実施形態１３０または１３１の方法。
１３３．前記細菌が、成長因子をコードする外因性核酸を含む、実施形態１３０～１３２
のいずれか１つの方法。
１３４．前記成長因子が前記細菌中で構成的に発現される、実施形態１３３の方法。
１３５．前記成長因子がＥＧＦである、実施形態１３３または１３４の方法。
１３６．前記哺乳動物がブタであり、かつ前記ＥＧＦがブタＥＧＦである、実施形態１３
５の方法。
１３７．腸粘膜への細菌の結合を増加させる方法であって、
（ａ）前記微生物を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させることであって
、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ＣｍｂＡポリペプチドをコードする配
列を含む、接触させること、および
（ｂ）前記細菌中で融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を発現させること
を含む方法。
１３８．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がＴＦＦポリペプチドをコードする
配列をさらに含む、実施形態１３７の方法。
１３９．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸の発現が、前記ＴＦＦおよび前記Ｃ
ｍｂＡを含む融合タンパク質を産生する、実施形態１３８の方法。
１４０．（１）実施形態１～８９のいずれか１つに記載の細菌、実施形態９０に記載の組
成物、実施形態９１の医薬組成物、または実施形態１２７～１２９のいずれか１つの単位
剤形、および（２）前記細菌、前記組成物、前記医薬組成物、または前記単位剤形を哺乳
動物に投与するための説明書を含むキット。
１４１．前記哺乳動物がヒトである、実施形態１４０のキット。
１４２．（ｉ）細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、Ｍｂ
ｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される細胞付着ポリペプチドをコ
ードする配列、ならびに
（ｉｉ）ＴＦＦポリペプチド、ＭｕｂＢＰ、およびこれらの組合せから選択されるムチン
結合ポリペプチドをコードする配列
を含む、融合タンパク質をコードする核酸。
１４３．前記ムチン結合ポリペプチドがＴＦＦポリペプチドである、実施形態１４２の核
酸。
１４４．前記ＴＦＦポリペプチドがＴＦＦ３である、実施形態１４３の核酸。
１４５．前記細胞付着ポリペプチドがＣｍｂＡである、実施形態１４２～１４４のいずれ
か１つの核酸。
１４６．実施形態１４２～１４５のいずれか１つの核酸を含むプラスミド。
１４７．実施形態１４６のプラスミドを含む細菌宿主細胞。

Claims (21)

  1. それを必要とする対象における疾患を処置するための、
    (i) 融合タンパク質をコードする第１の外因性核酸；および
    (ii) 治療用ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸：
    を含む組換え乳酸菌（ＬＡＢ）を含む医薬組成物であって、
    前記融合タンパク質が：
    （ａ）Ｎ末端のトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチド；および
    （ｂ）細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）またはラクトコッカスのムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）であるＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含み、
    前記治療用ポリペプチドが、前記組換えＬＡＢを前記対象に投与すると、前記対象の粘膜組織に送達されて、前記疾患を治療し得る、医薬組成物。
  2. 前記疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）またはセリアック病である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記細胞付着ポリペプチドが、ＣｍｂＡである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ＣｍｂＡが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記ＣｍｂＡが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 前記ＴＦＦポリペプチドが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３である、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  8. 前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびヒトＴＦＦ３ポリペプチドを含む、請求項１～７のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  9. 前記融合タンパク質または前記治療用ポリペプチドが、分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１～８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  10. 前記分泌シグナルペプチドが、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（ＳＳｕｓｐ４５）の分泌リーダーである、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記第１の外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、またはｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）に作動可能に連結される、請求項１～１０のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  12. 前記第２の外因性核酸がｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）に作動可能に連結される、請求項１～１１のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  13. 前記治療用ポリペプチドが：
    (i) ＩＬ－２、またはＩＬ－１０であり；
    (ii) プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、またはシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）であり；または
    (iii) グリアジンエピトープを含む、グルテンアレルゲンである；
