JP2012504116A - 粘膜での微生物のコロニー形成の低減 - Google Patents
粘膜での微生物のコロニー形成の低減 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)PdpsA、usp45及びhIL−10;PdpsA、usp45N4及びhIL−10;
PpepV、usp45及びhIL−10;PpepV、usp45N4及びhIL−10;
PsodA、usp45及びhIL−10;PsodA、usp45N4及びhIL−10;
PhIIA、usp45及びhIL−10;PhIIA、usp45N4及びhIL−10;
(b)PdpsA、usp45N4及びhTFF1;PdpsA、usp45及びhTFF1;
PpepV、usp45N4及びhTFF1;PpepV、usp45及びhTFF1;
PsodA、usp45N4及びhTFF1;PsodA、usp45及びhTFF1;
PhIIA、usp45N4及びhTFF1;PhIIA、usp45及びhTFF1;
(c)PdpsA、usp45N4及びhTFF3;PdpsA、usp45及びhTFF3;
PpepV、usp45N4及びhTFF3;PpepV、usp45及びhTFF3;
PsodA、usp45N4及びhTFF3;PsodA、usp45及びhTFF3;
PhIIA、usp45N4及びhTFF3;PhIIA、usp45及びhTFF3;
(d)PdpsA、usp45N4及びhPYY;PdpsA、usp45及びhPYY;
PpepV、usp45N4及びhPYY;PpepV、usp45及びhPYY;
PsodA、usp45N4及びhPYY;PsodA、usp45及びhPYY;
PhIIA、usp45N4及びhPYY;PhIIA、usp45及びhPYY;PhIIA、usp45及びhPYY G9(3−36);
(e)PdpsA、usp45N4及びGLP−1;PdpsA、usp45及びGLP−1;
PpepV、usp45N4及びGLP−1;PpepV、usp45及びGLP−1;
PsodA、usp45N4及びGLP−1;PsodA、usp45及びGLP−1;
PhIIA、usp45N4及びGLP−1;PhIIA、usp45及びGLP−1;
(f)PdpsA、usp45N4及びGLP−2;PdpsA、usp45及びGLP−2;
PpepV、usp45N4及びGLP−2;PpepV、usp45及びGLP−2;
PsodA、usp45N4及びGLP−2;PsodA、usp45及びGLP−2;
PhIIA、usp45N4及びGLP−2;又はPhIIA、usp45及びGLP−2を含み得る。
1.GI番号
2.遺伝子/タンパク質名
3.略称
4.遺伝子座
5.NCBI参照配列における遺伝子位置
6.プロモーター領域
1.199598845
2.リボソームタンパク質 S14*
3.rpsJ
4.LRH_03200
5.NZ_ABWJ01000023.1:25789..25974
6.19083〜19412
1.199598701
2.ヌクレオイドDNA結合タンパク質
3.dnabp
4.LRH_04048
5.相補体(NZ_ABWJ01000020.1:15543..15818)
6.c(15819〜16051)
1.199599325
2.リボソームタンパク質 S21
3.rpS21
4.LRH_09358
5.相補体(NZ_ABWJ01000036.1:5953..6129)
6.c(6130〜6401)
1.199598841
2.リボソームタンパク質 S17*
3.rpsJ
4.LRH_03180
5.NZ_ABWJ01000023.1:24203..24466
6.19083〜19412
1.199597121
2.50S リボソームタンパク質 L19
3.rplS
4.LRH_07296
5.相補体(NZ_ABWJ01000002.1:62543..62890)
6.c(62891〜63094)
1.199598859
2.50S リボソームタンパク質 L17
3.map40
4.LRH_03270
5.NZ_ABWJ01000023.1:33024..33404
6.31990〜32063
1.199598851
2.リボソームタンパク質 L15*
3.rpsJ
4.LRH_03230
5.NZ_ABWJ01000023.1:28112..28552
6.19083〜19412
1.199598872
2.50S リボソームタンパク質 L13
3.rplM
4.LRH_03335
5.NZ_ABWJ01000023.1:42964..43410
6.42698〜42963
1.199597445
2.ホスホグリセリン酸ムターゼ 1
3.pgm1
4.LRH_13389
5.NZ_ABWJ01000004.1:98387..09076
6.98118〜98386
