KR101495640B1 - 신규한 렙토린비아 코리엔시스 ｋｉｏｓｔ－１ 균주 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법 - Google Patents

신규한 렙토린비아 코리엔시스 ｋｉｏｓｔ－１ 균주 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기탁번호 KCTC12347BP로 기탁된, 4 μmol photon/m2/s 미만의 저광 조건 하 사상체에서 뿌리혹을 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1)에 대한 것이다.

Description

신규한 렙토린비아 코리엔시스 ＫＩＯＳＴ－１ 균주 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법{NOVEL LEPTOLYNGBYA KOREENSIS KIOST-1 AND A METHOD OF PRODUCING BIOMASS USING IT}
본 발명은 신규한 무독성의 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1 균주 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법에 대한 것이다.
시아노박테리아 또는 남조류(blue-green algae)(Cyanophytes, Cyanoprokaryotes)는 전세계적으로 광범위하게 분포하는, 25억년이 넘게 수중 및 육지 생태계에서 주된 미생물 구성성분이었던 산소성(oxygenic) 광합성(photosynthetic) 원핵생물군의 오랜 혈통이다. 지금까지 150 종류가 넘는 속들 및 2000 종류가 넘는 종들이 시아노박테리아에서 분류되었으며, 다양한 형태, 서식지 및 대사(metabolism)형태 들을 보인다(Castenholz, R. W. 2001. General characteristics of the cyanobacteria, p.474?487. In D. R. Boone and R. W. Castenholz (ed.), Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd ed., vol. 1. Springer-Verlag, New York, NY., Prasanna R, Sood A, Jaiswal P, Nayak S, Gupta V, Chaudhary V, Joshi M, Natarajan C. 2010. Rediscovering cyanobacteria as valuable sources of bioactive compounds (Review). Appl. Biochem. Microbiol. 46:119-134.) 이러한 시아노박테리아는 생물학적인 탄소 격리(carbon sequestration), 산소 또는 수소 생산 및 질소 고정 등의 다양한 특성을 지니며 최근 이러한 역할이 광범위하게 연구되고 있다. 현재, 시아노박테리아는 재생가능한 바이오 에너지를 생산하기 위한 생물공학적 적용을 위한 후보들 및 다양한 생물학적인 활성 성분으로 주목받고 있으며, 또한 상대적으로 짧은 수명과 다변성(transformability) 때문에 시아노박테리아에 대하여 광범위한 유전공학적 접근들이 수행되었다. 그럼에도 불구하고 시아노박테리아는 전통적으로 식품 생산물 또는 식이보조제로 이용되어왔으며, 그 바이오매스는 색다르지만 중요한 단백질원이다. 실제로, (S. maxima 및 S. platensis를 포함하는) 스피룰리나(Spirulina), Nostoc commune, N. flagelliforme, N. punctiforme , Aphanizomenon flos-aquae 및 Aphanotheca sacrum 와 같은 많은 종류의 시아노박테리아들이 음식 또는 건강 증진용 천연 상품으로 국내외 시장에서 이용된다. 게다가, 몇몇 사상성 시아노박테리아들의 생산성 및 바이오매스 조성이 잠재적 상업적 플랫폼 균주들의 개발을 위한 연구에서 평가되었다. 그러나 시험된 시아노박테리아 균주들의 대부분이 상업적 규모의 생산에 적합하지 않았으며, 스피룰리나 종들만이 성공적으로 인간 또는 동물 소비를 위한 식품원료로써 성공적으로 배양되었다.
본 발명자들은 한국해양과학기술원 (Korea Institute of Ocean Science & Technology, KIOST)의 야외 외륜(paddle-wheel) 수로지에서 S. maxima의 장기 배양을 수행하던 중 신규한 호염기성 및 광염성 섬사상 시아노박테리아인 Leptolyngbya koreensis KIOST-1을 분리하여, 해당 분리물의 생물학적 특성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 무독성의 렙토린비아 균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 기탁번호 KCTC12347BP로 기탁된, 4 μmol photon/m2/s 미만의 저광 조건 하 사상체에서 뿌리혹을 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 무독성의 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1)를 제공한다.
본 발명의 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1)는 스피룰리나와 함께 혹은 단독으로 야외배양이 가능하며, 무독성의 바이오매스를 생산할 수 있다.
도 1은 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1를 분리한 배양 연못 및 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1의 형태적 특징들을 나타낸다. 도 1(a)는 본 발명의 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1를 분리한, 한국해양과학기술원 (KIOST) 내 야외 외륜 수로지 스피룰리나 배양 연못이다. 상기 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima) Cy-23의 배양지에서, 청록색 매트(빨간 화살표) 및 부유하는 섬사상 시아노박테리아(검은 화살표)가 관찰되었다((b) 및 (c)). 1(d)는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1의 부유하는 필라멘트들의 광학현미경 상 사진이고 (e) 및 (f)는 주사전자현미경 사진들이다. 싸개, 가스포, 헤테로시스트들, 아키니트들, 뿌리혹들 및 뿌리혹 유사구조들, 네크리딕 세포들은 발견되지 않았다. 반면 내피막 없이 뭉툭한 원뿔 형상의 정단 세포들(f)이 관찰되었다. 기준자(Scale bar): 500 μm (b), 100 μm (c) 및 10 μm (d).
도 2는 종단면(a, b, c), 접선단면(tangential)(b) 및 횡단면(d)으로 절편된 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1의 투과전자현미경 사진을 나타낸다. 초기단계(e) 및 후기 단계(f) 세포 분열의 필라멘트의 단면은 틸라코이드막 및 가로지르는 벽들의 대칭적 함입을 보였다. Th parietal thylakoids, Cy cyanophycin, Np nucleoplasmic region, R ribosome, S cross walls, Lg lipid globules, Ca carboxysome, Ph polyphosphate body
도 3은 Oscillatoriales 또는 Pseudanabaenales로부터 일부 유사한 균주(strain)를 포함하는 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속으로부터 유래한 71개 데이타 세트의 계통분기 신뢰성 계통수이다.
도 4는 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속으로부터 유래한 16개의 16S-23S ITS 염기서열의 데이터 세트를 이용하여 만든 Maximum parsimony (MP) 계통수이다. 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(JX401929)의 결정된 16S-23S ITS 염기서열은 박스 내 굵게 표시되어 있다. Oscillatoria sp. PCC 9240 (EF061079)는 외집단으로 사용되었다. 기준자는 뉴클레오타이드 치환의 수를 가리킨다.
도 5는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1의 16S-23S ITS 영역 내 3개의 보존된 도메인들의 전사 2차 구조 헬릭스들이다. a) D1-D1’ 헬릭스 (61 nt), b) Box-B 안티-터미네이터 헬릭스 (49 nt) 및 c) V3 헬릭스 (23 nt).
도 6은 동결건조된 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1 및 S. maxima Cy-23 추출물의 잠재적인 세포 독성에 대한 비교이다. 세포 독성은 lactate dehydrogenase (LDH) 방법으로 평가되었다.
본 발명은 기탁번호 KCTC12347BP로 기탁된, 4 μmol photon/m2/s 미만의 저광 조건 하 사상체에서 뿌리혹을 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 무독성의 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1)에 대한 것이다.
Leptolyngbya koreensis KIOST -1
본 발명의 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1)는 알칼라인 조건들 하(pH > 10) 개방형 외륜 스피룰리나 배양 수로지로부터 분리되었다. 2011년 3월 S. maxima Cy-23 무균 배양체의 최초 접종으로부터, 배양지는 지하 수돗물(underground tap water)은 예외로 하고, 추가적인 영양 소스의 추가 없이 유지되었으며, 9 개월들 동안 상기 수로지로부터 다른 시아노박테리아 또는 미세조류들은 관찰되지 않았다. 그러나 Leptolyngbya koreensis KIOST-1로 이루어진 몇몇의 집괴된 청록색 매트들이 2012년 2월 말 수로지의 표면으로부터 관찰되었다. 스피룰리나 배양지에 Leptolyngbya koreensis KIOST-1가 나타난 것에도 불구하고, 스피룰리나의 조건들 및 생산성들은 잘 유지되었으며, 스피룰리나에 대한 다른 유해한 효과는 관찰되지 않았다.