    請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記組換えＬＡＢが、ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、エンテロコッカス（Enterococcus）種細菌、またはラクトコッカス（Lactococcus）種細菌である、請求項１～１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  15. 前記組換えＬＡＢが、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項１～１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  16. 前記組換えＬＡＢが、前記第１の外因性核酸を欠く対応するＬＡＢと異なる少なくとも１つの特徴を有し、前記少なくとも１つの特徴が；
    (i) 少なくとも１０％増加した胃腸（ＧＩ）通過時間；
    (ii) 少なくとも１０％増加した腸粘膜への付着；
    (iii) 少なくとも２０％増加したｉｎ ｖｉｔｒｏムチン結合能力；または
    (iv) 少なくとも１０％増加したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｃｏ－２細胞結合能力である、請求項１～１５のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  17. 前記組換えＬＡＢが、トレハロース蓄積を増加させる少なくとも１つの変異または挿入をさらに含み、前記少なくとも１つの変異または挿入が：
    (i) ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５遺伝子、ｒｐｍＤ遺伝子のすぐ５’にある遺伝子間領域および大腸菌（Escherichia coli）のＯｔｓＢをコードする核酸を５’から３’の順に含む、第１のポリシストロン性発現カセットの挿入；
    (ii) ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、並びにトレハローストランスポーター遺伝子ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含む核酸を５’から３’の順に含む、第２のポリシストロン性発現カセットの挿入；
    (iii) 不活性化された内因性のトレハロース－６－リン酸ホスホリラーゼ（ｔｒｅＰＰ）遺伝子であって、前記ｔｒｅＰＰ遺伝子は遺伝子の欠失により不活性化され、前記組換えＬＡＢがＴｒｅＰＰ活性を欠く、不活性化された内因性のｔｒｅＰＰ遺伝子；または
    (iv) 不活性化された内因性のセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ｐｔｃＣ）遺伝子であって、前記ｐｔｃＣ遺伝子は、未成熟終止コドンを挿入することによって不活性化され、前記組換えＬＡＢがＰｔｃＣ活性を欠く、不活性化された内因性のｐｔｃＣ遺伝子；
    である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 前記治療用ポリペプチドが、(i) グリアジンエピトープを含む、グルテンアレルゲンおよび(ii) 分泌シグナルペプチドを含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  19. セリアック病を処置するための医薬の調製のための組換えＬＡＢの使用であって、
    前記組換えＬＡＢが：
    (i) 融合タンパク質をコードする第１の外因性核酸；および
    (ii) 治療用ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸
    を含み、
    前記融合タンパク質が：
    （ａ）Ｎ末端のトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチド；および
    （ｂ）細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）またはラクトコッカスのムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）であるＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含み、
    前記治療用ポリペプチドが、前記組換えＬＡＢを対象に投与すると、前記対象の粘膜組織に送達されて、セリアック病を治療し得、
    前記治療用ポリペプチドが、(i) グリアジンエピトープを含む、グルテンアレルゲンおよび(ii) 分泌シグナルペプチドを含む、使用。
  20. 前記組換えＬＡＢがＰＩＮＳとＩＬ－１０を発現し、
    前記ＰＩＮＳが、ｇａｐＢプロモーター、ｇａｐＢ遺伝子、ｒｐｍＤ遺伝子のすぐ５’にある遺伝子間領域、Ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）をコードする核酸配列および前記ＰＩＮＳをコードする核酸配列を５’から３’の順に含む、ポリシストロン性発現カセットの前記ＳＳｕｓｐ４５を含む融合タンパク質として発現され、
    前記ＩＬ－１０が、ｈｌｌＡプロモーター、ＳＳｕｓｐ４５をコードする核酸配列および前記ＩＬ－１０をコードする核酸配列を５’から３’の順に含む、ポリシストロン性発現カセットの前記ＳＳｕｓｐ４５を含む融合タンパク質として発現される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  21. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置するための医薬の調製のための組換えＬＡＢの使用であって、
    前記組換えＬＡＢが：
    (i) 融合タンパク質をコードする第１の外因性核酸；および
    (ii) 治療用ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸
    を含み、
    前記融合タンパク質が：
    （ａ）Ｎ末端のトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチド；および
    （ｂ）細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）またはラクトコッカスのムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）であるＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含み、
    前記治療用ポリペプチドが、前記組換えＬＡＢを対象に投与すると、前記対象の粘膜組織に送達されて、Ｔ１Ｄを治療し得、
    前記組換えＬＡＢがＰＩＮＳとＩＬ－１０を発現し、
    前記ＰＩＮＳが、ｇａｐＢプロモーター、ｇａｐＢ遺伝子、ｒｐｍＤ遺伝子のすぐ５’にある遺伝子間領域、Ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）をコードする核酸配列および前記ＰＩＮＳをコードする核酸配列を５’から３’の順に含む、ポリシストロン性発現カセットの前記ＳＳｕｓｐ４５を含む融合タンパク質として発現され、
    前記ＩＬ－１０が、ｈｌｌＡプロモーター、ＳＳｕｓｐ４５をコードする核酸配列および前記ＩＬ－１０をコードする核酸配列を５’から３’の順に含む、ポリシストロン性発現カセットの前記ＳＳｕｓｐ４５を含む融合タンパク質として発現される、使用。
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