1.199598838
2.リボソームタンパク質 S3*
3.rpsJ
4.LRH_03165
5.NZ_ABWJ01000023.1:22898..23560
6.19083〜19412
1.199597503
2.リボソームタンパク質 S4
3.rpS4
4.LRH_06231
5.NZ_ABWJ01000005.1:20167..20778
6.19992〜20166
1.199597272
2.グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
3.cggr
4.LRH_05289
5.NZ_ABWJ01000003.1:50087..51109
6.48208〜49012
*同一オペロン
1.GI番号
2.遺伝子/タンパク質名
3.遺伝子座
4.NCBI参照配列NC_004350(バージョン1)における遺伝子位置
5.プロモーター領域
1.1350920
2.30S リボソームタンパク質 S10
3.SMU.2026c
4.相補体(1893020..1893130)
5.c1893131〜1893647
1.24379304
2.50S リボソームタンパク質 L27
3.SMU.849
4.797718..798011
5.796862〜797035
1.24378669
2.30S リボソームタンパク質 S15
3.SMU.154
4.156212..156481
5.155470〜156212
1.24378669
2.30S リボソームタンパク質 S16
3.SMU.865
4.814687..814962
5.814285〜814686
1.24379704
2.50S リボソームタンパク質 L19
3.SMU.1288
4.相補体(1214632..1214979)
5.c1214980〜1215169
1.24380355
2.30S リボソームタンパク質 S8
3.SMU.2012
4.相補体(1887696..1888094)
5.c1888095〜1888350
1.24380353
2.50S リボソームタンパク質 L18*
3.SMU.2010
4.相補体(1886301..1886657)
5.c1886658〜1886746
1.24378685
2.30S リボソームタンパク質 S9
3.SMU.170
4.170269..170661
5.169406〜169798
1.24380352
2.30S リボソームタンパク質 S5*
3.SMU.2009
4.相補体(1885788..1886282)
5.c1886658〜1886746
1.15902260
2.50S リボソームタンパク質 L17
3.SMU.2000
4.相補体(1880033..1880419)
5.c1881377〜1881421
1.24380345
2.30S リボソームタンパク質 S13
3.SMU.2003
4.相補体(1881823..1882188)
5.c1882569〜1882686
1.24378855
2.30S リボソームタンパク質 S7
3.SMU.358
4.334526..334996
5.334997〜335164
1.24380350
2.50S リボソームタンパク質 L15
3.SMU.2007
4.相補体(1884859..1885299)
5.c1885300〜1885591
1.24380465
2.30S リボソームタンパク質 S4
3.SMU.2135c
4.相補体(1999236..1999847)
5.c1999848〜1999950
1.24380354
2.50S リボソームタンパク質 L6
3.SMU.2011
4.相補体(1886747..1887283)
5.c1887284〜1887695
1.161486819
2.30S リボソームタンパク質 S3**
3.SMU.2021
4.相補体(1890900..1891553)
5.c1892786〜1893019
1.24379074
2.ホスホグリセロムターゼ
3.SMU.74
4.74927..75637
5.74855〜74926
1.24380367
2.50S リボソームタンパク質 L3**
3.SMU.2025
4.相補体(1892159..1892785)
5.c1892786〜1893019
*同一オペロン
**同一オペロン
thyA欠損突然変異株の構築
本発明者らは、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・サリバリウスWCFS1から、thyA遺伝子に隣接する1000bp領域をクローン化している。以下に記載のような方法における任意のストレプトコッカス株及びラクトバチルス株の遺伝子改変のためのDNA配列情報は公的な供給源から利用可能である(表1)。