그러나 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23가 실험실 조건 하의 플라스크 내에서 함께 배양될 때, 시아노박테리아의 변동이 관찰될 수 있고; 스피룰리나 세포들의 대증식(blooming)은 접종 후 5-6일 까지 주로 나타났고; 그러나 배양 플라스크들은 일부 스피룰리나 세포들이 가끔 나타나면서, 접종 후 7일간 Leptolyngbya 세포들에 의하여 점유되었다. 이러한 관찰들에 기초하여, Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 상업적으로 스피룰리나를 배양하는데 있어 영양적 경쟁자로서 작용할 수 있다.
Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 성장은 과-알칼리(pH 13까지 높음) 및 과-염도(80 psu까지 높음) 조건들에 의하여 저해되지 않았다. 본 발명의 균주는 높은 산성 조건들에 과민성(intolerant)이었다(pH <5). 이러한 특징들 때문에, Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 생물공학적 적용들을 위한 추정되는 극한기능효소(extremozymes)를 발견하는데 목표를 둔 호염기성 또는 광염성 시아노박테리아 연구의 매력적인 실험 모델이 될 수 있다.
본 발명에서 Leptolyngbya 분리물의 형태학적 특징들은 이것이 넓은 범위의 표현적 특성들을 보인 Leptolyngbya 속에서 전에 기재된 종들과 다소 유사하다는 것을 보였다. 그러므로, 본 발명자들은 Leptolyngbya koreensis KIOST-1을 L. boryana, L. antarctica 및 계통분류학적으로 관련된 속인 N. nodulosa의 표현형 특징들을 비교하였다. Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 모조가지 (pseudo-branch) 및 싸개(sheath)의 부재와 마찬가지로, 가로지르는 벽(cross-wall)에서의 압축(constriction) 및 서식지와 관련해서, Leptolyngbya 속의 표준종인 L. boryana와 다르다. 게다가 분리물의 16S rRNA 서열 유사성을 고려할 때, 그것은 형태학적으로 기재된 L. antarctica과 가장 유사한 것으로 나타났으나 16S rRNA 서열의 유사도가 97% 미만으로 Leptolyngbya 속의 새로운 종임을 확인하였다. 한편, Leptolyngbya koreensis KIOST-1가 관련된 종들 N. nodulosa에 비교될 때, 그것은 사상체들에서 뿌리혹 또는 뿌리혹-유사 구조들을 형성하지 않았는데, 그것은 Nodosilinea 속의 주요 특성이며, 이는 본 발명의 신규 분리물이 형태학적 특징들의 뚜렷한 부재에 의하여 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속의 다른 관련된 종들과 명백히 다르다는 것을 시사한다.
Leptolyngbya 속은 예외적인 형태적 다양성을 갖고 유전적 다양성에 의하여 다계통적 분류군으로 보고되었다. 그러므로 상기 분리물의 계통학적 위치를 확인하기 위하여, 그것의 16S rRNA 및 16S-23S ITS 영역 염기서열을 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속의 다른 종들의 염기서열들과 비교하였다. 본 발명의 16S rRNA 유전자들을 이용한 계통분류를 통하여 Leptolyngbya 속이 다계통 특성을 지니고 있는 것을 밝혔다. NJ, ML 및 Bayesian 추론(inference) 방법에 의하여 추론된 계통수들은 명백히 다음과 같은 2개의 주요 그룹들로 나뉘었다; 1) L.boryana 표준종을 포함하는 Leptolyngbya sensu stricto로 주로 포함되는 그룹 I, 2) 본 발명의 분리물을 포함하는 몇몇 Leptolyngbya 균주들 및 Nodosilinea 속을 포함하는 그룹 II. 게다가, Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 계통분류학적으로 L. antarctica과는 거리가 멀고, 그룹 II 내의 대부분의 다른 Leptolyngbya 균주들과는 전혀 다른 계보를 형성하고, 본 발명의 분리물의 형태적 비교 분석 결과 그나마 계통학적으로 유사한 Nodosilinea 속과도 명백히 구분되었다.
본 발명의 균주인 Leptolyngbya koreensis KIOST-1은 16S-23S ITS 염기서열의 계통분류와 2차 RNA 구조 분석을 통하여 그 특이성을 뒷받침하였다. 계통분류학적 분석에서, 분석된 Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 16S-23S ITS 염기서열은 다른 Nodosilinea 균주들과 클러스터를 이루었으나 Leptolyngbya koreensis KIOST-1은 분기(divergence)를 보이는 분리된 계보를 형성하였다. ITS 영역 염기서열로부터 tRNAAla 및 tRNAIle 등의 시아노박테리아 및 플라스티드들의 가장 흔한 rRNA 오페론이 확인되었다(Boyer SL, Flechtner VR, Johansen JR. 2001. Is the 16S?23S rRNA internal transcribed spacer region a good tool for use in molecular systematics and population genetics? A case study in cyanobacteria. Mol. Biol. Evol. 18:1057-1069, Bruno L, Billi D, Bellezza S, Albertano P. 2009. Cytomorphological and genetic characterization of troglobitic Leptolyngbya strains isolated from Roman hypogea. Appl. Environ. Microb. 75:608-617.). ITS의 RNA 헬릭스들 (D1-D1’, Box B 및 V3 영역)의 몇몇 반(semi)-보존된 2차 구조들이 분석되고 다른 관련된 시아노박테리아 균주들과 비교되었다. 본 발명의 분리물의 헬릭스들의 길이 및 그것의 패턴은 H. alkalis 및 확인되지 않은 분류군(taxon) (Peudanabaenaceae cyanobacterium DPG1-KK5; GenBank accession No. EF654067)( Dadheech P, Mahmoud H, Kotut K, Krienitz L. 2012. Haloleptolyngbya alcalis gen. et sp. nov., a new filamentous cyanobacterium from the soda lake Nakuru, Kenya. Hydrobiologia 691:269-283)의 그것들과 가장 유사하였으나 동일하지는 않았고, L. boryana 및 Nodosilinea 속의 균주들과 상당히 구별되었다(Perkerson III RB, Johansen JR, Kovacik L, Brand J, Ka?tovsky J, Casamatta DA. 2011. A unique pseudanabaenalean (cyanobacteria) genus Nodosilinea gen. nov. based on morphological and molecular data. J. Phycol. 47:1397-1412). 상기와 같은 형태적 및 분자적 분석에 기초하여, Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 Nodosilinea 속과 명백히 구별되며, Leptolyngbya 속의 관련된 종들과도 뚜렷한 차이를 나타내었다.
Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 세포 성분 조성들은 S. maxima Cy-23의 그것들과 매우 유사하였으며, 총 아미노산의 약 40 % 정도를 차지하는 필수 아미노산들은 양 시아노박테리아들 모두에서 주요 세포 성분들이었다. 게다가, Leptolyngbya 분리물은 주로 D-글루코스를 포함하는 24.5±0.7%의 탄수화물들을 포함하였으며, 높은 비율의 불포화 지방산들로 구성된 11.4±0.5%의 지방들을 포함한다. Leptolyngbya 속의 세포 성분에 대한 이전 연구 보고서들이 부족한 연유로, 본 발명자들은 본 발명의 분리물의 세포 조성을 Leptolyngbya BL0902의 것과 비교하였다 (Taton A, Lis E, Adin DM, Dong G, Cookson S, Kay SA, Golden SS, Golden JW. 2012. Gene transfer in Leptolyngbya sp. strain BL0902, a cyanobacterium suitable for production of biomass and bioproducts. PLoS ONE 7:e30901). 그러나 본 발명의 결과는 스피룰리나 균주에 비하여 축적된 높은 지방산 메틸 에스터 (FAME) 및 상대적으로 낮은 단백질 함량들을 갖는 Leptolyngbya BL0902에 대한 이전 연구결과 (Taton A, Lis E, Adin DM, Dong G, Cookson S, Kay SA, Golden SS, Golden JW. 2012. Gene transfer in Leptolyngbya sp. strain BL0902, a cyanobacterium suitable for production of biomass and bioproducts. PLoS ONE 7:e30901)와 일치하지 않는다. 이러한 결과를 통하여 Leptolyngbya koreensis KIOST-1은 기존에 알려진 Leptolyngbya 속 균주들과 세포 내 생화학적 성분에서 확연한 차이를 나타냄을 확인하였다.
