ES2616020T3 - Transglutaminasa estabilizada y procedimiento para la producción de la misma - Google Patents

Abstract

Transglutaminasa estabilizada, que comprende un péptido pro-secuencia de la transglutaminasa y una transglutaminasa madura, en la que el péptido pro-secuencia de la transglutaminasa está unido a la transglutaminasa madura y la transglutaminasa estabilizada tiene una estabilidad superior a la transglutaminasa madura a la que no está unido el péptido pro-secuencia, y la estabilidad es al menos una estabilidad seleccionada del grupo que consiste en la estabilidad con el pH, estabilidad con la temperatura, la estabilidad frente a la oxidación y la estabilidad con el almacenamiento.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

15

25

35

45

55

65

[0034] Se evaluó la estabilidad en forma de polvo. P-TGasa y M-TGasa se liofilizaron en polvo. Al polvo de M-TGasa, se mezcló dextrina, de manera que la actividad de transglutaminasa por peso era la misma que la del polvo de P-TGasa. La temperatura de almacenamiento fue de 44ºC. La actividad restante después de dos meses fue del 79% para M-TGasa, y por otra parte, del 85% para P-TGasa (Figura 4). De este modo, en el caso de un estado de polvo, la P-TGasa mostró una alta estabilidad.

6. Purificación de P-TGasa (cepa No.466 de Streptomyces lavendulae)

[0035] Se utilizó un medio que incluía 2% de almidón soluble, 5% de sacarosa, 2% de polipeptona, 0,2% extracto de levadura, 0,1% de sulfato de magnesio, 0,2% de fosfato de potasio dibásico, y 0,05% de Adecanol. Se cultivó la cepa No. 466 de Streptomyces lavendulae como una cepa productora de transglutaminasa (véase la Patente No. 2.849.773, la patente japonesa no examinada de No. de publicación H4-207194) por agitación a 30ºC durante tres días para obtener 1500 ml de solución de enzima en bruto.

[0036] A continuación, la solución de enzima en bruto se concentró utilizando una membrana de ultrafiltración (ACP1010, Asahi Kasei Corporation) y se obtuvieron 300 ml de solución concentrada. La solución concentrada se precipitó con 80% de solución saturada de sulfato de amonio, se recuperaron los precipitados. Los precipitados recuperados se disolvieron en solución de tampón de fosfato 20 mM (KPB; pH 7,2), y se dializaron adicionalmente frente a la misma solución tampón. Las materias insolubles se extrajeron de la muestra dializada y el sobrenadante se sometió de manera similar a Blue-Sepharose 6 Fast Flow equilibrada con solución de tampón fosfato 20 mM (KPB; pH 7,2). La fracción de lavado en la solución tampón se recuperó y se dializó frente a solución de tampón fosfato 20 mM (KPB; pH 6,8) que contenías sulfato de amonio 1,7 M. Las muestras dializadas se sometieron de manera similar a Fenil-Sepharose 6 Fast Flow equilibrada con solución de tampón de fosfato 20 mM (KPB; pH 6,8) que contenía sulfato de amonio 1,7 M. La muestra se lavó con la misma solución tampón y se eluyó usando un gradiente de concentración lineal de 1,7 -0 M de sulfato de amonio. La P-TGasa se eluyó a la concentración de sulfato de amonio alrededor de 1,0 M. Además, la M-TGasa se eluyó a una concentración de sulfato de amonio alrededor de 0,8 M.

7.

Prueba de estabilidad 1 de P-TGasa (cepa No.466 de Streptomyces lavendulae)

[0037] Se llevó a cabo la comparación de la estabilidad con la temperatura entre P-TGasa y M-TGasa. Cada diluyente de enzima se preparó con una solución de tampón Tris-HCl 0,2 M (pH 6,0) y se trató térmicamente a cada temperatura. A continuación, se midió cada actividad de transglutaminasa. Como resultado, cuando se lleva a cabo el tratamiento a 50ºC durante 20 minutos, la actividad restante fue del 12% para M-TGasa y, por otra parte, del 29% para P-TGasa (Figura 5). De este modo, la P-TGasa derivada de la cepa No. 466 de Streptomyces lavendulae mostró una mayor estabilidad térmica que la de M-TGasa derivada de la misma cepa.

8.

Prueba de estabilidad 2 de P-TGasa (cepa No.466 de Streptomyces lavendulae)

[0038] Con el fin de evaluar la estabilidad a la oxidación en una solución (resistencia a la inactivación por oxidación), se llevó a cabo una prueba de inhibición (frente a peróxido de hidrógeno). Se diluyó apropiadamente peróxido de hidrógeno acuoso (reactivo, 30% (p/v)) con una solución tampón Tris-HCl 0,2 (pH 6,0) y la solución diluida se añadió a una solución de enzima y se trató a 37ºC durante 15 minutos. A continuación, se midieron las actividades de transglutaminasa. Cuando la concentración del tratamiento fue del 0,06% (p/v), la actividad restante fue del 35% para M-TGasa y del 62% para P-TGasa (Figura 6). De este modo, la P-TGasa derivada de la cepa No. 466 de Streptomyces lavendulae mostró una alta estabilidad frente a la oxidación en una solución.

9.

Preparación de pro-transglutaminasa

[0039] Se utilizó un medio que incluía 2% de almidón soluble, 5% de sacarosa, 2% de polipeptona, 0,2% extractos de levadura, 0,1% de sulfato de magnesio, 0,2% de fosfato de potasio dibásico, y 0,05% de Adecanol. Se cultivó la cepa No. 140226 de Streptomyces mobaraensis como una cepa productora de transglutaminasa (véase la patente japonesa no examinada de No. de publicación 2005-73628) por agitación a 30ºC durante dos días para obtener 1500 ml de solución de enzima en bruto. A continuación, la solución de enzima en bruto se concentró utilizando una membrana de ultrafiltración (ACP1010, Asahi Kasei Corporation) para obtener 150 ml de solución concentrada. La solución concentrada se purificó de acuerdo con el procedimiento basado en la información del documento (Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998)) y se obtuvo de este modo la pro-transglutaminasa.

10.

Preparación de P-TGasa (conversión de pro-transglutaminasa mediante el tratamiento con proteasas)

[0040] Se sometió a diálisis una solución de pro-transglutaminasa frente a solución tampón Hepes 50 mM (pH 7,4) que contenía cloruro de sodio 150 mM para obtener la muestra de diálisis (Abs. 280 nm = 1,8). Se añadió dispasa II (Roche) a la muestra de diálisis, de manera que la concentración final de la solución tratada fue de 0,08 u/ml y se trató a 30ºC durante 60 minutos. De este modo, se preparó la P-TGasa. La reacción se detuvo mediante la dilución de la solución de reacción con una solución tampón Tris-HCl 0,2 M (pH 6,0) que contenía EDTA 5 mM a la concentración de trabajo descrita en el siguiente punto "11." Por otra parte, similar a P-TGasa, como la M-TGasa que se utilizará en el siguiente punto "11", se utilizó una muestra que había sido tratada con dispasa II.

8

Claims (1)

1. imagen1