野生型のストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・サリバリウス細菌を、クロラムフェニコール(Cm)選択マーカーをコードするプラスミドを用いて形質転換した。それらの各々のthyA欠損突然変異体を、エリスロマイシン(Em)選択マーカーをコードするプラスミドを用いて形質転換した(上記又は順番を逆にしてもよい(vice versa))。
1.生物
2.ゲノム配列
3.thyA遺伝子
4.5’ thyA標的
5.3’ thyA標的
1.ストレプトコッカス・ミュータンス UA159
[1]
2.GenBank AE014133
参照配列 NC004350
3.遺伝子番号 1028296
4.配列番号1
5.配列番号5
1.ラクトバチルス・アシドフィルス NCFM
[2]
2.GenBank CP000033
3.参照配列 NC006841
4.遺伝子番号 3251830
5.配列番号2
6.配列番号6
1.ラクトバチルス・プランタラム WCFS1
[3]
2.GenBank AL935263
3.参照配列 NC004567
4.遺伝子番号 1064048
5.配列番号3
6.配列番号7
1.ラクトバチルス・サリバリウス UCC118
[4]
2.GenBank CP000233
3.参照配列 NC007929
4.遺伝子番号 3976937
5.配列番号4
6.配列番号8
[1](Ajdic et al., 2002(PNAS 99(22):14434-9)
[2](Altermann et al., 2005(PNAS 102(11):3906-12)
[3](Kleerebezem et al., 2003(PNAS 100(4):1990-5)
[4](Claesson et al., 2006(PNAS 103(17):6718-23)
CAAAATTCACCTTAAGTTTTTCCTGCAAATCAGATGGGACTTGCTTATCCATGATTTTGTTAAAGCCTTTAAGAGCTAGTTTAGGAAAAGGAAGATGAAAGCAAAAAGCTGCAAAATCAGTTAAAGAAACATCAAAACGTTTTTGATATTCTGCCCAAGTCGTTTTCAGCATATCCAAATATTGTTTGGTAGAATACATACCATTAACATAAGGTGTTGTTGTATAATTTGGCCGCCAAAAATCCATAATATCACGTGTCTGAGCTAAGGTCTCATCATGAAGAATAAGAATACGGGGATCTTTTTTGACCAGCATGGCAATGCTGCCGGCTCCTTGAGTAGATTCTCCGGGAGTTCCAATTCCGTATTTGGCAATATCGCTAGCAAGAACAAGCACACGCGTGTCAGGATGTTTTTCAACATGCAGTTTAGCATAGTTGAGAGCTGCAGTAGCACTGTAGCATGCCTCTTTCATCTCAAAGCTGCGCGCAAAAGGCTGAATACCTAATAAGGAATGCACATAAACAGCTCCAGCCTTACTTTGATCAACGCTGGATTCGGTAGCTAAAATGACCATATCAATTTTTTCTTTATCCTCTGCAGTCAGAATTTCATTGGCTGATCCGGCTGCTAGGGTGACAACGTCGTCGGTAATAGGAGCGATGCTAAGAGCATTCAGCAAAAGTCCTTTACTGAATTTTTGGGGATCTTCGCCACGGGCCTCAGCTAAATCTTTCATATTCAGGACATATTGGCTGCTTGTAAAACCAATTTTATCAATCCCAATTCTCATAAGTCAATCCTTCTTTTCTTTTTTATCTGATTTCTTTTTTGTAAAATGTCATAGTTATTTTATCACAATTTAAACTAAAGGTAATGAATAAACTTTCAAGGATTCAATTTTTGGGAGAATCTGTCAGATCAGACGAAACCTATTTTTTCTGCTATAATATCTAAAAGAAGTTTAAATTATTTTCTTAGAATCATAGAAGGAGAAGCA
SEQ ID N 5