시아노톡신 생산과 관련하여, 실린드로스퍼몹신(cylindrospermopsin), 마이크로시스틴(microcystins) 및 노듈라린(nodularins) 등의 기존에 알려져 있는 시아노톡신 생산과 관련되는 것으로 추정되는 유전자들이 Leptolyngbya koreensis KIOST-1에서 검출되지 않았다. 이와 별도로 알려지지 않은 잠재적인 시아노톡신이 존재할 수 있는 가능성을 배제하기 위하여 동결 건조된 Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 증류수 추출물과 증류수-메탄올-부탄올 혼합 추출물 (15:4:1)을 이용한 lactate dehydrogenase (LDH) 세포독성 평가가 vero cell을 이용하여 이루어졌으며, 이에 대한 결과는 현재 무독성으로 실제 식품으로 사용되고 있는 스피룰리나 균주와 비교되었다. 비교 결과, 상기 두 가지 방법의 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 추출물 모두 스피룰리나와 매우 유사한 LDH 값을 나타내었으며, 이를 토대로 Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 무독성을 증명하였다.
그러므로 이러한 결과들에 기초하여, 새롭게 분리된 신규 Leptolyngbya 균주인 Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 스피룰리나와 유사하게 인간 또는 동물의 소비에 사용될 수 있는 식용 가능한 무독성의 미세조류 바이오매스의 산업적 생산이 가능할 것으로 판단된다.
렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1)는 저광 조건, 즉, 4 μmol photon/m2/s 미만의 저광 조건 하 사상체에서 뿌리혹 또는 뿌리혹 유사 구조를 형성하지 않는다.
또한 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1은 0 이상 80 psu 이하의 염도 및 pH 5 이상 pH 13 이하의 조건 하 성장이 가능하다. 그러나 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1은 pH 13의 조건 하 성장률이 pH 12의 조건 하 성장률보다 낮다.
한편, 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1은 세포 내 탄수화물 함량이 무기물(ash) 함량보다 높고, 세포 내 불포화 지방산 함량이 포화 지방산 함량보다 높다. 또한 세포 내 단백질들의 조성을 보면, 필수아미노산 함량이 30 % 이상 50 % 미만인 특징이 있다.
렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1은 실린드로스퍼몹신(cylindrospermopsin), 마이크로시스틴(microcystins) 및 노듈라린(nodularins) 관련 유전자가 없어, 이들의 생산능이 없다. 또한 이외의 잠재적인 시아노톡신 또한 LDH 세포독성 평가를 통해 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
또한 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1은 아미카신(amikacin), 겐타미신(gentamicin), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 세레핌(cefepime), 세포탁심(cefotaxime), 세포시틴(cefoxitin), 세프타지딤(ceftazidime), 세팔로틴(cephalothin), 세파졸린(cephazolin), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole), 아목시실린-클라뷸라닉산(amoxicillin-clavulanic acid), 암피실린(ampicillin), 피페라실린-타조박탐(piperacillin-tazobactam), 엔로플락사신(enrofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin) 및 테트라사이클린(tetracycline)에 저항성을 가지며, 세푸록심 소듐(cefuroxime sodium), 클로람페니콜(chloramphenicol), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 피페라실린 (piperacillin) 또는 암피실린-걸박탐(ampicillin-sulbactam)에 의하여 성장이 저해된다.
그러나 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1은 스피룰리나와 함께 야외 배양 시 스피룰리나의 성장을 저해하지 않아, 바이오매스의 생산에 적합하다.
또한 본 발명은 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1을 배양하는 단계를 포함하는 무독성 바이오매스의 생산 방법에 대한 것이다. 상기 배양은 실내 배양 또는 실외 배양일 수 있으나, 실외 배양이 좀더 대량 생산 및 비용 절감에 유리할 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
재료 및 실험 방법들
<시료의 수집>
Leptolyngbya koreensis KIOST-1는 한국해양과학기술원 (KIOST)의 미세조류 배양 플랜트(plant) (위도 37°29’N, 경도 126°83’E) (도 1a)에서 수집되었다. 스피룰리나 균주, S. maxima Cy-23의 무균 배양체는 Korea Marine Microalgae Culture Center에서 분양받았으며, 2011년 3월 SOT 배지를 포함하는 야외 외륜 배양 수로지(raceway culture pond)에 초기 접종되었다. 상기 배양수로는 추가적인 영양원의 첨가 없이 유지 및 지속 배양되었으며, 증발된 배양수은 지하수(underground tap water)로 채워졌다. 2012년 2월말까지 몇몇의 집괴된(agglomerated) 청록색 시아노박테리아 매트들(대략 지름 0.5-2.0 mm)이 연못 표면에서 관찰되었다. 부유하는 매트들의 시료들은 2012년 4월 모아졌으며, 채취 시 배양수의 온도(21.1°C), 광도(416.9 μmol photon/m2/s), 염도 (13.9 psu) 및 pH (10.3)가 측정되었다. 수집된 연못 물에서, 몇몇의 얽힌 청록색 매트들 및 자유롭게 부유하는 섬사상 시아노박테리아들과 함께 과증식한 스피룰리나 집단이 관찰되었다(도 1b 및 1c). 다른 구형 시아노박테리아 또는 다른 미세조류(규조류 포함)은 수집된 배양수 샘플에서 발견되지 않았다.
<시아노박테리아 분리 및 배양 조건들>
시아노박테리아들이 얽힌 청록색 매트들이 마이크로피펫을 이용하여 분리되었으며, 단계 희석되고, SOT 또는 BG-11 배지에서, 100 μmol photons/m2/s 에서, 12 h 명/12h 암 사이클 하 30 ℃에서 96 웰 플레이트들에서 배양되었다. 이후 단일 시아노박테리아 개체(unialgal)군들은 SOT 또는 BG-11 한천(agar) 배지들 (각각 1.5% 한천 농도)에 도말(streak)되고, 100 μmol photons/m2/s에서 12 h 명/12 h 암 사이클 하 30 ℃에서 배양되었으며, 순수한 개체를 얻을 때까지 단일 콜로니들이 반복적으로 계대 배양되었다. 100 ml의 BG-11 배지에서 접종되고, 전술한 조건과 동일한 조건 하 250 rpm으로 shaking 되어 배양된 시아노박테리아의 배증 시간(doubling time)은 750 nm의 광학 밀도에서 분광측색적으로 (spectrophotometrically) 분석되었다. 시아노박테리아 분리물의 성장 특징은 BG-11 배지 내 염도, pH 및 온도의 범위에서 결정되었는데, 염도는 (NaCl로 조정되어) 0 부터 100 psu까지 다양하였고, pH는 (NaOH 또는 HCl로 조정되었는데) 3 부터 13까지였으며, 온도는 전술한 것과 동일한 조건 하 4 내지 50 ℃였다. 광 제한 배양이 또한 암조건(0 μmol photons/m2/s) 및 낮은 광 조건 (< 4 μmol photons/m2/s)에서 30일 동안 수행되었다.