AAATGACGAGCCAATAATTATGGCTCTTTTTTATAAAAAACCAATATATGTCTTGACACA TGTAAAAAACGTTGTATAATGATTTCAAACATTAATTAAAAAGGTGGAGCAAAACGGTGT CTAGAAAAGCAAGCAATATCTGGGATAATTTTAAATGGCTGTGGCAAGAAGGTAAAAAAT TAGGCTTTTGGGGGATATTACAAGCGCTATGGGAGGATTTGGTTAAAAATAGGAGCCTGTCGCAGTGGCTATACCTTTTAGCTCTTAGTTTTCCAACACTGGTTTTAGAATTTATCGGTGGAACACGGCACATTGCTGGTTTTGCGGCAGCACTGACAGGAATTCTATGTGTTATCTTTGTTGCTGAGGGGCGTATCAGTAATTATTTCATCGGTTTTATTCATGAAATGCTCTATCTTT ATCTCAGTTTTGAAAATATGTATTATGGTGAAGTTTTAACAACCTTATTTTTCACTGTCA TGCAATTTGTCGGTGCTTATTATTGGTTGATTGGACATCGTGAAGGACAGGGAAAGAAAG TTGAAGTAAAGGATGTTAAATCACGAAAACTGACACCCCTAGGCTGGTTGAAATCACTTG GAATTACAATTATTGTTTGGTTAGTTTTTGGCTTTATTTATCGATCAATCGGTTCGCATC GCCCTTTTTGGGATAGTTCAACAGATGGTACCAATTGGAGCGGTCAGTTTCTTCAAACAG GCATGTACAGTGAACAATGGCTCTTTTGGATTGCGACCAATGTTCTCAGCATTTTTCTTT GGTGGGGTGCAGAACCACATGTTATGCTCATGTATATTATTTATATGATTAATAGTATTG TTGGTTGGGTAAAATGGGAACGTGATCTTAGAATAACTCAAGAACAGTTAGCTTAAATAA GGAGTTTAAATACAATAGACAAAATGCATTTGAGTTTTTTCAATGCATTTTTTTTAGAAA TTTGATAAAATAAGAAAAGTATGAACAATAAGCGAGAAAA
SEQ ID N 2
ATTTTCTTTGGTGTAGGCAACGGTGGAAAGCCAATTGGTTTTAGCAATTTATGGGCTCATGGCGGTTTCTTTACTGGCGGAGTAAAAGGCTTTTTCTTCTCGATGTCAATTATTGTTGGTTCATATGAAGGAATTGAGTTGCTAGGCATTTCGGCAGGCGAGGTGGCTAACCCGCAAAA AGCAATTGTAAAGAGTGTCAAGTCTGTTCTTTTGAGAATTTTAATTTTCTACGTTGGTGCAATTTTTGTGATTGTAACTATTTATCCGTGGAATAAGTTAAGTAGCTTAGGTTCTCCTTTT GTAACTACCTTTGCTAAGGTAGGAATCACTGCTGCTGCTTCGATTATTAACTTCGTTGTA TTAACTGCAGCATTGTCAGGAGCTAACTCGGGGATTTATTCATCAAGTAGAATGCTATTT AAATTGTCTCATGATAATGAAGCACCTAGTGTATTTAAGCATATTTCTAAGAGAATTGTG CCTGATCGCGCCATTATGGGGATTTCTGGTGGGATTTTTATTGGGTTTATTTTAAATATA ATTGCATCTCAATTTAATCATTCGGCATCAGATTTATTTGTGATTGTCTTCAGTTCATCA GTTTTACCAGGAATGATTCCATGGTTTGTAATTCTATTGGCTGAGTTAAGATTTAGAAGA CATAATCAAGATATGATGAAAGATCACCCGTTCAAATTGCCGTTATATCCATTTTCTAAT TACTTCGCATTTTTAATGCTGTTAGTAATTGTTATCTTTATGTTTATTAATCCAGATACT AGAATTTCAGTAATTACCGGAGCATTGGTATTAATTGTGGCTACAATTGTTTATTTAGTT AGACATAAAGATGAATTTAGTAAAAATAATTAATGATTAAGAAGTCTTGAAATTTCAGGG CTTTTTATTTTTACCAAATACTAAATATTGATACTTGCATTATCAAAAATACTAGATCTA TGGTATCTTAAAAAGAAATGATACTTAAAGGGTGAGATAA
SEQ ID N 3
TTCGCTCGGTCAGCAGCGTTTGGGTAAGAAAGTGATCGAGTTAAAGGACGCGAGCTTGCAGTTTGATCGGCAAACCATCCTGGATCACTTTTCGATGTTGATCCAAGCCAATGACCGCATCGGTATCACTGGAATCAACGGTGCCGGGAAATCTAGTTTATTGAATGTGATTGCGGGT CGACTGCCACTTGATAGTGGGACCGTGACGATCGGTGAGACCGTCAAGATGGCCTATTATACTCAACAGACCGAACCGATTCCGGGCGACAAGCGCATCATTAATTACTTGCAAGATGTCGGTGAGACGGTCTTGAATAAGCAGGGCGAGCATGTTTCAGTGACTGAGTTACTAGAAGAGTTTCTGTTCCCACGTTCGATGCACGGCACGCTGATTCGCAAGTTATCTGGGGGCGA ACAGCGCCGGCTATACTTACTGAAGTTGTTGATGCAACAGCCGAACGTCCTCTTATTGGACGAACCGACTAATGATTTGGATATTGGTACGTTAACGGTGTTGGAGAACTACCTCGATGATTTTGCCGGGACCGTCATCACTGTTTCCCATGACCGCTATTTTTTGGACAAGGTCGGCACGAAACTACTGATTTTTGATGGTCAGGGGCATATTGAACGCTATTCTGGCCGTTTCTCCAGTTATTTGAAGGATCAAAAAGACGCGGCCAAGCCCGCAGCCAAGGCCACTGCGACAAAAACTACGGCTAAGCCGGTCACGGATGACTCGACCGCACCATTGGCCAAGAAAGCCAAAGTCAAGCTGACTTACGCGGAACAGCTCGAATACGACAAGATCGAAGGGGTTATCGAGCAATTGGATAGCCATAAGAGTGAGATCGAAGCGGCGATGGCTGCCAATGCCAGTGATTATGGCAAGTTGGCTGATTTGCAAAAAGAATTGACTAAGACGGAACAAACGATTGATGAGAAGATGGATCGCTGGGACTACCTCAGCCAGTATGCAGAAGCCTGAAAGGATGATCGC
SEQ ID N 6
GGTGAAGTAATGATTGAATATGTTTGGGCAGAAGATAAAGAAAAAAATATTGGCTTGAATGGACATTTACCATGGTATTTGCCGGCTGATATGAAGCATTTTAAAGAAGTAACAATTAATCATCCAATAATTATGGGAAGAAAAACATTTGAAAGTTTTCCTAATTTGTTACCTAAAAGA AAACATATTGTTTTAACTCATAATGAAGAGCTAAAAAATAAATATCAAAATAATGATCAAGTGACTATTTTACCCACAGTTGAAGATTTACATAATTTTGTGGCAGAACATCAAGATGAG CGGATGTGTGCAATTGGTGGAGTGTCGATTTTTAACGCTTTAATGGACCAAGTAGAAGTATTAGAAAAAACGGAGATAGATGCGATTTTTGAAGCAGATACTAAAATGCCTGAAATTGAT TATAGCCGTTTTAATTTAGTAGCTAAGAAGCATTATGAGCCGGATGAGAAAAATAAGTATCCATATACTTTTTTAACTTATAAATTAAAGTAAAAAAAGCCCGCAATTTGCGAGCTTTTT TGAATCTTAGGTATAATATTAATAAATATTAAGTTTCTTAGGTAATAATATATGAATGAAGAAAAAACAAATTTAAATACGGGCCTGACAGCTGCACAAGTTAAGCAAAAAATTGAAGCT GGTGAAATTAATAAGGCCGTTGATGATCAATTTAAAACAAATAAACAAATTATTGCAGAAAATTTATTTACTTACTTTAACTTGATTTTCTTAGTACTATCATTACTTTTGATTTTTGTT GGCGCATATAAGGATTTAACTTTTTTGCCAGTCATTGTTTTAAATACTGTAATTGGAATTGTGCAAGAAATTCGTGCTAAAAAAATATTGAACAAGTTAAACGTAATGAATGCTACAGAT ATTGGGGCTTTGCGAGATGGAAAAGAAGTACAAGTACCAATAGAAGAGTTAGTTAAAGGCGATATTGTTTTATTAAAAACAGGCGATCAGATTCCAGCAG
SEQ ID N 7
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SEQ ID N 4
TTGAT ATTAATTTAGGACAACAAAGATTGGGAAAGAAAGTATTAGAATTAAAAGATGCAA GTTTAACAATTGGAAATCATAAAATAATTGAAGATTTCAATTTGCTAATCCAAGCTGGAGACAGAATCGGTATTACAGGCGTTAATGGTGCCGGGAAATCTAGTTTTTTAAATGCTTTATCAGGTGAATTGCCATTAGATTCAGGTATTTTGACAATCGGTGAAACTGTAAAGATGGCTTATTATCGACAACAGACGGAAGAGATTCCTGAAGATAAAAGAATTATTAGTTATTTAAACGAAGTTGGTCAAAATATTGTAAATAAAGATGGTGAGCGAATTAGCACAACTCAATTATTGG