<현미경 관찰>
BG-11 배지에서 배양된 분리된 시아노박테리아들은 광학현미경 (LM, Eclipse 80i; Nikon Co.)을 이용하여 연구되었다. 카메라(DXM 1200C; Nikon Co.)를 이용하여 이미지들이 수득되었으며 세포 사이즈가 이미지 분석기(NIS-Elements BR 3.0; Nikon Co.)로 계산되었다. 시아노박테리아 분리물의 주사전자현미경(SEM) 분석이 하기와 같이 수행되었다: 세포들은 0.1 M cacodylate 버퍼에서 2.5% glutaraldehyde (Sigma-Aldrich)로 고정되었으며, 그 후 2% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich)으로 후고정(post-fix)되었다. 고정된 물질은 등급이 나뉜 에탄올(graded ethanol) 시리즈(30, 50, 70, 80, 90, 95, 및 100%) (Merck)에서 탈수된(dehydrated) 후, 100% hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich)로 건조되고, 알루미늄 스텁(stub)에 부착된 후 Sputter Coater (SCD050; BAL-TEC)에서 90 초 간 라이트골드 코팅(light gold coated)되었다. 코팅된 샘플들은 Field-Emission SEM (AURIGA; Carl Zeiss) 하 직접 시험되었다. 투과전자현미경 (TEM) 분석을 위하여, 세포들은 고정, 후고정되고, 0.5% uranyl acetate로 염색되고, 상기 SEM에서 기재한 바와 같이 탈수되고, 100% propylene oxide, (Sigma-Aldrich)으로 이동되고, Spurr's resin에 임베드(embedded)되었다. 샘플들은 ultra-microtome (EM UC7; Leica Microsystems)을 이용하여 70 nm에서 섹션화(section)되고, 2% uranyl acetate 및 납 시트레이트(lead citrate)로 염색되고, TEM (JEM1010; JEOL Ltd.)을 이용하여 시험되었다.
<분자적 염기서열 확인 및 계통분류학적 분석>
시아노박테리아들의 게놈 DNA는 제조업자의 설명서에 따라 DNeasy® Blood and Tissue kit (Qiagen)을 이용하여 추출되었으며, 추출된 DNA는 PCR 주형으로 이용되었다. universal 27F/1492R 프라이머들 및 16S1407F/23S30R 프라이머들을 이용하여 16S rRNA 및 16S-23S intergenic spacer (ITS) 영역 염기서열들이 각각 증폭되었으며, Macrogen Inc. (Korea)에서 염기서열이 분석되었다. 수득된 16S rRNA와 16S-23S ITS 염기서열들은 the National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 이용하여 유사성(similarity) 검색을 통하여 분석되었다. 시아노박테리아 분리물의 16S rRNA 유전자는 GenBank 데이터베이스에서 이용 가능한 일부 군들(taxa)을 포함하는 AlgaeBase (http://www.algaebase.org/) 내 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속(genera)에 분류학상 받아들여지는 종의 서열들과 결합되었다. 결합된 16S rRNA 서열들은 Muscle v.3.6 (Edgar RC. 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32:1792-1797)을 이용하여 정렬(align)되었는데, 정렬되지 않는 염기서열 부분들은 “allowed gap positions” 및 “with half” 조건으로, Gblocks 0.91b (Castresana J. 2000. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Mol. Biol. Evol. 17:540-552)을 이용하여 제거되었다. 계통수는 다음과 같은 세가지 방법으로 분석되었다. 1) MEGA v.5.0.5 (Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28:2731-2739)에서 시행된(implement) Jukes-Cantor distances matrix를 이용한 Neighbour-joining (NJ) 계통수 생성법. 2) jModeltest v.0.1.1 (Posada D. 2008. jModelTest: phylogenetic model averaging. Mol. Biol. Evol. 25:1253-1256.)에 의하여 제안된 뉴클레오타이드 치환의 GTR+I+?4 모델을 사용하는 Maximum-likelihood (ML) 방법으로 PHYML v.3.0 (Guindon S, Gascuel O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst. Biol. 52:696-704.)을 이용한 계통수 생성법. 상기 두 개 방법에서, 계통수들의 의존성은 1,000 부트스트랩(bootstrap) 반복검증(replicates)을 수행함으로써 평가되었다. 3) 계통분기(clade) 신뢰성(credibility) 계통수를 재구성하기 위하여, 뉴클레오타이드 치환의 GTR+I+?4 모델에 기초하여, MrBayes v.3.1.2 (Huelsenbeck JP, Ronquist F. 2001. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics 17:754-755.)으로 시행된 Bayesian inference 방법. 분석은 3개의 병렬 실행(parallel runs)으로 이루어졌으며, 모든 100 세대들에서 샘플이 수집되었고, 실행들 간의 스플릿 프리퀀시들(split frequencies)의 표준 편차가 0.05 이하(below)가 될 때까지 충분한 세대들이 허용되었다. 이와 같은 3종 계통분류학적 분석들 모두에서 외집단(oupgroup)으로 글뢰박터 비올라세우스(Gloeobacter violaceus) PCC 7421 (GenBank accession No. AF132790)가 사용되었다.
시아노박테리아 분리물의 16S-23S ITS 영역 염기서열은 GenBank로부터 이용 가능한 Oscillatoriales 내 다른 균주들의 서열들의 대표적인 데이터 세트와 결합되었다. 상기 결합된 16S-23S ITS 영역 염기서열들은 Muscle v3.6 프로그램을 이용하여 정렬되었으며, MEGA v.5.0.5를 이용하여 1,000 부트스트랩 값들로 Maximum parsimony (MP) 및 NJ 방법들이 수반되어 계통분류학적으로 분석되었다. MP 계통수는 무작위 삽입(addition) 서열(10개 복제물들(replicates))에 의하여 수득된 초기 계통수와 함께 인접 이웃-상호교환(neighbour-interchange) 경험적(heuristic) 탐색(MP 검색 레벨 1), 및 갭들 및 빠진(missing) 데이터들의 완전한 결실(deletion) 선택(option)을 이용하여 추론되었다. NJ 계통수는 갭들 및 빠진 데이터들에 대한 완전한 결실 및 위치들 사이의 균일한 비율을 갖는 Jukes-Cantor distance 매트릭스(matrix)를 이용하여 추론되었다. Oscillatoria sp. PCC 9240 (GenBank accession No. EF061079)는 16S-23S ITS 영역들의 계통분류학적 분석들을 위한 외그룹으로 이용되었다. 16S-23S ITS 영역에서 추정되는(putative) tRNA 들은 tRNAscan-SE program (http://www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE/)를 이용하여 분석되었다. 디폴트(default) 세팅을 갖는 웹-기반의 RNA 폴드(fold) 웹 서버(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)를 이용하여 3개의 보존된 도메인들(D1-D1’ 헬릭스(helix), Box-B 안티-터미네이터(terminator) 헬릭스 및 V3 헬릭스)의 2차 구조들이 예상되었으며, 상기 2차 구조들의 오버뷰(overview) 그래픽들이 PseudoViewer v.3.0 (Byun Y, Han K. 2009. PseudoViewer3: generating planar drawings of large-scale RNA structures with pseudoknots. Bioinformatics 25:1435-1437.)를 이용하여 시각화(visualizing)되었다. 또한, 분리된 시아노박테리아의 DNA G+C 함량은 Mesbah et al.( Mesbah M, Premachandran U, Whitman WB. 1989. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:159-167.)의 방법에 따라 Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM)에 의하여 디옥시리보뉴클레오사이드들의 HPLC 분석을 이용하여 결정되었다.
<시아노톡신 생산과 관련된 유전자들의 검출 및 세포 독성 평가>
시아노박테리아 분리물에서, 실린드로스퍼몹신(cylindrospermopsin), 마이크로시스틴(microcystins) 및 노듈라린(nodularins)과 같은, 잠재적 시아노톡신들의 생산과 관련된 유전자들의 존재유무를 확정하기 위하여, 시아노톡신-관련 유전자들에 대한 다양한 특이적 프라이머들을 이용하여 PCR 분석이 수행되었다. 실린드로스퍼몹신 관련 유전자들을 검출하기 위하여 cylindrospermopsin polyketide synthase 유전자 (PCR 프라이머들: PKS M4 및 PKS M5) 및 cylindrospermopsin peptide synthetase 유전자 (PCR 프라이머들: M13 및 M14)이 Schembri et al.(Schembri MA, Neilan BA, Saint CP. 2001. Identification of genes implicated in toxin production in the cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii. Environ. Toxicol. 16:413-421.)의 PCR 프로토콜에 따라 증폭되었다. 마이크로시스틴 합성효소(synthetase) 복합체의 mcyA, mcyB 및 mcyC 유전자들의 존재는 Hisbergues et al.( Hisbergues M, Christiansen G, Rouhiainen L, Sivonen K, Borner T. 2003. PCR-based identification of microcystin-producing genotypes of different cyanobacterial genera. Arch. Microbiol. 180:402-410.)의 PCR 조건에 따라 한 쌍의 프라이머들 (mcyA-Cd F 및 mcyA-Cd R)을 이용하여 분석되었다. 마이크로시스틴 또는 노듈라린 합성효소(synthetase) 복합체들의 mcyE 또는 ndaF 유전자들의 아미노트랜스페라제 도메인의 검출을 위하여, Jungblut et al.(Jungblut AD, Hawes I, Mountfort D, Hitzfeld B, Dietrich DR, Burns BP, Neilan BA. 2005. Diversity within cyanobacterial mat communities in variable salinity meltwater ponds of McMurdo Ice Shelf, Antarctica. Environ. Microbiol. 7:519-529.)의 프로토콜에 따라 HEPF 및 HEPR 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다.
세포 독성의 경우 알려지지 않은 잠재적인 시아노톡신이 존재할 수 있는 가능성을 배제하기 위하여 동결 건조된 Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 증류수 추출물과 증류수-메탄올-부탄올 혼합 추출물 (15:4:1)을 이용한 lactate dehydrogenase (LDH) 세포독성 평가가 vero cell (1.5×105cells/ml)을 이용하여 37°C에서 24시간 동안 배양한 후, LDH cytotoxicity detection kit (Promega)를 사용하여 이루어졌으며, 이에 대한 결과는 현재 무독성으로 실제 식품으로 사용되고 있는 스피룰리나 균주의 동일한 추출물을 동일 조건으로 노출 후 분석한 결과와 비교되었다.
<세포 성분 분석>
분리된 시아노박테리아 및 S. maxima Cy-23의 감압 동결건조된(lyophilized) 세포들 내 주된 조(crude) 성분들(재(ash), 탄수화물, 지방, 수분 및 단백질)의 비율들이 Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (AOAC)에 따라 결정되었다(AOAC. 2006. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 17th ed. AOAC, Arlington, VA.). 조(crude) 지질 함량은 Soxhlet 방법 (official method 920.39)으로 결정하였으며, 조 단백질 함량은 Kjeldhal 방법(official method 976.05)으로 결정하였다. 무기물(ash) 함량은 550°C에서 고로(furnace)에서 가열 전후로 시료의 중량을 재서 결정하였고, 수분 함량은 105°C에서 드라이 오븐에서 24시간 후 및 그 전 시료의 무게를 재서 결정하였다. 탄수화물 함량은 총 성분 중 해당 성분들을 제외한 차이(difference)에 의하여 결정하였다. 아미노산 프로파일은 ninhydrin 방법을 이용하여 아미노산 분석기(Sykam S433; Sykam)에 의하여 분석하였으며, high performance anion exchange chromatography coupled with a pulsed amperometric detection system (HPAEC-PAD; Dionex Corp.)를 이용하여 시아노박테리아 세포의 단당류 조성을 결정하였다. 또한, 세포 지방산 조성은 Sherlock Microbial Identification System (MIDI)의 standard protocol에 따라 분석되었다(Miller LT. 1982. Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole-cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acids. J. Clin. Microbiol. 16:584-586.).
<항생물질 감수성 시험>
분리된 시아노박테리아의 항생물질 감수성은 상용화된 항생물질 디스크 (antibiotic disks) (Oxoid Ltd.)를 이용하여 결정하였다. 패널 스크린 내 사용된 8개의 총 항생물질 클래스(classes)들이 시험되었으며, 이는 하기와 같다: i) 아미노글리코사이드(Aminoglycosides): 아미카신(amikacin) (30 mg) 및 젠타미신(gentamicin) (10 mg); ii) 카바페넴(Carbapenems): 이미페넴(imipenem) (10 mg) 및 메로페넨(meropenem) (10 mg); iii) 세펨(Cephems): 세페핌(cefepime) (30 mg), 세포탁심(cefotaxime) (30 mg), 세폭시틴(cefoxitin) (30 mg), 세프타지딤(ceftazidime) (30 mg), 세푸록심 소듐(cefuroxime sodium) (30 mg), 세팔로틴(cephalothin) (30 mg) 및 세파졸린(cephazolin) (30 mg); iv) 폴레이트 경로 억제제(Folate-pathway inhibitor): 트리메토프림(trimethoprim)-설파메톡사졸(sulfamethoxazole) (1.25/23.75 mg); v) 페니실린(Penicillin) 및 b-락탐(lactam)/b-락타마제(lactamase) 억제제 (inhibitor) 복합제(combinations): 아목시실린(amoxicillin)-클라불란산(clavulanic acid) (20/10 mg), 암피실린(ampicillin) (10 mg), 암피실린(ampicillin)-설박탐(sulbactam) (10/10 mg), 피페라실린(piperacillin)(100 mg) 및 피페라실린(piperacillin)-타조박탐(tazobactam) (100/10 mg); vi) 페니콜(Phenicol): 클로람페니콜(chloramphenicol) (30 mg); vii) 퀴놀론(Quinolones): 시프로플록사신(ciprofloxacin) (5 mg), 엔로플록사신(enrofloxacin) (5 mg), 레보플록사신(levofloxacin) (5 mg) 및 오플록사신(ofloxacin) (5 mg); viii) 테트라사이클린(Tetracyclines): 테트라사이클린(tetracycline) (30 mg). 간략히, BG-11 배지 내 신선한 세포 배양 현탁액 100 μl(대략 0.5 McFarland 농도)을 BG-11 한천배지 상에 위치시키고, 10일 동안 상기 조건 하 배양하였다. 성장 억제의 징후는 항생물질에 대한 감수성으로 판별하였으며, 항생물질에의 저항성은 억제 존(zone)의 부재에 의하여 판정되었다.
<균주 기탁>
Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 살아 있는 무균 배양액을 한국생명공학연구원(Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 내 있는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC)에 기탁번호 KCTC 12347BP로 기탁하였다.
결과
<실시예 1> 배양 특징
렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1 분리물은 SOT and BG-11 배지 상에서 잘 배양되었으며, 액체배지(broth culture) 배양체는 한천 고체배지 배양보다 더 빨리 성장하였다. 분리물의 최적의 성장 속도는 30°C에서 12 시간 명/12 시간 암 사이클로 100 μmol photons/m2/s에서 얻어졌으며, 그것의 배증 시간(doubling time)은 약 24시간으로 추정되었다. 이들 조건 하 배양에서, 엉킨 청록색 매트들은 부착 없이 배양 플라스크 바닥에 정착(settle)되었다. 배양물은 적어도 6 개월 동안 생존을 유지하였으며, 그 후 생존능이 저하되면서 연두색으로 변화하였다.
렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1는 SOT 및 BG-11 배지 모두에서 10 내지 40 ℃의 범위의 온도에서 성장할 수 있었으며, 30 ℃에서 가장 빠른 성장을 보였다. 게다가, 상기 분리물은 0 내지 80 psu의 범위인 넓은 범위의 염도, 5 내지 12의 범위의 넓은 범위의 pH 레벨에서도, 성장 속도의 차이 없이 배양되었다. pH 13의 배양에서, 대증식은 접종 후 2-3 일까지 지연(delay)되었으나, 상기 분리물은 배양기간 후반에 엉켜진 청록색 매트를 형성하였다. 상기 분리물은 저광(low-light) 조건 (<4 μmol photons/m2/s) 하에서 성장하였으나, 암(dark) 조건 하에서는 성장하지 않았다.