AACAATTTCTATTTCCAAGATTTATGCATGGAACATTGATTCGCAAACTCTCTGGCGGTGAAAAAAGACGCTTGTATCTTTTGAAATTATTAATGTCTCAACCTAATGTTTTATTATTGG ATGAACCAACTAACGATTTAGATATAGGAACATTAACAGTTTTGGAAGATTATTTAGATAACTTTAACGGAACTGTTATTACCGTATCACATGACAGATATTTTCTTGATAAGGTAGCTG ATTCATTATATATCTTTGAAGGAAATGCAAAAATCAAGCATTATGTCGGAATGTTTACAGATTATCTGAAGAATGCTGAGAATGAAGCAGTTAAGACTAAAAAACAAGTATCTGCAACAAAAGTAGAAAAGACAGATAGTGCAGAAGACAAAGTTAAAAAGAAAACCAAGTTAACTTACGCTGAAAAGATGGAATATGAAAAATTAGAATCAGAAATCGATAAGCTTGAAAATGATAAAGCAAGTTTAGAAGAAGAAATGCAACATGTTGATGGGGCTGATTATACTAAATTAGCAAGTTTACAGCAACAAATTGATGAATTAGATGAAGATATTATGGAAAAAGTTCAACGTTGGGACG AACTTAGTCAGTATGTTGATTAATAGGAAGGAGAACACCG
SEQ ID N 8
TCTGTGAGGTGTGCACTATGATTTCATTTGTATGGGCAGAAGATCAAAAACATCAAATAGGATATAAAGGACATTTACCTTGGAGACTTCCAGCCGATTTGGCTCATTTTAAAGAAGTTACAATGGGTCATCCAATGGTAATGGGGAAGAAAACGTTTGATAGTTTTCCTGGTTTATTACCAAGACGTCAACATATAGTGTTAACCCATGATACTAACTTAGAAGAAAAGTATAAAGATAATCCCCAAGTAGAAATTATGAATTCTATTGATGAATTAACTTCTTGGTTAGATGAAAATCAGTTTCAAGAAGTTAGCGTTATTGGTGGAGCGATGTTATTCAACTTACTTCTTAATAAAGTAGATAAATTATATAAGACTGAAATACTAAGTGAGTTTAATGGCGATACGGTTATGCCTACTATTAATTATGATGAATTTAAACTTGTTTCAAAAAAAATCGGTAAGGTAGATGAAAAAAACAAGTATCCTTATGTATTTTTGGAATACGAAAGAAAATAATTTCTAATAAAAATAATGAAAGATGAGTAAGACAATTTTGTAGTACTCATCTTTTTTTACATTTTTAAGGCTTAAATGTTGACTTCAAGTTAACTTGAAGTTTTATTATAGATATGTAAGTTCATATAGGGTTGATATTAAAAACTCTAAATTTTTAAGAGAAGGATGTGCTAAATATGCAAAAATTATCAAGTTTAACATCGCCATTAGTTCTAGCGAATGGTGTTGAAATTCCAGGACTAGGCTATGGTACTTACCAAACTCCACCTGAAGATACATACAAAGTAGTATCAGAAGCATTATCAATCGGTTATCGCCACATTGACACAGCTGCATTATATGGCAATGAAAGTGGTGTAGGTAAGGCTGTTAAAGATAG TGGGTTGAAGCGTGAAGAAGTATTTATTACTAGTAAGTTATGGAATACTGAACGTGGATACGACAAAGCAATTGCTTCCTTTAATAAGACTTTAGAAAAT
ストレプトコッカス・ミュータンスはグラム陽性の通性嫌気性乳酸産生細菌である。ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト及びハムスターの歯表面でコロニーを形成する種である。そのようなものとして、ストレプトコッカス・ミュータンスは治療用タンパク質を口腔粘膜に送達するための宿主生物として働く興味深い候補物質である。したがって、ストレプトコッカス・ミュータンスのコロニー形成能に対するthyA欠損の影響を本明細書で調べた。本発明者らの実験では全て、野生型ストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924 AL株(LMG14558;ATCC25175;NCTC10449)を用いた。