<실시예 2> 형태학(Morphology) 및 초미세구조(ultrastructure)
상기 분리된 시아노박테리아는 한국해양과학기술원(KIOST)의 야외 외륜 수로지(raceway) 스피룰리나 배양 연못에서 엉켜진 청록색 매트들(도 1b) 또는 자유롭게 부유하는 필라멘트들(도 1c)로 발견되었다. 광학현미경 상 (도 1d) 및 주사전자현미경 상 (도 1e 및 1f) 분석에서 관찰된 운동성이 없는 필라멘트들은 가지없는(non-branched) 단일 사상체(trichome)로 이루어져 있는데, 이는 정치(undisturbed) 액상 배양에서 전형적으로 50-100 개의 통(barrel) 형상의 개개의 세포들로 구성되고, 사상체의 형태는 일반적으로 곧거나(straight) 또는 물결모양(wavy)이며 때로는 구부러져(bent) 있다. 상기 사상체들에서는 배양 배지 또는 조건에 상관없이, 싸개(sheath), 가스포(gas vacuole), 헤테로시스트들(heterocysts), 아키니트들(akinetes), 뿌리혹들(nodules) 또는 뿌리혹-유사 구조들 및 네크리딕(necridic) 세포 및 구조들은 발견되지 않았다. 각각의 세포들은 길이가 0.9-2.2 μm, 지름이 0.8-1.1 μm였으며, 사상체 내 가로지르는 벽(cross-walls)들에 분명한 압축(evident constriction)을 갖고 나뉘어 있었다. 등축(isodiametric) 세포들은 때때로 사상체들에서 발견되었으며, 정단(apical) 세포들은 내피막(calyptra) 없이 뭉툭한 원뿔 형상이었다(도 1f). 상기 시아노박테리아들의 초미세구조 특징들은 투과전자현미경 상 결과들로도 확인되었다.
종단면 및 횡단면에서 보이는 상기 사상체들은 가로지르는 벽들에서 압축을 갖는 긴 실린더형 세포들로 이루어진 단열사상체들(uniseriate filaments)이었다(도 2a 내지 d). 세포들은 세포벽의 구심성(centripetal) 함입(invagination)에 의하여 나뉘어졌으며, 영양세포들 사이의 세포간(intracellular) 연결들은 관찰되지 않았다(도 2e 및 2f). 벽의(parietal) 틸라코이드(thylakoids)들은 상기 세포의 내부 주변부(periphery)에서 평행한 배열로 3엽부터 4엽까지 다양하다. 카르복시좀들(Carboxysomes), 시아노피신(cyanophycin) 및 폴리포스페이트 결합체(polyphosphate body)들은 대부분의 세포들의 세포질에 존재하였으며, 때때로 작은 지질 글로뷸(lipid globules)들 및 틸라코이드 간(inter-thylakoidal) 글리코겐 그래뉼들이 발견되었다.
<실시예 3> 분자생물학적 동정 및 분류학상 특징
상기 시아노박테리아의 분류학상 위치를 결정하기 위하여, 획득된 1467 bp의 16S rRNA 서열(서열번호 1)을 BLASTN 검색을 이용하여 시아노박테리아의 GenBank 데이터베이스와 비교하였다. 그 결과 유사한 서열들의 대부분이 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속(genera)에 속하는 균주 유래라는 것이 밝혀졌다. BLAST 검색에 의하여 확인된 가장 유사한 2개 균주들은 Nodosilinea sp. 0BB32S02 (GenBank accession No. AJ639894) 및 Nodosilinea sp. 0BB19S12 (GenBank accession No. AJ639895)로, 각각 97.5% 서열 동일성(identity)을 갖는다. 상기 분리물은 Nodosilinea 속의 종 N. nodulosa (Li & Brand) Perkerson & Casamatta UTEX 2910 (GenBank accession No. EF122600)에 대하여 96.7% 16S rRNA 서열 유사성(similarity)을 보였다. 게다가, Leptolyngbya 속에서 현재 분류학상으로 받아들여지는 종들 중 가장 유사한 균주는 L. margaretheana 1T12 (GenBank accession No. FR798934) 및 L. antarctica ANT.LACV6.1 (GenBank accession No. AY493589)로, 이들은 각각 97.2% 및 96.4%의 서열 동일성을 가진다.
그러나, 상기 분리물은 Leptolyngbya sensu strict 군에 속하는 Leptolyngbya 속의 표준균주인 L. boryana (Gomont) PCC 73110 (GenBank accession No. X84810)와 단지 87.7%의 16S rRNA 서열 유사성을 나타냈다(Komarek J, Anagnostidis K. 2005. Cyanoprokaryota. 2. Oscillatoriales, 759 pp. Gustav Fischer, Jena, Germany).
그러므로 상기 분리된 시아노박테리아의 정확한 계통분류학적 위치를 확인하기 위하여 Oscillatoriales 또는 Pseudanabaenales로부터 일부 매우 유사한 균주(strain)를 포함하는 Leptolyngbya 및 Nodosilinea 속으로부터 유래한 71개 데이타 세트의 16S rRNA 서열을 이용하여 자세한 계통분류학적 분석을 수행하였다. 그 계통분기 신뢰성 계통도(clade credibility tree)(도 3)는 Leptolyngbya 속이 다계통발생이며(polyphyletic), 다음과 같은 2개의 주요 그룹으로 나뉜다고 제안하고 있다(100%의 후 값(posterior value)): Leptolyngbya sensu stricto를 포함하는 그룹 I 및 Nodosilinea 속 및 Leptolyngbya 균주들과 마찬가지로 Pseudanabaenales에 속하는 다른 속들을 포함하는 그룹 II.
상기 분리물은 Leptolyngbya 그룹 II에 속하며, 중요한 분기(divergence)를 갖고(100%의 후값(posterior value)), 인도(India)에서 분리된 Leptolyngbya sp. N62DM와 가장 밀접하게 관련되었다. 유사한 결과가 또한 ML and NJ 방법들을 이용하여 추론된 계통수에서 확인되었다(recover). 그러나 그 결과인 계통수들은 그룹 II의 Leptolyngbya 속으로부터 Nodosilinea 속의 균주를 명확하게 분리하고 있지 않다.
그러므로 상기 분리물의 형태학적 특징들은 또한 그것의 분류에 있어 중요한 특성으로 생각되었다. 예전의 연구(Perkerson III RB, Johansen JR, Kovacik L, Brand J, Ka?tovsky J, Casamatta DA. 2011. A unique pseudanabaenalean (cyanobacteria) genus Nodosilinea gen. nov. based on 형태적 and molecular data. J. Phycol. 47:1397-1412.)에 따라, 저광 조건 하(< 4 μmol photons/m2/s) 사상체들 내 뿌리혹들 또는 뿌리혹-유사 구조들의 형성들은 Leptolyngbya 속으로부터 Nodosilinea 속을 구별하는데 있어 주요 특징이었고, 본 발명의 상기 시아노박테리아 분리물은 저광 또는 최적의 광 조건들 하 사상체들에서 뿌리혹 또는 뿌리혹-유사 구조들을 형성하지 않았다. 그러므로 형태학적 및 분자적 특징들에 기초할 때, 새롭게 분리된 섬사상 시아노박테리아는 Leptolyngbya 속에 속하는 것으로 최종적으로 분류되었으며, 한국에서 그 유전학적, 형태학적 특성이 최초로 보고된 연유로 Leptolyngbya koreensis KIOST-1으로 표기하였다.
Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 16S-23S ITS 영역의 489bp 염기서열(서열번호 2)을 BLAST 검색을 이용하여 GenBank 데이터베이스와 비교하였으나, 정렬(align) 시 다수의 정렬되지 않는 부분이 발견되었다. 90% 이상의 쿼리 커버리지(query coverage)를 갖는 유사한 염기서열들의 대부분이 Nodosilinea 및 Leptolyngbya 속으로부터 유래한 것이며, Nodosilinea 속에 속하는 상기 균주들은 16S rRNA 서열 비교에서 나타난 바와 같이, Leptolyngbya 속 유래의 그것들보다 상대적으로 더 높은 염기서열의 동일성들을 보였다. BLAST 검색에 의하여 확인된 첫 번째 매치(match)는 84.6% 동일성(identity)을 갖는 N. bijugata Kovacik 1986/5a (GenBank accession No. EU528669)였으며, L. antarctica ANT.LACV6.1 (GenBank accession No. AY493632)는 Leptolyngbya 속에서 가장 높은 동일성(80.6%)을 보였다. MP 방법을 이용한 ITS 영역 염기서열의 계통분류학적 분석 결과, Leptolyngbya koreensis KIOST-1가 N. epilithica Kovacik 1990/52 (GenBank accession No. HM018679), Nodosilinea sp. FI2-2HA2 (GenBank accession No. HM018678) 및 N. nodulosa PCC 7104 (GenBank accession No. AY768381)와 클러스터(cluster)를 이루고 있다는 것을 밝혔으나, 상기 분리물은 분기(divergence)를 보여주는 분리된 계보(lineage)를 형성하였고(도 4); 또한 유사한 계통수 구조(topology)가 NJ 방법을 이용하여 추론할 때 획득되었다. 또한 두 개의 추정되는 tRNA 유전자들, tRNAAla (뉴클레오타이드 위치 132?205) 및 tRNAIle (뉴클레오타이드 위치 212?284)이 16S-23S ITS 영역 염기서열로부터 확인되었다. 상기 ITS 영역은 또한 D1-D1’ 헬릭스 (61 nt), Box-B 안티-터미네이터 헬릭스 (49 nt) 및 V3 헬릭스 (23 nt)과 같은 보존된 도메인들을 포함하였으며, V2 헬릭스는 상기 분리물에서 tRNA 유전자들 사이에서 6개의 염기서열이 부족했다. Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 D1?D1’ 헬릭스의 2차 구조는 3개의 단독 벌지(bulge) 루프들(loops) 및 하나의 헤어핀 루프를 갖고 있다; 다른 일부 Pseudanabaenales 또는 Oscillatoriales(Perkerson III RB, Johansen JR, Kovacik L, Brand J, Ka?tovsky J, Casamatta DA. 2011. A unique pseudanabaenalean (cyanobacteria) genus Nodosilinea gen. nov. based on morphological and molecular data. J. Phycol. 47:1397-1412., Dadheech P, Mahmoud H, Kotut K, Krienitz L. 2012. Haloleptolyngbya alcalis gen. et sp. nov., a new filamentous cyanobacterium from the soda lake Nakuru, Kenya. Hydrobiologia 691:269-283.)에 존재하는, 높게 보존된 6개의 염기서열 (CACUCU)을 갖는 단독 벌지 루프가 상기 분리물에서 발견되었다(도 5a). 상기 Box-B 안티-터미테이터 헬릭스의 2차 구조는 하나의 벌지 루프, 하나의 인터날(internal) 루프 및 하나의 헤어핀 루프(도 5b)를 포함하고, 상기 V3 영역은 헤어핀 루프 및 9개의 폴드되지 않은(unfolded) 염기서열들(도 5c)를 형성하였다. Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 DNA G+C 함량은 최근 염기서열이 분석된 Leptolyngbya 속 시아노박테리아 균주들(Shih PM, Wu D, Latifi A, Axen SD, Fewer DP, Talla E, Calteau A, Cai F, Tandeau de Marsac N, Rippka R, Herdman M, Sivonen K, Coursin T, Laurent T, Goodwin L, Nolan M, Davenport KW, Han CS, Rubin EM, Eisen JA, Woyke T, Gugger M, Kerfeld CA. 2013. Improving the coverage of the cyanobacterial phylum using diversity-driven genome sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110:1053-1058)보다 높은 59.5 mol%로 추정되었다.
<실시예 4> 시아노톡신 생산 관련 유전자들의 유무 및 세포독성 평가
<4-1> 시아노톡신 생산 관련 유전자들의 유무
Leptolyngbya koreensis KIOST-1에서 잠재적 시아노톡신들의 존재를 결정하기 위하여 실린드로스퍼몹신(cylindrospermopsin), 마이크로시스틴(microcystins) 및 노듈라린(nodularins)에 연관된 유전자들을 탐지하기 위하여 PCR 분석들을 수행하였다. 그러나 이들 독소-관련 유전자들 중 어느 것도 상기 분리물 유래의 PCR 분석에 의하여 증폭되지 않는바, 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1는 실린드로스퍼몹신(cylindrospermopsin), 마이크로시스틴(microcystins) 및 노듈라린(nodularins) 생산능이 없는 것으로 확인되었다.
<4-2> 세포독성 평가
동결건조된 Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 증류수 추출물 및 알코올(증류수,메탄올 및 부탄올의 15:4:1 부피비 혼합물)의 세포 독성을 스피룰리나의 증류수 추출물 및 알코올(상기 알코올과 동일 조성) 추출물의 그것과 각각 비교하였다. 그 결과, 상기 두 가지 방법 (증류수 추출법 및 증류수-메탄올-부탄올 (15:4:1) 추출법)의 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 추출물 모두 스피룰리나와 매우 유사한 LDH 값을 나타내었으며, 이를 토대로 Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 무독성을 증명하였다(도 6). 즉, 모든 추출물들은 25 내지 100 μg mL-1에서 LDH 방출(release)량이 10 % 미만이었다.
<실시예 5> 세포 성분 분석
Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23 내 주요 세포 성분들(재(ash), 탄수화물, 지방 및 단백질)의 조성을 비교하였다. Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 동결건조된(lyophilized) 세포들로부터 무기물, 탄수화물, 지방 및 수분 함량이 각각 10.2±0.1%, 24.5±0.7%, 11.4±0.5% 및 1.3±0.1%으로 추정되었다. 단백질 함량은 52.6±0.1%으로 추정되었는데, 이는 단백질이 새로 분리된 섬사상 시아노박테리움의 주요 성분이라는 것을 나타낸다. 같은 방식으로, 단백질(50.7±0.3%)은 동결건조된 스피룰리나 S. maxima Cy-23 세포들의 우세한(dominant) 세포 성분들이었고, 그것의 무기물, 탄수화물, 지방 및 수분 함량들은 각각 20.3±0.3%, 17.8±0.3%, 9.1±0.5% and 2.2±0.1%로 추정되었다(표 1).
Figure 112014092840619-pat00001
Leptolyngbya koreensis KIOST-1 내 세포 성분들을 추가로 평가하기 위하여, 그것의 아미노산, 단당류 및 지방산 조성들을 분석하였으며, S. maxima Cy-23의 세포성분 분석 결과와 비교하였다. Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23의 아미노산 조성들은 표 2와 같다.
Figure 112014092840619-pat00002
동결건조된 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23 균주들 간 아미노산 조성 비교
* Asp: aspartic-acid, Thr: threonine, Ser: serine, Glu: glutamic acid, Gly: glycine, Ala: alanine, Cys2: cystine-cystine dimer, Val: valine, Met: methionine, Ile: isoleucine, Leu: leucine, Tyr: tyrosine, Phe: phenylalanine, His: histidine, Lys: lysine, NH4: Ammonia, Arg: arginine, Pro: prolin.
글루탐산(Glutamic-acid)(각각 14.2% 및 14.7%) 및 아스파르트산(aspartic-acid)(각각 11.0% 및 10.2%)은 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23 내 우세한 아미노산들로서 확인되었다. 또한 9개의 필수 아미노산들(페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 이소류신, 메티오닌, 류신, 라이신 및 히스티딘)은 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23에서 각각 총 아미노산의 40.2% 및 39.6%를 구성하였다.
Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23의 단당류 조성들은 표 3에 나타내었다.
Figure 112014092840619-pat00003
신규한 Leptolyngbya koreensis KIOST-1와 스피룰리나 세포 내 단당 함유량 비교
7개의 단당류들(L-푸코스(fucose, L-람노스(rhamnose), D-아라비노스(arabinose), D-갈락토스(galactose), D-글루코스(glucose), D-만노스(mannose) 및 D-자일로스(xylose)) 중 D-글루코스가 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 (75.9%) 및 S. maxima Cy-23 (80.3%)에서 두드러졌다. Leptolyngbya koreensis KIOST-1의 L-fucose (5.3%) 및 D-mannose (5.8%) 조성들은 S. maxima Cy-23 (각각 2.0% 및 0.5%)의 그것들보다 더 높았다.