二重相同組換えにより、ストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924 AL株のthyAを大腸菌β−グルクロニダーゼ(GUS)をコードするuidA遺伝子に置き換えた(図1、図2)。構築戦略では、条件付き複製プラスミド、pAGX0725を用い、これを非許容環境下でストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924 ALに導入した。プラスミドpAGX0725はthyAの上流で(thyA 5’)又は下流で(thyA 3’)染色体DNAからクローン化した1kb領域内にuidA遺伝子を保有する。エリスロマイシン含有固体寒天プレート上でのプレーティングによって、thyA 5’領域又はthyA 3’領域のいずれかで相同組換えが起こったコロニーのみの成長が可能となる。この例では、PCRにより検証されたように、第1のコロニーの成長をもたらした世代内において両方の領域で組換えが起こっている。得られるストレプトコッカス・ミュータンス株をsAGX0108と呼んだ。遺伝子修飾領域は構造をPCRで検証し、その結果はthyA 5’及びthyA 3’での組換え事象の存在、uidA遺伝子の存在、並びにthyAの非存在を示し、それらは全てストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924 ALにおけるこの領域の構造とは対照的である(図2)。
ハムスターにおけるthyA+及びthyA−ストレプトコッカス・ミュータンスのコロニー形成能を調べた。ハムスターの頬袋でthyA+及びthyA−ストレプトコッカス・ミュータンスを接種することによりこれを行った。これらのin vivoコロニー形成研究のために、接種したthyA+及びthyA−ストレプトコッカス・ミュータンスをハムスター口腔に存在する微生物叢から選別する方法が要求される。thyA+及びthyA−ストレプトコッカス・ミュータンスの混合物を接種させるため、この方法は、両方の株の相互選別も可能にするものでなければならない。
1 2 1+2
BHI+T 30コロニー 0コロニー 44コロニー
BHI+T+C-Gluc 白色:79コロニー 青色:134コロニー 白色:55コロニー
青色:44コロニー
ストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924 AL pILPOL及びストレプトコッカス・ミュータンスsAGX0108を、クロラムフェニコール耐性を運搬するプラスミドを用いて形質転換した。これによりストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924 AL pILPOL Cm+株及びストレプトコッカス・ミュータンスsAGX0108 Cm+株を得た。しかしながら、クロラムフェニコール(chlorampheincol)耐性が株を33℃以上で成長させた場合に世代を超えて遺伝するかどうかが不確かであり、ハムスターでのin vivo実験には適合しないことを見出した。
株 供給源 関連特徴
GUS Emに対する耐性 Cmに対する耐性ストレプトコッカス・
ミュータンスClarke LMG − − −
1924AL株
ストレプトコッカス・
ミュータンスClarke AGX − + −
1924AL
pILPOL株
ストレプトコッカス・
ミュータンスClarke AGX + − −
sAGX0108
BHI :ブレインハートインフュージョンブイヨン
TF−BHI:チミジン無含有ブレインハートインフュージョンブイヨン
E :エリスロマイシン
T :チミジン
X−Gluc:5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩
GUS :β−グルクロニダーゼ
thyA :チミジル酸シンターゼ遺伝子
uidA :大腸菌β−グルクロニダーゼ遺伝子
LMG :ヘントの微生物研究所(Laboratory of Microbiology Ghent)
AGX :ActoGeniX
BAM9T :アミノ酸及びチミジンを添加したカーボネート及びM9塩緩衝液
BM9 :カーボネート及びM9塩緩衝液
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Claims (20)
- 微生物のコロニー形成能を低減又は消失する方法であって、前記微生物においてチミジル酸シンターゼ(thyA)遺伝子を欠陥状態にさせることを含む、方法。
- thyA遺伝子を欠陥状態にさせることにより、前記微生物株においてチミジル酸シンターゼ欠乏が起こる、請求項1に記載の方法。
- 微生物が被験体、又はヒト又は動物において予防効果及び/又は治療効果を誘起する、請求項1又は2に記載の方法。
- 微生物が被験体、又はヒト又は動物において予防的応答及び/又は治療的応答を誘起することが可能である異種発現産物を発現する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種発現産物が抗原又は非ワクチン原性の予防的に及び/又は治療的に活性のあるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である、請求項4に記載の方法。
- 微生物が細菌、酵母又は真菌である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物が粘膜、又はヒト又は動物の粘膜、又は消化管の粘膜に存在することが可能である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物がカンジダ種、アスペルギルス種、ペニシリウム種、サッカロミセス種、ハンゼヌラ種、クリベロミセス種、シゾサッカロミセス種、チゴサッカロミセス種、ピチア種、モナスカス種、ゲオトリクム種、ヤロウイア種、バクテロイデス種、クロストリジウム種、フソバクテリウム種、ユーバクテリウム種、ルミノコッカス種、ペプトコッカス種、ペプトストレプトコッカス種、ストレプトコッカス種、ビフィドバクテリウム種、エシェリキア種及びラクトバチルス種のいずれかであり、又は該微生物がビフィドバクテリウム種又はラクトバチルス種であり、又は該微生物がカセイ菌、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・サリバリウス若しくはラクトバチルス・ラムノサスから選択されるラクトバチルス種、並びにその任意の亜種及び株であるか、又は該微生物がストレプトコッカス種、又はストレプトコッカス・ミュータンス、並びにその任意の亜種及び株であるか、又は該微生物がバクテロイデス種、又はバクテロイデス・オバタス、並びにその任意の亜種及び株である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物のコロニー形成能を低減又は消失するための前記微生物におけるチミジル酸シンターゼ欠乏の使用。
- 不活性チミジル酸シンターゼ遺伝子(thyA)を含む微生物であって、ヒト又は動物の粘膜でのコロニー形成能がその野生型祖先のものと比較して低減している、微生物。
- チミジル酸シンターゼが欠乏している、請求項10に記載の微生物。
- 前記微生物が被験体、又はヒト又は動物において予防効果及び/又は治療効果を誘起する、請求項10又は11に記載の微生物。
- 前記微生物が被験体、又はヒト又は動物において治療的応答又は免疫原性応答を誘起することが可能であるポリペプチドをコードする組換え核酸をさらに含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記組換え核酸が抗原及び/又は非ワクチン原性の治療的に活性のあるポリペプチドをコードする、請求項13に記載の微生物。
- 前記抗原がヒト又は動物の被験体において免疫応答又は免疫寛容応答を誘起することが可能であり、及び/又は前記非ワクチン原性の治療的に活性のあるポリペプチドがヒト又は動物において治療効果を生じることが可能である、請求項14に記載の微生物。
- 細菌、酵母又は真菌である、請求項10〜15のいずれか一項に記載の微生物。
- 粘膜、ヒトもしくは動物の被験体の粘膜、又は消化管の粘膜に存在することが可能である、請求項10〜16のいずれか一項に記載の微生物。
- カンジダ種、アスペルギルス種、ペニシリウム種、サッカロミセス種、ハンゼヌラ種、クリベロミセス種、シゾサッカロミセス種、チゴサッカロミセス種、ピチア種、モナスカス種、ゲオトリクム種、ヤロウイア種、バクテロイデス種、クロストリジウム種、フソバクテリウム種、ユーバクテリウム種、ルミノコッカス種、ペプトコッカス種、ペプトストレプトコッカス種、ストレプトコッカス種、ビフィドバクテリウム種、エシェリキア種及びラクトバチルス種のいずれかであり、又は該微生物がビフィドバクテリウム種又はラクトバチルス種であり、又は該微生物がカセイ菌、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・サリバリウス若しくはラクトバチルス・ラムノサスから選択されるラクトバチルス種、並びにその任意の亜種及び株であるか、又は該微生物がストレプトコッカス種、又はストレプトコッカス・ミュータンス、並びにその任意の亜種及び株であるか、又は該微生物がバクテロイデス種、又はバクテロイデス・オバタス、並びにその任意の亜種及び株である、請求項10〜17のいずれか一項に記載の微生物。
- 薬剤としての使用のためのコロニー形成が低減した株又は非コロニー形成株である、請求項10〜18のいずれか一項に記載の微生物。
- 予防用分子及び/又は治療用分子の送達のための、又は1つ又は複数の異種発現産物の送達のためのコロニー形成が低減した株又は非コロニー形成株としての、請求項10〜18のいずれか一項に記載の微生物の使用。
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