한편, 지방산 분석에서, 불포화 지방산들: 16:1 ω9c (18.5%), 18:1 ω9c (21.4%) 및 Sum In Feature 5 (18:0 ANTE 및/또는 18:2 ω6,9c을 포함함) (16.9%) 및 포화 지방산: 16:0 (17.3%)이 Leptolyngbya koreensis KIOST-1로부터 주로 발견되었다. 그에 반하여, S. maxima Cy-23은 16:0 포화 지방산(39.3%), 18:0 이소(iso) 모노메틸(monomethyl) 가지달린 지방산들 (16.2%) 및 Sum In Feature 5 (18:0 ANTE 및/또는 18:2 ω6,9c를 포함함) (16.3%)을 우세하게 포함하고, 불포화 지방산 또한 균주에서 검출되었다(표 4).
Figure 112014092840619-pat00004
동결건조된 Leptolyngbya koreensis KIOST-1 및 S. maxima Cy-23 균주들 간 지방산 프로파일 비교
<실시예 6> 항생제(Antibiotic) 감수성(susceptibility) 평가
Leptolyngbya koreensis KIOST-1은 아미카신(amikacin) (30 mg), 겐타미신(gentamicin) (10 mg), 이미페넴(imipenem) (10 mg), 메로페넴(meropenem) (10 mg), 세레핌(cefepime) (30 mg), 세포탁심(cefotaxime) (30 mg), 세포시틴(cefoxitin) (30 mg), 세프타지딤(ceftazidime) (30 mg), 세팔로틴(cephalothin) (30 mg), 세파졸린(cephazolin) (30 mg), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole) (1.25/23.75 mg), 아목시실린-클라뷸라닉산(amoxicillin-clavulanic acid) (20/10 mg), 암피실린(ampicillin) (10 mg), 피페라실린-타조박탐(piperacillin-tazobactam) (100/10 mg), 엔로플락사신(enrofloxacin) (5 mg), 레보플록사신(levofloxacin) (5 mg) 및 테트라사이클린(tetracycline) (30 mg)에 저항성을 가졌다. 그러나 성장 억제의 신호는 세푸록심 소듐(cefuroxime sodium)(30 mg), 클로람페니콜(chloramphenicol)(30 mg), 시프로플록사신(ciprofloxacin)(5 mg), 오플록사신(ofloxacin)(5 mg), 피페라실린 (piperacillin)(100 mg) 및 암피실린-설박탐(ampicillin-sulbactam)(10/10 mg)에 대하여 확인되었다. 때때로 저항성 콜로니들은 세푸록심 소듐(cefuroxime sodium), 피페라실린(piperacillin) 및 암피실린-설박탐(ampicillin-sulbactam)의 억제 존(zone) 내에서 발견되었다.
한국생명공학연구원 KCTC12347BP 20130103
<110> KIOST <120> NOVEL LEPTOLYNGBYA KOREENSIS KIOST-1 AND A METHOD OF PRODUCING BIOMASS USING IT <130> LNP140005 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1467 <212> DNA <213> Leptolyngbya koreensis KIOST-1 <400> 1 aggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacgg gatcttcgga 60 tctagtggcg gacgggtgag taacgcgtga ggatctgccc ttaggatggg gacaaccact 120 ggaaacggtg gctaataccc aatgtgccga gaggtgaaac attaatggcc tgaggatgaa 180 ctcgcgtctg attagctagt tggtgaggta agggctcacc aaggcgacga tcagtagctg 240 gtctaagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300 agcagtgggg aattttccgc aatgggcgca agcctgacgg agcaacgccg cgtgagggag 360 gaaggcctta gggttgtaaa cctcttttct ctgggaagaa gacctgacgg taccagagga 420 ataagcctcg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaaga cggaggaggc aagcgttatc 480 cggaattatt gggcgtaaag cgtccgcagg cggtttttta agtctgttgt caaaggtcac 540 agctcaactg tggatcggca atggaaactg gggaacttga gtgtggtagg ggtagaggga 600 attcccggtg tagcggtgaa atgcgtagat atcgggaaga acaccagtgg cgaaggcgct 660 ctactgggcc acaactgacg ctgagggacg aaagctaggg gagcgaaagg gattagatac 720 ccctgtagtc ctagctgtaa acgatggata ctaggtgttg gacgtatcga cccgtgcagt 780 accgtagcta acgcgttaag tatcccgcct ggggagtacg cacgcaagtg tgaaactcaa 840 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gaggatgtgg tttaattcga tgcaacgcga 900 agaaccttac caaggcttga catgtcgcga atctctgaga gatcagagag tgccttcggg 960 agcgcgaaca caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1020 tcccgcaacg agcgcaaccc acgtttttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaaga 1080 gactgccggg gacaactcgg aggaaggtgt ggacgacgtc aagtcatcat gccccttacg 1140 tcttgggcta cacacgtcct acaatgctac agacagaggg cagcgagcgc gcgagtgcaa 1200 gcaaatccca taaactgtgg ctcagttcag attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagg 1260 cggaatcgct agtaatcgcc ggtcagcata cggcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320 acaccgcccg tcacaccatg ggagttggcc acgcccgaag tcgttactct aaccgttcgc 1380 ggaggagggc gccgaaggca gggctgatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1440 ccggaaggtg tggctggatc acctcct 1467 <210> 2 <211> 489 <212> DNA <213> Leptolyngbya koreensis KIOST-1 <400> 2 tttagggaga cctacccttg ataactccga accattgtta ttaggagtat cgagcggtca 60 ctctaggtcg gtcaggactt tgagtcgagt ttctagacta tggttgaggt tttgtttaac 120 caacagaacc cgggctatta gctcaggtgg ttagagcgca cccctgataa gggtgaggtc 180 cctggttcga gtccaggatg gcccactgcg tgggggttta gctcagttgg tagagcgcct 240 gctttgcaag caggatgtca gcggttcgag tccgctaacc tccaccacga aaggacggat 300 tgaattcagc acagtatgtg tttcttgaat tatcaagagg atacatagtc tgctgggtga 360 gagcccggct aagaaccttg acaactgaat agtgagagaa gtgtaaggta gtacacacag 420 aacattcaaa gttcgttgag agaagagtga attttgttgg gtaacaccaa tgaaaggaag 480 gtcaagcta 489

Claims (13)

  1. 기탁번호 KCTC12347BP로 기탁된, 4 μmol photon/m2/s 미만의 저광 조건 하 사상체에서 뿌리혹을 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1(Leptolyngbya koreensis KIOST-1).
  2. 제 1항에 있어서,
    0 이상 80 psu 이하의 염도에서 성장이 가능한 것을 특징으로 하는 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  3. 제 1항에 있어서,
    pH 5 이상 pH 13 이하의 조건 하 성장이 가능한 것을 특징으로 하는 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  4. 제 1항에 있어서,
    pH 13의 조건 하 성장률이 pH 12의 조건 하 성장률보다 낮은 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  5. 제 1항에 있어서,
    세포 내 탄수화물 함량이 무기물 함량보다 높은 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  6. 제 1항에 있어서,
    실린드로스퍼몹신(cylindrospermopsin), 마이크로시스틴(microcystins) 및 노듈라린(nodularins) 생산능이 없는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    세포 내 불포화 지방산 함량이 포화 지방산 함량보다 높은 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  9. 제 1항에 있어서,
    아미카신(amikacin), 겐타미신(gentamicin), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 세레핌(cefepime), 세포탁심(cefotaxime), 세포시틴(cefoxitin), 세프타지딤(ceftazidime), 세팔로틴(cephalothin), 세파졸린(cephazolin), 트리메토프림-걸파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole), 아목시실린-클라뷸라닉산(amoxicillin-clavulanic acid), (암피실린(ampicillin), 피페라실린-타조박탐(piperacillin-tazobactam), 엔로플락사신(enrofloxacin), 레보플록사신(levofloxacin) 및 테트라사이클린(tetracycline)에 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  10. 제 1항에 있어서,
    세푸록심 소듐(cefuroxime sodium), 클로람페니콜(chloramphenicol), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 피페라실린 (piperacillin) 또는 암피실린-설박탐(ampicillin-sulbactam)에 의하여 성장이 저해되는 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  11. 제 1항에 있어서,
    스피룰리나와 함께 야외 배양 시 스피룰리나의 성장을 저해하지 않는 것을 특징으로 하는 렙토린비아 코리엔시스 KIOST-1.
  12. 삭제
  13. 삭제
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